KR20190141653A - 효모에서 폴리케티드를 제조하기 위한 세포주 및 방법 - Google Patents

효모에서 폴리케티드를 제조하기 위한 세포주 및 방법 Download PDF

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Abstract

효모에서 폴리케티드를 제조하기 위한 방법 및 세포주. 방법은 폴리케티드 신타아제 코딩 서열로 변형되는 효모 세포를 적용하고, 세포주는 폴리케티드 신타아제 CDS 및 사이토솔릭 프레닐트랜스퍼라아제(cytosolic prenyltransferase) CDS로 변형되는 효모 세포를 포함한다. 폴리케티드 신타아제 효소는 올리베톨(olivetol) 또는 메틸-올리베톨의 합성을 촉진시키고, 딕티오스텔리움 디스코이데움(Dictyostelium discoideum ) 폴리케티드 신타아제("DiPKS")를 포함할 수 있다. 야생형 DiPKS는 메틸-올리베톨만을 생성한다. DiPKS는 올리베톨 및 메틸-올리베톨의 혼합물 또는 올리베톨만을 생성하도록 형질 전환될 수 있다. 효모 세포는 DiPKS의 증가된 활성을 위해 포스포판테테이닐 트랜스퍼라아제를 포함하도록 변형될 수 있다. 효모 세포는 올리베톨 또는 메틸-올리베톨을 합성하기 위해 이용 가능한 말로닐-CoA를 증가시키기 위해 미토콘드리아 아세트알데히드 이화 작용을 완화시키기 위해 변형될 수 있다.

Description

효모에서 폴리케티드를 제조하기 위한 세포주 및 방법
(관련 출원의 상호 참조)
본 출원은 2017년 2월 17일에 출원된 METHOD AND CELL LINE FOR PRODUCTION OF PHYTOCANNABINOIDS IN YEAST 표제의 미국 가출원 특허 번호 제62/460,526의 우선권을 주장하며, 이 내용은 전체가 본 명세서에 참조로 포함된다.
본 개시는 일반적으로 효모에서 폴리케티드의 제조에 관한 것이다.
폴리케티드는 식물에서 다수의 가치 있는 2차 대사 산물의 전구체이다. 예를 들어, 삼(Cannabis sativa), 다른 식물, 및 일부 곰팡이에서 자연적으로 생산되는 파이토카나비노이드는 상당한 상업적 가치를 갖는다. 105개가 넘는 파이토카나비노이드는 삼(C. sativa)에서 생합성되거나 삼(C. sativa)에서 생합성된 파이토카나비노이드로부터 열 또는 다른 분해를 피토 카나비노이드로부터 열 또는 다른 분해로 인한 것으로 알려져 있다. 또한, 삼(C. sativa) 식물은 곡물, 섬유 및 다른 재료의 귀중한 원천이지만, 특히 실내에서 파이토카나비노이드 생산을 위해 삼(C. sativa)을 재배하는 것은 에너지와 노동의 측면에서 비용이 많이 든다. 또한, 삼(C. sativa)에서 파이토카나비노이드의 후속 추출, 정제 및 분류는 노동과 에너지 집약적이다.
파이토카나비노이드는 삼(C. sativa)의 의학적 및 향정신성 효과에 기여하는 약리학적 활성 분자이다. 삼(C. sativa) 식물에서 파이토카나비노이드의 생합성은 다른 농업 프로젝트와 유사하게 확장된다. 다른 농업 프로젝트와 마찬가지로, 삼(C. sativa)을 재배에 의한 파이토카나비노이드의 대량 생산은 다양한 투입이 필요하다(예를 들어, 영양분, 빛, 해충구제, CO2, 등). 삼(C. sativa) 배양에 필요한 투입물을 제공해야 한다. 또한, 삼(C. sativa) 배양은, 허용되는 경우, 현재 식물로부터 제조된 제품이 상업적 용도로 사용되는 경우 엄격한 규제, 세금 및 엄격한 품질 관리가 적용되므로, 비용이 더욱 증가한다. 파이토카나비노이드 유사페는 파이토카나비노이드와 구조적으로 유사한 약리학적으로 활성인 분자이다. 파이토카나비노이드 유사체는 종종 화학적으로 합성되고, 이는 노동 집약적이로 비용이 많이 들 수 있다. 결과적으로, 강력하고 확장 가능하며 발효 가능한 유기체에서 파이토카나비노이드 및 파이토카나비노이드 유사체를 생산하는 것이 경제적일 수 있다. 출아형 효모(Saccharomyces cerevisiae)는 유사한 분자의 산업적 규모로 생산하는데 사용될 수 있는 발효 가능한 유기체의 예이다.
자연적으로 발생하는 파이토카나비노이드 생산을 위한 삼(C. sativa) 배양과 관련된 시간, 에너지 및 노동은 다른 수단에 의해 파이토카나비노이드의 생산을 위한 형질 전환된 세포주를 생산하는 동기를 제공한다. 올리베톨산 및 이의 유사체를 포함하는 폴리케티드는 파이토카나비노이드의 가치 있는 전구체이다.
본 발명의 목적은 삼(C. sativa) 식물의 외측에서 파이토카나비노이드를 제조하는 것에 대한 이전 접근법, 및 파이토카나비노이드 유사체의 제조하는 것에 대한 이전 접근법의 단점 중 적어도 하나를 완화 또는 제거시키는 것이다. 삼(Cannabis sativa)에서 발견되는 105개의 파이토카나비노이드 중 다수는 올리베톨산 및 올리베톨로부터 생합성될 수 있다. 또한, 파이토카나비노이드 및 이의 유사체는 올리베톨 및 다른 시약으로부터 화학적으로 합성될 수 있다. 또한, 올리베톨 및 올리베톨산은 약제학적 또는 영양학적 제품 개발에도 사용될 수 있다. 결과적으로, 올리베톨, 올리베톨산 또는 올리베톨 또는 올리베톨산의 유사체의 효모 기반 생산을 개선하는 것이 바람직할 수 있다. 마찬가지로, 노동 집약적 합성의 필요 없이 파이토카나비노이드 유사체를 생산하기 위한 접근법이 바람직할 수 있다.
본 명세서에 제공되는 방법 및 세포주는 딕티오스텔리움 디스코이데움 폴리케티드 신타아제(Dictyostelium discoideum polyketide synthase, "DiPKS")의 유전자를 포함하도록 형질 전환되는 출아형 효모(Saccharomyces cerevisiae)를 적용 및 포함할 수 있다. DiPKS는 유형 I 지방산 신타아제("FAS")와 폴리케티드 신타아제("PKS")로 이루어진 융합 단백질이고, 하이브리드 "FAS- PKS" 단백질이라고 한다. DiPKS는 말로닐-CoA로부터 메틸-올리베톨의 합성을 촉진시킨다. 반응은 말로닐-CoA 대 메틸-올리베톨을 6:1 화학양론적 비율로 갖는다. 다운스트림에 있는 프레닐트랜스퍼라아제 효소는 올리베톨산 및 GPP로부터 카나비게롤산("CBGa")의 합성과 유사하게 게라닐 파이로포스페이트(" GPP ") 및 메틸-올리베톨로부터 메틸 카나비게롤("meCBG")의 합성을 촉진시킨다. 헥사노익산은 출아형 효모(S. cerevisiae)에 독성이다. 헥사노일-CoA는 삼(C. sativa) 올리베톨산 신타아제("OAS")에 의해 올리베톨의 합성을 위한 전구체이다. 결과적으로, OAS 대신에 DiPKS를 사용하는 경우, 헥사노익산은 성장 배지에 첨가될 필요가 없고, 이는 OAS를 사용하는 경우에 CBG의 수율과 비교하여 meCBG의 더 큰 수율 및 출아형 효모(S. cerevisiae) 배양물의 증가된 성장을 초래할 수 있다. 또한, 삼(C. sativa)에서, 올리베톨은 올리베톨산 시클라아제("OAC") 또는 다른 폴리케티드 시클라아제의 존재하에 올리베톨산으로 카르복실화되고, 이는 CBGa 합성 대사 경로로 공급되어, 막-결합 프레닐트랜스퍼라아제에 의해 삼(C. sativa)에 의해 촉진된 올리베톨산의 프레닐화를 시작한다. 올리베톨산 대신에 올리베톨 또는 메틸-올리베톨을 생산하는 옵션은 파이토카나비노이드의 탈카르복실화 종 및 파이토카나비노이드의 메틸화 유사체의 제조를 용이하게 할 수 있다.
일부 적용에서, meCBG 및 meCBG로부터 합성될 수 있는 메틸화된 다운스트림에 있는 파이토카나비노이드 유사체(삼(C. sativa)에서 CBGa로부터 합성되는 다운스트림에 있는 파이토카나비노이드와 유사한)는 가치가 있을 수 있다. 다른 경우에, 자연적으로 발생하는 파이토카나비노이드의 탈카르복시화 형태와 구조적으로 동일한 파이토카나비노이드가 더욱 바람직할 수 있다. 자연적으로 발생하는 파이토카나비노이드의 탈카르복시화 형태와 구조적으로 동일한 파이토카나비노이드의 제조를 위해, DiPKS는 올리베톨의 메틸화를 감소시키기 위해 야생형 DiPKS에 비해 변형되어, 올리베톨 및 메틸-올리베톨의 합성을 초래할 수 있다.
올리베톨 및 메틸-올리베톨의 합성은 사이토졸에서 증가된 레벨의 말로닐-CoA에 의해 용이해질 수 있다. 출아형 효모(S. cerevisiae)는 본래의 아세트알데히드 데하이드로게나아제의 과발현 및 변이체 아세틸-CoA 신타아제 또는 다른 유전자의 발현을 가질 수 있고, 이러한 변이는 미토콘드리아의 아세트알데히드의 이화 작용을 낮출 수 있다. 아세트알데히드를 아세틸-CoA 생산으로 전환함으로써 미토콘드리아의 아세트알데히드 이화 작용을 낮추면 올리베톨의 합성에 이용 가능한 말로닐-CoA를 증가시킨다. Acc1은 천연 효모 말로닐 CoA 신타아제이다. 출아형 효모(S. cerevisiae)는 증가된 활성을 위해 Acc1의 과발현 또는 Acc1의 변형을 가질 수 있고, 이용 가능한 말로닐-CoA를 증가시킬 수 있다. 출아형 효모(S. cerevisiae)는 Maf1의 변형된 발현 또는 tRNA 생합성의 다른 조절제를 포함할 수 있다. 천연 Maf1의 과발현은 이소펜틸 파이로포스페이트("IPP")의 tRNA 생합성으로의 손실을 감소시켜, 효모에서 모노테르펜 수율을 개선시키는 것을 보여준다. IPP는 메발로네이트 경로(mevalonate pathway)에서 중간체이다. Upc2는 출아형 효모(S. cerevisiae)에서 스테롤 생합성을 위한 활성화제이며, Upc2의 Glu888Asp 돌연변이는 효모에서 모노테르펜(monoterpene) 생산을 증가시킬 수 있다. 출아형 효모는 DiPKS의 활성을 증가시키기 위해 보조인자 적재 효소(co-factor loading enzyme)를 포함할 수 있다. 야로위아 리포리티카(Yarrowia lipolytica ), 클루이베로마이세스 마르시아누스(Kluyveromyces marxianus ), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis ), 로도스포리디움 토룰로이데스(Rhodosporidium toruloides), 크립토코커스 쿠르바투스( Cryptococcus curvatus ), 트리코스포론 풀루란(Trichosporon pullulan ) 및 리포마이시스 리포퍼(lipomyces lipofer) 등을 포함하는 다른 효모종이 적용될 수 있다.
