ES2899431T3 - Métodos y productos para la producción de ésteres de cera - Google Patents

Abstract

Una célula de Saccharomyces cerevisiae para sobreproducir ácidos grasos, comprendiendo dicha célula de S. cerevisiae un gen de acetil-CoA carboxilasa, caracterizado por que dicho gen de acetil-CoA carboxilasa es un gen de acetil-CoA carboxilasa mutado que codifica una acetil-CoA carboxilasa mutada, en la cual la serina en la posición 659 en la Id. de sec. n.° 16 se ha reemplazado por alanina y la serina en la posición 1157 en la id. de sec. n.° 16 se ha reemplazado por alanina; y dicho gen de acetil-CoA carboxilasa está bajo el control de un promotor expresado constitutivamente.

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos y productos para la producción de ásteres de cera

Antecedentes de la invención

Campo de la invención

La presente invención se refiere al desarrollo de microorganismos diseñados mediante ingeniería genética que pueden producir ásteres de cera de manera controlable y económica. Más específicamente, la invención se refiere a la producción de ásteres de cera líquida que pueden usarse para biocombustible, lubricantes, cosméticos, linóleo, tintas de impresión así como productos relacionados con ellos, y para la producción de ásteres de cera sólida usados para velas y productos limpiadores así como productos relacionados con ellos.

Descripción de la técnica relacionada

Los combustibles fósiles, tales como carbón, aceite y gas natural, han estado energizando la sociedad moderna durante más de un siglo. Sin embargo, los nuevos descubrimientos de depósitos están en decadencia y las demandas están aumentando. La demanda mundial de combustibles fósiles aumentará pronto el suministro actual. Un enfoque innovador que ofrece cierta solución proviene de las industrias biotecnológicas. Los esfuerzos han hecho al biodiesel uno de los combustibles alternativos más desarrollados y prometedores del mercado. Funciona bien en motores diésel convencionales, con menos emisiones peligrosas, y se consume en más de 13,2 mil millones de litros (3,5 mil millones de galones) por año.

El Biodiesel se compone, generalmente, de fatty acid methyl esters (ésteres metílicos de ácidos grasos - FAME) o fatty acid ethyl esters (ésteres etílicos de ácidos grasos - FAEE) y deriva en su mayoría de aceite vegetal o grasa animal por transesterificación química con metanol o etanol. A pesar del hecho de que los FAEE producidos en etanol tienen mejores rendimientos, por razones de coste, el metanol es el reactivo que se usa más frecuentemente para la transesterificación de triglicéridos. El proceso actual tiene varios inconvenientes, que incluyen intensidad energética, consumo de materias primas comestibles, dificultad para retirar el catalizador del producto y tratar el agua residual tóxica, así como restricciones geográficas y estacionales.

Para superar los problemas relacionados con el uso de catalizadores, las personas han estado explorando nuevas alternativas, tales como la conversión enzimática usando lipasas (EC 3.1.1.3, triacilglicerol hidrolasas). Las lipasas pueden descomponer los lípidos neutros tales como los triglicéridos y realizar una reacción de transesterificación en un sistema disolvente (es decir, terc-butanol). La producción enzimática de biodiesel puede llevarse a cabo en condiciones de reacción moderadas y en una relación inferior de alcohol a aceite. Los inconvenientes principales con este tipo de catálisis enzimática son el efecto de inactivación fuerte provocado por alcoholes (es decir, metanol) y los altos costes de las enzimas.

Tanto la transesterificación química como la enzimática requieren el uso de alcoholes tóxicos derivados del petróleo y materias primas costosas. Por lo tanto, el biodiesel basado en transesterificación se vuelve insostenible cuando se usan productos derivados de combustibles fósiles. Como resultado, las materias primas actuales para biodiesel derivan principalmente de aceites vegetales como el aceite de semilla de colza.

Sin embargo, tales aceites vegetales están inherentemente limitados por el suministro de agua y tierra y, posteriormente, no pueden producir suficiente biocombustible sin amenazar los suministros de alimentos y/o la biodiversidad natural. Las algas son una elección prometedora como una materia prima alternativa. Sin embargo, existen problemas con el uso de la superficie y la extracción de aceite de la producción basada en algas. Todos están de acuerdo en que los combustibles derivados de la biomasa son una de las mejores alternativas a los combustibles fósiles. Por lo tanto, la manipulación genética de microorganismos para producir ésteres de ácidos grasos, contribuirá sustancialmente a producir biodiéseles más respetuosos del medio ambiente, sostenibles y rentables.

En este sentido, se mostró previamente que una cepa de E. coli diseñada por ingeniería genética que expresa la wax synthase (cera sintasa - WS) de Acinetobacter baylyi ADP1 y los genes de producción de etanol de Z. mobilis, podría producir ésteres etílicos de ácidos grasos esterificando ácidos grasos añadidos exógenamente (Kalscheuer, Stolting et al. 2006). La investigación es una excelente demostración de factibilidad para la producción microbiana de ésteres de ácidos grasos. Recientemente, investigadores del grupo Keasling y la compañía LS9 Inc. (South San Francisco, EE. UU.) desarrollaron esta idea aún más al construir una E. coli diseñada por ingeniería genética que puede producir combustibles derivados de ácidos grasos y sustancias químicas a partir de azúcares sencillos y biomasa derivada de plantas, sin necesidad de suministrar ácidos grasos (Steen, Kang et al. 2010). La producción de derivados de ácidos grasos como biocombustibles se ha informado también en las solicitudes de patente recientes WO2009/009391, WO2007136762 y WO2008119082, todas propiedad de LS9 Inc. Brevemente, la cepa de E. coli diseñada metabólicamente por ingeniería genética se manipuló para ser capaz de producir ésteres (de ácidos) grasos y derivados de los mismos (alcoholes de cadena corta y larga, hidrocarburos, alcoholes grasos, ceras, etc.) a través de la introducción de varios genes que codifican enzimas tales como tioesterasa, cera sintasa, alcohol aciltransferasa, alcohol deshidrogenasa y diferentes tipos de acil-CoA reductasas formadoras de alcohol graso. En la publicación de patente de EE. UU. 2010/0071259, los inventores de la misma compañía enseñan que al añadir una mezcla de al menos dos alcoholes diferentes a un medio que contiene la cepa de E. coli diseñada por ingeniería genética que produce ésteres grasos, podrían producirse al menos dos ésteres grasos diferentes.

Todos los métodos de producción de biodiesel mencionados anteriormente se basan en el uso de la bacteria E. coli. Sin embargo, E. coli es incapaz de sobreproducir de forma natural los dos sustratos de biodiesel, ácidos grasos y alcohol (es decir, etanol), y este organismo no es adecuado para la producción a gran escala que implica frecuentemente condiciones ambientales severas. Además, E. coli es sensible a la contaminación por fagos lo que resulta, frecuentemente, en pérdidas económicas sustanciales. Las patentes de la técnica anterior enseñan con éxito varias estrategias para mejorar la biosíntesis de ácidos grasos en E. coli. Sin embargo, y aparte de los inconvenientes asociados al uso de este huésped, cabe señalar que las estrategias que funcionan en E. coli podrían no ser adecuadas cuando se aplican en otros microorganismos.

Una elección mucho mejor de la fábrica celular microbiana para la producción industrial de biodiesel sería la levadura Saccharomyces cerevisiae. Esta levadura ya se usa ampliamente en la industria, incluso para la producción de bioetanol a gran escala, pero también para un abanico de sustancias químicas especializadas. El desarrollo de S. cerevisiae como fábrica celular para la producción de biodiesel representaría una contribución importante ya que esto podría representar una solución de “conectar y usar” (expresión en inglés “plug and play” ) donde las infraestructuras actuales usadas para la producción de bioetanol podrían usarse para la producción de biodiéseles mucho más valiosos. A diferencia de la productividad insuficiente de etanol de E. coli, S. cerevisiae ya es un buen productor de etanol.

De hecho, la producción de FAEE y fatty acid isoamyl esters (ésteres isoamílicos de ácidos grasos - FAIE) se ha logrado en S. cerevisiae recombinante con adición de ácido oleico mediante la expresión de la enzima WS/DGAT bifuncional de A. baylyi (Kalscheuer, Luftmann et al. 2004). Una solicitud de patente reciente, a saber, la solicitud de patente de EE. UU. 2009/0117629 de Schmidt-dannert y Holtzapple describe también un método para la producción de ésteres, que incluyen ésteres de cera isoprenoide y ésteres alquílicos de ácidos grasos, tales como FAME y FAEE, por expresión heteróloga de la cera sintasa (WS2) de Marinobacter hydrocarbonoclasticus en S. cerevisiae. Sin embargo, la invención se limita al uso de polinucleótidos aislados específicos de Marinobacter hydrocarbonoclasticus y su aplicación en, p. ej., la producción de biodiesel). Por otro lado, este método requiere el suministro exógeno de ácidos grasos, ya que la producción endógena de ácidos grasos por parte de la levadura es demasiado baja para asegurar la producción económicamente viable de FAEE.

Una cepa modificada que porta los genes que codifican la cera sintasa de Marinobacter hydrocarbonoclasticus podría considerarse un huésped potencial para la producción de biodiesel en levaduras. Sin embargo, si bien este producto es muy adecuado para el fin particular que aborda, no es la opción ideal cuando se desea la síntesis de otros ésteres. El conocimiento de los sustratos preferidos para cada cera sintasa permite el uso de células de levadura en aplicaciones distintas de la producción de biodiesel. Además, todavía existe la necesidad de métodos y productos que permitan la producción a gran escala de ésteres de ácidos grasos.

Por lo tanto, es un objeto de la presente invención proporcionar una fábrica de células fúngicas mejorada, tal como una fábrica de células de levadura que pueda usarse para la producción de FAEE basada en la fermentación, que no dependa de la adición de ácidos grasos exógenos al cultivo de levadura y que posea un flujo aumentado hacia la biosíntesis de ácidos grasos, y donde se obtenga un alto nivel de producción de FAEE.

Sumario de la invención

Los problemas presentados anteriormente se han resuelto ahora al proporcionar una célula fúngica para producir ácidos grasos como se define en la reivindicación 1.

La invención se refiere a una célula de Saccharomyces cerevisiae para sobreproducir ácidos grasos. La célula de S. cerevisiae comprende un gen de acetil-CoA carboxilasa mutado que codifica una acetil-CoA carboxilasa mutada, en la cual la serina en la posición 659 en la Id. de sec. n.° 16 se ha reemplazado por alanina y la serina en la posición 1157 en la id. de sec. n.° 16 se ha reemplazado por alanina. El gen de acetil-CoA carboxilasa está bajo el control de un promotor expresado constitutivamente.

