CN110651047B - 用于在酵母中生产植物大麻素和植物大麻素类似物的方法和细胞系 - Google Patents
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Abstract
用于在酵母中生产植物大麻素和植物大麻素类似物的方法和细胞系。该方法应用，以及该细胞系包括，用聚酮化合物合成酶CDS和胞质异戊烯基转移酶CDS转化的酵母细胞。聚酮化合物合成酶催化橄榄醇或甲基橄榄醇的合成，并且可包括大麻橄榄醇酸合成酶或盘基网柄菌聚酮化合物合成酶(“DiPKS”)。可修饰酵母细胞，以包括磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶，用于增加DiPKS的活性。可修饰酵母细胞，以减轻线粒体乙醛分解代谢，用于增加合成橄榄醇或甲基橄榄醇可用的丙二酰基辅酶A。异戊烯基转移酶催化大麻萜酚或大麻萜酚类似物的合成，并且可包括来自链霉菌属CL190的αββα胞质异戊烯基转移酶。可修饰酵母细胞，以减轻焦磷酸香叶酯的消耗，用于增加用于异戊烯化可用的焦磷酸香叶酯。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求于2017年2月17日提交的名称为用于在酵母中生产植物大麻素的方法和细胞系的美国临时专利申请号62/460,526的优先权的权益，该申请在此通过引用以其整体并入。
技术领域
本公开大体上涉及在酵母中生产植物大麻素和植物大麻素的类似物。
背景技术
植物大麻素是在大麻(Cannabis sativa)、其他植物和一些真菌中天然生产的。已知超过105种植物大麻素在大麻中生物合成，或由在大麻中生物合成的植物大麻素的热分解或其他分解得到。虽然大麻植物也是谷物、纤维和其他材料的有价值来源，但是种植用于生产植物大麻素的大麻，特别室内种植，耗费能量和劳动。来自大麻植物的植物大麻素的随后的提取、纯化和分馏也是劳动和能量密集型的。
植物大麻素是有助于大麻的医学和精神治疗作用的药理活性分子。大麻植物中植物大麻素的生物合成与其他农业项目规模类似。与其他农业项目一样，通过种植大麻大规模生产植物大麻素需要各种投入(例如营养物、光、害虫控制、CO2等)。必须提供培育大麻所需的投入。此外，在允许的情况下，在从该植物制备的产品用于商业用途的情况下，大麻的培育目前受到严格的管制、税收和严格的质量控制，进一步增加了成本。植物大麻素类似物是与植物大麻素结构相似的药理活性分子。植物大麻素类似物通常是化学合成的，这可能是劳动密集型的和昂贵的。因此，在强健且可扩展的可发酵生物体中生产植物大麻素和植物大麻素类似物可为经济的。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是已经用于生产工业规模的类似分子的可发酵生物体的例子。
种植用于生产天然存在的植物大麻素的大麻所涉及的时间、能量和劳动提供了制备用于在酵母中生产植物大麻素的转基因细胞系的动机。这种努力的一个例子提供在Poulos和Farnia的美国专利申请公开号US2016/0010126中。
发明内容
本公开的目的是消除或减轻之前在酵母中生产植物大麻素的方法和之前生产植物大麻素类似物的方法的至少一个缺点。在大麻中发现的105种植物大麻素的许多种可在酵母中合成，并且可期望提高基于酵母的生产。类似地，可期望允许生产植物大麻素类似物而无需劳动密集型的合成的方法。
本文提供的方法和细胞系可应用并包括已经用编码来自天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)(“CL190”)的NphB异戊烯基转移酶(“AltPT”)的基因转化的转基因酿酒酵母。AltPT是αββα(“ABBA”)型异戊烯基转移酶。AltPT催化由橄榄醇酸和焦磷酸香叶酯(“GPP”)合成大麻萜酚酸(“CBGa”)。AltPT还催化由橄榄醇和GPP合成大麻萜酚(“CBG”)。在大麻中，异戊烯基转移酶催化由橄榄醇酸和GPP合成CBGa。大麻异戊烯基转移酶是膜结合的，使得在酿酒酵母中的表达复杂。相反，AltPT是胞质的并且在酿酒酵母中以比大麻异戊烯基转移酶更高的水平表达。当在酿酒酵母中表达以催化由橄榄醇酸和GPP合成CBGa或由橄榄醇和GPP合成CBG时，AltPT可提供优于膜结合的大麻异戊烯基转移酶的优势。酿酒酵母可在Erg20、Maf1或UPC2，或支持耗尽GPP的代谢途径的酶或其他蛋白质的其他基因中具有一个或多个突变，该一个或多个突变用于增加可用的GPP。可选地，可应用其他种类的酵母，包括解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、红冬孢酵母(Rhodosporidiumtoruloides)、弯曲隐球菌(Cryptococcus curvatus)、普鲁兰丝孢酵母(Trichosporonpullulan)和产油油脂酵母(Lipomyces lipoferetc)。
在本文提供的一些方法和细胞系中，转基因酿酒酵母包括大麻聚酮化合物合成酶(也称为橄榄醇酸合成酶或“OAS”)的基因。OAS催化由丙二酰基辅酶A和己酰基辅酶A合成橄榄醇。该反应的丙二酰基辅酶A与己酰基辅酶A与橄榄醇酸的化学计量比为2:1:1。在大麻中，橄榄醇在存在橄榄醇酸环化酶(“OAC”)或另一聚酮化合物环化酶的情况下被羧化成橄榄醇酸，橄榄醇酸被送到上面结合AltPT和其他胞质异戊烯基转移酶描述的通过大麻中的膜结合的异戊烯基转移酶催化的CBGa合成代谢途径中。来自大麻的OAC酶可从转基因酿酒酵母中排除，以促进通过AltPT合成CBG而不是CBGa。
在本文提供的一些方法和细胞系中，转基因酿酒酵母包括盘基网柄菌(Dictyostelium discoideum)聚酮化合物合成酶(“DiPKS”)的基因。DiPKS是由I型脂肪酸合成酶(“FAS”)和聚酮化合物合成酶组成的融合蛋白，并且被称为杂合“FAS-PKS”蛋白。DiPKS催化由丙二酰基辅酶A合成甲基橄榄醇。该反应的丙二酰基辅酶A与甲基橄榄醇的化学计量比为6:1。AltPT催化由甲基橄榄醇合成甲基大麻萜酚(“meCBG”)，类似于上述由橄榄醇合成CBG。己酸对酿酒酵母有毒。当应用OAS时，己酰基辅酶A是用于合成橄榄醇的必要前体。当使用DiPKS生产甲基橄榄醇而不是OAS，以生产橄榄醇或橄榄醇酸时(如果，不需要将己酸添加到生长培养基中。与使用OAS时的CBG产量相比，生长培养基中没有己酸可使得酿酒酵母培养物的生长增加以及meCBG的产量更高。
对于一些应用，meCBG和可由meCBG合成的甲基化的下游植物大麻素类似物(类似于在大麻中由CBGa合成的下游植物大麻素)为有价值的。在其他情况下，可更期望结构上与脱羧形式的天然存在的植物大麻素相同的植物大麻素。为了生产结构上与脱羧形式的天然存在的植物大麻素相同的植物大麻素，可相对于野生型DiPKS而修饰DiPKS以减少橄榄醇的甲基化，使得合成CBG而不是meCBG。酿酒酵母可包括增加DiPKS的活性的辅因子加载酶。
通过增加胞质中丙二酰基辅酶A的水平可促进橄榄醇和甲基橄榄醇的合成。酿酒酵母可具有天然的乙醛脱氢酶的过表达和突变型乙酰基辅酶A合成酶或其他基因的表达，这些突变使得减轻线粒体乙醛分解代谢。通过将乙醛转移至乙酰基辅酶A生产来减少线粒体乙醛分解代谢，增加了合成橄榄醇可用的丙二酰基辅酶A。Acc1是天然的酵母丙二酰基辅酶A合成酶。酿酒酵母可具有Acc1的过表达或Acc1的修饰用于增加的活性和增加的可用的丙二酰基辅酶A。酿酒酵母可包括Maf1的修饰的表达或tRNA生物合成的其他调节剂。已经显示，过表达天然的Maf1减少tRNA生物合成的焦磷酸异戊酯(“IPP”)的损失，从而提高酵母中的单萜产量。IPP是甲羟戊酸途径的中间体。Upc2是酿酒酵母中甾醇生物合成的活化剂，并且Upc2的Glu888Asp突变可增加酵母中的单萜生产。
在第一方面中，本文提供了用于在酵母中生产植物大麻素和植物大麻素类似物的方法和细胞系。该方法应用，并且该细胞系包括，用聚酮化合物合成酶CDS和胞质异戊烯基转移酶CDS转化的酵母细胞。聚酮化合物合成酶催化橄榄醇或甲基橄榄醇的合成，并且可包括大麻橄榄醇酸合成酶或盘基网柄菌聚酮化合物合成酶(“DiPKS”)。可修饰酵母细胞以包括用于增加DiPKS的活性的磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶。可修饰酵母细胞，以减轻线粒体乙醛分解代谢，用于增加可用于合成橄榄醇或甲基橄榄醇的丙二酰基辅酶A。异戊烯基转移酶催化大麻萜酚或大麻萜酚类似物的合成，并且可包括来自链霉菌属CL190的αββα胞质异戊烯基转移酶。可修饰酵母细胞，以减轻焦磷酸香叶酯的消耗，用于增加异戊烯化可用的焦磷酸香叶酯。
在进一步的方面中，本文提供了生产植物大麻素或植物大麻素类似物的方法，该方法包括：提供包括编码聚酮化合物合成酶的第一多核苷酸和编码胞质异戊烯基转移酶的第二多核苷酸的酵母细胞，和使酵母细胞繁殖，用于提供酵母细胞培养物。该聚酮化合物合成酶用于由丙二酰基辅酶A生产至少一种前体化学物质，该前体化学物质具有结构I：在结构I上，R1是链长为1、2、3、4或5个碳的烷基，R2是H、羧基或甲基，并且R3是H、羧基或甲基。该胞质异戊烯基转移酶用于使至少一种前体化学物质异戊烯化，提供至少一个种类的植物大麻素或植物大麻素类似物。
在一些实施方式中，酵母细胞包括编码己酰基合成酶的己酰基合成酶多核苷酸；聚酮化合物合成酶包括来自大麻的OAS酶；并且使酵母细胞繁殖包括使酵母细胞在包括己酸的营养制剂中繁殖。在一些实施方式中，酵母细胞不包括大麻聚酮化合物环化酶，并且至少一个种类的植物大麻素或植物大麻素类似物包括脱羧的植物大麻素或植物大麻素类似物。在一些实施方式中，第一多核苷酸包括来自大麻的OAS酶的编码序列，其中OAS酶的一级结构与由SEQ ID NO:45的碱基3841至4995限定的阅读框编码的蛋白质具有80％和100％之间的氨基酸残基序列同源性。在一些实施方式中，第一多核苷酸与SEQ ID NO:45的碱基3841至4995具有80％和100％之间的碱基序列同源性。在一些实施方式中，第一多核苷酸与SEQ ID NO:45的碱基3841至4995具有80％和100％之间的碱基序列同源性。
在一些实施方式中，R1是链长为3个碳的烷基，R2是H，并且R3是H。
在一些实施方式中，R1是链长为3个碳的烷基，R2是羧基，并且R3是H。
在一些实施方式中，R1是链长为3个碳的烷基，R2是甲基，并且R3是H。
在一些实施方式中，R1是链长为3个碳的烷基，R2是羧基，并且R3是甲基。