제1 측면에서, 효모에서 폴리케티드를 제조하기 위한 방법 및 세포주가 본 명세서에 제공된다. 상기 방법은 폴리케티드 신타아제 코딩 서열로 형질 전환되는 효모 세포를 적용하고, 세포주는 폴리케티드 신타아제 코딩 서열로 형질 전환되는 효모 세포를 포함한다. 폴리케티드 신타아제 효소는 올리베톨(olivetol) 또는 메틸-올리베톨의 합성을 촉진시키고, 딕티오스텔리움 디스코이데움 폴리케티드 신타아제(Dictyostelium discoideum polyketide synthase, "DiPKS")를 포함할 수 있다. 야생형 DiPKS는 메틸-올리베톨만을 생성한다. DiPKS는 올리베톨 및 메틸-올리베톨의 혼합물 또는 올리베톨만을 생성하도록 형질 전환될 수 있다. 효모 세포는 DiPKS의 증가된 활성을 위해 포스포판테테이닐 트랜스퍼라아제를 포함하도록 변형될 수 있다. 효모 세포는 올리베톨 또는 메틸-올리베톨을 합성하기 위해 이용 가능한 말로닐-CoA를 증가시키기 위해 미토콘드리아 아세트알데히드의 이화 작용을 완화시키기 위해 변형될 수 있다.
다른 측면에서, 폴리케티드의 제조방법이 본 명세서에 제공되고, 상기 방법은, 폴리케티드 신타아제 효소(polyketide synthase enzyme)를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드를 포함하는 효모 세포를 제공하는 단계, 및 효모 세포 배양액을 제공하기 위해 효모 세포를 증식시키는 단계를 포함한다. 폴리케티드 신타아제 효소는 말로닐-CoA로부터 적어도 하나의 폴리케티드의 종을 생성하기 위한 것이고, 상기 폴리케티드는 하기 화학식 I을 갖는 것이다:
[화학식 I]
Figure pct00001
.
상기 화학식 I에서, R1은 펜틸기이다. 상기 화학식 I에서, R2는 H, 카르복실, 또는 메틸이다. 상기 화학식 I에서, R3은 H, 카르복실, 또는 메틸이다.
일부 양태에서, 상기 폴리케티드 신타아제 효소는 딕티오스텔리움 디스코이데움(D. discoideum)으로부터의 DiPKS 폴리케티드 신타아제 효소를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 제1 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:13의 535 내지 9978번째 염기로 정의되는 리딩 프레임에 의해 코딩된 단백질과 80 % 내지 100 %의 아미노산 잔기 서열 상동성을 갖는 1차 구조를 갖는 DiPKS 폴리케티드 신타아제 효소에 대한 코딩 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 상기 제1 폴리펩티드는 SEQ ID NO:13의 535 내지 9978번째 염기와 80 % 내지 100 %의 염기 서열 상동성을 갖는다. 일부 양태에서, 상기 적어도 하나의 폴리케티드의 종은 R2에서 메틸기를 갖는 폴리케티드를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 DiPKS 폴리케티드 신타아제 효소는 적어도 하나의 폴리케티드의 종의 메틸화를 완화시키기 위해 C-Met 도메인의 활성 부위에 영향을 미치는 돌연변이를 포함하여, R2가 메틸이고, R3이 H인 제1 폴리케티드, 및 R2가 H이고, R3이 H인 제2 폴리케티드의 종을 포함하는 적어도 하나의 폴리케티드의 종을 생성한다. 일부 양태에서, 상기 DiPKS 폴리케티드 신타아제는 DiPKSG1516D ; G1518A 폴리케티드 신타아제를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 제1 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:9의 523 내지 9966번째 염기로 정의되는 리딩 프레임에 의해 코딩된 단백질과 80 % 내지 100 %의 아미노산 잔기 서열 상동성을 갖는 1차 구조를 갖는 DiPKSG1516D;G1518A 폴리케티드 신타아제 효소에 대한 코딩 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 상기 제1 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:9의 523 내지 9966번째 염기와 80 % 내지 100 %의 염기 서열 상동성을 갖는다. 일부 양태에서, 상기 DiPKS 폴리케티드 신타아제는 DiPKSG1516R 폴리케티드 신타아제를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 제1 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:10의 523 내지 9966번째 염기로 정의되는 리딩 프레임에 의해 코딩된 단백질과 80 % 내지 100 %의 아미노산 잔기 서열 상동성을 갖는 1차 구조를 갖는 DiPKSG1516R 폴리케티드 신타아제 효소에 대한 코딩 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 상기 제1 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:10의 523 내지 9966번째 염기와 80 % 내지 100 %의 염기 서열 상동성을 갖는다. 일부 양태에서, 상기 DiPKS 폴리케티드 신타아제 효소는 적어도 하나의 폴리케티드의 종의 메틸화를 억제하기 위해 DiPKS 폴리케티드 신타아제 효소의 C-Met 도메인의 활성 부위에서 변이 감소 활성을 포함하여, 수소 R2기 및 수소 R3기를 갖는 적어도 하나의 폴리케티드의 종을 생성한다. 일부 양태에서, 상기 효모 세포는 DiPKS의 활성을 증가시키기 위해 포스포판테테이닐 트랜스퍼라아제 효소(phosphopantetheinyl transferase enzyme)를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 포스포판테테이닐 트랜스퍼라아제는 아스페르길루스 니둘란스(A. nidulans)로부터 NpgA 포스포판테테이닐 트랜스퍼라아제 효소를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 제2 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:8의 1170 내지 2201번째 염기로 정의되는 리딩 프레임에 의해 코딩된 단백질과 80 % 내지 100 %의 아미노산 잔기 서열 상동성을 갖는 1차 구조를 갖는 아스페르길루스 니둘란스(A. nidulans)로부터의 NpgA 포스포판테테이닐 트랜스퍼라아제 효소에 대한 코딩 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 상기 제2 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:8의 1170 내지 2201번째 염기와 80 % 내지 100 %의 염기 서열 상동성을 갖는다.
일부 양태에서, 상기 폴리케티드 신타아제 효소는 더 장쇄 케틸-CoA 없이 말로닐-CoA로부터 적어도 하나의 폴리케티드의 종을 합성하기 위한 활성 부위를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 적어도 하나의 폴리케티드의 종은 올리베톨(olivetol) 올리베톨산, 메틸-올리베톨, 또는 메틸-올리베톨산 중 적어도 하나를 포함한다.
일부 양태에서, R2는 H이고, R3은 H이다.
일부 양태에서, R2는 카르복실이고, R3은 H이다.
일부 양태에서, R2는 메틸이고, R3은 H이다.
일부 양태에서, R2는 카르복실이고, R3은 메틸이다.
일부 양태에서, 상기 효모 세포는 이용 가능한 말로닐-CoA를 증가시키기 위한 유전적 변형을 포함한다. 일부 양태에서, 상기 유전적 변형은 Maf1의 증가된 발현을 포함한다. 일부 양태에서, 상기 효모 세포는 SEQ ID NO:6의 936 내지 2123번째 염기로 정의되는 리딩 프레임에 의해 코딩된 단백질과 80 % 내지 100 %의 아미노산 잔기 서열 상동성을 갖는 1차 구조를 갖는 Maf1에 대한 코딩 서열을 포함하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 제2 폴리뉴클레오티드는 프로모터 서열, 터미네이터 서열 및 인터그레이션 서열을 더 포함하고, SEQ ID NO:6과 80 % 내지 100 %의 염기 서열 상동성을 갖는다. 일부 양태에서, 상기 유전적 변형은 알데히드 데하이드로게나아제(aldehyde dehydrogenase) 및 아세틸-CoA 신타아제의 사이토솔릭 발현을 포함한다. 일부 양태에서, 상기 효모 세포는 SEQ ID NO:2의 3938 내지 5893번째 염기로 정의되는 리딩 프레임에 의해 코딩된 단백질과 80 % 내지 100 %의 아미노산 잔기 서열 상동성을 갖는 1차 구조를 갖는 살모넬라 엔테리카(S. enterica)의 AcsL641P에 대한 코딩 서열, 및 SEQ ID NO:2의 1494 내지 2999번째 염기로 정의되는 리딩 프레임에 의해 코딩된 단백질과 80 % 내지 100 %의 아미노산 잔기 서열 상동성을 갖는 1차 구조를 갖는 출아형 효모(S. cerevisiae)로부터의 Ald6에 대한 코딩 서열을 포함하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 제2 폴리뉴클레오티드는 프로모터 서열, 터미네이터 서열 및 인터그레이션 서열을 더 포함하고, SEQ ID NO:2의 51 내지 7114번째 염기와 80 % 내지 100 %의 염기 서열 상동성을 갖는다. 일부 양태에서, 상기 유전적 변형은 말로닐-CoA 신타아제의 증가된 활성을 포함한다. 일부 양태에서, 상기 효모 세포는 출아형 효모(S. cerevisiae)로부터의 Acc1S659A;S1167A에 대한 코딩 서열을 포함하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 제2 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:5의 9 내지 1716번째 염기로 정의되는 리딩 프레임에 의해 코딩된 단백질 부분과 80 % 내지 100 %의 아미노산 잔기 서열 상동성을 갖는 1차 구조를 갖는 부분을 갖는 Acc1S659A;S1167A 효소에 대한 코딩 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 상기 제2 폴리뉴클레오티드는 프로모터 서열, 터미네이터 서열 및 인터그레이션 서열을 더 포함하고, SEQ ID NO:5와 80 % 내지 100 %의 염기 서열 상동성을 갖는다. 일부 양태에서, 상기 유전적 변형은 스테롤 생합성을 위한 활성화제의 증가된 발현을 포함한다. 일부 양태에서, 상기 효모 세포는 SEQ ID NO:7의 975 내지 3701번째 염기로 정의되는 리딩 프레임에 의해 코딩된 단백질과 80 % 내지 100 %의 아미노산 잔기 서열 상동성을 갖는 1차 구조를 갖는 출아형 효모(S. cerevisiae)로부터의 Upc2E888D에 대한 코딩 서열을 포함하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 제2 폴리뉴클레오티드는 프로모터 서열, 터미네이터 서열 및 인터그레이션 서열을 더 포함하고, SEQ ID NO:7과 80 % 내지 100 %의 염기 서열 상동성을 갖는다.