En consecuencia, un objeto principal de la presente invención es proporcionar un avance en el método de fermentación de microorganismos para producir ésteres de cera, que incluyen, pero no se limitan a, las ceras líquidas usadas para biocombustibles, lubricantes, cosméticos, linóleo y tintas de impresión, y las ceras sólidas usadas para velas, productos limpiadores, etc. El sistema de células fúngicas y el método descrito en la presente descripción combinan la expresión de diferentes cera sintasas con modificaciones metabólicas diseñadas por ingeniería genética para asegurar un alto flujo para realizar la biosíntesis de ésteres cerosos. El flujo alto descrito en la presente descripción significa un aumento de al menos 2 veces en el flujo de ácidos grasos en comparación con el flujo hacia ácidos grasos en la levadura de referencia.

En este sentido, antes de explicar al menos una modalidad de la invención en detalle, debe entenderse que la invención no se limita en su aplicación a los detalles de construcción y a las configuraciones de los componentes expuestos en la siguiente descripción o ilustrados en los dibujos. La invención es capaz de otras modalidades y de practicarse y llevarse a cabo de varias maneras. Además, debe entenderse que la fraseología y terminología usadas en la presente descripción tienen el fin de la descripción y no deben considerarse como limitantes.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra la ruta de glicólisis en la levadura Saccharomyces cerevisiae para producir dos sustratos precursores directos (etanol y acil-CoA) de la cera sintasa. La glucosa, a través de la glicólisis, puede convertirse en etanol (1) y acil-CoA (2), el precursor de ácidos grasos.

La Figura 2 muestra las diferentes reacciones de las rutas que consumen ácidos grasos.

La Figura 3 muestra una ruta de biosíntesis de éster de cera (p. ej., FAEE) catalizada por la cera sintasa heteróloga en Saccharomyces cerevisiae. Los alcoholes podrían biosintetizarse por el huésped de producción o suplementarse con heterólogos. La acil-CoA podría producirse a través de la biosíntesis de ácidos grasos por un huésped de producción o suplementarse heterólogamente.

La Figura 4 muestra el vector usado para la expresión génica en la invención de la presente descripción.

La Figura 5 muestra el análisis de CG-EM del éster etílico del ácido heptadecanoico producido por la cera sintasa que expresa S. cerevisiae CB1 con ácido heptadecanoico suplementado. El tiempo de retención es 15,53 minutos. La Figura 6 muestra un análisis de CG-EM de éster etílico de ácido heptadecanoico convencional. El tiempo de retención es 15,62 minutos.

La Figura 7 muestra los plásmidos construidos para expresar las WS de Acinetobacter baylyi, Marinobacter hydrocarbonoclasticus DSM 8798, Rhodococcus opacus PD630, Mus musculus C57BL/6, y Psychrobacter articus 273-4.

La Figura 8 muestra una visión general de diferentes estrategias de diseño por ingeniería genética metabólica para mejorar la producción de derivados de ácidos grasos en levadura. Las enzimas heterólogas se muestran subrayadas.

La Figura 9 muestra el esquema del método de deleción de genes.

La Figura 10 muestra la producción de biodiesel en cepas diseñadas por ingeniería genética.

La Figura 11 muestra un método para la integración cromosómica. El casete de integración cromosómica, obtenido por PCR de fusión, contiene cera sintasa controlada por TEF1 o PGK1 y un marcador seleccionable (neo) se suministra al cromosoma. La duplicación variable de genes en tándem se logra al seleccionar en las placas con antibióticos superiores.

La Figura 12 muestra el efecto de la producción de diferentes promotores y biodiesel en cepas basadas en la integración de plásmidos o cromosomas.

La Figura 13 muestra la relación de la concentración de producción de biodiesel y la concentración de G418.

Descripción detallada de la invención y realizaciones preferidas de la misma

La invención en la presente descripción depende, a menos que se indique de cualquier otra manera, del uso de técnicas convencionales de bioquímica, biología molecular, microbiología, biología celular, genómica y tecnología recombinante.

Para facilitar la comprensión de la invención, a continuación se definen una serie de términos. El término “ recombinante” significa que un ácido nucleico particular (ADN o ARN) es el producto de diversas combinaciones de etapas de clonación, restricción y/o ligación que resultan en una construcción que tiene una secuencia estructural codificante o no codificante distinguible de los ácidos nucleicos endógenos que se encuentran en sistemas naturales. El término “sobreproducir” se usa en la presente descripción con referencia a la producción de FAEE en una célula huésped e indica que la célula huésped produce más del FAEE en virtud de la introducción de secuencias de ácido nucleico que codifican polipéptidos diferentes implicados en las rutas metabólicas de la célula huésped o como resultado de otras modificaciones en comparación con la célula huésped natural o no modificada.

Como se usa en la presente descripción, los términos “proteína” y “polipéptido” se refieren a compuestos que comprenden aminoácidos unidos a través de enlaces peptídicos y se usan indistintamente.

Como se usa en la presente descripción, una “ACBP o proteína de unión a acil-CoA” es una proteína pequeña (10 kDa) que se une a ésteres de acil-CoA de cadena media y larga con afinidad muy alta y puede funcionar como un vehículo intracelular de ésteres de acil-CoA. Se supone que la mayoría de los ésteres celulares de acil-CoA de cadena larga se secuestran con la acyl-CoA binding protein (proteína de unión a acil-CoA - ACBP).

Aunque la ACBP se produce como una proteína completamente independiente, se han identificado dominios ACB intactos en varias proteínas grandes y multifuncionales en una diversidad de especies eucariotas que varían desde levaduras y plantas hasta reptiles y mamíferos. Generalmente, la ACBP está altamente conservada en todos los eucariotas. El homólogo de levaduras de ACBP se conoce como Acb1p. Como se usa en la presente descripción, una “acetil CoA carboxilasa” es una enzima que contiene biotina que cataliza la reacción irreversible en la cual la acetil-CoA se carboxila en malonil-CoA, véanse las Figuras 1 y 8, que es el precursor de acil-CoA graso de cadena larga. En mamíferos, se expresan dos isoformas principales de ACC, ACC1 y ACC2, que difieren tanto en la distribución tisular como en la función. ACC1 se encuentra en el citoplasma de todas las células y codifica la acetil CoA carboxilasa en células de levadura.

Como se usa en la presente descripción, FAS o una “ácido graso sintasa” es un sistema enzimático que cataliza la iniciación y elongación de las cadenas acilo y, por lo tanto, desempeña un papel clave en la síntesis de ácidos grasos a partir de acetil-CoA y malonil-CoA. Son ejemplos de estas enzimas AccABCD, FabD, FabH, FabG, FabA, FabZ, Fabl, FabK, FabL, FabM, FabB y FabF. En la levadura Saccharomyces cerevisae, los ácidos grasos se sintetizan por un complejo enzimático multifuncional 2,4 Mba con dos subunidades codificadas por dos genes no ^{enlazados FAS1 y FAS}2^.

Como se usa en la presente descripción, la acil-CoA sintasa incluye péptidos en el número de clasificación de enzimas EC 2.3.1.86, y son cualquiera de las diversas ligasas que catalizan la conversión de un ácido graso en acil-CoA para la p-oxidación posterior.

Como se usa en la presente descripción, “gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa” (GAPDH) cataliza la interconversión reversible entre 1,3-bisfosfoglicerato y d-gliceraldehído-3-fosfato usando cualquiera de NAD(H) o NADP(H) como una coenzima. Esta es la sexta etapa de la glicólisis (Figura 1) y sirve por lo tanto para descomponer la glucosa para energía y moléculas de carbono.

NADPH, un producto de la ruta de las pentosas fosfato, funciona como un reductor en diversas rutas sintéticas (anabólicas) que incluyen la síntesis de ácidos grasos.

Como se usa en la presente descripción, una “acetil-coenzima A sintetasa” es una enzima que cataliza la formación de un nuevo enlace químico entre acetato y coenzima A (CoA), que es una molécula de ramificación clave para diferentes rutas metabólicas.

Como se usa en la presente descripción, “ p-oxidación” es el proceso por el cual los ácidos grasos en forma de moléculas de Acil-CoA se descomponen para generar Acetil-CoA. Es la ruta metabólica principal responsable de la degradación de los ácidos grasos (Figura 2).

Como se usa en la presente descripción, un “ motivo catalítico” es una unidad estructural tridimensional formada por una secuencia particular de aminoácidos, encontrada en proteínas y que, frecuentemente, está unida a una función particular. Para los ácidos nucleicos es una secuencia de nucleótidos particular, usualmente corta, que forma, usualmente, un sitio de reconocimiento, al cual se unen otras proteínas.

Un péptido de la presente invención puede estar presente en un vector de expresión. El término “vector de expresión” se define en la presente descripción como una molécula de ADN lineal o circular que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido de la invención y que está unido operativamente a nucleótidos adicionales que aseguran su expresión. Los vectores de expresión adecuados incluyen vectores fúngicos, de baculovirus, vectores de bacteriófagos, plásmidos, fagémidos, cósmidos, fósmidos, Acinetobacterbaylyi, plásmidos de levadura y cualquier otro vector específico para los huéspedes de interés. Los vectores pueden introducirse en una célula huésped mediante el uso de métodos que se conocen en la materia, tales como precipitación con fosfato cálcico, electroporación, choque térmico, lipofección, microinyección, etc.

Un “sistema de células fúngicas” , como se describe en la presente descripción, comprende una célula fúngica que se ha modificado, tal como genéticamente modificada, como se describe en la presente descripción, y que expresa al menos una cera sintasa, como se ejemplifica en la presente descripción. Dicha cera sintasa se introduce en dicha célula fúngica para proporcionar la expresión de esta en dicha célula fúngica. El sistema de células fúngicas según la invención proporciona, por tanto, la combinación de una célula fúngica modificada y la expresión de una cera sintasa en dicha célula fúngica, lo que permite un flujo metabólico aumentado hacia la biosíntesis de ésteres de ácidos grasos en dicha célula fúngica. Esta combinación ventajosa se denomina en la presente descripción el “sistema de células fúngicas” .