在一些实施方式中，聚酮化合物合成酶包括来自盘基网柄菌的DiPKS聚酮化合物合成酶。在一些实施方式中，第一多核苷酸包括用于DiPKS聚酮化合物合成酶的编码序列，其中DiPKS聚酮化合物合成酶的一级结构与由SEQ ID NO:46的碱基535至9978限定的阅读框编码的蛋白质具有80％和100％之间的氨基酸残基序列同源性。在一些实施方式中，第一多核苷酸与SEQ ID NO:46的碱基535至9978具有80％和100％之间的碱基序列同源性。在一些实施方式中，至少一种前体化学物质在R2处包括甲基，并且至少一个种类的植物大麻素或植物大麻素类似物包括甲基化的植物大麻素类似物。在一些实施方式中，DiPKS聚酮化合物合成酶包括影响C-Met结构域的活性位点的突变，用于减轻至少一种前体化学物质的甲基化，使得至少一种前体化学物质包括其中R2是甲基并且R3是H的第一前体化学物质，和其中R2是H并且R3是H的第二前体化学物质；并且至少一个种类的植物大麻素或植物大麻素类似物包括甲基化的植物大麻素类似物和未甲基化的植物大麻素。在一些实施方式中，DiPKS聚酮化合物合成酶包括DiPKSG1516D；G1518A聚酮化合物合成酶。在一些实施方式中，第一多核苷酸包括用于DiPKSG1516D；G1518A聚酮化合物合成酶的编码序列，其中DiPKSG1516D；G1518A聚酮化合物合成酶的一级结构与由SEQ ID NO:37的碱基523至9966限定的阅读框编码的蛋白质具有80％和100％之间的氨基酸残基序列同源性。在一些实施方式中，第一多核苷酸与SEQ ID NO:37的碱基523至9966具有80％和100％之间的碱基序列同源性。在一些实施方式中，DiPKS聚酮化合物合成酶包括DiPKSG1516R聚酮化合物合成酶。在一些实施方式中，第一多核苷酸包括DiPKSG1516R聚酮化合物合成酶的编码序列，该DiPKSG1516R聚酮化合物合成酶的一级结构与由SEQ ID NO:38的碱基523至9966限定的阅读框编码的蛋白质具有80％和100％之间的氨基酸残基序列同源性。在一些实施方式中，第一多核苷酸与SEQ IDNO:38的碱基523至9966具有80％和100％之间的碱基序列同源性。在一些实施方式中，DiPKS聚酮化合物合成酶包括降低在DiPKS聚酮化合物合成酶的C-Met结构域的活性位点处的活性的突变，用于防止至少一种前体化学物质的甲基化，使得至少一种前体化学物质具有氢R2基团和氢R3基团；并且至少一个种类的植物大麻素或植物大麻素类似物包括脱羧的植物大麻素或植物大麻素类似物。在一些实施方式中，酵母细胞包括编码磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶多核苷酸，用于增加DiPKS的活性。在一些实施方式中，磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶包括来自构巢曲霉(A.nidulans)的NpgA磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶。在一些实施方式中，磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶多核苷酸包括用于来自构巢曲霉的NpgA磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的编码序列，其中NpgA磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的一级结构与由SEQ ID NO:10的碱基1170至2201限定的阅读框编码的蛋白质具有80％和100％之间的氨基酸残基序列同源性。在一些实施方式中，磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶多核苷酸与SEQ ID NO:10的碱基1170至2201具有80％和100％之间的碱基序列同源性。
在一些实施方式中，聚酮化合物合成酶包括用于由丙二酰基辅酶A合成至少一种前体化学物质的活性位点，而不需要较长链的羰游基辅酶A。在一些实施方式中，至少一种前体化学物质在R1处包括戊基，并且至少一个种类的植物大麻素或植物大麻素类似物包括戊基植物大麻素或甲基化的戊基植物大麻素类似物。在一些实施方式中，至少一种前体化学物质包括橄榄醇橄榄醇酸、甲基橄榄醇或甲基橄榄醇酸中的至少一种，并且至少一个种类的植物大麻素或植物大麻素类似物包括CBG、CBGa、meCBG或meCBGa中的至少一种。
在一些实施方式中，胞质异戊烯基转移酶包括来自链霉菌属CL190的NphB异戊烯基转移酶。在一些实施方式中，第二多核苷酸包括用于来自链霉菌属CL190的NphB异戊烯基转移酶的编码序列，其中NphB异戊烯基转移酶的一级结构与由SEQ ID NO:44的碱基987至1913限定的阅读框编码的蛋白质具有80％和100％之间的氨基酸残基序列同源性。在一些实施方式中，第二多核苷酸与SEQ ID NO:44的碱基987至1913具有80％和100％之间的碱基序列同源性。
在一些实施方式中，R1是链长为5个碳的烷基，R2是H，并且R3是H。
在一些实施方式中，R1是链长为5个碳的烷基，R2是羧基，并且R3是H。
在一些实施方式中，R1是链长为5个碳的烷基，R2是甲基，并且R3是H。
在一些实施方式中，R1是链长为5个碳的烷基，R2是羧基，并且R3是甲基。
在一些实施方式中，酵母细胞包括增加可用的焦磷酸香叶酯的遗传修饰。在一些实施方式中，遗传修饰包括Erg20酶的失活。在一些实施方式中，酵母细胞包括Erg20多核苷酸，Erg20多核苷酸包括用于Erg20K197E的编码序列，其中Erg20K197E的一级结构与由SEQID NO:3限定的阅读框编码的蛋白质具有80％和100％之间的氨基酸残基序列同源性。在一些实施方式中，Erg20多核苷酸与SEQ ID NO:3具有80％和100％之间的碱基序列同源性。
在一些实施方式中，酵母细胞包括增加可用的丙二酰基辅酶A的遗传修饰。在一些实施方式中，遗传修饰包括Mafl的增加的表达。在一些实施方式中，酵母细胞包括Mafl多核苷酸，Mafl多核苷酸包括用于Maf1的编码序列，其中Maf1的一级结构与由SEQ ID NO:8的碱基936至2123限定的阅读框编码的蛋白质具有80％和100％之间的氨基酸残基序列同源性。在一些实施方式中，Mafl多核苷酸进一步包括启动子序列、终止子序列和整合序列，并且与SEQ ID NO:8具有80％和100％之间的碱基序列同源性。在一些实施方式中，遗传修饰包括用于增加醛脱氢酶和乙酰基辅酶A合成酶的胞质表达的修饰。在一些实施方式中，酵母细胞包括Acs多核苷酸，Acs多核苷酸包括用于来自肠道沙门氏菌的AcsL641P的编码序列和用于来自酿酒酵母的Ald6的编码序列，其中AcsL641P的一级结构与由SEQ ID NO:4的碱基3938至5893限定的阅读框编码的蛋白质具有80％和100％之间的氨基酸残基序列同源性，并且其中Ald6的一级结构与由SEQ ID NO:4的碱基1494至2999限定的阅读框编码的蛋白质具有80％和100％之间的氨基酸残基序列同源性。在一些实施方式中，Acs多核苷酸进一步包括启动子序列、终止子序列和整合序列，并且与SEQ ID NO:4的碱基51至7114具有80％和100％之间的碱基序列同源性。在一些实施方式中，遗传修饰包括用于增加丙二酰基辅酶A合成酶活性的修饰。在一些实施方式中，酵母细胞包括Acc1多核苷酸，Acc1多核苷酸包括用于来自酿酒酵母的Acc1S659A；S1157A的编码序列。在一些实施方式中，Acc1多核苷酸包括用于Acc1S659A；S1157A酶的编码序列，其中Acc1S659A；S1157A酶的一部分的一级结构与由SEQ ID NO:7的碱基9至1716限定的阅读框编码的蛋白质部分具有80％和100％之间的氨基酸残基序列同源性。在一些实施方式中，Acc1多核苷酸进一步包括启动子序列、终止子序列和整合序列，并且与SEQ ID NO:7具有80％和100％之间的碱基序列同源性。在一些实施方式中，酵母细胞包括Acc1多核苷酸，Acc1多核苷酸包括用于由组成型启动子调节的来自酿酒酵母的Acc1的编码序列。在一些实施方式中，组成型启动子包括来自酿酒酵母的PGK1启动子。在一些实施方式中，PGK1启动子与SEQ ID NO:6的碱基7至750具有80％和100％之间的核苷酸同源性。在一些实施方式中，遗传修饰包括用于甾醇生物合成的活化剂的增加的表达。在一些实施方式中，酵母细胞包括Upc2多核苷酸，Upc2多核苷酸包括用于来自酿酒酵母的Upc2E888D的编码序列，其中Upc2E888D的一级结构与由SEQ ID NO:9的碱基975至3701限定的阅读框编码的蛋白质具有80％和100％之间的氨基酸残基序列同源性。在一些实施方式中，Upc2多核苷酸进一步包括启动子序列、终止子序列和整合序列，并且与SEQ ID NO:9具有80％和100％之间的碱基序列同源性。
在一些实施方式中，第二多核苷酸包括用于胞质异戊烯基转移酶的编码序列，其中胞质异戊烯基转移酶的一级结构与下述中的任何一个具有80％和100％之间的氨基酸残基序列同源性：SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ IDNO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ IDNO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ IDNO:34、SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:36。
在一些实施方式中，方法包括从酵母细胞培养物中提取至少一个种类的植物大麻素或植物大麻素类似物。
在进一步的方面中，本文提供了用于生产植物大麻素或植物大麻素类似物的酵母细胞，酵母细胞包括：编码聚酮化合物合成酶的第一多核苷酸；和编码胞质异戊烯基转移酶的第二多核苷酸。
在一些实施方式中，酵母细胞中包括本文所述的酵母细胞、第一多核苷酸或第二多核苷酸中的一个或多个的特征。
在进一步的方面中，本文提供了转化用于生产植物大麻素或植物大麻素类似物的酵母细胞的方法。方法包括：将用于编码聚酮化合物合成酶的第一多核苷酸引入酵母细胞系中；和将用于编码胞质异戊烯基转移酶的第二多核苷酸引入酵母中。
在一些实施方式中，本文所述的酵母细胞、第一多核苷酸或第二多核苷酸中的一个或多个的特征应用于转化酵母细胞中。
在进一步的方面中，本文提供了具有下述结构II的植物大麻素类似物：
在结构II上，R1是链长为1、2、3、4或5个碳的烷基。R2是甲基。R3是H、羧基或甲基。
在一些实施方式中，R1具有5个碳的链长并且R3是H。在一些实施方式中，植物大麻素类似物通过酵母中的生物合成生产。
在进一步的方面中，本文提供了具有下述结构III的植物大麻素类似物：
在结构III上，R1是戊基；R2是甲基；并且R3是H。
通过结合附图阅读下述具体实施方式的描述时，本公开的其他方面和特征将对于本领域普通技术人员变得显而易见。
附图说明
现在将参考附图仅通过实施例的方式描述本公开的实施方式。
图1是在大麻中橄榄醇酸和具有不同烷基链长度的相关化合物的生物合成的示意图；
图2是在大麻中由己酸、丙二酰基辅酶A和焦磷酸香叶酯生物合成CBGa的示意图；
图3是在大麻中由CBGa生物合成酸形式的下游植物大麻素的示意图；
图4是在转化的酵母细胞中通过OAS和AltPT生物合成CBG的示意图；
图5是在转化的酵母细胞中由CBG生物合成下游植物大麻素的示意图；
图6是在转化的酵母细胞中由DiPKS和AltPT生物合成meCBG的示意图；
图7是在转化的酵母细胞中由meCBG生物合成下游甲基化的植物大麻素类似物的示意图；
图8是在转化的酵母细胞中由meCBG生物合成下游甲基化的植物大麻素类似物的示意图；
图9是DiPKS中的功能结构域的示意图，其具有用于降低橄榄醇的甲基化的C-甲基转移酶的突变；
图10是在转化的酵母细胞中通过DiPKSG1516D；G1518A和AltPT生物合成meCBG和CBG的示意图；
图11是在转化的酵母细胞中通过DiPKSG1516R和AltPT生物合成CBG的示意图；
图12显示了在不同浓度的己酸下酿酒酵母的生长；
图13显示了在引入己酸之前和之后的酿酒酵母生长和橄榄醇生产；
图14显示了在引入己酸之前和之后的酵母生长和CBG生产；
图15显示了在引入己酸之前和之后的酵母生长和酿酒酵母中的己酸消耗；