일부 양태에서, 효모 세포 배양액으로부터 적어도 하나의 폴리케티드의 종을 추출하는 단계를 포함한다.
다른 측면에서, 적어도 하나의 폴리케티드의 종을 제조하기 위한 효모 세포가 제공된다. 상기 효모 세포는, 폴리케타이드 신타아제 효소를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 양태에서, 본 명세서에 기재되는 효모 세포, 제1 폴리뉴클레오티드, 또는 제2 폴리뉴클레오티드 중 하나 이상의 특징들은 효모 세포 내에 포함된다.
다른 측면에서, 적어도 하나의 폴리케티드의 종을 제조하기 위해 효모 세포를 변형하는 방법이 제공되고, 상기 방법은, 효모 세포주에 폴리케타이드 신타아제 효소를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드를 도입하는 단계를 포함한다.
일부 양태에서, 본 명세서에 기재되는 효모 세포, 제1 폴리뉴클레오티드, 또는 제2 폴리뉴클레오티드 중 하나 이상의 특징들은 효모 세포로 포함된다.
다른 측면에서, 폴리케티드를 제조하는 방법이 본 명세서에 제공되고, 상기 방법은, 폴리케티드 신타아제 효소(polyketide synthase enzyme)를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드를 포함하는 효모 세포를 제공하는 단계, 및 효모 세포 배양액을 제공하기 위해 효모 세포를 증식시키는 단계를 포함한다. 상기 폴리케티드 신타아제 효소는 말로닐-CoA로부터 적어도 하나의 폴리케티드의 종을 생성하기 위한 것이고, 상기 폴리케티드는 하기 화학식 II를 갖는 것이다:
[화학식 II]
Figure pct00002
.
상기 화학식 II에서, R1은 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 탄소원자의 쇄 길이를 갖는 알킬기이다. 상기 화학식 II에서, R2는 H, 카르복실, 또는 메틸이다. 상기 화학식 II에서, R3은 H, 카르복실, 또는 메틸이다.
일부 양태에서, 본 명세서에 기재되는 효모 세포, 제1 폴리뉴클레오티드, 또는 제2 폴리뉴클레오티드 중 하나 이상의 특징들은 상기 방법에 적용된다.
다른 측면에서, DiPKSG1516D; G1518A 폴리케티드 신타아제에 대한 코딩 서열을 포함하는 뉴클레오티드가 본 명세서에 제공된다. 일부 양태에서, 제45항의 폴리뉴클레오티드에 있어서, DiPKSG1516D; G1518A 폴리케티드 신타아제 효소는 SEQ ID NO: 9의 523 내지 9966번째 염기로 정의되는 리딩 프레임에 의해 코딩된 단백질과 80 % 내지 100 %의 아미노산 잔기 서열 상동성을 갖는 1차 구조를 갖는다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 9의 523 내지 9966번째 염기와 80% 내지 100% 염기 서열 상동성을 갖는다.
다른 측면에서, DiPKSG1516R 폴리케티드 신타아제에 대한 코딩 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 본 명세서에 제공된다. 일부 양태에서, DiPKSG1516R 폴리케티드 신타아제 효소는 SEQ ID NO: 10의 523 내지 9966번째 염기로 정의되는 리딩 프레임에 의해 코딩된 단백질과 80 % 내지 100 %의 아미노산 잔기 서열 상동성을 갖는 1차 구조를 갖는다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 10의 523 내지 9966번째 염기와 80 % 내지 100 % 염기 서열 상동성을 갖는다.
다른 측면에서, SEQ ID NO: 9의 523 내지 9966번째 염기로 정의되는 리딩 프레임에 의해 코딩된 단백질과 80 % 내지 100 %의 아미노산 잔기 서열 상동성을 갖는 1차 구조를 갖는 DiPKSG1516D ; G1518A 폴리케티드 신타아제가 본 명세서에 제공된다.
다른 측면에서, SEQ ID NO: 10의 523 내지 9966번째 염기로 정의되는 리딩 프레임에 의해 코딩된 단백질과 80 % 내지 100 %의 아미노산 잔기 서열 상동성을 갖는 1차 구조를 갖는 DiPKSG1516R 폴리케티드 신타아제가 본 명세서에 제공된다.
본 발명의 다른 측면들 및 특징들은 첨부 도면들과 관련하여 이하의 특정 양태의 설명을 검토할 때 당업자에게 명백해질 것이다.
본 발명의 양태는 첨부 도면을 참조하여 단지 실시예에 의해 기재될 것이다.
도 1은 삼(C. sativa)에서 다양한 알킬기 쇄 길이를 갖는 올리베톨산 및 관련 화합물의 생합성의 개략도이고;
도 2는 삼(C. sativa)에서 핵사노익산, 말로닐-CoA, 및 게라닐 파이로포스페이트로부터 CBGa의 생합성의 개략도이고;
도 3은 삼(C. sativa)에서 CBGa로부터 산 형태로 다운스트림에 있는 파이토카나비노이드의 생합성의 개략도이고;
도 4는 DiPKS에 의해 형질전환된 효모 세포에서 올리베톨산의 생합성의 개략도이고;
도 5는 메틸-올리베톨로부터 형질전환된 효모 세포에서 다운스트림에 있는 메틸화된 파이토카나비노이드 유사체 및 meCBG의 생합성의 개략도이고;
도 6은 메틸-올리베톨로부터 형질전환된 효모 세포에서 다운스트림에 있는 메틸화 파이토카나비노이드 유사체 및 meCBG의 생합성의 개략도이고;
도 7은 올리베톨의 메틸화를 낮추기 위한 C-메틸 트랜스퍼라아제에 대한 돌연변이를 갖는 DiPKS의 기능성 도메인의 개략도이고;
도 8은 DiPKSG1516D ; G1518A에 의해 형질전환된 효모 세포에서 메틸-올리베톨 및 올리베톨의 생합성의 개략도이고;
도 9는 DiPKSG1516R에 의해 형질전환된 효모 세포에서 올리베톨의 생합성의 개략도이고;
도 10은 DiPKSG1516D ; G1518A에 의한 메틸-올리베톨 및 올리베톨의 생성 및 DiPKS에 의한 메틸-올리베톨의 생산을 도시하고;
도 11은 출아형 효모(S. cerevisiae)의 2개의 분리된 균주에서 DiPKS에 의한 메틸-올리베톨의 생성을 도시하고;
도 12는 출아형 효모(S. cerevisiae)의 2개의 분리된 균주에서 DiPKS에 의한 메틸-올리베톨의 생성을 도시하고;
도 13은 출아형 효모(S. cerevisiae)의 2개의 분리된 균주에서 DiPKS에 의한 메틸-올리베톨의 생성, 및 DiPKSG1516R에 의한 올리베톨 및 메틸-올리베톨의 생성을 도시하고; 및
도 14는 출아형 효모(S. cerevisiae)의 3개의 분리된 균주에서 DiPKSG1516R에 의한 올리베톨의 생성을 도시한다.
일반적으로, 본 발명은 삼(Cannabis sativa) 식물에서 자연적으로 생합성된 올리베톨산과 유사한 올리베톨 및 메틸-올리베톨을 생산하는 방법 및 효모 세포주를 제공한다. 올리베톨 및 메틸-올리베톨은 형질전환된 효모에서 생산될 수 있다. 본 명세서에 제공되는 방법 및 세포주는 삼(C. sativa) 식물에 없는 효소에 대한 유전자의 적용을 포함한다. 삼 OAS 및 OAC를 사용하는 접근법과 비교하여, 본 명세서에 제공되는 방법 및 세포주는 올리베톨산 대신 올리베톨 및 메틸-올리베톨이 합성되고, 이는 탈카르복실화 파이토카나비노이드의 생합성, 메틸화 파이토카나비노이드 유사체의 생합성, 및 출아형 효모(S. cerevisiae) 및 다른 효모종에 독성이 있는 헥사노익산의 투입 없이 파이토카나비노이드의 생합성 제조를 포함하여 하나 이상의 이점을 제공할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 "탈카르복실화"는 △9-테트라하이드로카나비놀("THC")의 위치 2 또는 4, 또는 삼(C. sativa)에서 CBGa의 생합성의 전구체인 올리베톨산의 위치 4에 대응하는 다른 파이토카나비노이드 또는 유사체에서의 등가의 위치에서 산 기가 없는 파이토카나비노이드 또는 카나비노이드 유사체의 형태를 지칭한다. 파이토카나비노이드의 산 형태는 삼(C. sativa)에서 올리베톨산으로부터 생합성된다. 파이토카나비노이드의 산 형태가 가열되면, 파이토카나비노이드의 방향족 고리와 카르복실기 사이의 결합이 깨진다. 탈카르복실화는 삼(C. sativa)에서 생산되는 카르복실화 파이토카나비노이드의 가열을 일으키는데, 이는 일반적으로 약 110 ℃ 초과의 온도까지 연소 또는 가열 동안 빠르게 일어난다. 간략화를 위해, 본 명세서에 사용되는, "탈카르복실화된"은 파이토카나비노이드가 진정한 탈카르복실화 동안 손실되거나 카르복실기 없이 생합성된 산기를 포함했는지 여부에 관계 없이 산기가 부족한 파이토카나비노이드를 말한다.