Como se usa en la presente descripción, los vectores pESC son una serie de vectores que etiquetan epítopos diseñados para expresión y análisis funcional de genes eucariotas en la levadura S. cerevisiae. Estos vectores contienen los promotores de levadura GAL1 y GAL10 en orientación opuesta. Con estos vectores pueden introducirse uno o dos genes clonados en una cepa huésped de levadura bajo el control de un promotor reprimible Preferentemente el vector de expresión de la presente invención es un plásmido derivado de pESC en el cual se ha reemplazado el promotor original. (S. Partow et al. 2010)

Como se usa en la presente descripción, un “promotor” es una secuencia de ADN que precede usualmente a un gen en un polímero de ADN y proporciona un sitio para la iniciación de la transcripción en ARNm. En la presente invención se usaron promotores derivados del Factor potenciador de la transcripción 1 (TEF1) y fosfoglicerato quinasa (PGK1 ).(S. Partow et al. 2010).

Como se usa en la presente descripción, identidad de secuencia se refiere a la similitud de secuencia entre dos secuencias de nucleótidos o dos secuencias de péptidos o proteínas. La similitud se determina por alineación de secuencias para determinar las relaciones funcionales, estructurales y/o evolutivas entre las secuencias. Se permiten interrupciones en una o ambas secuencias para hacer la alineación exitosa.

Por dos secuencias de nucleótidos o dos secuencias de péptidos o proteínas que tienen una secuencia de aminoácidos al menos, por ejemplo, el 95 % idéntica a una secuencia de aminoácidos de referencia, se prevé que la secuencia de aminoácidos de, p. ej., los péptidos es idéntica a la secuencia de referencia, excepto que la secuencia de aminoácidos puede incluir hasta 5 mutaciones puntuales por cada 100 aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de referencia. En otras palabras, para obtener un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos al menos el 95 % idéntica a una secuencia de aminoácidos de referencia: hasta el 5 % de los aminoácidos en la secuencia de referencia pueden eliminarse o sustituirse con otro aminoácido, o puede insertarse en la secuencia de referencia un número de aminoácidos de hasta el 5 % del total de aminoácidos en la secuencia de referencia. Estas mutaciones de la secuencia de referencia pueden producirse en las posiciones amino y/o carboxi terminales de la secuencia de aminoácidos de referencia o en cualquier lugar entre esas posiciones terminales, intercalados individualmente entre aminoácidos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia.

En la presente invención, un programa de algoritmo local es el más adecuado para determinar la identidad. Los programas de algoritmos locales (tales como Smith Waterman) comparan una subsecuencia en una secuencia con una subsecuencia en una segunda secuencia, y encuentran la combinación de subsecuencias y la alineación de esas subsecuencias, lo que produce la puntuación de similitud global más alta. Los huecos internos, si se permiten, se penalizan. Los algoritmos locales funcionan bien para comparar dos proteínas multidominio, que tienen un solo dominio o solo un sitio de unión en común.

Los métodos para determinar la identidad y similitud están codificados en programas públicamente disponibles. Los métodos de programas informáticos preferidos para determinar la identidad y similitud entre dos secuencias incluyen, pero no se limitan a, el paquete de programas GCG (Devereux, J et al (1994)) BLASTP, BLASTN y FASTA (Altschul, S.F. et al (1990)). El programa b La STX está disponible públicamente de Nc BI y otras fuentes (BLAST Manual, Altschul, S.F. et al, Altschul, S.F. et al (1990)). Cada programa de análisis de secuencias tiene una matriz de puntuación predeterminada y penalizaciones de huecos predeterminadas. Generalmente, se esperaría que un biólogo molecular use la configuración predeterminada establecida por el programa de software usado.

Ruta de síntesis de ácidos grasos

La ruta de síntesis de ácidos grasos incluye enzimas ácido graso sintasa seleccionadas del grupo que consiste en ACC1 (que codifica la acetil-CoA carboxilasa), FAS1/FAS2 (que codifican la ácido graso sintasa) y ACS1 (acetil coenzima A sintasa) de cualquier especie para codificar tales proteínas.

Los fatty acids (ácidos grasos - FA) desempeñan un papel importante como bloques de construcción de biodiesel. En S. cerevisiae, FA se sintetizan principalmente en el citosol y limitan la producción de biodiesel. Una célula de levadura que sobreproduce ácidos grasos producirá, a su vez, ésteres derivados de ácidos grasos, p. ej., FAEE (biodiesel). En esta modalidad, los inventores en la presente descripción mejoran el suministro de precursores de FAEE. Por lo tanto, una sobreexpresión del gen que codifica la acetil-CoA carboxilasa (ACC1) en combinación con una expresión aumentada de ácido graso sintetasas (FAS1 y FAS2) produce una cantidad aumentada de Malonil CoA y ácidos grasos, respectivamente.

Generalmente, se supone que las fuentes de malonil-CoA son limitadas, lo que impide su utilidad para sobreproducir FA. La actividad de acetil-CoA carboxilasa está altamente regulada en S. cerevisiae: (1) La transcripción de ACC1 se reprime por inositol y colina, ya que se encontró el sitio UASINO en el promotor de ACC1 (Chirala, Zhong et al.

1994); (2) la actividad acetil-CoA carboxilasa podría inactivarse directamente por Snflp a través de fosforilación (Shirra, Patton-Vogt et al. 2001).

Para liberar la regulación estrecha de la ACC1 a nivel de ARNm y proteína, se reemplaza el promotor del ACC1. Además, los inventores en la presente descripción han descubierto que bajo el control del promotor expresado constitutivamente, una liberación de sitios de fosforilación de ACC1 proporcionaría un aumento adicional hacia el flujo biosintético de FAEE. Por ejemplo, Ser659Ala y Ser1157Ala podrían sustituirse (id. de sec. n.° 16). Por lo tanto, podría evitarse la inactivación por Snf1. La cepa resultante con Acc1p hiperactiva mejoraría significativamente la biosíntesis de FA.

Como se mencionó anteriormente, además de la actividad regulada positivamente de la acetil-CoA carboxilasa, la fatty acid synthase (ácido graso sintasa - FAS) podría sobreactivarse para reforzar el empuje de la acetil-CoA carboxilasa hiperactiva. Por lo tanto, FAS1 y FAS2 se sobreexpresarían en la cepa diseñada por ingeniería genética con Acc1p hiperactiva. Las manipulaciones combinadas conducirían a un alto flujo hacia la biosíntesis de ácidos grasos.

Otra modificación preferida dirigida a aumentar la reserva de ácidos grasos es la sobreexpresión de acetil coenzima A sintasa. En S. cerevisiae, el acetil-CoA citosólico se produce por descarboxilación de piruvato a acetaldehído que, después, se convierte además en acetato y acetil-CoA (Figura 1; Figura 8), que se usa para la síntesis de malonil-CoA y la biosíntesis de FA. El suministro de acetil-CoA puede volverse una escasez cuando la capacidad de biosíntesis de FA se refuerza severamente. La etapa para biosintetizar acetil-CoA se cataliza por la acetil-coenzima A sintetasa, que está codificada por dos genes, ACS1 y ACS2, en S. cerevisiae. En comparación con ACS2, se ha informado que ACS1 muestra una actividad considerablemente superior y, por lo tanto, en esta invención, ACS1 se ha elegido para sobreexpresarse.

La célula de levadura modificada genéticamente de la presente invención proporcionará una producción aumentada de FA que es al menos 2 veces superior a la cantidad de éster producida por una levadura control que no está modificada genéticamente como se describe en la presente descripción.

Rutas que consumen ácidos grasos

Los ácidos grasos son el precursor de Acil CoA y el huésped de producción se diseña por ingeniería genética para producir ésteres de ácidos grasos a partir de acil-CoA y etanol. Es por eso que es importante mejorar la agrupación de ácidos grasos mediante la regulación negativa de las rutas que consumen ácidos grasos.

La mayoría de los ácidos grasos se almacenan en forma de lípidos neutros tales como triacilgliceroles (TAG) y ésteres de esterilo, que pueden constituir hasta el 70 % del contenido total de lípidos de la célula. En S. cerevisiae, los TAG pueden sintetizarse a través de dos rutas diferentes. Según muestra la Figura 8, una es una reacción dependiente de acil-CoA que está catalizada por la acil-CoA:diacilglicerol aciltransferasa (codificada por el gen DGA1); otra es la reacción dependiente de phospholipids (fosfolípidos - PL) que está catalizada por la lecitina:colesterol aciltransferasa (codificada por el gen LRO1). Los ésteres de esterilo se forman a partir de esteroles a través de la acción de la enzima acyl-CoA:sterol acyltransferase (acil-CoA:esterol aciltransferasa - ASAT) que está codificada por los genes ARE1 y ARE2 en S. cerevisiae.

Estudios previos han demostrado que el mutante cuádruple, S. cerevisiae H1246, en el cual se interrumpieron DGA1, LRO1, ARE1 y ARE2, ya no era capaz de producir cualquier TAG o éster de estearilo y ya no tuvo defectos de crecimiento aparentes en condiciones estándar (Sandager, Gustavsson et al. 2002). En la fase estacionaria, la cepa con una interrupción cuádruple tiene un aumento de 2,5 veces en los ácidos grasos. Usando el sistema CreloxP, los cuatro genes, DGA1, LRO1, ARE1 y ARE2, se interrumpieron secuencialmente. El mutante disminuiría o suprimiría la cantidad de FA convertido en producción de lípidos neutros.

Los lípidos neutros almacenados podrían hidrolizarse en cualquier momento para producir ácidos grasos. Los ácidos grasos liberados y los ácidos grasos libres podrían, a su vez, oxidarse para generar energía por p-oxidación. S. cerevisiae tiene solo una acil-CoA oxidasa peroxisómica, Pox1 p, que se considera la etapa enzimática principal que controla el flujo a través de la p-oxidación. Inactivar el gen endógeno POX1 para bloquear la p-oxidación de ácidos grasos sería beneficioso para la acumulación de lípidos.

Las modificaciones adecuadas que permiten esta modalidad particular incluyen la deleción de los genes clave mencionados anteriormente: DGA1, LRO1, ARE1, ARE2 y POX1. Por lo tanto, una célula de levadura con todas las reacciones de conversión de ácidos grasos no esenciales eliminadas o atenuadas, específicamente, aquellas relacionadas con la p-oxidación, síntesis de fosfolípidos, triacilglicerol y ésteres de esterol, mostraría una producción superior de ácidos grasos y, por lo tanto, una sobreproducción de FAEE.

Por otra parte, como informan varios autores, una disminución en el flujo de p-oxidación aumentaría la acumulación de lípidos (Slocombe, Cornah et al. 2009; Steen, Kang et al. 2010).

Rutas de biosíntesis de carbohidratos

La célula de levadura modificada con, p. ej., una capacidad mejorada para sobreproducir ácidos grasos, debería necesitar mucho más NADPH, ya que se requieren dos moléculas de NADPH para cada etapa en la elongación de la cadena acilo FA en crecimiento (Figura 1).