图16显示了在酿酒酵母中，大麻膜结合的异戊烯基转移酶和AltPT的胞质表达。
图17显示了在酿酒酵母中，用大麻OAS和AltPT生产CBG以及用DiPKS和AltPT生产meCBG；
图18显示了通过DiPKS生产甲基橄榄醇，以及通过DiPKSG1516D；G1518A生产甲基橄榄醇和橄榄醇二者；
图19显示了在两个单独的酿酒酵母菌株中通过DiPKS生产甲基橄榄醇；
图20显示了在两个单独的酿酒酵母菌株中通过DiPKS生产甲基橄榄醇；
图21显示了在两个单独的酿酒酵母菌株中通过AltPT生产meCBG；
图22显示了在两个单独的酿酒酵母菌株中通过DiPKS生产甲基橄榄醇以及通过DiPKS G1516R生产甲基橄榄醇和橄榄醇二者；
图23显示了在三个单独的酿酒酵母菌株中通过DiPKSG1516R生产橄榄醇；和
图24显示了在三个酿酒酵母菌株中通过大麻OAS和AltPT生产CBG，通过DiPKS和AltPT生产meCBG，以及通过DiPKSG1516R和AltPT生产CBG。
具体实施方式
大体上，本公开提供了用于生产在大麻植物中天然生物合成的植物大麻素和由甲基橄榄醇生物合成的甲基化的植物大麻素类似物的方法和酵母细胞系。植物大麻素和植物大麻素类似物在转基因酵母中生产。本文提供的方法和细胞系包括应用大麻植物中不存在的酶的基因。应用在大麻植物中编码在生物合成途径中得至植物大麻素的酶的完整的基因组之外的基因，可提供一种或多种益处，包括在不用投入对于酿酒酵母和其他种类的酵母有毒的己酸的情况下生物合成脱羧的植物大麻素、生物合成甲基化的植物大麻素类似物和生物合成植物大麻素。
如本文所用的修饰语“脱羧的”是指在Δ9-四氢大麻酚(“THC”)的例如第2位或第4位处，或在其他植物大麻素或类似物中与橄榄醇酸(其是大麻中生物合成大麻萜酚酸(“CBGa”)的前体)的4位相对应的等同位置处缺乏酸基的植物大麻素或植物大麻素类似物的形式。在大麻中，酸形式的植物大麻素由橄榄醇酸生物合成。当酸形式的植物大麻素被加热时，植物大麻素的芳环与羧基之间的键断裂。脱羧源自加热大麻中生产的羧化的植物大麻素，其在燃烧或加热至一般高于约110℃的温度期间迅速发生。为简单起见，如本文所用，“脱羧的”是指缺乏酸基的植物大麻素，无论该植物大麻素是包括在真正脱羧期间失去的酸基，还是在没有羧基的情况下被生物合成的。
图1显示了如在大麻中发生的由丙二酰基辅酶A和己酰基辅酶A的聚酮化合物缩合产物生物合成橄榄醇酸。橄榄醇酸是CBGa的代谢前体。如下面进一步详细描述的，CBGa是大量下游植物大麻素的前体。在大多数品种的大麻中，大部分植物大麻素是由橄榄醇酸生物合成的戊基大麻素，而橄榄醇酸由丙二酰基辅酶A和己酰基辅酶A以2:1的化学计量比合成。观察到了一些丙基大麻素，并且经常在广泛使用的三字母缩写中用“v”后缀标识(例如，四氢次大麻酚通常被称为“THCv”，次大麻二酚通常被称为“CBDv”等)。图1还显示了由丙二酰基辅酶A与正丁基辅酶A缩合来生物合成二酚酸(divarinolic acid)，其将提供下游丙基植物大麻素。
图1还显示了由丙二酰基辅酶A与乙酰基辅酶A的缩合来生物合成苔色酸，其可提供下游甲基植物大麻素。在该上下文中，术语“甲基植物大麻素”意思是它们的烷基侧链是甲基，其中大多数植物大麻素在烷基侧链上具有戊基，并且酚酸(varinnic)植物大麻素在烷基侧链上具有丙基。其中meCBG和其他甲基化的植物大麻素类似物被称为“甲基化”的上下文与“甲基植物大麻素”中和图1中“甲基”作为前缀的使用不同并且平行。类似地，由于橄榄醇具有限定长度的侧链(否则其将是图1中所示的另外三个聚酮化合物之一而不是“橄榄醇”)，所以甲基橄榄醇是指环上的甲基化而不是指较短的侧链。
图1还显示了由丙二酰基辅酶A与戊酰基辅酶A的缩合来生物合成2,4-二醇-6-丙基苯甲酸，其将提供下游丁基植物大麻素。
图2显示了在大麻中由己酸、丙二酰基辅酶A和焦磷酸香叶酯(“GPP”)生物合成CBGa，其包括图1中所示的橄榄醇酸生物合成步骤。己酸通过己酰基辅酶A合成酶用辅酶A活化(“Hex1；图2中的反应1)。OAS(也称为橄榄醇酸合成酶，但是合成橄榄醇而不是橄榄醇酸)和OAC一起催化由己酰基辅酶A和丙二酰基辅酶A生产橄榄醇酸(图2中的反应2)。异戊烯基转移酶将橄榄醇酸与GPP组合，提供CBGa(图2中的步骤3)。
图3显示了在大麻中由CBGa生物合成下游酸形式的植物大麻素。CBGa通过THCa合成酶被氧化环化成Δ9-四氢大麻酚酸(“THCa”)。CBGa通过CBDa合成酶氧化环化成大麻二酚酸(“CBDa”)。通过其他合成酶或通过以影响针对所生产的植物大麻素结构的酶活性的方式改变植物细胞中的条件，也在大麻中合成其他植物大麻素，比如大麻色烯酸(“CBCa”)、大麻伊索因酸(cannabielsoinic acid)(“CBEa”)、异-四氢大麻酚酸(“异-THCa”)、大麻环酚酸(“CBLa”)或大麻西川酸(“CBTa”)。这些一般的植物大麻素类型中的每一种的酸形式显示在图3中，其中通用的“R”基团显示烷基侧链，在由己酰基辅酶A和丙二酰基辅酶A合成橄榄醇酸的情况下其将是5碳链。在某些情况下，可替换地在与图3所示的R基团位置相对的环位置上出现羧基(例如，THC的4位而不是图3所示的2位等)。图3所示的脱羧形式的植物大麻素分别为THC、大麻二酚(“CBD”)、大麻色烯(“CBC”)、大麻伊索因(“CBE”)、异-四氢大麻酚(“异-THC”)、大麻环酚(“CBL”)或大麻西川(“CBT”)。
Poulos等人的美国公开号2016/0010126描述了酿酒酵母和马克斯克鲁维酵母中的五种天然的大麻基因的表达。用于生产植物大麻素的来自酵母中天然的大麻途径的基因的表达可能带来缺点。大麻OAS使用己酰基辅酶A作为聚酮化合物底物。己酸对于酿酒酵母和一些其他酵母菌株有毒。此外，由橄榄醇酸合成CBGa需要膜结合的大麻异戊烯基转移酶，其在真菌中的表达较差。
本文提供的用于生产植物大麻素和植物大麻素类似物的方法和酵母细胞可应用和包括用来自链霉菌属CL 190的异戊烯基转移酶NphB的基因转化的酿酒酵母。链霉菌属CL190NphB异戊烯基转移酶为大麻异戊烯基转移酶提供了替代方案，并在下文称为“AltPT”。AltPT是αββα(“ABBA”)型异戊烯基转移酶。AltPT是高度混杂的，接受大部分聚酮化合物作为用于异戊烯化的底物。AltPT针对作为萜类化合物供体的GPP是特异的。AltPT是在链霉菌属CL 190(革兰氏阳性细菌)中表达的胞质酶，相对照，膜结合的异戊烯基转移酶在大麻(植物)中表达。细菌胞质酶在酵母中的表达水平高于植物膜结合成酶。AltPT将橄榄醇酸异戊烯化为CBGa，类似于在大麻中被膜结合的异戊烯基转移酶催化的反应。AltPT还将橄榄醇异戊烯化为大麻萜酚(“CBG”)，或将甲基橄榄醇异戊烯化为甲基大麻萜酚(“meCBG”)。针对酵母密码子优化的AltPT的合成序列在此包括在SEQ ID NO:1中。AltPT的完整编码DNA序列(“CDS”)可在NCBI GenBank在线数据库获得，登录号为NCBI-AB187169。
图4显示了在转基因酵母中用于由己酸、丙二酰基辅酶A和GPP生产CBG的生物合成途径。如图4所示的本文提供的用于生产CBG的酵母菌株可包括用于编码链霉菌属CL190AltPT、大麻Hex1和大麻OAS的基因。这样的酵母菌株的实施例以“HB37”和“HB88”提供，其中的每个描述在表7中。
图5显示了由CBG生物合成下游植物大麻素。CBG被氧化环化成THC、CBD、CBC、CBE、异-THC、CBL或CBT。这些一般的植物大麻素类型中的每一种的脱羧形式显示在图5中，其中通用的“R”基团显示烷基侧链，其在由橄榄醇生物合成的植物大麻素中将是5碳链。
图4显示了通过Hex1由己酸生产己酰基辅酶A。通过Hex1，用辅酶A将己酸活化(图4中的反应1)。OAS催化由己酰基辅酶A和丙二酰基辅酶A生产橄榄醇(图4中的反应2)。AltPT将橄榄醇酸与GPP缩合，提供CBG(图4中的反应3)。
图4中所示的途径包括大麻HEx1和大麻OAS。图4中所示的途径不包括大麻OAC。用于实施图4的途径的转基因酵母细胞将相应地包括用于OAS的基因，但不包括用于大麻OAC的基因。在橄榄醇酸的生物合成期间，大麻OAC将橄榄醇羧化为橄榄醇酸。在存在OAS且不存在OAC或其他聚酮化合物环化酶的情况下，生产橄榄醇而不是在大麻中生产的橄榄醇酸。结果，被AltPT催化的反应得到CBG而不是CBGa。接着，生产植物大麻素的下游反应将相应地生产脱羧种类的植物大麻素，包括图5中的植物大麻素，而在也存在OAC或另一种聚酮化合物环化酶的情况下(比如在大麻中)，将生产酸形式的植物大麻素，包括图3中的植物大麻素。
在图4的反应2中的由OAS催化的己酰基辅酶A转化为橄榄醇被确认为图4途径中的代谢瓶颈。为了增加图4的反应2的产量，功能性筛选了多种酶，并且确认了一种酶，来自盘基网柄菌的称为“DiPKS”的聚酮化合物合成酶，其可直接由丙二酰基辅酶A生产甲基橄榄醇。针对酵母密码子优化的DiPKS的合成序列在此包括在SEQ ID NO:2中。DiPKS的CDS可在NCBI GenBank在线数据库中获得，登录号为NC_007087.3。
图6显示了在转基因酵母中用于由丙二酰基辅酶A和GPP生产meCBG的生物合成途径。如图6所示的本文提供的用于生产CBG的酵母菌株可包括用于AltPT的基因和用于DiPKS的基因(其支持仅由丙二酰基辅酶A生产聚酮化合物)，在培养基中不需要己酸。DiPKS包括与在脂肪酸合成酶中发现的结构域类似的功能结构域、甲基转移酶结构域和Pks III结构域(见图9)。包括编码野生型DiPKS基因的密码子优化的合成序列的酵母菌株的实施例被提供为“HB84”、“HB90”和“HB105”，其各自描述在表7中。
图6显示了由被DiPKS催化的丙二酰基辅酶A生产甲基橄榄醇(图6中的反应1)。AltPT以GPP作为异戊烯基团供体将甲基橄榄醇异戊烯化，提供meCBG(图6中的反应2)。应用DiPKS而不是OAS，促进了植物大麻素和植物大麻素类似物的生产，而不需要补充己酸。由于己酸对酿酒酵母有毒，因此在CBG或meCBG的生物合成途径中消除己酸的需求可提供相比表达OAS和Hex1的酵母细胞中的CBG的产量更大的CBG或meCBG的产量。
图7和图8显示了对应于甲基-四氢大麻酚(“meTHC”)、甲基-大麻二酚(“meCBD”)、甲基-大麻色烯(“meCBC”)、甲基-大麻伊索因(“meCBE”)、异甲基-四氢大麻酚(“异-meTHC”)、甲基-大麻环酚(“meCBL”)或甲基-大麻西川(“meCBT”)的下游甲基化的植物大麻素类似物，它们分别是THC、CBD、CBC、CBE、异-THC、CBL和CBT的甲基化类似物，当提供甲基橄榄醇而不是橄榄醇酸或橄榄醇作为前体化学物质时可制备它们。这些甲基化的植物大麻素类似物中的每一种的脱羧形式示于图7和图8中，其中通用的“R”基团显示烷基侧链，其在由己酰基辅酶A和丙二酰基辅酶A或只有丙二酰基辅酶A使得合成的情况下是5碳链。
除了meCBD之外，图7和图8中所示的每种下游植物大麻素类似物的结构的一部分包括与芳环键合的旋转受限基团。结果，除了meCBD之外的图7和图8中所示的每种下游植物大麻素类似物可由以两种旋转异构体之一的meCBG合成。取决于合成期间meCBG的旋转异构体，所得环化的甲基化的植物大麻素类似物中的甲基可在针对图7中的meTHC、meCBC、meCBE、异-meTHC、meCBL或meCBT的异构体所示的位置处，或针对图8中的meTHC、meCBC、meCBE、异-meTHC、meCBL或meCBT的异构体所示的位置处。本文参考meTHC、meCBC、meCBE、异-meTHC、meCBL或meCBT包括图7和图8中所示的异构体之一或二者。