도 1은 삼(C. sativa)에서 발생하는 것과 같이 말로닐-CoA 및 헥사노일-CoA의 폴리케티드 축합 생성물로부터 올리베톨산의 생합성을 도시한다. 올리베톨산은 CBGa의 대사 전구체이다. CBGa는 하기 추가 설명에 기재되는 바와 같이 다운스트림에 있는 다수의 파이토카나비노이드에 전구체이다. 대부분의 삼(C. sativa)에서, 대다수의 파이토카나비노이드는 펜틸-카나비노이드이고, 이는 올리베톨산으로부터 생합성되고, 결국 말로닐-CoA 및 헥사노일-CoA를 2:1의 화학양론비로 합성된다. 일부 프로필-카나비노이드가 관측되고, 널리 사용되는 3문자 축약(예를 들어, 테트라하이드로카나비바린(tetrahydrocannabivarin)은 보통 "THCv"라 하고, 카나비디바린(cannabidivarin)은 보통 "CBDv"이라 하는 등)에서 "v" 접미사로 식별된다. 또한, 도 1은 말로닐-CoA와 n-부틸-CoA의 축합으로부터 디바리놀릭산(divarinolic acid)의 생합성을 도시한다.
또한, 도 1은 말로닐-CoA와 아세틸-CoA의 축합으로부터 오르셀린산(orsellinic acid)을 생합성하여, 다운스트림에서 메틸-파이토카나비노이드를 제공하는 것을 도시한다. 본 맥락에서 용어 "메틸-파이토카나비노이드"는, 이들의 알킬 측쇄가 메틸기이며, 대부분의 파이토카나비노이드가 알킬 측쇄 상에서 펜틸기를 가지고, 바리닉 파이토카나비노이드(varinnic phytocannabinoid)가 알킬 측쇄 상에 프로필기를 갖는 것을 의미한다. meCBG 및 다른 메틸화 파이토카나비노이드 유사체를 "메틸화"라고 하는 맥락은 "메틸-파이토카나비노이드" 및 도 1에서 접두사로서 "메틸"을 사용하는 것과 상이하고 유사하다. 마찬가지로, 올리베톨이 정의된 길이의 측쇄를 갖기 때문에(그렇지 않으면, 이는 "올리베톨"이 아닌 도 1에 도시된 다른 3개의 폴리케티드 중 하나일 것임), 메틸-올리베톨은 짧은 측쇄가 아닌 고리 상의 메틸화에 대한 기준(reference)이다.
또한, 도 1은 말로닐-CoA와 발레릴-CoA의 축합으로부터 2,4-디올-6-프로필벤제노익산을 생합성하여, 다운스트림에 부틸-파이토카나비노이드를 제공하는 것을 도시한다.
도 2는 도 1에 도시되는 올리베톨산 생합성 단계를 포함하여, 삼(C. sativa)에서 헥사노익산, 말로닐-CoA, 및 게라닐 파이로포스페이트("GPP")로부터 CBGa의 생합성을 도시한다. 헥사노익산은 헥사노일-CoA 신타아제("Hex1; 도 2에서 반응 1)에 의해 보조효소 A로 활성화된다. 폴리케티드 신타아제(올리베톨산이 아닌 올리베톨의 합성에도 불구하고 올리베톨산 신타아제 "OAS" 라고도 함) 및 OAC는 헥사노일 CoA 및 말로닐-CoA로부터 올리베톨산의 생산을 함께 촉진시킨다(도 2에서 반응 2). 프레닐트랜스퍼라아제는 올리베톨산과 GPP를 결합하여, 도 2에서 CBGa 3단계를 제공한다.
도 3은 CBGa로부터 삼(C. sativa)에서 파이토카나비노이드의 다운스트림에 있는 산 형태의 생합성을 도시한다. CBGa는 THCa 신타아제에 의해 △9-테트라하이드로카나비놀산(cannabinolic acid, "THCa")으로 산화하여 고리화된다. CBGa는 CBDa 신타아제에 의해 카나비디올산(cannabidiolic acid, "CBDa")으로 산화하여 고리화된다. 또한, 다른 파이토카나비노이드는 다른 신타아제 효소에 의해, 또는 생성되는 파이토카나비노이드 구조의 관점에서 효소 활성에 영향을 미치는 방법으로 식물 세포 내에서 조건을 변경함으로써, 삼(C. sativa) 내에서 카나비크로메닉산(cannabichromenic acid, "CBCa"), 카나비엘소이닉산(cannabielsoin, "CBEa"), 이소-테트라하이드로카나비놀산(iso-tetrahydrocannabinolic acid, "iso- THCa"), 카나비사이클로릭산(cannabicyclolic acid, "CBLa"), 또는 카나비시트라닉산(cannabicitrannic acid, "CBTa")과 같이 합성된다. 이러한 일반적인 파이토카나비노이드 유형의 각각의 산 형태는 도 3에 도시되고, 알킬 측쇄를 나타내는 일반적인 "R"기는 올리베톨산이 헥사노일-CoA 및 말로닐-CoA로부터 합성되는 5개의 탄소원자의 쇄이다. 일부 경우에, 카르복실기는 대안적으로 도 3에 도시되는 위치로부터 R 기에 대향하는 환 위치 상에서 발견된다(예를 들어, 도 3에 도시되는 바와 같이, 위치 2 대신 THC의 위치 4, 등). 도 3에 도시되는 파이토카나비노이드의 산 형태의 탈카르복실화 형태는 각각 THC, 카나비디올(cannabidiol, "CBD"), 카나비크롬(cannabichromene, "CBC"), 카나비엘소인(cannabielsoin, "CBE"), 이소-테트라하이드로카나비놀(iso-tetrahydrocannabinol, "iso-THC"), 카나비사이클로일(cannabicyclol, "CBL"), 또는 카나비시트란(cannabicitran, "CBT")이다.
도 4는 말로닐-CoA로부터 메틸-올리베톨의 생산을 위한 형질 전환된 효모에서의 생합성 경로를 도시한다. 도 4에 도시되는 바와 같이 메틸-올리베톨을 생산하기 위한 본 명세서에 제공되는 효모 균주는 DiPKS 효소를 포함할 수 있고, 이는 배지에서 헥사노익산을 필요로 하지 않고, 오직 말로닐-CoA로부터 폴리케티드의 생산을 지지한다. 상술한 바와 같이, DiPKS는 지방산 신타아제에서 발견되는 도메인, 메틸트랜스퍼라아제 도메인, 및 Pks III 도메인과 유사한 기능적 도메인을 포함하고(도 7 참조), 따라서 FAS-PKS라고도 한다. 야생형 DiPKS 유전자를 코딩하는 코돈 최적화된 합성 서열을 포함하는 효모 균주의 예는 "HB80", 및 "HB98"로 제공되고, 이들 각각은 표 3에 기재된다.
도 5 및 6은 meCBG를 제공하고, 프레닐기 공여체로서 GPP를 사용하는 메틸-올리베톨의 프레닐화를 도시한다(도 4의 반응 1에 이어,도 5 및 6의 반응 2). OAS 대신 DiPKS의 적용은 헥사노익산 보충물 없이 파이토카나비노이드 및 파이토카나비노이드 유사체의 생산을 용이하게 한다. 헥사노익산이 출아형 효모(S. cerevisiae)에 독성이기 때문에, CBG 또는 meCBG의 생합성 경로에서 헥사노익산의 필요성을 제거하는 것은 OAS 및 Hex1을 발현하는 효모 세포에서 CBG의 수율보다 CBG 또는 meCBG의 더 큰 수율을 제공할 수 있다.
도 5 및 6은 각각 THC, CBD, CBC, CBE, 이소-THC, CBL, 및 CBT의 메틸화 유사체인 메틸-테트라하이드로카나비놀(methyl-tetrahydrocannabinol, "meTHC"), 메틸-카나비디올(methyl-cannabidiol, "meCBD"), 메틸-카나비크롬(methyl-cannabichromene, "meCBC"), 메틸-카나비엘소인(methyl-cannabielsoin, "meCBE"), 이소-메틸-테트라하이드로카나비놀(iso-methyl-tetrahydrocannabinol, "iso-meTHC"), 메틸-카나비사이클롤(methyl-cannabicyclol, "meCBL"), 또는 메틸-카나비시트란(methyl-cannabicitran, "meCBT")에 대응하는 다운 스트림에 있는 메틸화된 파이토카나비노이드 유사체를 도시하고, 이들은 메틸-올리베톨이 올리베톨산 또는 올리베톨 대신에 전구체 화학 물질로서 제공되는 경우에 제조될 수 있다. 이러한 메틸화 파이토카나비노이드 유사체의 각각의 탈카르복실화 형태는 도 5 및 6에 도시되고, 알킬 측쇄를 나타내는 일반적인 "R"기는 단지 헥사노일-CoA 및 말로닐-CoA, 또는 말로닐-CoA로부터 합성이 일어나는 5개의 탄소원자의 쇄이다.
meCBD 이외에도, 도 5 및 6에 도시된 다운스트림에 있는 파이토카나비노이드 유사체의 각각의 구조의 일부는 방향족 고리로 결합되는 회전 구속된 기를 포함한다. 결과적으로, meCBD 이외에 도 5 및 6에 도시된 각각의 다운스트림에 있는 파이토카나비노이드 유사체는 2개의 회전 이성질체 중 하나에서 meCBG로부터 합성될 수 있다. 합성 동안 meCBG의 회전 이성질체에 따라, 고리화된 메틸화 파이토카나비노이드 유사체를 생성하는 메틸기는 도 5에서 meTHC, meCBC, meCBE, 이소-meTHC, meCBL, 또는 meCBT의 이성질체에 대해 도시된 위치에, 도 6에서 meTHC, meCBC, meCBE, 이소-meTHC, meCBL, 또는 meCBT의 이성질체에 대해 도시된 위치에 있을 수 있다. 본 명세서에서 meTHC, meCBC, meCBE, 이소-meTHC, meCBL, 또는 meCBT에 대한 언급은 도 5 및 6에 도시된 이성질체 중 어느 것 또는 이들 모두를 포함한다.
DiPKS는 방향족 고리 상의 위치 4에서 올리베톨을 메틸화하는 C-메틸트랜스퍼라아제 도메인을 포함한다. 결과적으로, 임의의 다운스트림에 있는 프레닐화는 메틸-올리베톨일 것이고, CBGa 대신에 파이토카나비노이드 유사체인 meCBG를 생성하고, 이는 삼(C. sativa) 내에서 합성되는 것으로 알려져 있다. CBGa 또는 CBG를 투입물로 사용하는 경우 파이토카나비노이드를 생산할 수 있는 임의의 다운스트림에 있는 반응은 따라서 도 5 및 6에 도시되는 메틸화 파이토카나비노이드 유사체의 다카르복실화 종을 생산할 것이지만, 파이토카나비노이드의 메틸화되지 않은 산 형태는 삼(C. sativa) 내에서 생산할 것이다(도 3에서와 같이). OAC 또는 다른 폴리케티드 시클라아제가 포함되는 경우, 메틸화 및 카르복실화 탄소는 다른 위치에 있을 수 있기 때문에, 메틸-올리베톨은 OAC 또는 다른 폴리케티드 시클라아제에 의해 meCBGa로 전환될 수 있다. 예를 들어, meCBG로부터 합성된 meTHC는 탄소 4에서 메틸화될 수 있고, 메틸-테트라하이드로카나비놀산(methyl-tetrahydrocannabinolic acid, "meTHCa")으로 카르복실화 될 수 있고, THCa의 카르복실기는 위치 2에 있을 수 있다. 또는, meCBG로부터 합성되는 meTHC는 탄소 2에서 메틸화될 수 있고, 이 경우 THCa의 카르복실기는 위치 4에 있을 수 있다. THCa는 위치 2에서, 또는 위치 4에서 카르복실기를 갖는 삼(C. sativa)에서 관측된다.