Básicamente, la disponibilidad de NADPH intracelular se potencia al modificar genéticamente el huésped de producción para expresar una NADH:NADPH transhidrogenasa. La expresión de una o más NADH:NADPH transhidrogenasas produce una conversión aumentada del NADH producido en la glicólisis en NADPH. Específicamente, los autores en la presente descripción han diseñado una cepa de levadura novedosa que expresa una gliceraldehído-3- fosfato deshidrogenasa dependiente de NADP+ heteróloga (GAPN, codificada por el gen gapN) (Figura 8) para aumentar la producción de derivados de ácidos grasos. La expresión heteróloga de gapN, de mutantes de Streptococcus en levadura proporciona una capacidad adicional de biosíntesis de FA, mientras tanto conduce, además, a un rendimiento superior de etanol, que es otro precursor para biodiesel (Figura 8).

Establecimiento de la ruta de biosíntesis de FAEE

Un método conocido para producir ésteres de ácidos grasos incluye aumentar la expresión de éster sintasas tales como cera sintasas (EC 2.3.1.75) (Figura 2). Un aumento adicional podría obtenerse al aumentar la disponibilidad de sustrato de la cera sintasa, p. ej., sobreproducir ácidos grasos como se sugirió anteriormente.

Una célula de levadura natural no tiene la maquinaria metabólica para producir FAEE a partir de ácidos grasos. Las cera sintasas, las enzimas que catalizan estas reacciones, son características de organismos tales como cepas de Mycobacterium, Rhodococcus, Acinetobacter y Marinobacter que crecen en ambientes en donde una fuente de carbono fue abundante con respecto a otros nutrientes tales como fósforo y nitrógeno. La secuencia de la cera sintasa contiene, usualmente, el motivo catalítico HHXXXDG, que se informa es crucial para la actividad enzimática.

La actividad de la cera sintasa nunca se ha descrito previamente para levadura. En la levadura, solo se demostró que los polipéptidos Eht1p y Eeb1p tienen una actividad de síntesis y degradación de éster etílico de ácido graso de cadena media (C4-C8). Sin embargo, Kalscheuer et al. (2004) mostraron por primera vez que la actividad baja de cera sintasa podría detectarse en S. cerevisiae G175 natural con el uso de palmitoil-CoA y 1-Hexadecanol como sustratos. Pero no se detectó ninguna secuencia homóloga en levadura. Además, el análisis por CG/EM de extractos lipídicos totales de S. cerevisiae natural mostró que los FAEE estaban ausentes, incluso cuando el medio se suministró con ácidos grasos (ácido oleico).

Por lo tanto, la capacidad de sintetizar ésteres etílicos de ácidos grasos de cadena larga puede existir en la levadura y puede generarse por la actividad inespecífica de Eht1p y Eeb1p, pero la actividad es muy pobre, lo que no es suficiente para formar FAEE (es decir, éster etílico de ácidos grasos de cadena larga) a partir de ácidos grasos en una levadura natural.

En una realización particular los inventores en la presente descripción proponen el uso de una éster de cera sintasa/aciltransferasa microbiana (WS/DGAT) de Acinetobacter baylyi ADP1 ya que se sabe que esta enzima tiene la actividad para alcoholes de cadena corta y la capacidad de formar FAEE. Se obtiene mediante la expresión del gen atfA. Esta cera sintasa puede tener una similitud de secuencia con la secuencia de nucleótidos de la Id. de sec. n.° 1 (véase el Listado de secuencias adjunto).

Sin embargo, la cera sintasa de Acinetobacter baylyi ADP1 es una enzima bastante inespecífica con espectros amplios de sustratos posibles y, de hecho, era bifuncional in vivo actuando también como una diacilglicerol aciltransferasa (DGAT).

Se han identificado también genes con altas homologías con cera sintasa ADP1 de Acinetobacter baylyi en otras especies. Existen tres familias no relacionadas de cera sintasa encontradas en plantas superiores, mamíferos y bacterias. La cera sintasa de plantas no muestra actividad para alcoholes de cadena corta.

Se evaluaron varias cera sintasas heterólogas de otros organismos (Ejemplo 3). Como se sospecha, la mayoría de la cera sintasa tuvo la actividad más alta para acil-CoA y alcoholes con una longitud de cadena de 14 a 18, con una especificidad mucho menor para etanol. Toda la cera sintasa detectada (es decir, cera sintasa de Acinetobacter baylyi ADP1, Marinobacter hydrocarbonoclasticus DSM 8798, Rhodococcus opacus PD630, Mus musculus C57BL/6, y Psychrobacter articus 273-4) tiene actividad variada para etanol y podría conducir a la formación de FAEE. Sin embargo, se descubrió que la enzima con la mayor actividad para sintetizar FAEE era la cera sintasa de Marinobacter hydrocarbonoclasticus DSM 8798 (denominada CB2 en la presente solicitud). Según la presente invención, una célula de levadura capaz de producir eficazmente FAEE que podrían usarse directamente como biodiesel debe expresar una cera sintasa de M. hydrocarbonoclasticus o cera sintasa de Psychrobacter articus (Tabla 3).

La sobreexpresión del EEblgene nativo que codifica EeB1p, con la capacidad de sintetizar éster etílico de ácido graso de cadena media en combinación con la expresión de WS seleccionadas podría conducir a resultados favorables con respecto a la síntesis de FAEE específicos. Para este fin, debe elegirse una cera sintasa con la mejor especificidad de sustrato adaptada.

Por otra parte, la estandarización de los métodos de evolución molecular o fusión de proteínas podría ayudar a mejorar la preferencia de WS existentes para ciertos sustratos, p. ej., mediante el uso de PCR propensa a errores, mezcla de genes o diseño por ingeniería genética de proteínas más dirigidas de las WS. Por ejemplo, podría conducir a la identificación de las WS con especificidad superior por el etanol. La selección de WS con actividad alta por el etanol es, por supuesto, de importancia crucial para diseñar un productor de biodiesel eficaz ya que el biodiesel está compuesto, generalmente, por fatty acid ethyl esters (ésteres etílicos de ácidos grasos - FAEE). Los ácidos grasos tienen generalmente una longitud de cadena de 14 a 20 átomos de carbono, dentro del intervalo operativo óptimo para los acil-CoA. Una célula de levadura recombinante que expresa, p. ej., M. hydrocarbonoclasticus es una buena opción para diseñar un productor de FAEE debido a su alta preferencia por el etanol.

Los espectros amplios identificados de posibles sustratos de diferentes WS como se muestra en la Tabla 3 de la invención en la presente descripción (véase más abajo) permiten muchas aplicaciones biotecnológicas que incluyen, pero no se limitan a, producción de biodiesel. Dependiendo de la especificidad del sustrato de las enzimas de wax synthase (cera sintasa - WS), pueden generarse diversas mezclas de isómeros de éster y longitudes de cadena. Estos ésteres se refieren a ésteres de cera líquida que pueden usarse para biocombustible, lubricantes, cosméticos, linóleo, tintas de impresión así como productos relacionados con ellos, y ésteres de cera sólida usados para velas, productos limpiadores así como productos relacionados con ellos. Otra aplicación biotecnológica ilustrativa de la cera sintasa es la producción de esperma de ballena. El esperma de ballena se compone principalmente de palmitato de cetilo y miristato de cetilo, y se usa ampliamente en cosméticos, farmacia y también en velas.

Un polipéptido de cera sintasa de la presente invención puede aislarse y obtenerse de otras fuentes que incluyen microorganismos aislados de la naturaleza. Las personas expertas en la técnica saben cómo cribar una genoteca de ADNc o genómica para este fin. Una vez que se detecta una secuencia de polinucleótido que codifica un polipéptido, esta puede aislarse o clonarse utilizando técnicas muy conocidas para los expertos en la técnica.

Nuevamente, hemos usado el plásmido pSP-GM2, derivado de pESC, que es un plásmido común con un alto número de copias. Los promotores originales más débiles en pESC se intercambiaron por dos promotores fuertes TEF1 y PGK1, respectivamente, para construir pSP-GM2. El alto número de copias y la fuerte impulsada por TEF1 garantizan un alto nivel de expresión de la WS. Un polinucleótido que codifica un polipéptido de cera sintasa de la presente invención puede estar presente en la célula de levadura como un vector o integrado en un cromosoma (S. Partow et al.).

Enzima que actúa como transportadores de éster de cera.

Como se menciona en la presente descripción, la célula diseñada por ingeniería genética que expresa una cera sintasa sería capaz de sintetizar ésteres de ácidos grasos, p. ej., FAEE. La transferencia de ésteres al medio de fermentación es dependiente de su composición. Disminuye drásticamente al aumentar la longitud de cadena, p. ej., del 100 % para hexanoato de etilo, al 54-68 % para octanoato de etilo y el 8-17 % para decanoato de etilo. Un transportador de éster de cera facilitaría la liberación de ésteres al medio de fermentación.

En una modalidad, la invención en la presente descripción usa un transportador de éster de cera vegetal (Pighin, Zheng et al. 2004). Por ejemplo, la Cer5 de Arabidopsis facilita la exportación de aldehídos, cetonas, alcoholes, alcanos, ésteres de cadena muy larga y otros derivados posibles de ácidos grasos.

Caracterizaciones de cepas y polipéptidos

La actividad de la cera sintasa es un parámetro importante. Se mide según publicaciones anteriores (Kalscheuer et al., 2004). Básicamente, los extractos brutos se preparan a partir de cepas de S. cerevisiae y se añaden a un sistema de reacción que contiene [1-14C] palmitoil-CoA y alcoholes con cadena específica. Los ensayos de prueba se incuban a 35 0C durante 30 minutos y se detienen por extracción con cloroformo/metanol. Los extractos se separan por TLC.

Los puntos correspondientes a las ceras se desprenden de las placas, y la radioactividad se mide mediante recuento de centelleo.

Los FAEE, se detectan por CG-EM. En resumen, el total de lípidos se extrae primero de las cepas de S. cerevisiae y, después, corren en una placa de TLC. Los puntos correspondientes a los FAEE se desprenden de las placas y se resuelven en cloroformo/metanol que, después, se mide mediante CG-EM.

Las células de levadura modificadas genéticamente descritas de esta manera en la presente descripción pueden incluirse en una composición que comprende, además, componentes adicionales seleccionados de, aunque no de forma limitativa, el grupo que consiste en: tampones; estabilizantes; agentes inhibidores de proteasa; enzimas hidrolíticas, enzimas sacarolíticas; membrana celular y/o compuestos que preservan la pared celular, medios nutricionales apropiados para la célula; y similares.