DiPKS包括C-甲基转移酶结构域，其在芳环上的4位处使橄榄醇甲基化。结果，AltPT使甲基橄榄醇异戊烯化，得到meCBG，一种植物大麻素类似物，而不是已知在大麻中合成的CBGa。可能生产植物大麻素的任何下游反应当使用CBGa或CBG作为投入时将相应地生产图7和图8所示的甲基化的植物大麻素类似物的脱羧种类，而在大麻中生产未甲基化的酸形式的植物大麻素(如图3中)。如果包括OAC或另一种聚酮化合物环化酶，则甲基橄榄醇可通过OAC或其他聚酮化合物环化酶转化为meCBGa，因为甲基化和羧化碳可在不同的位置上。例如，由meCBG合成的meTHC可在碳4处甲基化，并且可羧化成甲基-四氢大麻酚酸(“meTHCa”)，其中THCa的羧基可在2位。可选地，由meCBG合成的meTHC可在碳2处甲基化，在该情况下，THCa的羧基可在4位。在大麻中观察到的THCa的羧基在2位或4位。
图9是DiPKS的功能结构域的示意图，显示了β-酮酰基-合成酶(“KS”)、酰基转乙酰基酶(“AT”)、脱水酶(“DH”)、C-甲基转移酶(“C-Met”)、烯酰还原酶(“ER”)、酮还原酶(“KR”)和酰基载体蛋白(“ACP”)。“TYPE III”结构域是3型聚酮化合物合成酶。KS、AT、DH、ER、KR和ACP部分提供通常与脂肪酸合成酶相关的功能，显示DiPKS是FAS-PKS蛋白。C-Met结构域为在碳4处甲基化橄榄醇提供催化活性。图9中划掉了C-Met结构域，示意性地说明了对DiPKS蛋白的修饰，其使C-Met结构域失活并减轻或消除甲基化功能。TYPE III结构域催化迭代的聚酮化合物延伸和从ACP转移到TYPE III结构域的己酸硫酯的环化。
图10显示了在转基因酵母中由丙二酰基辅酶A和GPP生产meCBG和CBG二者的生物合成途径。如图10所示，本文提供的用于生产CBG和meCBG二者的酵母菌株可包括用于AltPT的基因和用于如图9示意性示出的在C-Met结构域处具有降低活性的突变DiPKS的基因。DiPKS蛋白的C-Met结构域包括DiPKS的氨基酸残基1510至1633。C-Met结构域包括三个基序。第一基序包括残基1510至1518。第二基序包括残基1596至1603。第三基序包括残基1623至1633。破坏这三个基序中的一个或多个可使得C-Met结构域处的活性降低。
表达在C-Met结构域中具有降低的活性的修饰的DiPKS的酵母菌株的例子在下面的实施例V中提供为“HB80A”。HB80A包括编码野生型DiPKS蛋白的酵母-密码子优化基因的修饰。HB80A包括DiPKS基因的修饰，使得DiPKS蛋白在C-Met结构域的第一基序中被修饰。由于对DiPKS基因的这些修饰，DiPKS蛋白具有Gly1516Asp和Gly1518Ala的替换。HB80A仅包括DiPKSG1516D；G1518A而不包括AltPT，结果仅催化图10的步骤1A和1B，而不催化反应2A和2B。HB80A生产甲基橄榄醇和橄榄醇。可修饰HB80A菌株以包括AltPT，比如通过用pAltPT质粒转化HB80A(见表6)。
图10显示了由丙二酰基辅酶A生产甲基橄榄醇(图10中的反应1A)和由丙二酰基辅酶A生产橄榄醇(图10中的反应1B)二者。反应1A和1B各自被DiPKSG1516D；G1518A催化。Gly1516Asp和Gly1518Ala替换在C-Met结构域的活性位点中，并且减少了DiPKSG1516D；G1518A对橄榄醇环的4位上的甲基化的催化作用，允许一部分投入的丙二酰基辅酶A根据反应1B而不是反应1A被催化。AltPT，一种混杂的ABBA异戊烯基转移酶，催化甲基橄榄醇与GPP以及橄榄醇与GPP的异戊烯化二者。接着生产meCBG(图10中的反应2A)和CBG(图10中的反应2B)二者。然后，生产其他植物大麻素的任何下游反应将相应地生产甲基化的植物大麻素类似物的混合物和在CBG的芳环上的4位(或下游植物大麻素中的相应位置)处没有官能团的种类，而在大麻中将生产酸形式。
图11显示了在转基因酵母中由丙二酰基辅酶A和GPP仅生产CBG的生物合成途径。如图11所示，本文提供的用于仅生产CBG的酵母菌株可包括用于AltPT的基因和用于如图9中示意性示出的在C-Met结构域处具有降低活性的突变DiPKS基因。
表达在C-Met结构域中基本上没有活性的修饰的DiPKS的酵母菌株的例子在下面的实施例VIII、IX和X中提供为“HB135”、“HB137”、“HB138”和“HB139”。HB135、HB137、HB138和HB139各自包括编码野生型DiPKS蛋白的酵母-密码子优化基因的修饰。HB135、HB137、HB138和HB139各自包括DiPKS基因的修饰，使得DiPKS蛋白在C-Met结构域的第一基序中被修饰。由于这种对DiPKS基因的修饰，DiPKS蛋白具有Gly1516Arg的替换。
DiPKSG1516R催化图11中的反应1。Gly1516Arg替换在C-Met结构域的活性位点上，并且减少DiPKSG1516R对橄榄醇环的4位上的甲基化的催化作用。根据图11的反应1催化投入的丙二酰基辅酶A。HB139还包括AltPT，并且随后生产橄榄醇和CBG(图11中的反应2)。然后，生产其他植物大麻素的任何下游反应将相应地生产在CBG的芳环上的4位或下游植物大麻素中的相应位置上没有官能团的植物大麻素种类，而在大麻中将生产酸形式。
增加生物合成前体的可用性
图4、6、10和11中显示的生物合成途径各自需要丙二酰基辅酶A和GPP以分别生产CBGa、CBG或meCBG。除了引入聚酮化合物合成酶(比如OAS或DiPKS)，并且除了引入胞质异戊烯基转移酶(比如AltPT)以外，可使酵母细胞突变，可引入来自其他种类的基因，可上调或下调基因，或以其他方式对酵母细胞进行基因修饰，来增加丙二酰基辅酶A、GPP或支持图4、6、10和11中任一个的生物合成途径所需的其他投入代谢物的可用性。
可修饰酵母细胞，以增加可用的GPP。酿酒酵母可在Erg20或其他支持消耗GPP的代谢途径的酶的基因中具有一个或多个其他突变。Erg20催化酵母细胞中的GPP生产。Erg20还向GPP添加一个3-异戊基焦磷酸(“IPP”)的亚单元，得到焦磷酸法呢基酯(“FPP”)，一种用于下游倍半萜和甾醇生物合成的代谢物。已经证实了Erg20中的一些突变减少GPP转化成FPP，增加细胞中可用的GPP。Erg20中的替换突变Lys197Glu降低了Erg20将GPP转化成FPP。如下表4中所示，所有修饰碱基的菌株表达Erg20K197E突变蛋白(“HB42”、“HB82”、“HB100”、“HB106”和“HB110”)。类似地，基于HB42、HB82、HB100、HB106或HB110中的任一个的每个修饰的酵母菌株包括编码整合至酵母基因组中的Erg20K197E突变体的整合多核苷酸。SEQ ID NO:3是编码Erg20K197E蛋白的CDS和用于同源重组的侧翼序列。
可修饰酵母菌株用于增加可用的丙二酰基辅酶A。降低的线粒体乙醛分解代谢使得乙醛从乙醇分解代谢转向乙酰基辅酶A生产，这进而驱动丙二酰基辅酶A和下游聚酮化合物和萜类化合物的生产。可修饰酿酒酵母以表达来自肠道沙门氏菌(Salmonellaenterica)的在残基641处具有亮氨酸至脯氨酸的替换修饰的乙酰基辅酶A合成酶(“AcsL641P”)和来自酿酒酵母的醛脱氢酶6(“Ald6”)。Leu641 Pro突变去除了Acs的下游调节，与野生型Acs相比，AcsL641P突变体具有更高的活性。这两种酶的胞质表达一起增加了胞质中乙酰基辅酶A的浓度。胞质中较大的乙酰基辅酶A浓度使得线粒体分解代谢降低，绕过线粒体丙酮酸脱氢酶(“PDH”)，提供PDH旁路。结果，更多的乙酰基辅酶A可用于丙二酰基辅酶A生产。SEQ ID NO:4是基于pGREG质粒的质粒，并且其包括编码Ald6和SeAcsL641P的基因的DNA序列、启动子、终止子和整合位点同源序列，该整合位点同源序列用于通过重组应用规律成簇的间隔短回文重复序列(“CRISPR”)整合至酿酒酵母基因组中的Flagfeldt-位点19处。如下表4所示(术语“PDH旁路”)，基础菌株HB82、HB100、HB106和HB110具有在TDH3启动子下编码Ald6的SEQ ID NO:4的从碱基1494至2999的一部分，以及在Tef1P启动子下编码SeAcsL641P的SEQ ID NO:4的从基因3948至5893的一部分。类似地，基于HB82、HB100、HB106或HB110中的任一个的每个修饰的酵母菌株包括编码Ald6和SeAcsL641P的多核苷酸。
用来增加胞质丙二酰基辅酶A的另一种方法是上调Acc1，Acc1是天然的酵母丙二酰基辅酶A合成酶。Acc1基因的启动子序列被PGK1基因的组成型酵母启动子替换。来自PGK1基因的启动子允许Acc1的多个拷贝存在于细胞中。天然的Acc1启动子一次仅允许蛋白质的单个拷贝存在于细胞中。天然的启动子区域显示在SEQ ID NO:5中。修饰的启动子区域显示在SEQ ID NO:6中。
除了上调Acc1的表达之外，酿酒酵母还可包括一个或多个Acc1的修饰，以增加Acc1活性和胞质乙酰基辅酶A浓度。在文献中确认了调节序列中的两个突变，其消除了Acc1的抑制，使得更高的Acc1表达和更高的丙二酰基辅酶A生产。SEQ ID NO:7是可用于通过同源重组来修饰酿酒酵母基因组的天然的Acc1基因的多核苷酸。SEQ ID NO:7包括用于具有Ser659Ala和Ser1157Ala修饰的Acc1基因的编码序列的一部分。结果，用该序列转化的酿酒酵母将表达Acc1S659A；S1157A。例如，通过在任何合适的位点将序列与Tef1启动子、具有Ser659Ala和Ser1157Ala修饰的Acc1和Prm9终止子整合，可实现类似的结果。最终结果将是Tef1、Acc1S659A；S1157A和Prm9的侧翼是用于促进整合至酿酒酵母基因组中的基因组DNA序列。这是在Flagfeldt位点18处尝试的，但是由于构建体的大小，接下来改为上述用SEQ ID NO:7的方法。
酿酒酵母可包括Maf1或其他tRNA生物合成调节剂的修饰表达。已经显示，过表达天然的Maf1可减少IPP对于tRNA生物合成的损失，从而提高酵母中的单萜产量。IPP是甲羟戊酸途径的中间体。SEQ ID NO:8是整合至酿酒酵母基因组中Maf1位点5处的多核苷酸，其用于在Tef1启动子下Maf1的基因组整合。SEQ ID NO:8包括Tef1启动子、天然的Maf1基因和Prm9终止子。Tef1、Maf1和Prm9一起的侧翼是用于促进整合至酿酒酵母基因组中的基因组DNA序列。如下表4所示，基础菌株HB100、HB106和HB110在Tefl启动子下表达Mafl。类似地，基于HB100、HB106或HB110中的任一个的每个修饰的酵母菌株包括含有在Tef1启动子下Maf1的编码序列的多核苷酸。
Upc2是用于酿酒酵母中甾醇生物合成的活化剂。Upc2的Glu888Asp突变增加了酵母中单萜的生产。SEQ ID NO:9是可整合至基因组中以提供在Tef1启动子下表达Upc2E888D的多核苷酸。SEQ ID NO:9包括Tef1启动子、Upc2E888D基因和Prm9终止子。Tef1、Upc2E888D和Prm9一起的侧翼是用于促进整合至酿酒酵母基因组中的基因组DNA序列。