도 7은 β-케토아실-신타아제(ketoacyl-synthase, "KS"), 아실 트랜스아세틸라아제(acyl transacetylase, "AT"), 데하이드레이트(dehydratase, "DH"), C-메틸 트랜스퍼라아제(methyl transferase, "C-Met"), 에노일 리덕타아제(enoyl reductase, "ER"), 케토리덕타아제(ketoreductase, "KR"), 및 아실 캐리어 단백질(acyl carrier protein, "ACP")를 나타내는 DiPKS의 기능적 도메인의 개략도이다. "유형 III" 도메인은 유형 3 폴리케티드 신타아제이다. KS, AT, DH, ER, KR, 및 ACP 부분은 일반적으로 지방산 신타아제와 관련된 기능을 제공한다. C-Met 도메인은 탄소 4에서 올리베톨을 메틸화 하기 위한 촉매적 활성을 제공한다. C-Met 도메인은, C-Met 도메인을 불활성화하고 메틸화 기능성을 완화시키거나 제거하는 DiPKS 단백질로의 변형을 개략적으로 나타내는 도 7에 나와있다. 유형 III 도메인은 반복하는 폴리케티드 확장 및 ACP로부터 유형 III으로 전환되는 헥사노익산 티오에스테르의 고리화를 촉진시킨다.
도 8은 말로닐-CoA 및 GPP로부터 meCBG 및 CBG의 생산을 위한 형질 전환된 효모에서 생합성 경로를 도시한다. 도 8에 도시되는 CBG 및 meCBG를 생산하기 위해 본 명세서에 제공되는 효모의 균주는 도 7에 개략적으로 도시되는 바와 같이 C-Met 도메인에서 더 낮은 활성을 갖는 변이체 DiPKS의 유전자 및 프레닐트랜스퍼라아제의 유전자를 포함할 수 있다. DiPKS 단백질의 C-Met 도메인은 DiPKS의 1510 내지 1633번째 아미노산 잔기를 포함한다. C-Met 도메인은 3개의 모티프를 포함한다. 첫번째 모티프는 1510 내지 1518번째 잔기를 포함한다. 두번째 모티프는 1596 내지 1603번째 잔기를 포함한다. 세번째 모티프는 1623 내지 1633번째 잔기를 포함한다. 이러한 3개의 모티프 중 하나 이상의 중단은 C-Met 도메인에서 활성이 저하될 수 있다.
C-Met 도메인에서 낮아진 활성을 갖는 변형된 DiPKS를 발현하는 효모 균주의 예는 하기 실시예 III에서 "HB80A"로 제공된다. HB80A는 야생형 DiPKS 단백질을 코딩하는 효모-코돈 최적화된 유전자에서의 변형을 포함한다. HB80A는 DiPKS 단백질이 C-Met 도메인의 첫번째 모티프에서 변형되도록 DiPKS 유전자에서의 변형을 포함한다. DiPKS 유전자로의 이러한 변형의 결과로, DiPKS 단백질은 Gly1516Asp 및 Gly1518Ala의 치환을 갖는다. HB80A는 DiPKSG1516D ; G1518A를 포함하고, 결과적으로 도 8의 단계 1A 및 1B를 촉진시킨다.
도 8은 말로닐-CoA로부터 메틸-올리베톨(도 8에서 반응 1A) 및 말로닐-CoA로부터 올리베톨(도 8에서 반응 1B)의 생산을 도시한다. 반응 1A 및 1B는 각각 DiPKSG1516D; G1518A에 의해 촉진된다. Gly1516Asp 및 Gly1518Ala 치환기는 C-Met 도메인의 활성 부위 내에 있고, 올리베톨 고리의 위치 4 상에서 메틸화의 DiPKSG1516D ; G1518A에 의해 촉매 작용을 감소시켜, 투입물 말로닐-CoA의 일부가 반응 1A 대신 반응 1B에 따라 촉진시킨다. 난잡한 αββα 프레닐트랜스퍼라아제는 GPP를 사용하는 메틸-올리베톨과 GPP를 사용하는 올리베톨 모두의 프레닐화를 촉진시켜, 산기는 없지만 도 2의 반응 3과 유사하게, 올리베톨의 프레닐화를 통해 meCBG (도 5 및 6에서 반응 2) 및 CBG를 생성할 수 있다. 그 후, 다른 파이토카나비노이드를 생산하기 위한 임의의 다운스트림에 있는 반응은 CBG의 방향족 고리 상의 위치 4에서 작용기가 없는 메틸화 파이토카나비노이드 유사체 및 종들의 혼합물(또는 다운스트림에 있는 파이토카나비노이드에서 대응하는 위치)을 생산할 것이지만, 산 형태가 삼(C. sativa) 내에서 생산될 것이다.
도 9는 말로닐-CoA로부터 메틸-올리베톨 없이 오직 올리베톨의 생산을 위한 형질 전환된 효모에서 생합성 경로를 도시한다. 도 9에 도시되는 바와 같이 단지 올리베톨을 생산하기 위해 본 명세서에 제공되는 효모 균주는 도 7에서 개략적으로 도시되는 바와 같이 C-Met 도메인에서 더 낮은 활성을 갖는 변이체 DiPKS의 유전자를 포함할 수 있다.
C-Met 도메인에서 필수적으로 활성이 없는 변형된 DiPKS를 발현하는 효모 균주의 예는 하기 실시예 VI 및 VII에서 "HB135", "HB137", 및 "HB138"로 제공된다. 각각의 HB135, HB137 및 HB138은 야생형 DiPKS 단백질을 코딩하는 효모-코돈 최적화된 유전자 내에서 변형을 포함한다. 각각의 HB135, HB137 및 HB138은 DiPKS 단백질이 C-Met 도메인의 첫번째 모티프에서 변형되도록 DiPKS 유전자의 변형을 포함한다. DiPKS 유전자로의 이러한 변형의 결과, DiPKS 단백질은 Gly1516Arg의 치환을 갖는다.
DiPKSG1516R은 도 9에서 반응 1을 촉진시킨다. Gly1516Arg 치환은 올리베톨 고리의 위치 4 상에서 메틸화의 DiPKSG1516R에 의한 촉매작용을 감소시킨다. 말로닐-CoA의 투입물은 도 9의 반응 1에 따라 촉진된다. 그 후 다른 파이토카나비노이드를 생산하기 위한 임의의 다운스트림에 있는 반응은 CBG의 방향족 고리 상에 위치 4에서, 또는 다운스트림에 있는 파이토카나비노이드에서 대응하는 위치에서, 작용기를 갖지 않는 파이토카나비노이드 종을 생산할 것이지만, 산 형태가 삼(C. sativa) 내에서 생산될 것이다.
생합성 전구체의 가용성 증가
도 4, 8 및 9에 도시되는 각각의 생합성 경로는 각각 오직 메틸-올리베톨, 메틸-올리베톨과 올리베톨, 및 오직 올리베톨을 생산하기 위해 말로닐-CoA를 필요로 한다. 효모 세포는 말로닐-CoA 또는 도 4, 8 또는 9 중 어느 하나의 생합성 경로를 지지하는데 필요한 기타 투입 대사 산물의 가용성을 증가시키기 위해, 변이될 수 있고, 다른 종들로부터 유전자가 도입될 수 있고, 유전자는 상향 조절되거나 하향 조절될 수 있고, 또는 효모 세포는 유전적으로 변형될 수 있다.
효모 균주는 이용 가능한 말로닐-CoA를 증가시키기 위해 변형될 수 있다. 저하된 미토콘드리아 아세트알데히드 이화 작용은 에탄올 이화 작용으로부터 아세트알데히드의 아세틸-CoA 생산으로의 전환을 야기하고, 이는 결국 말로닐-CoA 및 다운스트림에 있는 폴리케티드 및 테르페노이드의 생산을 구동한다. 출아형 효모(S. cerevisiae)는 출아형 효모(S. cerevisiae)로부터 알데히드 데하이드로게나아제 6("Ald6")을 가지고, 잔기 641에서 류신의 프롤린으로의 치환 변형 ("Acs L641P ")을 갖는 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica)로부터 아세틸-CoA 신타아제를 발현하도록 변형될 수 있다. Leu641Pro 변이는 Acs의 다운스트림 조절을 제거하여, 야생형 Acs보다 AcsL641P 변이에 더 큰 활성을 제공한다. 이러한 2개의 효소의 사이토솔릭 발현은 사이토솔에서 아세틸-CoA의 농도를 증가시킨다. 사이토솔에서 더 큰 아세틸-CoA 농도는 미토콘드리아 이화 작용을 저하시켜, 미토콘드리아 피루베이트 데하이드로게나아제("PDH")를 바이패싱하여, PDH 바이패스를 제공한다. 결과적으로, 더욱 아세틸-CoA는 말로닐-CoA 생산에 이용 가능하다. SEQ ID NO: 2는 플라스미드에 기초한 플라스미드이고, Ald6 및 SeAcsL641P에 대한 유전자를 코딩하는 DNA 서열, 프로모터, 터미네이터, 및 크리스퍼(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, "CRISPR ")을 적용하는 재조합에 의해 플래그펠트(Flagfeldt)-부위 19에서 출아형 효모(S. cerevisiae) 게놈으로의 통합을 위한 통합 부위 상동성 서열을 포함한다. 하기 표 2에 나타내는 바와 같이(용어 "PDH 바이패스"에 의해), 각각의 베이스 균주 "HB82", "HB100", "HB106", 및 "HB110"은 TDH3 프로모터 하에서 Ald6를 코딩하는 1494 내지 2999번째 염기로부터 SEQ ID NO: 2의 일부, 및 Tef1P 프로모터 하에서 SeAcsL641P를 코딩하는 3948 내지 5893번째 염기로부터 SEQ ID NO: 2의 일부를 갖는다. 마찬가지로, HB82, HB100, HB106, 또는 HB110 중 어느 하나 상에 기초한 각각의 변형된 효모 균주는 Ald6 및 SeAcsL641P를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
사이토솔릭 말로닐-CoA를 증가시키는 다른 접근법은 천연 효모 말로닐-CoA 신타아제인 Acc1을 상향 조절하는 것이다. Acc1 유전자의 프로모터 서열은 PGK1 유전자에 대한 구성적 효모 프로모터로 대체되었다. PGK1 유전자로부터 프로모터는 Acc1의 복수의 복제물이 세포 내에 존재하도록 한다. 천연 Acc1 프로모터는 한 번에 단 하나의 단백질 복제가 세포 내에 존재하도록 한다. 천연 프로모터 영역은 SEQ ID NO: 3에 제시되어있다. 변형된 프로모터 영역은 SEQ ID NO: 4에 제시되어 있다.