Para expresar las secuencias heterólogas, las células de levadura se cultivan en un medio suplementado con carbohidrato como la única fuente suministrada externamente. Los compuestos incluidos en este grupo, aunque no de forma limitativa, son glucosa, fructosa, galactosa, xilosa, arabinosa, sacarosa, maltosa, almidón, celulosa y hemicelulosa.

En esta invención en lugar de proporcionar el alcohol en los medios de fermentación como se conoce en la técnica, p. ej., cuando se usa E. coli como fábrica de biodiesel, el solicitante ha desarrollado un microorganismo diseñado por ingeniería genética que puede producir ésteres de cera de manera controlable y económica sin necesidad de suplementación de ácidos grasos o etanol.

En modalidades específicas, la concentración de carbohidratos en el medio de cultivo está entre 20 g/l y 50 g/l. Los componentes adicionales de los medios de cultivo son base de nitrógeno para levadura y CSM-Ura.

En consecuencia, la presente invención se refiere a un sistema de células fúngicas para producir fatty acyl ethyl esters (ésteres etílicos de acilo graso - FAEE), dicho sistema que comprende una célula fúngica, y un vector de expresión que codifica al menos una cera sintasa, en donde el metabolismo de dicha célula fúngica se modifica adicionalmente, dicha modificación que proporciona regulación negativa, atenuación, deleción y/o sobreexpresión de uno o más gen o genes seleccionados del grupo que consiste en genes que codifican una o más enzima o enzimas implicadas en al menos una de las rutas de síntesis de ácidos grasos de dicha célula fúngica, rutas que consumen ácidos grasos y rutas de biosíntesis de carbohidratos, y/o seleccionadas del grupo que consiste en genes que codifican una o más enzima o enzimas que actúan como transportador o transportadores de éster ceroso de dicha célula fúngica. La invención se refiere también a una célula fúngica que es una célula de levadura.

Cuando se hace referencia a la regulación negativa, atenuación, deleción y/o sobreexpresión de uno o más gen o genes, esto significa que el nivel de expresión/traducción/transcripción del gen o del producto génico se ha alterado de alguna manera. La manipulación en la presente descripción podría lograrse mediante suplementación con medio, ingeniería genética o biología sintética. Los genes regulados incluyen genes que podrían traducirse en proteína, así como genes que se transcriben en tipos de ARN que no se traducen en proteína. La regulación génica puede producirse mediante la alteración de la región estructural o de control, la introducción de más número de copias, la desactivación del gen represor correspondiente o la activación del gen inducible, el aumento de la estabilidad del ARN del gen, y combinaciones de los mismos.

Los fatty acid ethyl esters (ésteres etílicos de ácidos grasos - FAEE) son productos de esterificación de etanol y ácidos grasos. El Biodiesel es un tipo de mezcla de ésteres de cera (FAEE). La biosíntesis de FAEE se cataliza por la éster de cera sintasa, denominada también wax synthase (cera sintasa - WS). La longitud de cadena y el grado de insaturación y ramificación del ácido graso pueden variar. Generalmente, este sitio del éster tiene una longitud de al menos 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 o 26 carbonos y puede ser mono-, di- o triinsaturado.

La presente invención proporciona células de levadura modificadas genéticamente que tienen al menos un polinucleótido heterólogo que codifica un polipéptido implicado en una ruta biosintética de FAEE. La presente invención se refiere también a otras células fúngicas modificadas genéticamente, como se ilustra en la presente descripción, que tienen al menos un polinucleótido heterólogo que codifica un polipéptido implicado en una ruta biosintética de FAEE.

Una célula fúngica usada en el contexto de la presente invención puede seleccionarse del grupo de células fúngicas que consisten en Saccharomyces, Saccharomyces cerevisae Hansenula polymorpha, Kluyveromyces, Pichia, Candida albicans, Aspergilli, Rhodotorula rubra, Torulopsis, Trichosporon cutaneum, Trichoderma reesei, Apiofrichum curvafum, Yarrowia lipolytica y Cryptococcus curvatus. Un ejemplo de una célula fúngica que puede usarse es Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-5D (van Dijken, J. P., et al., 2000).

Una modificación del metabolismo de una célula fúngica según la presente invención puede ser genética y llevarse a cabo mediante la introducción de uno o más vector o vectores de expresión exógenos en dicha célula fúngica. En el contexto de la invención, dichos uno o más vector o vectores de expresión exógenos pueden ser un plásmido u otro vehículo, tal como se ilustra en la presente descripción. El vector comprende también un gen estructural para la selección de células transformadas, tales como URA3, HIS3.

En aspectos de la invención, dicha modificación genética de dicha célula fúngica proporciona un suministro aumentado de acilos grasos al metabolismo de dicha célula fúngica. Además, dicha célula fúngica puede modificarse genéticamente para estimular la sobreproducción de ácidos grasos, como se describe además en la presente descripción.

En aspectos de la invención, una modificación a un sistema de células fúngicas como se define en la presente descripción se lleva a cabo con uno cualquiera o más de los siguientes genes, o sus productos de expresión: ACB1 (ACBP, proteína de unión a acil-CoA), ACC1 (Acetil-CoA carboxilasa), FAS1, FAS2 (ácido graso sintasa), gapN (gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa dependiente de NADP+), ACS1 (Acetil-CoA sintetasa), DGA1 (Acil-CoA:diacilglicerol aciltransferasa), LRO1 (Lecitina: colesterol aciltransferasa), ARE1, ARE2 (Acil-CoA:esterol aciltransferasa) y POX1 (acil-CoA oxidasa peroxisómica).

En otros aspectos, opcionalmente en combinación con otras modificaciones, dicha modificación a dicha célula fúngica se realiza mediante una inactivación/deleción de uno o más de los genes DGA1, LRO1, ARE1, ARE2 y POX1.

Según la invención, una modificación a una célula fúngica, como se describe en la presente descripción, puede realizarse también mediante la sobreexpresión de uno o más producto o productos génicos mediante la introducción de uno o más vector o vectores de expresión que codifican dicho uno o más producto o productos génicos, seleccionándose dichos uno o más producto o productos génicos del grupo que consiste en: proteína de unión a acil-CoA, Acetil-CoA carboxilasa (ACC1), gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa dependiente de NADP+, ácido graso sintasas (FAS1, FAS2) y acetil-CoA sintetasa (ACS1).

Según la invención, una modificación también puede proporcionar una sobreexpresión de ACC1 en combinación con una expresión aumentada de FAS1 y FAS2. En algunos aspectos de la invención, la modificación de ACC1 se realiza mediante la introducción de un vector de expresión y se realiza una expresión aumentada de FAS1/FAS2 al reemplazar el promotor del mismo (el promotor de FAS1/FAS2). En un aspecto de la invención, el gen ACC1 se modifica en virtud de reemplazarse Ser659Ala y Ser1157Ala de dicho gen ACC1 (Id. de sec. n.° 16).

La invención también proporciona un sistema de células fúngicas como se define en la presente descripción, en donde dicha cera sintasa codificada por dicho vector de expresión es heteróloga. En este contexto, una cera sintasa “heteróloga” se refiere a una cera sintasa que se origina de un organismo distinto al de la célula fúngica usada en el sistema de células fúngicas.

Un sistema de células fúngicas como se define en la presente descripción puede comprender una cera sintasa obtenida de una o más de las especies Mycobacterium, Rhodococcus, Acinetobacter, Mus Musculus y/o Marinobacter. Además, más específicamente, dicha al menos una cera sintasa puede seleccionarse del grupo que consiste en Acinetobacter baylyi ADP1, Marinobacter hydrocarbonoclasticus DSM 8798, Rhodococcus opacus PD630, Mus musculus C57BL/6 y Psychrobacter articus 273-4. Un gen que expresa dicha cera sintasa usada en la presente descripción puede tener codones optimizados y comprender una secuencia de ácido nucleico codificada por una cualquiera de las id. de sec. n.° 1, id. de sec. n. ° 4, id. de sec. n. ° 5, id. de sec. n.° 6 y/o id. de sec. n. ° 7. También se abarcan por la presente invención las secuencias de ácido nucleico que tienen al menos el 80 % de identidad con la secuencia presentada, tal como aproximadamente al menos el 80, 82, 85, 87, 90, 92, 95, 97 o 99 % de identidad con la secuencia presentada. Una secuencia de nucleótidos descrita en la presente descripción puede ser de una especie natural, una versión mutada de una cera sintasa de origen natural o una enzima rediseñada producida obtenida mediante ingeniería de proteínas, las ceras sintasas que se mutan o se rediseñan aún manteniendo su actividad cuando se expresan.

La presente invención se refiere también a una cera sintasa que tiene al menos el 80 %, tal como al menos el 80, 82, 85, 87, 90, 92, 95, 97 o 99 % en identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos que corresponde a cualquiera de las cera sintasas presentadas en la presente descripción.

Una cera sintasa del sistema de células fúngicas según la presente invención puede codificarse por uno o más de los siguientes vectores de expresión pSP-B1, pSP-B2, pSP-B3, pSP-B4 y/o pSP-B5. Estos vectores de expresión se definen, además, en la presente descripción, p. ej., en la sección experimental, y en la Figura 7. Las secuencias de ácido nucleico de los vectores mencionados anteriormente son id. de sec. n.° 31, id. de sec. n.° 32, id. de sec. n.° 33, id. de sec. n.° 34 e id. de sec. n.° 35. La presente invención se refiere también a los vectores de expresión pSP-B1, pSP-B2, pSP-B3, pSP-B4 y/o pSP-B5, en donde ciertas partes de los mismos se han modificado ligeramente o se han retirado partes, dichos vectores de expresión aún retienen su actividad, así como los vectores de expresión que comprenden cualquiera de las secuencias id. de sec. n.° 30-35.

Según la invención, dicho vector de expresión que codifica dichas una o más cera sintasa o sintasas puede ser un plásmido episómico (plásmidos de copia única) o un plásmido de altas copias. Un plásmido de copia única se define como un plásmido que existe solamente como una o algunas copias en cada huésped. Un plásmido de copias altas es un plásmido que proporcionará una expresión más prolongada en el huésped, ya que estará presente en más copias que el plásmido de copia única.

En el contexto de la presente invención, dicho vector de expresión que codifica dicha cera sintasa puede proporcionar la integración cromosómica en el cromosoma de dicha célula fúngica. Tal evento se ilustra además en las Figuras 9 y 10 y en la sección experimental (Example7).

A un sistema de células fúngicas según se define en la presente memoria, pueden suministrarse carbohidratos como un sustrato externo a dicho sistema de células fúngicas para la producción de FAEE. Dichos carbohidratos pueden seleccionarse del grupo que consiste en glucosa, fructosa, galactosa, xilosa, arabinosa, sacarosa, maltosa, almidón, celulosa y hemicelulosa.