上述基因，Erg20K197E、AcsL641P、Ald6、Maf1、Acc1S659A；S1157A或Upc2E888D，中的任一个可从质粒表达或整合至酿酒酵母的基因组中。基因组整合可通过同源重组，包括CRISPR重组，或任何合适的方法。可类似地通过重组修饰Acc1的启动子。SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9中的每一个中的编码序列和调节序列可包括在质粒中用于表达(例如pYES等)或包括在线性多核苷酸中用于整合至酿酒酵母基因组中。基础菌株HB42、HB82、HB100、HB106或HB110中的每一个包括一个或多个整合的SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:10(见下文)。可通过类似方法应用SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9的整合。
增加的DiPKS功能
如图9所示，DiPKS包括ACP结构域。DiPKS的ACP结构域需要磷酸泛酰巯基乙胺基团作为辅因子。NpgA是来自构巢曲霉(Aspergillus nidulans)的4’-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶。可将用于酿酒酵母的密码子优化的NpgA的拷贝引入酿酒酵母中并转化至酿酒酵母中，包括通过同源重组。将NpgA基因盒整合至酿酒酵母的基因组中的Flagfeldt位点14处以产生菌株HB100。整合的DNA的序列显示在SEQ ID NO:10中，并且包括Tef1启动子、NpgA编码序列和Prm9终止子。Tef1p、NpgA和Prm9t的侧翼是促进整合至酿酒酵母基因组中的Flagfeldt位点14中的基因组DNA序列。如下表4所示，基础菌株HB100、HB106和HB110包括该整合的盒。可选地，SEQ ID NO:10的碱基636至2782可包括在表达质粒上，如菌株HB98中那样。
NpgA的表达提供了构巢曲霉磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶，用于将磷酸泛酰巯基乙胺基团加载到DiPKS的ACP结构域上的更大催化作用。结果，由DiPKS催化的反应(图6中的反应1)可以以更大的速率发生，提供更大量的甲基橄榄醇用于异戊烯化为meCBG。
其他异戊烯基转移酶
基于DELTA BLAST检索ABBA异戊烯基转移酶结构来限定NphB变体。通过查找适合于GPP而非IPP、二甲基烯丙基焦磷酸或其他异戊烯基的结合口袋来重新限定该列表。SEQID NO:12至SEQ ID NO:33提供了位于DELTABLAST检索中的来自真菌和细菌的胞质异戊烯基转移酶的一级结构氨基酸残基序列。还进行了大麻基因组的DELTA BLAST检索，并且膜结合的异戊烯基转移酶位于这些检索中。一些大麻膜结合的异戊烯基转移酶在一些酵母种类中表达较差，而不会被引入本文提供的制备植物大麻素或植物大麻素类似物的酵母菌株中。
SEQ ID NO:33至SEQ ID NO:36提供了位于手工文献检索中的来自真菌和细菌的胞质异戊烯基转移酶的一级结构氨基酸残基序列。SEQ ID NO:33至SEQ ID NO:36分别是名为FNQ26、FNQ28、FUR7和NAPT9的胞质异戊烯基转移酶的一级结构氨基酸残基序列。
SEQ ID NO:11至SEQ ID NO:36中的任一个可作为胞质异戊烯基转移酶应用于本文所述的酵母菌株。这些异戊烯基转移酶中的每一个总结在表1中。
表1：异戊烯基转移酶
DiPKS的修饰
可修饰DiPKS以降低或消除C-Met的活性。
SEQ ID NO:37是针对酵母密码子优化的DIPKS的合成序列的修饰形式，其中DiPKS包括Gly1516Asp替换和Gly1518Ala替换，其共同破坏C-met结构域的活性。下述关于包括菌株HB80A的实施例IV提供了酿酒酵母培养物中DiPKSG1516D，G1518A表达的结果。可将其他修饰引入DiPKS中以破坏或消除C-Met的全部活性位点或所有C-Met。如针对野生型DiPKS所描述的，可将这些修饰的DiPKS酶中的每一个引入酿酒酵母中。
SEQ ID NO:38是针对酵母密码子优化的DIPKS的合成序列的修饰形式，其中DiPKS包括破坏C-met结构域活性的Gly1516Arg替换。下述结合包括菌株HB135的实施例VIII和包括菌株HB135、HB137和HB138的实施例IX提供酿酒酵母培养物中DiPKSG1516R表达的结果。
除了具体地DiPKSG1516D，G1518A和DiPKSG1516R外，还将其他修饰引入DiPKS中以破坏或消除C-Met的全部活性位点或所有C-Met：(a)用GGGSGGGSG替换基序1，(b)基序1中的Gly1516Arg替换和用GGGSGGGS替换基序2，(c)Glu1634Ala，其恰好在基序3的外部并破坏C-Met结构域中活性位点处的三级结构，和(d)通过His1608Gln替换破坏C-Met结构域中的活性位点。将针对(a)至(d)中每一个的密码子优化序列引入酵母中的表达质粒上，类似于表达DiPKSG1516D，G1518A和DiPKSG1516R，引入基础菌株HB100中。在每种情况下，未观察到橄榄醇的生产。用GGGSGGGS替换基序1或基序2也消除了甲基橄榄醇的生产。在一个实施例批次中，表达DiPKSG1634A突变体的酵母的培养物每1培养物提供2.67mg甲基橄榄醇。在一个实施例批次中，表达DiPKSH1608N突变体的酵母的培养物每1培养物提供3.19mg甲基橄榄醇。
转化和生长酵母细胞
根据本说明书进行的方法和制备的酵母细胞的具体实施例的细节在下面作为实施例I至实施例X提供。这10个具体实施例中的每一个应用了类似的方法来构建质粒，转化酵母，定量菌株生长，和定量细胞内代谢物。下述描述10个实施例中的这些共同特征，随后是与10个实施例中的一个或多个相关的结果和其他细节。
质粒构建
被组装用来应用和制备本文提供的方法和酵母细胞的实施例的质粒显示在表2中。在表2中，对于表达质粒pYES和pYES2，SEQ ID NO 39和40分别在没有表达盒的情况下提供整个质粒。可包括SEQ ID NO:10、37、38和41至47的表达盒以制备表2中所示的质粒。SEQID NO:4是pGREG质粒，包括PDH旁路基因的盒。
表2：用于制备酵母菌株的质粒和盒
使用Eppendorf Mastercycler ep Gradient 5341根据制造商推荐的方案，用来自Operon Eurofins和Phusion HF聚合酶(ThermoFisheRF-530S)的引物通过聚合酶链反应(“PCR”)扩增用于引入酿酒酵母中的质粒。
在酿酒酵母中使用重叠DNA部分和转化辅助重组来组装所有质粒。使用如Gietz，R.D.和Schiestl，R.H.，“High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SScarrier DNA/PEG method.”Nat.Protoc.2，31–34(2007)所述的乙酸锂热激法将质粒转化至酿酒酵母中。用于组装质粒的基础酵母菌株如表3所示：
| 菌株 | 背景 | 修饰 | 注释 |
| HB24 | -LEU | 无 | 用于组装质粒的具有亮氨酸营养缺陷型的未修饰的酵母 |
| HB25 | -URA | 无 | 用于组装质粒的具有尿嘧啶营养缺陷型的未修饰的酵母 |
表3：基础酵母菌株
将pAltPT质粒组装在HB24亮氨酸营养缺陷型中。将pNPGA、pDiPKSm1、pDiPKSm2、pGFP、pPTGFP、pAPTGFP、pH1OAS、pDiPKS、pCRISPR和pPDH质粒组装在HB25尿嘧啶营养缺陷型中。在琼脂培养皿上通过营养缺陷选择来选择转化的酿酒酵母细胞。从培养皿中回收的菌落在液体选择性培养基中于30℃下生长16小时，同时在250RPM下振荡。
在液体选择性培养基中生长后，收集转化的酿酒酵母细胞并提取质粒DNA。将提取的质粒DNA转化至大肠杆菌(Escherichia coli)中。通过在包括氨苄青霉素的琼脂培养皿上生长来选择转化的大肠杆菌。培养大肠杆菌以扩增质粒。提取在大肠杆菌中生长的质粒并用Sanger双脱氧测序进行测序以验证精确的构建。然后将序列验证的质粒用于基因组修饰或酿酒酵母的稳定转化。
酿酒酵母的基因组修饰
本文所述的酿酒酵母菌株可通过质粒的稳定转化或基因组修饰来制备。基因组修饰可通过同源重组来实现，包括通过利用CRISPR的方法。
采用应用CRISPR的方法来从酿酒酵母基因组中删除DNA并将异源DNA引入至酿酒酵母基因组中。用Benchling在线DNA编辑软件设计用于将Cas9核酸内切酶靶向至酿酒酵母基因组上期望位置的引导RNA(“gRNA”)序列。应用通过重叠延伸(“SOEing”)和PCR进行的DNA剪接来组装gRNA序列并扩增包括功能性gRNA盒的DNA序列。
将功能性gRNA盒、表达Cas9的基因盒和pYes2(URA)质粒组装至pCRISPR质粒中并转化至酿酒酵母中，用于促进靶向DNA双链切割。通过添加靶向DNA的线性片段修复所得的DNA切割。
通过同源重组将SEQ ID NO:3中所示的Erg20K197E蛋白的CDS整合至HB13的基因组中，得到HB42基础菌株。
通过CRISPR将SEQ ID NO:4的碱基51至7114整合至HB42菌株中，以提供在酿酒酵母中具有PDH旁路基因的HB82基础菌株。在酿酒酵母中组装后，对pPDH质粒进行序列验证。序列验证的pPDH质粒在大肠杆菌中生长，纯化，并用BciV1限制酶消化。如表2中，通过BciV1消化提供了包括Ald6和SeAcsL641P的基因、启动子、终止子和整合位点同源序列的多核苷酸，该整合位点同源序列用于整合至酿酒酵母基因组中的Cas9旁边的PDH-位点19处。通过凝胶分离纯化得到的线性PDH旁路供体多核苷酸，如SEQ ID NO:4的碱基51至7114所示。
在两个PDH旁路基因(Ald6和AcsL641P)在单个PDH旁路多核苷酸上的情况下，将PDH旁路供体多核苷酸共转化至具有pCRISPR的酿酒酵母中。通过Gietz所述的乙酸锂热激法进行转化。pCRISPR质粒表达Cas9，其通过gRNA分子靶向至酿酒酵母基因组的选定位置。在该位置处，Cas9蛋白造成DNA中的双链断裂。PDH旁路供体多核苷酸用作CRISPR反应中的供体多核苷酸。包括Ald6、AcsL641P、启动子和终止子的PDH旁路供体多核苷酸通过同源重组整合至基因组中的断裂位点，位点19，得到菌株HB82。
制备并扩增SEQ ID NO:10中所示的NpgA供体多核苷酸。使用DNA SOEing来从3个多核苷酸产生单个供体DNA片段用于NpgA整合。第一多核苷酸是基因组同源性的5'区域，其允许供体重组至基因组中的特定基因座处。第二多核苷酸编码NpgA基因盒。NpgA基因盒包括Tef1启动子、NpgA编码序列和Prm9终止子。磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶多核苷酸包括基因组同源性的3’区域，以促进靶向整合至酿酒酵母基因组中。
将NpgA供体多核苷酸与pCRISPR质粒共转化至菌株HB82中。表达pCRISPR质粒，并通过gRNA分子将核酸内切酶Cas9靶向至酿酒酵母基因组上的位置。在该位置处，Cas9蛋白产生DNA中的双链断裂，并且通过同源重组将NpgA供体多核苷酸整合至基因组中的断裂处，以提供HB100基础菌株。