Acc1의 발현을 상향 조절하는 것 이외에, 출아형 효모(S. cerevisiae)는 Acc1 활성 및 사이토솔릭 아세틸-CoA 농도를 증가시키기 위해 Acc1의 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다. 조절 서열에서 2개의 변이가 Acc1의 억제를 제거하여 Acc1 발현을 증가시키고 말로닐-CoA의 생산을 증가시키는 것이 문헌에서 확인되었다. SEQ ID NO: 5는 상동 재조합에 의해 천연 Acc1 유전자에서 출아형 효모(S. cerevisiae) 게놈을 변형시키는데 사용될 수 있는 폴리뉴클레오티드이다. SEQ ID NO: 5는 Ser659Ala 및 Ser1167Ala 변형을 갖는 Acc1 유전자에 대한 코딩 서열의 일부를 포함한다. 결과적으로, 이러한 서열로 형질 전환된 출아형 효모(S. cerevisiae)는 Acc1S659A ; S1167A를 발현할 것이다. 유사한 결과는, 예를 들어 임의의 적합한 부위에서 서열을 Tef1 프로모터와, Acc1을 Ser659Ala 및 Ser1167Ala 변형, 및 Prm9 터미네이터를 통합함으로써 달성될 수 있다. 최종 결과는, Tef1, Acc1S659A ; S1167A, 및 Prm9는 출아형 효모(S. cerevisiae) 게놈으로 통합을 증진시키기 위해 게놈의 DNA 서열에 의해 플랭크된다. 이는 플래그펠트(Flagfeldt) 부위 18에서 시도되었지만, 구조체의 크기로 인해 상기 기재된 SEQ ID NO: 5를 사용하는 접근법이 대신 수행되었다.
출아형 효모(S. cerevisiae)는 Maf1 또는 tRNA 생합성의 다른 조절자의 변형된 발현을 포함할 수 있다. 천연 Maf1을 과발현하는 것은 tRNA 생합성에 대한 IPP의 손실을 감소시켜, 효모에서 모노테르펜 수율을 개선시키는 것으로 나타났다. IPP는 메발로네이트 경로에서 중간체이다. SEQ ID NO: 6은 Tef1 프로모터 하에서 Tef1의 게놈 통합을 위한 Maf1-부위 5에서 출아형 효모(S. cerevisiae) 게놈으로 통합되는 폴리뉴클레오티드이다. SEQ ID NO: 6은 Tef1 프로모터, 천연 Maf1 유전자, 및 Prm9 터미네이터를 포함한다. Tef1, Maf1, 및 Prm9는 함께 출아형 효모(S. cerevisiae) 게놈으로 통합을 증진시키기 위해 게놈 DNA 서열에 의해 플랭크된다. 하기 표 2에 나타내는 바와 같이, 베이스 균주 HB100, HB106, 및 HB110은 Tef1 프로모터 하에서 Maf1을 발현시킨다. 마찬가지로, HB100, HB106, 또는 HB110 중 어느 하나에 기초한 각각의 변형된 효모 균주는 Tef1 프로모터 하에서 Maf1의 코딩 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
Upc2는 출아형 효모(S. cerevisiae )에서 스테롤 생합성을 위한 활성화제이다. Upc2의 Glu888Asp 변이는 효모에서 모노테르펜 생산을 증가시킨다. SEQ ID NO: 7은 Tef1 프로모터 하에서 Upc2E888D의 발현을 제공하기 위해 게놈으로 통합될 수 있는 폴리뉴클레오티드이다. SEQ ID NO: 7은 Tef1 프로모터, Upc2E888D 유전자, 및 Prm9 터미네이터를 포함한다. Tef1, Upc2E888D, 및 Prm9는 함께 출아형 효모(S. cerevisiae) 게놈으로 통합을 증진시키기 위해 게놈 DNA 서열에 의해 플랭크된다.
상기 유전자들, AcsL641P, Ald6, Maf1, Acc1S659A ; S1167A 또는 Upc2E888D 중 하나는 출아형 효모(S. cerevisiae)의 게놈으로 통합되거나 플라스미드로부터 발현될 수 있다. 게놈 통합은 CRISPR 재조합, 또는 임의의 적합한 접근법을 포함하는 상동 재조합을 통해서일 수 있다. Acc1의 프로모터는 재조합을 통해 유사하게 변형될 수 있다. SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 또는 SEQ ID NO: 7의 각각에서 코딩 및 조절 서열은 출아형 효모(S. Cerevisiae) 게놈으로 통합을 위한 선형 폴리뉴클레오티드 또는 발현(예를 들어, pYES 등)을 위한 플라스미드에 포함될 수 있다. 베이스 균주 HB82, HB100, HB106, 또는 HB110의 각각은 하나 이상의 통합된 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 또는 SEQ ID NO: 8을 포함한다(하기 표 2 참조). SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 7의 통합은 유사한 접근법에 의해 적용될 수 있다.
증가된 DiPKS 기능
도 7에 도시되는 바와 같이, DiPKS는 ACP 도메인을 포함한다. DiPKS의 ACP 도메인은 보조인자로서 포스포판테테인기를 필요로 한다. NpgA는 아스페르질루스 니둘란스(Aspergillus nidulans)로부터 4'-포스포판테티에닐 트랜스퍼라아제이다. 출아형 효모(S. cerevisiae)의 NpgA의 코돈-최적화 복제물은 출아형 효모(S. cerevisiae)로 도입되고, 상동 재조합에 의한 것을 포함하여 출아형 효모(S. cerevisiae)로 형질 전환될 수 있다. NpgA 유전자 카셋은 균주 HB100를 생성하기 위해 플래그펠트(Flagfeldt) 부위 14에서 출아형 효모(Saccharomyces cerevisiae) 게놈으로 통합된다. 통합된 DNA의 서열은 SEQ ID NO: 8에 제시되어 있고, Tef1 프로모터, NpgA 코딩 서열 및 Prm9 터미네이터를 포함한다. Tef1p, NpgA, 및 Prm9t는 함께 출아형 효모(S. cerevisiae) 게놈에서 플래그펠트(Flagfeldt) 부위 14로 통합을 증진시키는 게놈 DNA에 의해 플랭크된다. 하기 표 2에 도시되는 바와 같이, 베이스 균주 HB100, HB106, 및 HB110은 이러한 통합된 카셋을 포함한다. 또는, SEQ ID NO: 8의 636 내지 2782번째 염기는 균주 HB98에서와 같이 발현 플라스미드 상에 포함될 수 있다.
NpgA의 발현은 DiPKS의 ACP 도메인 상에 포스포판테테인기를 로딩하는 더 큰 촉매 작용을 위해 아스페르길루스 니둘란스(A. nidulans) 포스포판테테이닐 트랜스퍼라아제를 제공한다. 결과적으로, DiPKS에 의해 촉진되는 반응(도 4에서 반응 1)은 더 빠른 속도로 일어나, 더 많은 양의 메틸-올리베톨을 제공할 수 있다.
DiPKS의 변형
DiPKS는 C-Met의 활성을 감소 또는 제거하기 위해 변형될 수 있다.
SEQ ID NO: 9는 DiPKS가 C-met 도메인의 활성을 함께 방해하는 Gly1516Asp 치환 및 Gly1518Ala 치환을 포함하는 효모에 코돈 최적화된 DIPKS에 대한 합성 서열의 변형된 형태이다. 출아형 효모(S. cerevisiae) 배양액에서 DiPKSG1516D , G1518A 발현의 결과는 균주 HB80A를 포함하는 실시예 II와 관련하여 하기에 제공된다. 다른 변형은 C-Met 전체 또는 C-Met의 전체 활성 부위를 제거 또는 차단하기 위해 DiPKS로 도입될 수 있다. 이들 변형된 DiPKS 효소 각각은 야생형 DiPKS에 대해 기재되는 바와 같이 출아형 효모(S. cerevisiae)로 도입될 수 있다.
SEQ ID NO: 10은 DiPKS가 C-met 도메인의 활성을 차단하는 Gly1516Arg 치환을 포함하는 효모에 코돈 최적화된 DIPKS의 합성 서열의 변형된 형태이다. 출아형 효모(S. cerevisiae) 배양액에서 DiPKSG1516R 발현의 결과는 균주 HB135을 포함하는 실시예 VI 및 균주 HB135, HB137 및 HB138을 포함하는 실시예 VII와 관련하여 하기에 제공된다.
구체적으로 DiPKSG1516D , G1518A 및 DiPKSG1516R 이외에, C-Met 전체 또는 C-Met의 전체 활성 부위를 차단 또는 제거하기 위해 DiPKS로 다른 변형이 도입된다: (a) 모티프 1의 GGGSGGGSG로의 치환, (b) 모티프 1에서 Gly1516Arg 치환 및 모티프 2의 GGGSGGGS로의 치환, (c) C-Met 도메인의 활성 부위에서 3차 구조를 차단하고 모티프 3 외측에 있는 Glu1634Ala, 및 (d) His1608Gln 치환에 의해 C-Met 도메인에서 활성 부위의 차단. (a) 내지 (d) 각각에 대해 코돈 최적화된 서열을 DiPKSG1516D , G1518A 및 DiPKSG1516R의 발현과 마찬가지로 발현 플라스미드 상의 효모에, 베이스 균주 HB100으로 도입했다. 각각의 경우에, 올리베톨의 생산이 관측되지 않았다. 모티프 1 또는 모티프 2의 GGGSGGGS로의 치환은 메틸-올리베톨의 생산을 제거했다. DiPKSG1634A 변이체를 발현하는 효모의 배양액이 하나의 예시적인 배치에서 배양액의 l 당 2.67 mg의 메틸-올리베톨을 제공했다. DiPKSH1608N 변이체를 발현하는 효모의 배양액이 하나의 예시적인 배치에서 배양액의 l 당 3.19 mg의 메틸-올리베톨을 제공했다.