En algunos aspectos de la invención, de forma adicional cualquiera de o ambos de los genes Eht1 p y Eeb1 p de dicha célula fúngica, se sobreexpresan por dicha célula fúngica. Se mostró que Eht1p y Eeb1p tienen actividad sintética y de degradación de éster etílico de ácido graso de cadena media (que incluye hexanoato de etilo) (Lilly, M., F. Bauer, M. Lambrechts, J. Swiegers, D. Cozzolino, e I. Pretorius. 2006. The effect of increased yeast alcohol acetyltransferase and esterase activity on the flavour profiles of wine and distillates. Yeast 23:641-659.). Eht1 prefería sustratos de cadena corta (la producción más alta fue butanoato de etilo), mientras que Eeb1 prefería sustratos de cadena más larga (la producción más alta fue octanoato de etilo) (Saerens, S., K. Verstrepen, S. Van Laere, A. Voet, P. Van Dijck, F. Delvaux, y J. Thevelein. 2006. The Saccharomyces cerevisiae EHT1 and EEB1 genes encode novel enzymes with medium-chain fatty acid ethyl ester synthesis and hydrolysis capacity. Journal of Biological Chemistry 281:4446.).

La presente invención también se refiere al uso de un éster de acilo graso, tal como un fatty acyl ethyl ester (éster etílico de acilo graso - FAEE), producido por un sistema de células fúngicas como se define en la presente descripción como un componente en un biocombustible, tal como biodiesel, un lubricante, cosmético, linóleo, tinta de impresión y/o un éster de cera sólida usado para velas y/o productos limpiadores.

La presente invención se refiere también a una composición que comprende un sistema de células fúngicas como se define en la presente descripción, dicha composición que comprende, además, al menos un componente adicional seleccionado del grupo que consiste en tampones; estabilizantes; agentes inhibidores de proteasa; enzimas hidrolíticas, enzimas sacarolíticas; membrana celular y/o compuestos que preservan la pared celular, medios nutricionales apropiados para la célula; y similares.

La presente invención se refiere también a un método para producir fatty acyl ethyl esters (ésteres etílicos de acilo graso - FAEE), dicho método que comprende:

a) proporcionar un sistema de células fúngicas como se define en la presente invención en un caldo de cultivo,

b) añadir una o más fuentes de carbohidratos como un sustrato externo a dicho sistema de células fúngicas;

c) y en donde dichos FAEE se recuperan después de eso por extracción de dicho caldo de cultivo.

Dichos carbohidratos pueden seleccionarse del grupo que consiste en: glucosa, fructosa, galactosa, xilosa, arabinosa, sacarosa, maltosa, almidón, celulosa y hemicelulosa. Teniendo en cuenta la importancia del desarrollo de procesos de segunda generación basados en biomasa, será una ventaja prometedora cómo pueden producirse los biocombustibles a partir de xilosa, celulosa y hemicelulosa, que la levadura no consume de forma natural.

La invención también se refiere a una composición que comprende una célula fúngica cuyo metabolismo se modifica y, de esta manera, posee un mayor flujo hacia la biosíntesis de ácidos grasos; y uno o más vectores de expresión que codifican una o más cera sintasa o sintasas. Una célula fúngica tal puede ser cualquier célula fúngica como se describe en la presente descripción, es decir, Saccharomyces, Saccharomyces cerevisae Hansenula polymorpha, Kluyveromyces, Pichia, Candida albicans, Aspergilli, Rhodotorula rubra, Torulopsis, Trichosporon cutaneum, Trichoderma reesei, Apiofrichum curvafum, Yarrowia lipolytica y Cryptococcus curvatus. Además, dicha cera sintasa en dicha composición puede seleccionarse de Mycobacterium, Rhodococcus, Acinetobacter, Mus Musculus y/o Marinobacter. Una modificación de una célula fúngica de este tipo puede realizarse de cualquier manera ilustrada en la presente descripción, tal como por regulación negativa, atenuación, deleción y/o sobreexpresión de uno o más gen o genes seleccionados del grupo que consiste en genes que codifican una o más enzima o enzimas implicadas en al menos una de las rutas de síntesis de ácidos grasos de la célula fúngica, rutas que consumen ácidos grasos y rutas de biosíntesis de carbohidratos, y/o seleccionadas del grupo que consiste en genes que codifican una o más enzima o enzimas que actúan como transportador o transportadores de éster de cera Una célula fúngica tal puede usarse para producir ésteres de biocombustible, tales como biodiesel, lubricantes, cosméticos, linóleo y tintas de impresión y/o las ceras sólidas usadas para velas y productos limpiadores.

La presente invención se refiere también a una célula de levadura que tiene un flujo metabólico aumentado hacia la biosíntesis de ésteres de ácidos grasos, dicha célula de levadura que expresa al menos una cera sintasa seleccionada del grupo que consiste en Acinetobacter baylyi ADP1, Marinobacter hydrocarbonoclasticus DSM 8798, Rhodococcus opacus PD630, Mus musculus C57BL/6 y Psychrobacter articus 273-4 en combinación con la sobreexpresión de la proteína ACBP (proteína de unión a acil-CoA). Dicha célula de levadura puede ser, por ejemplo, Saccharomyces cerevisae.

Modalidades preferidas

En una modalidad preferida, la invención describe un método para aumentar la producción de ácidos grasos en células de levadura por medio de la sobreexpresión de ACBP.

Saccharomyces cerevisae es el huésped preferido para llevar a cabo la invención, ya que es un huésped popular en la investigación básica y aplicada aparte de ser un buen productor de etanol, un precursor de ésteres y específicamente de ésteres etílicos de ácidos grasos. Sin embargo, como se mencionó anteriormente en la presente descripción, otras células fúngicas que permiten la presente invención se seleccionan del grupo que consiste en otras especies de Saccharomyces, así como otros hongos tales como, aunque no de forma limitativa, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces, Pichia, Candida albicans, Aspergilli, Rhodotorula rubra, Torulopsis, Trichosporon cutaneum, Trichoderma reesei, Apiofrichum curvafum, Yarrowia lipolytica, Cryptococcus curvatus.

En S. cerevisae, los ácidos grasos actúan como un inhibidor de retroalimentación de la acetil CoA carboxilasa y, además, como un inhibidor de la oxidación de ácidos grasos en respuesta a una mayor disponibilidad de ácidos grasos. Por otra parte, sabemos que las propiedades reguladoras de los ácidos grasos están mediadas a través de su activación a Acil CoA. Esto significa que en S. cerevisiae, la biosíntesis de ácidos grasos se inhibe por su producto, la acil-CoA.

La Acyl CoA binding protein (proteína de unión a acil CoA - ACBP) puede atenuar el efecto inhibidor de Acil CoA al unir ésteres acil-CoA de cadena larga y media con afinidad muy alta. Debido a la alta afinidad de ACBP por Acil CoA, se predice que la concentración intracelular de Acil CoA libre es muy baja. Se ha demostrado que la sobreexpresión de Acb1p y ACBP bovino en S. cerevisiae aumentó el tamaño total de la agrupación de acil-CoA. Los inventores en la presente descripción han desarrollado una célula de levadura en la cual ACBP (proteína de unión a acil CoA) se sobreexpresa para regular negativamente la actividad de las enzimas implicadas en el metabolismo de lípidos y, en este caso específico, para desregular la acetil-CoA carboxilasa. La expresión aumentada de ACBP se traduce en niveles bajos de acil CoA libre y más disponibilidad de ácidos grasos.

Como se explicó anteriormente, la presente invención adoptó un plásmido derivado de pESC como el vector de expresión. El plásmido pSP-GM2 que se muestra en la Figura 4 puede expresar dos genes simultáneamente. En esta modificación específica, Acb1 se liga también al plásmido pSP-GM2 y bajo el control del promotor PGK1 (S. Partow et al., 2010).

La sobreexpresión de ACBP como se usa en la presente descripción significa alterar la velocidad de transcripción, postranscripción o traducción del gen que codifica la proteína en comparación con las mismas velocidades en la célula de levadura sin modificación.

Los métodos de prueba para la sobreexpresión son muy conocidos en la técnica, por ejemplo, los niveles de ARN transcrito pueden evaluarse con el uso de rtPCR y los niveles de proteínas pueden evaluarse con el uso de análisis en gel SDS page.

En una modalidad preferida adicional, la invención describe un sistema y un método en el cual se obtiene un aumento adicional en la producción de ácidos grasos mediante regulación negativa, atenuación, deleción o sobreexpresión de genes adicionales que codifican enzimas implicadas en la ruta de síntesis de ácidos grasos, rutas de consumo de ácidos grasos, rutas de biosíntesis de carbohidratos o enzimas que actúan como transportadores de éster de cera o una combinación de los mismos. Con respecto a esto, la célula de levadura modificada genéticamente de la presente invención puede incluir otras modificaciones además de una ACBP sobreexpresada, pero debe contener preferentemente genes que codifiquen una combinación de diferentes cera sintasas con alta especificidad por alcoholes de cadena corta.

Básicamente, las modificaciones genéticas pueden aumentar el nivel de enzimas implicadas en las diferentes rutas biosintéticas, reducir la inhibición de realimentación en diferentes ubicaciones en las rutas biosintéticas, afectar la disponibilidad de sustratos y cofactores diferentes usados en dichas rutas, afectar la expresión de genes que codifican esas enzimas, etc.

Los polipéptidos según la invención pueden purificarse y aislarse mediante métodos conocidos en la técnica. Particularmente, habiendo identificado la secuencia génica, es posible usar técnicas recombinantes para expresar los genes en el huésped adecuado seleccionado.

Sección experimental

Ejemplo 1

Construcción del huésped de producción de biodiesel Saccharomyces cerevisiae CB1

En este experimento, la éster de cera sintasa de A. bayiyi ADP1 se expresó en una cepa de laboratorio Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-5D (MAT-alfa ura3-52 HIS3 LEU2 TRP1 MAL2-8c SUC2) para crear el productor de biodiesel, Saccharomyces cerevisiae CB1.