制备并扩增SEQ ID NO:8中所示的Maf1供体多核苷酸。使用DNA SOEing来从3个多核苷酸产生单个供体DNA片段，用于Maf1整合。第一多核苷酸是基因组同源性的5’区域，其允许供体重组至基因组中的特定基因座处。第二多核苷酸编码Maf1基因盒。Maf1基因盒包括Tef1启动子、Maf1编码序列和Prm9终止子。Maf1多核苷酸包括基因组同源性的3’区域，以促进靶向整合至酿酒酵母基因组中。
将Maf1供体多核苷酸与pCRISPR质粒共转化至菌株HB100中。可表达pCRISPR质粒，并通过gRNA分子将核酸内切酶Cas9靶向至酿酒酵母基因组上的位置。在该位置处，Cas9蛋白可产生DNA中的双链断裂，并且可通过同源重组将Maf1供体多核苷酸整合至基因组中的断裂处。Maf1供体多核苷酸的稳定转化至HB100菌株中提供了HB106基础菌株。
制备并扩增SEQ ID NO:6中所示的Acc1-PGK1p供体多核苷酸。使用DNA SOEing来从3个多核苷酸产生单个供体DNA片段，用于Acc1-PGK1整合。第一多核苷酸是基因组同源性的5’区域，其允许供体重组至基因组中的特定基因座处。第二多核苷酸编码PGK1启动子区域。Acc1多核苷酸包括基因组同源性的3’区域，以促进靶向整合至酿酒酵母基因组中。
将Acc1-PGK1供体多核苷酸与pCRISPR质粒共转化。表达pCRISPR质粒，并通过gRNA分子将核酸内切酶Cas9靶向至酿酒酵母基因组上的位置。在该位置处，Cas9蛋白产生DNA中的双链断裂，并且通过同源重组将Acc1-PGK1供体多核苷酸整合至基因组中的断裂处。供体多核苷酸的稳定转化至HB100菌株提供了具有由PGK1启动子调节的Acc1的HB110基础菌株。
表4提供了通过酿酒酵母的基因组修饰制备的基础菌株的总结。表4中所示的每个基础菌株是亮氨酸和尿嘧啶营养缺陷型，并且它们都不包括质粒。
表4：用于确认蛋白质表达和植物大麻素生产制备的碱基转化菌株
用于菌株构建的稳定转化
使用如Gietz所述的乙酸锂热激法将质粒转化至酿酒酵母中。
如下表5中所示，通过将表2中的质粒引入HB25中，由HB25基础菌株制备转基因酿酒酵母菌株HB1、HB6和HB7。菌株HB1、HB6和HB7用于比较酿酒酵母中大麻异戊烯基转移酶和AltPT的蛋白质表达水平。
| 菌株 | 基础菌株 | 质粒 |
| HB1 | HB25 | pGFP |
| HB6 | HB25 | pPTGFP |
| HB7 | HB25 | pAPTGFP |
| HB13 | HB25 | pEV |
表5：用于确认蛋白质表达和植物大麻素生产而制备的包括表达质粒的转化酵母菌株
如下表6所示，通过用表达质粒转化HB42，由HB42、HB100、HB106和HB110基础菌株制备转基因酿酒酵母HB80、HB80A、HB98、HB102、HB135、HB137和HB138，并且通过转化HB80制备HB80A。HB80、HB98和HB102各自包括和表达DiPKS。HB80A包括和表达DiPKSG1516D；G1518A。HB135、HB137和HB138各自包括和表达DiPKSG1516R。HB98包括和表达来自质粒的DiPKS和NPGa。
表6：包括表达聚酮化合物合成酶的质粒的菌株
通过用下表7中所示的表达质粒转化基础菌株，由表7中所示的基础菌株制备转基因酿酒酵母HB37、HB84、HB88、HB90、HB105和HB130。HB37和HB88各自包括和表达AltPT和OAS。HB80、HB90和HB105各自包括和表达AltPT和DiPKS。HB139包括和表达AltPT和DiPKSG1516R。
| 菌株 | 基础菌株 | 质粒1 | 质粒2 |
| HB37 | HB42 | pAltPT | pH1OAS |
| HB84 | HB42 | pAltPT | pDiPKS |
| HB88 | HB82 | pAltPT | pH1OAS |
| HB90 | HB82 | pAltPT | pDiPKS |
| HB105 | HB100 | pAltPT | pDIPKS |
| HB139 | HB106 | pAltPT | pDIPKSm2 |
表7：包括表达胞质异戊烯基转移酶的质粒的菌株
酵母生长和饲养条件
用选择性培养基在过夜培养物中生长酵母培养物以提供起始培养物。然后将得到的起始培养物用于接种一式三份50ml培养物至光密度为在600nm处的吸收率(“A600”)为0.1。表6显示了用于生长每种菌株的培养基的细节。
| 菌株 | 生长培养基 |
| HB13-HA | YNB+2％葡萄糖+1.6g/L 4DO*+0.5mM己酸 |
| HB13-No | YNB+2％棉子糖+2％半乳糖+1.6g/L 4DO* |
| HB37-HA | YNB+2％葡萄糖+1.6g/L 4DO*+0.5mM己酸 |
| HB84-No | YNB+2％棉子糖+2％半乳糖+1.6g/L 4DO* |
表8：用于酵母的生长培养基
在表8中，“4DO*”指缺乏亮氨酸和尿嘧啶的酵母合成缺失培养基补充剂。就菌株HB13而言，“HB13-HΑ”指在存在0.5mM己酸的情况下生长的HB13，并且“HB13-No”指在不存在己酸的情况下生长的HB13。在表8中，“YNB”是包括表9的前两列中列出的化学物质的营养肉汤。表9的第3和第4列中列出的化学物质包括在4DO*补充剂中。
表9：YNB营养肉汤和4DO*补充剂
代谢物的定量
使用甲醇提取从酿酒酵母细胞中提取细胞内代谢物。将1mL液体培养物以12,000×g离心3分钟。将250μl所得上清液用于细胞外代谢物定量。将得到的细胞团块悬浮于200μl的-40℃80％甲醇中。使混合物起旋涡并在冰上冷却10分钟。在冰上冷却10分钟后，将混合物在15,000×g，4℃下旋转14分钟。收集所得上清液。将另外200μl的-40℃80％甲醇加入至细胞碎片团块中，并且使混合物起旋涡并在冰上冷却10分钟。在冰上冷却10分钟后，将混合物在15,000×g，4℃下离心14分钟。将得到的200μl上清液加入到之前收集的200μl上清液中，提供总共400μl的80％甲醇和细胞内代谢物。
使用高效液相色谱(“HPLC”)和质谱(“MS”)方法定量细胞内代谢物。使用连接至ThermoFinnigan LTQ质谱仪的Agilent 1260自动进样器和HPLC系统。HPLC系统包括ZorbaxEclipseC18 2.1μm×5.6mm×100mm柱。
使用自动进样器将代谢物注入至10μl样品中，并在HPLC上使用1ml/min的流速分离。HPLC分离方案总共20分钟，其中(a)0-2分钟，98％溶剂A和2％溶剂B；(b)2-15分钟，达到98％溶剂B；(c)15-16.5分钟处于98％溶剂B；(d)16.5-17.5分钟达到98％A；和(e)在98％溶剂A下最终平衡2.5分钟。溶剂A是MS水中的乙腈+0.1％甲酸，并且溶剂B是MS水中的0.1％甲酸。
HPLC分离后，通过电喷雾电离将样品注入至质谱仪中并以正模式分析。毛细管温度保持在380℃。管透镜电压为30V，毛细管电压为0V，并且喷射电压为5kV。在HPLC-MS/MS后，CBG分析为母离子在317.2处且子离子在193.1处，而meCBG分析为母离子为331.2。类似地，在HPLC-MS/MS后，橄榄醇分析为母离子在181.2处且子离子在111处，而甲基橄榄醇分析为母离子在193.2处且子离子在125处。
注入不同浓度的已知标准品以产生线性标准曲线。CBG和meCBG的标准品购自Toronto Research Chemicals。meCBG是根据要求定制的，因为Toronto ResearchChemicals在被要求该标准品之前没有合成过该化学物质。橄榄醇和甲基橄榄醇标准品购自Sigma Aldrich。
己酸对酿酒酵母生长的影响
编码己酸生物合成所需的酶的基因未引入酿酒酵母中。而是，在包括OAS基因的酵母细胞，比如HB37中，将己酸包括在生长培养基中。
图12显示了己酸补充对酿酒酵母生长的影响。HB13在YNB+2％葡萄糖+1.6g/L4DO*+0.5mM己酸中培养。在培养36小时时加入己酸。分别以0、0.5、1.0和3.0mM的浓度将己酸加入到培养样品中。己酸对酿酒酵母有毒。在存在己酸的情况下观察到了生长减少。酿酒酵母生长减少的程度对应于生长培养基中己酸的浓度。培养物悬浮液的A600值定量了生长速率，其在图12中显示为0、0.5、1.0和3.0mM的己酸浓度。
在存在0.5mM己酸的情况下，HB13和HB37生长96小时，其中在24小时、36小时、48小时、60小时、72小时、84小时和96小时的点取样。在不存在己酸的情况下，生长HB13和HB84，并且在72小时采取单个时间点。在两个实验中都使用HB13作为对照。上面结合表8和9描述了生长培养基。
| 时间点 | HB13-HA | HB13-No | HB37-HA | HB84-No |
| 24小时 | 5.33 | (无数据) | 3.33 | (无数据) |
| 36小时 | 5.80 | (无数据) | 3.43 | (无数据) |
| 48小时 | 4.67 | (无数据) | 3.33 | (无数据) |
| 60小时 | 6.07 | (无数据) | 3.53 | (无数据) |
| 72小时 | 8.96 | 10.7 | 4.48 | 6.9 |
| 84小时 | 7.23 | (无数据) | 4.13 | (无数据) |
| 96小时 | 8.28 | (无数据) | 4.33 | (无数据) |
表10：HB13和HB37(0.5mM己酸)和HB13和HB84(无己酸)生长
如表10中所示，HB84生长快于HB37。此外，HB84不需要己酸来生产meCBG，而HB37需要己酸来生产CBG。类似地，与存在0.5mM己酸相比，HB13在不存在己酸的情况下在72小时显示出更好的生长，与图12中显示的数据一致。
图13至15各自显示表10中列出的HB37培养物的A600值(具有三角形数据点的虚线)。另外，图13至15中的每一个显示具有圆形数据点的实线的另一数据系列。
图13以具有圆形数据点的实线显示了橄榄醇产量(μg橄榄醇/L培养基)。
图14以具有圆形数据点的实线显示了CBG产量(μgCBG/L培养基)。
图15以具有圆形数据点的实线显示了培养物中存在的己酸(mg己酸/L培养基)。
图13至15一起与在50和60小时之间发生的二次转变(dioxic shift)一致。二次转变包括从葡萄糖分解代谢到乙酸和乙醇分解代谢的代谢转变。利用二次转变，许多次级代谢途径变得更加活跃，并且AltPT和OAS活性类似地增加。
图12至15和表10显示了与下述一致的数据：通过消耗己酸生产植物大麻素似乎没有在很大程度上减轻己酸毒性，直到在50和60小时之间己酸水平下降，然后继续下降。如图12和13中所示，从引入己酸开始生产橄榄醇和CBG。然而，当生产CBG并且己酸转化为橄榄醇时，培养物的A600随着橄榄醇和CBG的生产没有大幅度增加。如图15所示，仅在50和60小时之间己酸开始耗尽之后A600才增加。耗尽至少部分由于橄榄醇生产。然而，在36小时引入己酸后生产橄榄醇和CBG期间没有观察到培养物A600显著增加，直至己酸浓度耗尽。
胞质和膜结合的异戊烯基转移酶的表达
大麻异戊烯基转移酶是膜结合植物蛋白，而AltPT是胞质细菌蛋白。在酿酒酵母中应用AltPT而不是大麻异戊烯基转移酶在酵母细胞中提供更高的蛋白质表达水平。表5中所示的HB1、HB6、HB7和HB13各自在YNB、2％葡萄糖和1.6g/L 4DO*中生长过夜。在生长过夜后，将所得培养物归一化至1.0A600，然后在YNB、2％葡萄糖和1.6g/L 4DO*中生长4小时。使用BDAcuri C6流式细胞仪测量每个培养物悬浮液的荧光。