효모 세포의 형질 전환 및 성장
본 기재에 따라 생산되는 효모 세포 및 수행되는 방법의 특정 실시예의 상세를 실시예 I 내지 VII로서 하기에 제공했다. 이러한 7개의 특정 실시예의 각각은 플라스미드 구조, 효모의 형질 전환, 균주 성장의 정량, 및 세포내 대사 산물의 정량화에 대해 유사한 접근법을 적용한다. 7개의 실시예에서 이러한 공통적인 특징은 하기에 기재되고, 7개의 실시예 중 하나 이상과 관련하여 다른 상세 및 결과가 이어서 기재된다.
플라스미드 구조
본 명세서에 제공되는 효모 세포 및 방법의 예를 적용 및 제조하기 위해 어셈블링되는 플라스미드를 표 1에 나타냈다. 표 1에서, 발현 플라스미드 pYES, 및 pYES2에 있어서, SEQ ID NOs 11 및 12는 각각 발현 카셋 없이 전체로서 플라스미드를 제공한다. SEQ ID NOs: 8 내지 10, 13, 및 14의 발현 카셋은 표 1에 나타내는 플라스미드를 제조하기 위해 포함될 수 있다. SEQ ID NO: 2는 PDH 바이패스 유전자에 대한 카셋을 포함하는 pGREG 플라스미드이다.
[표 1] 효모 균주를 제조하는데 사용되는 플라스미드 및 카셋
Figure pct00003
출아형 효모(S. cerevisiae)로 도입하기 위한 플라스미드는 Eppendorf Mastercycler ep Gradient 5341을 사용하는 제조업체의 권장 프로토콜에 따라 Operon Eurofins 및 Phusion HF 중합 효소 (ThermoFisher F-530S)의 프라이머를 사용한 중합 효소 연쇄 반응 ("PCR")에 의해 증폭되었다.
전체 플라스미드를 출아형 효모(S. cerevisiae)에서 오버랩핑 DNA 부분 및 형질 전환 보조 재조합을 사용하여 어셈블링했다. 플라스미드를 Gietz, R. D. 및 Schiestl, R. H., "High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method." Nat . Protoc . 2, 31-34 (2007)에 기재되는 바와 같이 리튬 아세테이트 열 쇼크를 사용하여 출아형 효모(S. cerevisiae)로 형질 전환했다. pNPGa, pDiPKSm1, pDiPKSm2, pCRISPR, pDiPKS 및 pPDH 플라스미드를 우라실 영양 요구체인 효모 균주 HB25에 어셈블링했다. 형질 전환된 출아형 효모(S. cerevisiae) 세포를 한천(agar) 페트리 접시 상에 영양 요구성 선택에 의해 선택했다. 페트리 접시로부터 회수된 콜로니를 250 RPM으로 진탕하면서 30 ℃에서 16시간 동안 액체 선택 배지에서 성장시켰다.
액체 선택적 배지에서 성장시킨 후, 형질 전환된 출아형 효모(S. cerevisiae) 세포를 수집하고, 플라스미드 DNA를 추출했다. 추출된 플라스미드 DNA를 대장균(Escherichia coli)으로 형질 전환시켰다. 형질 전환된 대장균(E. coli)을 암피실린(ampicillin)을 포함하는 한천 페트리 접시 상에서 성장시킴으로써 선택했다. 대장균을 배양시켜, 플라스미드를 증폭시켰다. 대장균에서 성장되는 플라스미드를 생어 다이데옥시 시퀀싱(Sanger dideoxy sequencing)으로 추출 및 시퀀싱하여, 정확한 구성을 확인했다. 그 후, 서열-검증된 플라스미드를 출아형 효모(S. cerevisiae)의 안정한 형질 전환 또는 게놈 변형에 사용했다.
출아형 효모의 게놈 변형
본 명세서에 기재된 출아형 효모 균주는 플라스미드의 안정한 형질 전환 또는 게놈 변형에 의해 제조할 수 있다. 게놈 변형은 CRISPR을 이용하는 방법을 포함하여 상동 재조합을 통해 완성할 수 있다.
CRISPR을 적용하는 방법은 출아형 효모(S. cerevisiae) 게놈으로부터 DNA를 제거하고, 이종 DNA를 출아형 효모(S. cerevisiae) 게놈으로 도입하기 위해 적용된다. 출아형 효모(S. cerevisiae) 게놈 상에 목적하는 위치로 Cas9 엔도뉴클레아제를 타겟팅하기 위한 가이드 RNA("gRNA") 서열은 벤치링 온라인 DNA 편집 소프트웨어를 사용하여 고안했다. 중첩 연장에 의한 DNA 스플라이싱 ("SOEing") 및 PCR을 적용하여 gRNA 서열을 어셈블링하고, 기능성 gRNA 카세트를 포함하는 DNA 서열을 증폭시켰다.
기능적 gRNA 카셋, Cas9-발현 유전자 카셋, 및 pYes2 (URA) 플라스미드를 pCRISPR 플라스미드로 어셈블링하고, 타겟팅한 DNA 이중-가닥 분열을 이용 가능한 출아형 효모(S. cerevisiae)로 형질 전환했다. 생성된 DNA 분열을 타겟 DNA의 선형 단편의 첨가에 의해 복구했다.
출아형 효모(S. cerevisiae)의 게놈 변형은 결국 균주 HB25에 기초한 우라실 영양 요구체인 균주 HB42를 기초로 하고, Erg20K197E 단백질에 대한 CDS의 통합을 포함한다. 이러한 통합은 메틸-올리베톨 또는 올리베톨의 생산과 직접 관련되지 않은 다른 목적을 위한 것이지만, GPP를 필요로 하는 CBG 또는 meCBG를 합성할 때 유용할 수 있다. Erg20K197E 돌연변이 단백질은 세포에서 GPP 수준을 증가시킨다.
SEQ ID NO: 2의 51 내지 7114번째 염기를 CRISPR에 의해 HB42 균주로 통합하여, 출아형 효모(S. cerevisiae)에서 PDH 바이패스 유전자를 갖는 HB82 베이스 균주를 제공했다. pPDH 플라스미드를 출아형 효모(S. cerevisiae)에서 어셈블링한 후 서열 확인했다. 서열-확인된 pPDH 플라스미드를 대장균(E. coli)에서 성장시키고, 정제시키고, BciV1 제한 효소로 소화시켰다(digested). 표 1에서와 같이, BciV1에 의한 소화는 Ald6 및 SeAcsL641P의 유전자, 프로모터, 터미네이터, 및 Cas9에 의해 PDH-부위 19에서 출아형 효모(S. cerevisiae) 게놈으로 통합하기 위한 통합 부위 상동 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공했다. SEQ ID NO: 2의 51 내지 7114번째 염기에서 나타내는 생성된 선형 PDH 바이패스 공여체 폴리뉴클레오티드를 겔 분리에 의해 정제했다.
단일 PDH 폴리뉴클레오티드 상에 PDH 바이패스 유전자(Ald6 및 AcsL641P)를 사용하여, PDH 바이패스 공여체 폴리뉴클레오티드를 pCRISPR를 이용하여 출아형 효모(S. cerevisiae)로 공동-형질 전환시켰다(co-tranformed). 형질 전환은 지에츠(Gietz)에 의해 기재된 바와 같이 리튬 아세테이트(lithium acetate) 열 충격법에 의해 수행되었다. pCRISPR 플라스미드는 Cas9를 발현하는데, 이는 gRNA 분자에 의해 출아형 효모(S. cerevisiae) 게놈의 선택된 위치를 표적으로 한다. 그 위치에서, Cas9 단백질은 DNA에서 이중 가닥 파열(double stranded break)을 생성한다. PDH 바이패스 공여체 폴리뉴클레오티드는 CRISPR 반응으로 공여체 폴리뉴클레오티드로서 사용된다. Ald6, AcsL641P, 프로모터, 및 터미네이터를 포함하는 PDH 바이패스 공여체 폴리뉴클레오티드는 상동 재조합에 의해 파열 부위인, 부위 19에서 게놈으로 통합하여, 균주 HB82를 생성한다.
SEQ ID NO: 8에 나타낸 NpgA 공여체 폴리뉴클레오티드를 제조 및 증폭시켰다. DNA SOEing을 사용하여, NpgA 통합을 위해 3개의 폴리뉴클레오티드로부터 단일 공여체 DNA 단편을 생성했다. 제1 폴리뉴클레오티드는 특정 로커스(locus)에서 공여체를 게놈으로 재조합시키는 게놈 상동성의 5' 영역이다. 제2 폴리뉴클레오티드는 NpgA 유전자 카셋으로 코딩된다. NpgA 유전자 카셋은 Tef1 프로모터, NpgA 코딩 서열 및 Prm9 터미네이터를 포함한다. 제3 폴리뉴클레오티드는 출아형 효모(S. cerevisiae) 게놈으로 타겟팅된 통합을 용이하게 하는 게놈 상동성을 위한 3' 영역을 포함한다.
NpgA 공여체 폴리뉴클레오티드를 균주 HB82로 pCRISPR 플라스미드와 공동-형질 전환시켰다. pCRISPR 플라스미드를 발현시켜, 엔도뉴클레아제 Cas9를 gRNA 분자에 의해 출아형 효모(S. cerevisiae) 게놈 상의 위치로 타겟팅시켰다. 그 위치에서, Cas9 단백질은 DNA에서 이중 가닥 파열을 생성하고, NpgA 공여체 폴리뉴클레오티드를 상동 재조합에 의해 파열 시에 게놈으로 통합시켜, HB100 베이스 균주를 제공했다.
SEQ ID NO: 6에 나타내는 Maf1 공여체 폴리뉴클레오티드를 제조 및 증폭시켰다. DNA SOEing을 사용하여, Maf1 통합을 위한 3개의 폴리뉴클레오티드로부터 단일 공여체 DNA 단편을 생성했다. 제1 폴리뉴클레오티드는 특정 로커스에서 공여체를 게놈으로 재조합시키는 게놈 상동성의 5' 영역이다. 제2 폴리뉴클레오티드는 Maf1 유전자 카셋으로 코딩된다. Maf1 유전자 카셋은 Tef1 프로모터, Maf1 코딩 서열 및 Prm9 터미네이터를 포함한다. 제3 폴리뉴클레오티드는 출아형 효모(S. cerevisiae) 게놈으로 타겟팅된 통합을 용이하게 하는 게놈 상동성을 위한 3' 영역을 포함한다.