En resumen, todas las manipulaciones de ADN y clonación se llevaron a cabo en E. coli DH5a y se realizaron por procedimientos convencionales (Sambrook y Russell 2001). La secuencia del gen atfA con la cera sintasa informada a partir de Acinetobacter bayiyi ADP1 se optimizó para la expresión en un huésped de levadura. La secuencia optimizada se da como la id. de sec. n.° 1, que se basó en la secuencia génica publicada (núm. de registro de Gene Bank AF529086). Se sintetizó y se proporcionó por la DNA2.0 Company (Menlo Park, Calif.). La id. de sec. n.° 1 se amplificó mediante el uso de los siguientes oligonucleótidos:

5'-CGGGATCCCGCTCGAGATGCGTCCATT-3' (id. de sec. n.° 2) que introduce el sitio de restricción BamHI (subrayado) y;

5'-GGGGTACCCCAAGCTTGGGTTAGTTTGCAG-3' (id. de sec. n.° 3) que introduce el sitio de restricción Hindlll (subrayado). La secuencia de ADN digerida con BamHI/ Hindlll se ligó en el vector pSP-GM2 (Figura. 4) y bajo el control del promotor TEF1 expresado constitutivamente, que dio el plásmido pSP-B1 (Figura 7A). Las secuencias clonadas se verificaron por secuenciación. Los plásmidos pSP-GM2 y pSP-B1 se transformaron en S. cerevisiae CEN.PK113-5D. Las cepas resultantes se denominaron S. cerevisiae CBO y S. cerevisiae CB1, respectivamente. Se usó medio synthetic minimal dropout (sintético mínimo de eliminación - SD) sin uracilo para seleccionar los transformantes.

Ejemplo 2

Características de la célula huésped recombinante

Los transformantes inoculados de S. cerevisiae CB0 y S. cerevisiae CB1 se cultivaron hasta el periodo de crecimiento exponencial tardío en 100 ml de medio SD sin uracilo y que contenía glucosa al 2 % (p/v) a 30 0C. Después, los cultivos se cosecharon. Los extractos libres de células se prepararon mediante el uso de un método de preparación rápida informado previamente para el análisis enzimático (Hou, Vemuri et al. 2009). El análisis lipídico se extrajo a partir de los sedimentos celulares liofilizados mediante el uso del método informado (Gu, Valianpour et al. 2004).

Las actividades de la cera sintasa en los transformantes se testificaron in vitro mediante el uso de [1-14C] palmitoil-CoA y 1-hexadecanol o etanol como los sustratos. La Tabla 1 resume los resultados del análisis enzimático. Una baja actividad de la cera sintasa podría detectarse en el control negativo de S. cerevisiae CB0 usando 1-hexadecanol o etanol como los sustratos. Por el contrario, se detectó una actividad de cera sintasa significativamente alta en S. cerevisiae CB1.

La extracción de lípidos se analizó con cromatografía de gases/ Espectroscopía de masas (CG/EM). No se detectaron FAEE en el control negativo de S. cerevisiae CB0 incluso cuando el medio cultivado se suplementó con ácidos grasos libres al 0,1 % (p/v), ácido heptadecanoico. En contraste, S. cerevisiae CB1 podría producir FAEE con un título de 5,0 mg/l. El éster etílico del ácido heptadecanoico fue producido por S. cerevisiae CB1 cuando el medio cultivado se suplementó con ácidos grasos libres al 0,1 % (p/v), ácido heptadecanoico (C17), que no sintetizó por la propia levadura. Tomando el éster etílico del ácido heptadecanoico como un ejemplo para los resultados de CG/EM, se eluyó a aproximadamente 15,6 min y se observó claramente el espectro de masas de los iones principales de m/z 298 (Figura 5). Además, las exploraciones hijas de iones recibieron confirmación estructural de m/z 298 (Figura 5). Los espectros son los mismos que en el éster etílico de ácido heptadecanoico convencional (Figura 6).

Tabla 1. Actividades WS en extractos brutos de diferentes S. cerevisiae recombinantes

aLos datos son valores medios de dos experimentos independientes ± SD.

Ejemplo 3

Evaluación de la preferencia de sustrato de diferentes WS en levadura

Tabla 2. Oligonucleótidos específicos usados para la amplificación por PCR de las secuencias WS sintetizadas

Secuencia del cebador 5'— 3^'

Hacia arriba Hacia abajo

WS de CGGGATCCCGCTC GGGGT ACCCCAAGCTTGGGTT ACTT

Marinobacter GAGAT GAAGAGATT TCTAGTACG

hydrocarbonoc AGG (Id. de sec. n.° 9)

lasticus DSM 8798 (Id. de sec. n.° 8)

WS de CGGGATCCCGCTC GGGGT ACCCCAAGCTTGGGTT AGCT

Rhodococcus GAGTT GACCGACG AGCCACCACC

opacus PD630 TGATTAC (Id. de sec. n.° 11)

(Id. de sec. n.° 10)

WS de Mus CGGGATCCCGCTC GGGGT ACCCCAAGCTTGGGTT AAAC

musculus GAGATGTTCTGGCC AATGACCAAC

C57BL/6 AACC (Id. de sec. n.° 13)

(Id. de sec. n.° 12)

WS de CGGGATCCCGCTC GGGGT ACCCCAAGCTTGGGTT AAG

Psychrobacter GAGAT GAGATT ACT GGGCCAACT

articus 273-4 GACCGCTGT (Id. de sec. n.° 15)

(Id. de sec. n.° 14)

En este ejemplo, excepto para la cera sintasa de Acinetobacter baylyi ADP1, se optimizaron otras cuatro WS putativas de Marinobacter hydrocarbonoclasticus DSM 8798, Rhodococcus opacus PD630, Mus musculus C57BL/6 y Psychrobacter articus 273-4 para la expresión en un huésped de levadura. Las secuencias optimizadas pueden verse en id. de sec. n.° 4, id. de sec. n.° 5, id. de sec. n.° 6 e id. de sec. n.° 7. Después se sintetizaron por la DNA2.0 Company (Menlo Park, Calif.). Estas secuencias sintetizadas se amplificaron por PCR mediante el uso de oligonucleótidos específicos que introducen sitios de restricción BamHI e Hindlll (Tabla 2 anterior). Las secuencias de ADN digeridas con BamHI/Hindlll se ligaron en pSP-GM2 (Figura. 4), respectivamente, y bajo el control del promotor TEF1 expresado constitutivamente, que dio como resultado los plásmidos pSP-B2, pSP-B3, pSP-B4 y pSP-B5 (Figura. 7B, 7C, 7D, 7E). Las secuencias clonadas se verificaron por secuenciación. Los plásmidos pSP-B2, pSP-B3, pSP-B4 y pSP-B5 se transformaron en S. ^{cerevisiae CEN.PK113-5D para construir S. cerevisiae c}B2, ^CB3, CB4 y CB5, respectivamente. Se usó medio synthetic minimal dropout (sintético mínimo de eliminación - SD) sin uracilo para seleccionar los transformantes.

Los extractos libres de células de S. cerevisiae CB1, CB2, CB3, CB4 y CB5 recombinantes construidos se prepararon como el método descrito en el Ejemplo 2. Las actividades de la cera sintasa en los transformantes se testificaron in vitro usando alcoholes con diversas longitudes de cadena como sustratos. La Tabla 3 resume los resultados del análisis enzimático.

Los perfiles de sustrato de la Tabla 3 muestran que CB2 y CB5 catalizaron etanol con una actividad superior, lo que podría reducir la formación de subproductos e impulsar el flujo de carbono hacia los ésteres etílicos objetivo. En realidad, CB2 y CB5 podrían producir FAEE con un rendimiento de 6,3 mg/l y 2,3 mg/l, que son claramente superiores a otras levaduras que expresan cera sintasa. Además, CB2 catalizó alcohol cetílico (1-Hexadecanol) con una actividad superior, que es la elección para construir la levadura productora de esperma de ballena. Nuestros descubrimientos muestran claramente que las preferencias del sustrato de las diferentes WS son las instrucciones para producir ciertos ésteres de cera.

Tabla 3. Especificidades de aceptor de acilo con diferentes alcoholes en extractos brutos de diferentes S. cerevisiae recombinantes

Actividad de cera sintasaa (pmol [mg de extracto celular min-1])

Aceptor de acilo CB1 CB2 CB3 CB4 CB5

Etanol 4,6 ± 0,55 8,1 ± 1,87 2.7 ± 0,37 3,8 ± 0,51 5,9 ± 0,83 Butanol 10,8 ± 1,60 14,6 ± 1,75 6.8 ± 0,82 3.5 ± 0,53 4,2 ± 0,46 1-Hexanol 17,3 ± 2,04 33,8± 3,77 16,1 ± 2,29 10.2 ± 1,59 18.7 ± 2,19 1 -Octanol 23.0 ± 2,39 45,7± 4,51 32,3± 3,84 22.3 ± 2,44 17.7 ± 1,67 1-Decanol 19,7 ± 3,11 41,1± 4,13 37,3± 3,90 33.5 ± 2,22 27.5 ± 2,50 1-Dodecanol 31,8± 3,48 48,4± 4,56 36,7± 3,78 44,2 ± 3,07 42.8 ± 3,11 1-Tetradecanol 45.0 ± 4,72 49,7± 4,38 33,5± 3,66 35,1 ± 2,87 36.5 ± 3,03 1-Hexadecanol 41,6 ± 2,21 49,0 ± 3,65 28,9 ± 3,29 35,5 ± 2,91 39,1 ± 2,72 aLos datos son valores medios de dos experimentos independientes ± SD.

Ejemplo 4

Estrategia de diseño por ingeniería genética metabólica para aumentar la biosíntesis-expresión de ácidos grasos de gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa dependiente de NADP+ heteróloga En esta invención, suministrar más NADPH se toma como un ejemplo para ilustrar la estrategia de diseño por ingeniería genética metabólica para aumentar la biosíntesis de ácidos grasos. Para obtener más NADPH, se usa la expresión heteróloga de gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa dependiente de NADP+ (gapN, de Streptococcus mutans). La reacción heteróloga se enumera en la Figura 8.

La secuencia de gapN (de Streptococcus mutans) se optimizó para la expresión en un huésped de levadura (id. de sec. n.° 17) y se sintetizó por la DNA2.0 Company (Menlo Park, Calif.). La secuencia sintetizada se amplificó por PCR mediante el uso de oligonucleótidos específicos: 5'-AAAcAa GCGGCCGCACTAGTTTGACAAAAC-31 (id. de sec. n.° 18) que introduce el sitio de restricción Notl (subrayado) y 5'-TT AATT AAGAGCTCAGÁT CTTT ATTT GAT AT CAA-31 (id. de sec. n.° 19) que introduce el sitio de restricción Sacl (subrayado). Las secuencias de ADN digeridas con Notl/Sacl se ligaron en pSP-GM2 y se transformaron en la cepa huésped de S. cerevisiae.