HB1表达绿色荧光蛋白(“GFP”)。HB6和HB7各自表达GFP-异戊烯基转移酶融合蛋白。HB6和HB7都不包括来自pDiPKS或pH1OAS质粒的基因。相应地，HB6和HB7都不表达聚酮化合物合成酶基因或都不包括实现图4、6或9中任何一个中的生物合成途径的所有酶。
图16显示了来自HB13(“阴性”)、HB1(“阳性”)、HB6(“异戊烯基转移酶_大麻”)和HB7(“异戊烯基转移酶_Alt”)的细胞培养物样品的平均荧光水平。荧光水平对应于蛋白质表达水平，显示HB6的大麻异戊烯基转移酶和HB7的AltPT的相对表达水平。普通膜结合的大麻异戊烯基转移酶在酿酒酵母的胞质中具有低的表达。胞质AltPT在酿酒酵母的胞质中的表达水平高于普通膜结合的大麻异戊烯基转移酶。
实施例I
如上表7中所述的酵母菌株HB37在YNB+2％葡萄糖+1.6g/L 4DO*+0.5mM己酸培养基中培养。观察到了由葡萄糖和己酸生产CBG，表明在酵母中直接生产CBG。
用0.85mM己酸以10μg/L的浓度生产CBG。在优化己酸进料和生长条件后，用0.5mM己酸生产50μg/L的CBG。
实施例II
如上表7中所述的酵母菌株HB84在YNB+2％棉子糖+2％半乳糖+1.6g/L 4DO*培养基中培养。观察到了由棉子糖和半乳糖生产meCBG，表明在没有己酸的情况下，在酵母中直接生产meCBG。生产的meCBG为42.63mg/L。与HB37的CBG产量相比，HB84生产的meCBG产量增加了近1,000倍。
图17显示了实施例I中由HB37的CBG(“CBG_C_sativa”)的产量相比于实施例II中由HB84的meCBG(“HB_CBG_me”)的产量。
实施例III
如上表6中所述的酵母菌株HB80在YNB+2％棉子糖+2％半乳糖+1.6g/L 4DO*培养基中培养。观察到了由棉子糖和半乳糖生产甲基橄榄醇，表明在酵母中直接生产甲基橄榄醇而不转化为meCBG，因为HB80缺乏AltPT。生产的甲基橄榄醇的浓度为3.259mg/L。在包括HB80的特征和AltPT或另一种异戊烯基转移酶的菌株，比如HB139中将预期发生转化为meCBG。
实施例IV
如上表6中所述的酵母菌株HB80A在YNB+2％棉子糖+2％半乳糖+1.6g/L 4DO*培养基中培养。观察到了由DiPKSG1516D；G1518A催化，由棉子糖和半乳糖生产橄榄醇和甲基橄榄醇二者。该数据表明了在没有己酸的情况下，在酵母中直接生产橄榄醇和甲基橄榄醇二者。由于HB80A缺乏AltPT，因此未发生转化为CBG和meCBG。在包括HB80A的特征和AltPT或另一种异戊烯基转移酶的菌株，比如通过用pAltPT转化HB80A中将预期发生转化为CBG和meCBG。
图18显示来自实施例III的由HB80生产的甲基橄榄醇(“甲基橄榄醇HB80”)的浓度和HB80A生产的橄榄醇和甲基橄榄醇(分别为“甲基橄榄醇HB80A”和“橄榄醇HB80A”)的浓度。在72小时对培养物取样。HB80A主要生产甲基橄榄醇(每L培养物1.4mg甲基橄榄醇，相比于每L培养物0.010mg橄榄醇)，并且生产的甲基橄榄醇和橄榄醇总量少于HB80生产的甲基橄榄醇(3.26mg/L)。
实施例V
如上表6中所述的酵母菌株HB98在YNB+2％棉子糖+2％半乳糖+1.6g/L 4DO*培养基中培养。观察到了由DiPKS催化，由棉子糖和半乳糖生产甲基橄榄醇。该数据表明，与实施例III中所述的HB80相比，甲基橄榄醇的产量增加，并且也是在不包括己酸的情况下。由于HB80A缺乏AltPT，因此未发生转化为meCBG。在包括HB98的特征和AltPT或另一种异戊烯基转移酶的菌株，比如通过用pAltPT转化HB98或用pNPGa转化的HB84中将预期发生转化为meCBG。
图19显示来自实施例III的HB80生产的甲基橄榄醇(“甲基橄榄醇HB80”)的浓度和来自实施例V的HB98生产的甲基橄榄醇(“甲基橄榄醇HB98”)的浓度。在72小时对培养物取样。HB98生产29.85mg/L甲基橄榄醇，而HB80每L培养物仅生产3.26mg甲基橄榄醇。HB98生产的甲基橄榄醇几乎是HB80的10倍。
实施例VI
如上表6中所述的酵母菌株HB102在YNB+2％棉子糖+2％半乳糖+1.6g/L 4DO*培养基中培养。观察到了由棉子糖和半乳糖生产甲基橄榄醇，表明与HB98菌株相比，甲基橄榄醇在酵母中的增加的产量为42.44mg/L，而HB98仅生产29.85mg/L甲基橄榄醇。这表明NpgA的基因整合形式是起作用的。由于HB102缺乏AltPT，因此未发生转化为meCBG。在包括HB102的特征和AltPT或另一种异戊烯基转移酶的菌株，比如HB105中将预期发生转化为meCBG。
图20显示了与实施例V中来自菌株HB98的甲基橄榄醇(“甲基橄榄醇HB98”)的生产相比，来自实施例VI的HB102生产的甲基橄榄醇(“甲基橄榄醇HB102”)的浓度。
实施例VII
如上表7中所述的酵母菌株HB105在YNB+2％棉子糖+2％半乳糖+1.6g/L 4DO*培养基中培养。观察到了以66.3mg/L的滴度由棉子糖和半乳糖生产meCBG，表明与HB84的CBG的产量相比，增加的meCBG的生产。这表明了PDH旁路和整合的NpgA对meCBG滴度的积极作用。
图21显示了与实施例II中来自菌株HB84的meCBG(“甲基_CBG HB84”)生产相比，来自实施例VII的HB105生产的meCBG(“甲基_CBG HB105”)的滴度。
实施例VIII
将如上表6中所述的酵母菌株HB135在YNB+2％棉子糖+2％半乳糖+1.6g/L4DO*培养基中培养。观察到了由棉子糖和半乳糖生产橄榄醇，表明在不含任何己酸的酵母中且以49.24mg/L的高滴度生产橄榄醇，且不生产甲基橄榄醇。这与由菌株HB102的甲基橄榄醇产量相当，表明DIPKS的突变对于生产橄榄醇而不是甲基橄榄醇有效。由于HB135缺乏AltPT，因此未发生转化为CBG和meCBG。在包括HB135的特征和AltPT或另一种异戊烯基转移酶的菌株中将预期发生转化为CBG和meCBG。
图22显示了与实施例VI中来自菌株HB102的甲基橄榄醇(“甲基橄榄醇HB102”)的生产相比，来自实施例VIII的HB135生产的橄榄醇和甲基橄榄醇(分别为“甲基橄榄醇HB135”和“橄榄醇HB135”)的浓度。
实施例IX
如上表6中所述的酵母菌株HB137和HB138在YNB+2％棉子糖+2％半乳糖+1.6g/L4DO*培养基中培养。在两个菌株中均观察到了由棉子糖和半乳糖生产橄榄醇。菌株HB137生产61.26mg/L的橄榄醇，并且菌株HB138生产74.26mg/L的橄榄醇，表明Mafl整合和Acc1-启动子交换对橄榄醇滴度的积极作用。由于HB137和HB138缺乏AltPT，因此未发生转化为CBG。在包括HB137和HB138的特征和AltPT或另一种异戊烯基转移酶的菌株中将预期发生转化为CBG。
图23显示了与相比于实施例VIII中由HB135生产的橄榄醇(“橄榄醇HB135”)的浓度相比，来自实施例IX的HB137生产的橄榄醇(“橄榄醇HB137”)的浓度和HB138生产的橄榄醇(“橄榄醇HB138”)的浓度。
实施例X
如上表7中所述的酵母菌株HB139在YNB+2％棉子糖+2％半乳糖+1.6g/L 4DO*培养基中培养。观察到了由棉子糖和半乳糖以0.03mg/L的滴度直接生产CBG。这远小于菌株HB105生产的meCBG的滴度。
图24显示了与来自实施例VII的HB105的meCBG(“meCBG HB105”)的产量和在实施例I中HB37的CBG(“CBG HB37”)的产量相比，来自实施例X的HB139由半乳糖和棉子糖直接生产的CBG(“CBG HB139”)的浓度。
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序列
下述序列以电子方式随本申请提交，但也包括在此。
只是实施例
在前面的描述中，出于解释的目的，阐述了许多细节以便提供对实施方式的透彻理解。然而，对于本领域技术人员将明显的是这些具体细节不是必须的。
上述实施方式仅期望作为实施例。在不背离仅由本文所附权利要求限定的范围的情况下，本领域技术人员可对特定实施方式进行变更、修改和变化。
Claims (47)
1.一种生产植物大麻素或植物大麻素类似物的方法，所述方法包括：
提供酵母细胞，所述酵母细胞包括编码来自盘基网柄菌的聚酮化合物合成酶的第一多核苷酸和编码胞质异戊烯基转移酶的第二多核苷酸，其中：
所述第一多核苷酸由编码来自盘基网柄菌的聚酮化合物合成酶的SEQ ID NO:38的碱基523至9966组成，包括与来自盘基网柄菌的酮化合物合成酶野生型相比，降低在C-Met结构域的活性位点处的活性的突变G1516R，
所述聚酮化合物合成酶用于由丙二酰基辅酶A生产至少一种前体化学物质，
所述前体化学物质具有结构I：
其中，在结构I上，R1是链长为1、2、3、4或5个碳的烷基，R2是H、羧基或甲基，并且R3是H、羧基或甲基；
所述聚酮化合物合成酶对于大麻不是天然的；并且
所述胞质异戊烯基转移酶用于使所述至少一种前体化学物质异戊烯化，提供至少一个种类的植物大麻素或植物大麻素类似物；和
使所述酵母细胞繁殖，用于提供酵母细胞培养物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中R1是链长为3个碳的烷基，R2是H，并且R3是H。
3.根据权利要求1所述的方法，其中R1是链长为3个碳的烷基，R2是羧基，并且R3是H。
4.根据权利要求1所述的方法，其中R1是链长为3个碳的烷基，R2是甲基，并且R3是H。
5.根据权利要求1所述的方法，其中R1是链长为3个碳的烷基，R2是羧基，并且R3是甲基。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一种前体化学物质在R2处包括甲基，并且所述至少一个种类的植物大麻素或植物大麻素类似物包括甲基化的植物大麻素类似物。
7.根据权利要求1所述的方法，其中：
所述聚酮化合物合成酶包括影响C-Met结构域的活性位点的突变，用于减轻所述至少一种前体化学物质的甲基化，使得所述至少一种前体化学物质包括其中R2是甲基并且R3是H的第一前体化学物质，和其中R2是H并且R3是H的第二前体化学物质；并且
所述至少一个种类的植物大麻素或植物大麻素类似物包括甲基化的植物大麻素类似物和未甲基化的植物大麻素。
8.根据权利要求1所述的方法，其中：
所述聚酮化合物合成酶包括降低在所述聚酮化合物合成酶的C-Met结构域的活性位点处的活性的突变，用于防止所述至少一种前体化学物质的甲基化，使得所述至少一种前体化学物质具有氢R2基团和氢R3基团；并且
所述至少一个种类的植物大麻素或植物大麻素类似物包括脱羧的植物大麻素或植物大麻素类似物。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述酵母细胞包括编码磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的第三多核苷酸，用于增加聚酮化合物合成酶的活性。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶包括来自构巢曲霉的NpgA磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述第三多核苷酸包括用于来自构巢曲霉的所述NpgA磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的编码序列，所述NpgA磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的一级结构与由SEQ ID NO:10的碱基1170至2201限定的阅读框编码的蛋白质具有100％的氨基酸残基序列同源性。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述第三多核苷酸与SEQ ID NO:10的碱基1170至2201具有100％的碱基序列同源性。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述聚酮化合物合成酶包括用于由丙二酰基辅酶A合成所述至少一种前体化学物质的活性位点，而不需要较长链的羰游基辅酶A。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述至少一种前体化学物质在R1处包括戊基，并且所述至少一个种类的植物大麻素或植物大麻素类似物包括戊基植物大麻素或甲基化的戊基植物大麻素类似物。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述至少一种前体化学物质包括橄榄醇橄榄醇酸、甲基橄榄醇或甲基橄榄醇酸中的至少一种，并且所述至少一个种类的植物大麻素或植物大麻素类似物包括CBG、CBGa、meCBG或meCBGa中的至少一种。
16.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述胞质异戊烯基转移酶包括来自链霉菌属CL190的NphB异戊烯基转移酶。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述第二多核苷酸包括用于来自链霉菌属CL190的NphB异戊烯基转移酶的编码序列，所述NphB异戊烯基转移酶的一级结构与由SEQ ID NO:44的碱基987至1913限定的阅读框编码的蛋白质具有100％的氨基酸残基序列同源性。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述第二多核苷酸与SEQ ID NO:44的碱基987至1913具有100％的碱基序列同源性。
19.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中R1是链长为5个碳的烷基，R2是H，并且R3是H。
20.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中R1是链长为5个碳的烷基，R2是羧基，并且R3是H。
21.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中R1是链长为5个碳的烷基，R2是甲基，并且R3是H。
22.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中R1是链长为5个碳的烷基，R2是羧基，并且R3是甲基。
23.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述酵母细胞包括增加可用的焦磷酸香叶酯的遗传修饰。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述遗传修饰包括Erg20酶的失活。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述酵母细胞包括Erg20多核苷酸，所述Erg20多核苷酸包括用于Erg20K197E的编码序列，所述Erg20K197E的一级结构与由SEQ ID NO:3限定的阅读框编码的蛋白质具有100％的氨基酸残基序列同源性。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述Erg20多核苷酸与SEQ ID NO:3具有100％的碱基序列同源性。
27.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述酵母细胞包括增加可用的丙二酰基辅酶A的遗传修饰。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述遗传修饰包括Maf1的增加的表达。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述酵母细胞包括Maf1多核苷酸，所述Maf1多核苷酸包括用于Maf1的编码序列，所述Maf1的一级结构与由SEQ ID NO:8的碱基936至2123限定的阅读框编码的蛋白质具有100％的氨基酸残基序列同源性。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述Maf1多核苷酸进一步包括启动子序列、终止子序列和整合序列，并且与SEQ ID NO:8具有100％的碱基序列同源性。
31.根据权利要求27所述的方法，其中所述遗传修饰包括用于增加醛脱氢酶和乙酰基辅酶A合成酶的胞质表达的修饰。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述酵母细胞包括Acs多核苷酸，所述Acs多核苷酸包括用于来自肠道沙门氏菌的AcsL641P的编码序列和用于来自酿酒酵母的Ald6的编码序列，所述AcsL641P的一级结构与由SEQ ID NO:4的碱基3938至5893限定的阅读框编码的蛋白质具有100％的氨基酸残基序列同源性，并且所述Ald6的一级结构与由SEQ ID NO:4的碱基1494至2999限定的阅读框编码的蛋白质具有100％的氨基酸残基序列同源性。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述Acs多核苷酸进一步包括启动子序列、终止子序列和整合序列，并且与SEQ ID NO:4的碱基51至7114具有100％的碱基序列同源性。
34.根据权利要求27所述的方法，其中所述遗传修饰包括用于增加丙二酰基辅酶A合成酶活性的修饰。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述酵母细胞包括Acc1多核苷酸，所述Acc1多核苷酸包括用于来自酿酒酵母的Acc1S659A；S1157A的编码序列。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述Acc1多核苷酸包括用于所述Acc1S659A；S1157A酶的编码序列，所述Acc1S659A；S1157A酶的一部分的一级结构与由SEQ ID NO:7Acc1S659A；S1157A的碱基9至1716限定的阅读框编码的蛋白质部分具有100％的氨基酸残基序列同源性。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述Acc1多核苷酸进一步包括启动子序列、终止子序列和整合序列，并且与SEQ ID NO:7具有100％的碱基序列同源性。
38.根据权利要求34所述的方法，其中所述酵母细胞包括Acc1多核苷酸，所述Acc1多核苷酸包括用于由组成型启动子调节的来自酿酒酵母的Acc1的编码序列。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述组成型启动子包括来自酿酒酵母的PGK1启动子。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述PGK1启动子与SEQ ID NO:6的碱基7至750具有100％的核苷酸同源性。
41.根据权利要求27所述的方法，其中所述遗传修饰包括用于甾醇生物合成的活化剂的增加的表达。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述酵母细胞包括Upc2多核苷酸，所述Upc2多核苷酸包括用于来自酿酒酵母的Upc2E888D的编码序列，所述Upc2E888D的一级结构与由SEQ IDNO:9的碱基975至3701限定的阅读框编码的蛋白质具有100％的氨基酸残基序列同源性。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述Upc2多核苷酸进一步包括启动子序列、终止子序列和整合序列，并且与SEQ ID NO:9具有100％的碱基序列同源性。
44.根据权利要求1所述的方法，其中所述第二多核苷酸包括用于胞质异戊烯基转移酶的编码序列，所述胞质异戊烯基转移酶的一级结构与下述中的任何一个具有100％的氨基酸残基序列同源性：SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ IDNO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ IDNO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ IDNO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ IDNO:34、SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:36。
45.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，进一步包括从所述酵母细胞培养物中提取所述至少一个种类的植物大麻素或植物大麻素类似物。
46.一种用于生产植物大麻素或植物大麻素类似物的酵母细胞，所述酵母细胞包括：
编码来自盘基网柄菌的聚酮化合物合成酶的第一多核苷酸；和
编码胞质异戊烯基转移酶的第二多核苷酸，
其中：
所述聚酮化合物合成酶由丙二酰基辅酶A生产至少一种前体化学物质，所述前体化学物质具有结构I：
其中，在结构I上，R1是链长为1、2、3、4或5个碳的烷基，R2是H、羧基或甲基，并且R3是H、羧基或甲基；
所述聚酮化合物合成酶对于大麻不是天然的；并且
所述胞质异戊烯基转移酶用于使所述至少一种前体化学物质异戊烯化，提供至少一个种类的植物大麻素或植物大麻素类似物，
其中所述第一多核苷酸由编码来自盘基网柄菌的聚酮化合物合成酶的SEQ ID NO:38的碱基523至9966组成，包括与来自盘基网柄菌的野生型聚酮化合物合成酶相比，降低在C-Met结构域的活性位点处的活性的突变G1516R。
47.一种转化用于生产植物大麻素或植物大麻素类似物的酵母细胞的方法，所述方法包括：
将编码来自盘基网柄菌的聚酮化合物合成酶的第一多核苷酸引入至酵母细胞系中；和
将编码胞质异戊烯基转移酶的第二多核苷酸引入至酵母中，
其中：
所述聚酮化合物合成酶由丙二酰基辅酶A生产至少一种前体化学物质，所述前体化学物质具有结构I：
其中，在结构I上，R1是链长为1、2、3、4或5个碳的烷基，R2是H、羧基或甲基，并且R3是H、羧基或甲基；
所述聚酮化合物合成酶对于大麻不是天然的；并且
所述胞质异戊烯基转移酶用于使所述至少一种前体化学物质异戊烯化，提供至少一个种类的植物大麻素或植物大麻素类似物，
其中所述第一多核苷酸由编码来自盘基网柄菌的聚酮化合物合成酶的SEQ ID NO:38的碱基523至9966组成，包括与来自盘基网柄菌的野生型聚酮化合物合成酶相比，降低在C-Met结构域的活性位点处的活性的突变G1516R。
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