Ejemplo 5

Resumen de modificaciones útiles para producir levadura con suministro aumentado de FA para producir ésteres de cera

Tabla 4. es un resumen de modificaciones para construir células de levadura diseñadas por ingeniería genética que pueden biosintetizar eficientemente FA para producir ésteres cerosos. Las modificaciones pueden combinarse entre sí.

Ejemplo 6

Fermentación

Después de combinar las estrategias de diseño por ingeniería genética mencionadas anteriormente, la levadura huésped diseñada por ingeniería genética mantiene la capacidad con un flujo aumentado hacia la biosíntesis de FA. Después de la expresión combinada de la cera sintasa, produce éster de cera sin necesidad de la adición de ácidos grasos exógenos al cultivo. En dicho ejemplo, la cera sintasa diseñada por ingeniería genética que expresa S. cerevisiae con un flujo aumentado hacia la biosíntesis de FA permite una producción de alto nivel de biodiesel (FAEE) a partir del único sustrato suministrado externamente, los carbohidratos. Para la producción de biodiesel a gran escala, la S. cerevisiae diseñada por ingeniería genética se cultiva en un fermentador de 5 l. La glucosa se suministra continuamente en el medio, en el cual se mantiene una relación alta de C/N. Mientras tanto, se superpuso dodecano (10 %, v/v) al medio para evitar potencialmente la evaporación de FAEE y facilitar la captura del producto in-situ.

Ejemplo 7

Construcción de plásmidos para evaluación de cinco ásteres de cera sintasas en la producción de FAEE:

En resumen, todas las manipulaciones de ADN y clonación se llevaron a cabo en E. coli DH5a y se realizaron por procedimientos convencionales (Sambrook y Russell 2001). Las cinco secuencias de la cera sintasa de diferentes especies se optimizaron para la expresión en un huésped de levaduras. Después se sintetizaron y se proporcionaron por la DNA2.0 Company (Menlo Park, Calif.). Estas cinco secuencias diferentes se amplificaron mediante el uso de cebadores de oligonucleótidos, respectivamente (Tabla 2). Las cinco secuencias de ADN digeridas con BamHI/Hindlll se ligaron, respectivamente, en el vector pSP-GM2 y bajo el control del promotor TEF1 expresado constitutivamente, que dio cinco plásmidos diferentes. Estos plásmidos se transformaron en Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-5D (MAT-alfa ura3-52 HIS3 LEU2 TRP1 MAL2-8c SUC2) para crear cinco productores de biodiesel. El método para la transformación de levadura es el método convencional LiAc/SS Vehículo ADN/PEG (Xiao 2006). Se usó medio synthetic minimal dropout (sintético mínimo de eliminación - SD) sin uracilo para seleccionar los transformantes.

Deleción de genes:

Como se muestra en la Figura 9, los cinco genes (DGA1, LRO1, ARE1, ARE2, POX1) se eliminaron posteriormente en Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-5D usando el método de lazo cerrado con ayuda del casete loxP-KanMX-loxP (Xiao 2006).

Descripción general y método para la integración cromosómica

Se sugiere que la cera sintasa de Marinobacter hydrocarbonoclasticus DSM 8798 tiene la actividad más alta para la producción de biodiesel y se elige como la enzima de trabajo. En las cepas de deleción, los genes relacionados se introdujeron y se construyeron las siguientes cepas. La capacidad de producción de biodiesel se muestra en la Figura 10 y los genotipos de las cepas se enumeran en la Tabla 5. Las ACC1 sobreexpresadas liberaron sus sitios de fosforilación (Ser659Ala y Ser1157Ala), como se muestra en la id. de sec. n.° 16.

Tabla 5. Lista de cepas y sus genotipos.

Ejemplo 8

Aunque se han usado métodos basados en plásmidos para la producción de biodiesel, el plásmido no es genéticamente estable, lo que contribuyó a la pérdida de productividad. En este trabajo, revelamos un método libre de plásmidos con estabilidad genética alta y expresión de copia génica alta para la producción de biodiesel. Como se muestra en la Figura 11, la cera sintasa y el gen neo bacteriano (Neo, gen de resistencia G418) se fusionaron entre sí y se integraron en la secuencia delta del cromosoma mediante transformación de levadura. Las copias de la secuencia delta se producen en múltiples lugares a lo largo del genoma de la levadura y, bajo la selección de concentración creciente de G418, pueden generarse clones con múltiples copias del gen insertado. Finalmente, la inactivación génica de RAD52 estabiliza el número de

genética no requiere marcadores de selección y no se ve afectada por las inestabilidades del plásmido.

La WS (cera sintasa) de Marinobacter hydrocarbonoclasticus DSM 8798 se evaluó bajo el control de dos promotores fuertes diferentes, TEF1 y PGK1. Amplificada por el cebador 1 y el cebador 2 (Tabla 6), la secuencia WS digerida con BamHI/ Hindlll se ligó en el vector pSP-GM2 y bajo el control del promotor TEF1 expresado constitutivamente, lo que dio el plásmido pSP-B2. Con el uso del plásmido pSP-B2 como la plantilla, la secuencia WS con el promotor TEF1 y el terminador CYC1 podría amplificarse con el cebador 3 y el cebador 4. El gen neo se amplificó a partir del plásmido pJEF1105 (Wang, Wang et al. 1996) con el cebador 5 y el cebador 6. Como se muestra en la Figura 11, el extremo 5' del cebador 3 y el cebador 6 son homólogos a la secuencia delta, lo que facilitaría la integración; el extremo 5' del cebador 4 es homólogo al gen neo y el extremo 5' del cebador 5 es homólogo al terminador CYC1, lo que facilitaría la fusión de secuencias. Las dos secuencias de ADN, WS controlada por TEF1 (producto 1 de PCR, Figura 11) y gen neo (producto 2 de PCR, Figura 11), podrían fusionarse entre sí en uno por amplificación de PCR tomada de estas dos secuencias como plantilla y el cebador 3 y 6 como los cebadores de PCR. El fragmento de ADN fusionado (producto 3 de PCR, Figura 11) se transforma en levadura y se selecciona en las placas con concentración de G418. Similarmente, el fragmento de ADN que contenía WS controlada por PGK1 y el gen neo también se construyó y se integró en la levadura.

Como se muestra en la Figura 12, los resultados iniciales sugieren que WS controlada por PGK1 tiene una productividad superior y se elige como la elección para la selección de las placas con una concentración creciente de G418. Las colonias seleccionadas de la placa con concentración superior de G418 deben contener un número de copias superior de WS y contribuir a una producción superior de biodiesel. La Figura 13 muestra la relación de la concentración de producción de biodiesel y la concentración de G418. El rendimiento aumentó notablemente a medida que se usó más G418 en la evolución cromosómica hasta que el rendimiento dejó de aumentar cuando el suministro de precursores limitó la función de la cera sintasa. La integración cromosómica construyó una ruta estable y la producción es comparable o superior a las alcanzables con el uso de plásmidos de múltiples copias. Tabla 6: lista de cebadores

Análisis:

Los transformantes inoculados de S. cerevisiae se cultivaron hasta el periodo de crecimiento exponencial tardío en 100 ml de medio SD sin uracilo y que contenía glucosa al 2 % (p/v) a 30 0C. Después, los cultivos se cosecharon. Los extractos libres de células se prepararon mediante el uso de un método de preparación rápida informado previamente para el análisis enzimático (Hou, Vemuri et al. 2009). Las actividades de la cera sintasa en los transformantes se testificaron in vitro mediante el uso de [1-14C] palmitoil-CoA y 1-hexadecanol o etanol como los sustratos (Kalscheuer, Luftmann et al. 2004). La actividad de ACCasa (Acetil-CoA carboxilasa) se midió en una campana de extracción como la incorporación de radioactividad de NaHuCOa en un producto estable en medio ácido, como se describe anteriormente (Diacovich, Peir et al. 2002). Los lípidos totales se extrajeron a partir de los sedimentos celulares liofilizados mediante el uso del método informado (Gu, Valianpour et al. 2004). Los FAEE putativos en el total de lípidos se purificaron por TLC preparativa y se detectaron por CG-EM (Kalscheuer, Luftmann et al. 2004).

Referencias

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Claims (7)

1. REIVINDICACIONES

   i . Una célula de Saccharomyces cerevisiae para sobreproducir ácidos grasos, comprendiendo dicha célula de S. cerevisiae un gen de acetil-CoA carboxilasa, caracterizado por que

   dicho gen de acetil-CoA carboxilasa es un gen de acetil-CoA carboxilasa mutado que codifica una acetil-CoA carboxilasa mutada, en la cual la serina en la posición 659 en la Id. de sec. n.° 16 se ha reemplazado por alanina y la serina en la posición 1157 en la id. de sec. n.° 16 se ha reemplazado por alanina; y

   dicho gen de acetil-CoA carboxilasa está bajo el control de un promotor expresado constitutivamente.
2. 2. La célula de S. cerevisiae según la reivindicación 1, caracterizada por un vector de expresión que comprende dicho gen de acetil-CoA carboxilasa mutado.
3. 3. La célula de S. cerevisiae según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, caracterizada por:

   sobreexpresión de ACB1 (ACBP, proteína de unión a acil-CoA);

   sobreexpresión de FAS1 (ácido graso sintasa);

   sobreexpresión de FAS2 (ácido graso sintasa);

   expresión heteróloga de gapN (gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa dependiente de NADP+); y/o

   sobreexpresión de ACS1 (acetil-CoA sintetasa).
4. 4. La S. cerevisiae según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada por una o más deleción de genes seleccionados del grupo que consiste en:

   DGA1 (acil-CoA:diacilglicerol aciltransferasa);

   LRO1 (lecitina:colesterol aciltransferasa);

   ARE1 (acil-CoA:esterol aciltransferasa);

   ARE2 (acil-CoA:esterol aciltransferasa); y

   POX1 (acil-CoA oxidasa peroxisómica).
5. 5. La célula de S. cerevisiae según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada por un gen que codifica una éster de cera sintasa.
6. 6. La célula de S. cerevisiae según la reivindicación 5, caracterizada por que dicho éster de cera sintasa se selecciona del grupo que consiste en Acinetobacter baylyi ADP1, Marinobacter hydrocarbonoclasticus DSM 8798, Rhodococcus opacus PD630, Mus musculus C57BU6 y Psychrobacter articus 273-4.
7. 7. La célula de S. cerevisiae según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada por que dicha célula de S. cerevisiae usa carbohidratos suministrados como un sustrato externo, en donde dichos carbohidratos se seleccionan del grupo que consiste en glucosa, fructosa, galactosa, xilosa, arabinosa, sacarosa, maltosa, almidón, celulosa, y hemicelulosa.