Maf1 공여체 폴리뉴클레오티드를 HB100 균주로 pCRISPR 플라스미드와 공동-형질 전환시켰다. pCRISPR 플라스미드를 발현시켜, 엔도뉴클레아제 Cas9를 gRNA 분자에 의해 출아형 효모(S. cerevisiae) 게놈 상의 위치로 타겟팅시켰다. 그 위치에서, Cas9 단백질은 DNA에서 이중 가닥 파열을 생성하고, Maf1 공여체 폴리뉴클레오티드를 상동 재조합에 의해 파열 시에 게놈으로 통합시킬 수 있다. Maf1 공여체 폴리뉴클레오티드의 HB100 균주로의 안정한 형질 전환은 HB106 베이스 균주를 제공한다.
SEQ ID NO: 6에 나타낸 Acc1-PGK1p 공여체 폴리뉴클레오티드를 제조 및 증폭시켰다. DNA SOEing을 사용하여, Acc1-PGK1 통합을 위해 3개의 폴리뉴클레오티드로부터 단일 공여체 DNA 단편을 생성했다. 제1 폴리뉴클레오티드는 특정 로커스에서 공여체를 게놈으로 재조합시키는 게놈 상동성의 5' 영역이다. 제2 폴리뉴클레오티드는 PGK1 프로모터 영역을 코딩된다. 제3 폴리뉴클레오티드는 출아형 효모(S. cerevisiae) 게놈으로 타겟팅된 통합을 용이하게 하는 게놈 상동성을 위한 3' 영역을 포함한다.
Acc1-PGK1 공여체 폴리뉴클레오티드를 pCRISPR 플라스미로 공동-형질 전환했다. pCRISPR 플라스미드를 발현시키고, 엔도뉴클레아제 Cas9를 gRNA 분자에 의해 출아형 효모(S. cerevisiae) 게놈 상의 위치로 타겟팅시켰다. 그 위치에서, Cas9 단백질은 DNA에서 이중 가닥 파열을 생성하고, Acc1-PGK1 공여체 폴리뉴클레오티드를 상동 재조합에 의해 파열 시에 게놈으로 통합시킬 수 있다. 공여체 폴리뉴클레오티드의 HB100 균주로의 안정한 형질 전환은 PGK1 프로모터의 조절 하에서 Acc1을 갖는 HB110 베이스 균주를 제공한다.
표 2는 출아형 효모의 게놈 변형에 의해 제조되는 베이스 균주의 요약을 제공한다. 표 2에 나타내는 각각의 베이스 균주는 류신 및 우라실 영양 요구체이고, 이들 중 어느 것도 플라스미드를 포함하지 않는다.
[표 2] 폴리케티드 생산을 위해 제조되는 형질 전환된 베이스 균주
Figure pct00004
균주 구조의 안정한 형질 전환
플라스미드를 지에츠(Gietz)에 의해 기재된 바와 같이 리튬 아세테이트(lithium acetate)를 사용하여 출아형 효모(S. cerevisiae)로 형질 전환했다.
형질 전환된 출아형 효모(S. cerevisiae) HB80, HB98, HB102, HB135, HB137 및 HB138을 발현 플라스미드를 갖는 HB42의 형질 전환에 의해 HB42, HB100, HB106 및 HB110 베이스 균주로부터 제조했고, HB80A를 표 3에서 하기에 나타내는 바와 같이 HB80의 형질 전환에 의해 제조했다. HB80, HB98 및 HB102 각각은 DiPKS를 포함하고 발현시켰다. HB80A는 DiPKSG1516D ; G1518A를 포함하고 발현시켰다. HB135, HB137 및 HB138 각각은 DiPKSG1516R를 포함하고 발현시켰다. HB98는 플라스미드로부터 DiPKS 및 NPGa를 포함하고 발현시켰다.
[표 3] 폴리케티드 신타아제를 발현하는 플라스미드를 포함하는 균주
Figure pct00005
효모 성장 및 공급 조건
효모 배양액을 선택 배지를 갖는 배양물에서 밤새 성장시켜, 종균 배양액을 제공했다. 그 후, 생성된 종균 배양액을 사용하여 600 nm ("A 600 ")에서 0.1의 흡광도를 갖는 광학 밀도로 3번 50 ml 배양액을 접종시켰다.
효모를 YNB + 2% 라피노오스 + 2% 갈락토오스 + 1.6g/L 4DO*를 포함하는 배지에서 배양시켰다. "4DO *"는 류신 및 우라실이 결여된 효모 SD 배지 보충제를 말한다. "YNB"는 표 4의 첫번째 2개의 컬럼측에 나열된 화학물질을 포함하는 영양액(nutrient broth)이다. 표 4의 세번째 및 네번째 컬럼에 나열된 화학물질은 4DO* 보충제 내에 포함된다.
[표 4] YNB 영양액 및 4DO* 보충제
Figure pct00006
대사 산물의 정량
세포 내 대사 산물을 메탄올 추출을 사용하여 출아형 효모(S. cerevisiae) 세포로부터 추출했다. 액체 배양액 1 mL를 3분 동안 12,000 x g에서 회전시켰다. 250 μL의 생성된 상청액을 세포 외 대사 산물 정량화에 사용했다. 생성된 세포 펠릿을 -40 ℃의 80% 메탄올 200 μl에 현탁시켰다. 혼합물을 볼텍싱하고(vortexed), 10분 동안 얼음 위에서 냉각시켰다. 10분 동안 얼음 위에서 냉각한 후, 혼합물을 14분 동안 4 ℃에서 15,000 x g에서 회전시켰다. 생성된 상청액을 수집했다. 추가적인 -40 ℃의 80% 메탄올 200 μl를 세포 파편 펠릿에 첨가하고, 혼합물을 볼텍싱하고 얼음 상에서 10분 동안 냉각시켰다. 10분 동안 냉각한 후, 혼합물을 14분 동안 4 ℃에서 15,000 x g에서 회전시켰다. 생성된 200 μl의 상청액을 이전에 수집된 200 μl의 상청액에 첨가하여, 세포 내 대사 산물을 갖는 총 400 μl의 80% 메탄올을 제공했다.
세포 내 대사 산물을 고성능 액체 크로마토그래피("HPLC") 및 질량 분석법("MS")을 사용하여 정량화했다. ThermoFinnigan LTQ 질량 분석기에 연결된 Agilent 1260 오토 샘플러 및 HPLC 시스템을 사용했다. HPLC ttmxpa은 Zorbax Eclipse C18 2.1 μm x 5.6 mm x 100 mm 컬럼을 포함한다.
대사 산물을 오토 샘플러를 사용하여 10 ㎕ 샘플에 주입하고 1 ml/분의 유속으로 HPLC상에서 분리했다. HPLC 분리 프로토콜은, (a) 98 % 용매 A 및 2 % 용매 B에서 0-2분; (b) 98 % 용매 B에 도달하도록 2-15분; (c) 98 % 용매 B에서 15-16.5분; (d) 98 % A에 도달하도록 16.5-17.5분; 및 (e) 98 % 용매 A에서 평형화 최종 2.5분으로 총 20분이었다. 용매 A는 MS 워터 중 아세토니트릴+0.1% 포름산이고, 용매 B는 MS 워터 중 0.1% 포름산이다.
HPLC 분리 후, 시료를 전기 분무 이온화에 의해 질량 분석계로 주입하고, 포지티브 모드로 분석했다. 모세관 온도를 380 ℃로 유지했다. 튜브 렌즈 전압은 30V, 모세관 전압은 0V, 스프레이 전압은 5kV였다. 마찬가지로, HPLC-MS/MS 후, 올리베톨은 181.2에서 모 이온으로, 111에서 딸 이온으로 분석했고, 메틸-올리베톨은 193.2에서 모 이온으로, 125에서 딸 이온으로 분석했다.
선형 표준 곡선을 생성하기 위해 다른 농도의 공지된 표준액(standard)을 주입했다. 올리베톨 및 메틸-올리베톨 표준액은 Sigma Aldrich로부터 구입했다.
실시예 I
표 3에서 상기 기재된 효모 균주 HB80을 YNB + 2% 라피노오스 + 2% 갈락토오스 + 1.6g/L 4DO* 배지에서 배양했다. 라피노오스 및 갈락토오스로부터 메틸-올리베톨의 생산을 관측했고, 이는 메틸 올리메톨의 효모에서의 직접 생산을 보여준다. 메틸-올리베톨을 3.259 mg/L의 농도에서 생산했다.
실시예 II
표 3에 상기 기재된 바와 같이 효모 균주 HB80A를 YNB + 2% 라피노오스(raffinose) + 2% 갈락토오스(galactose) + 1.6g/L 4DO* 배지에서 배양했다. DiPKSG1516D ; G1518A에 의해 촉진되는 라피노오스 및 갈락토오스로부터 올리베톨 및 메틸-올리베톨 모두의 생산을 관측했다. 이러한 데이터는 헥사노익산을 포함하지 않고 올리베톨 및 메틸-올리베톨의 효모에서의 직접 생산을 입증한다.
도 10은 실시예 I로부터 HB80(" 메틸 _ 올리베톨 HB80")에 의해 생산되는 메틸-올리베톨의 농도, 및 HB80A(각각 "메틸_올리베톨 HB80A" 및 " 올리베톨 HB80A")에 의해 생산되는 올리베톨과 메틸-올리베톨의 농도를 도시한다. 배양액의 시료를 72시간에 취했다. HB80A는 주로 메틸-올리베톨(올리베톨 배양액의 L 당 0.010 mg과 비교되는 배양액의 L 당 1.4 mg 메틸-올리베톨)을 생산하고, HB80(3.26 mg/L)에 의해 생산되는 메틸-올리베톨보다 결합된 메틸-올리베톨 및 올리베톨을 덜 생산한다.
실시예 III
표 3에서 상기 기재되는 바와 같이 효모 균주 HB98을 YNB + 2% 라피노오스 + 2% 갈락토오스 + 1.6g/L 4DO* 배지에서 배양했다. DiPKS에 의해 촉진되는 라피노오스 및 갈락토오스로부터 메틸-올리베톨의 생산을 관측했다. 이러한 데이터는 헥사노익산을 포함하지 않고, 실시예 I에 기재되는 바와 같이 HB80과 비교하여 메틸-올리베톨 생산이 증가된 것을 입증한다.
도 11은 실시예 I로부터 HB80("Methyl_ Olivetol HB80")에 의해 생산되는 메틸-올리베톨의 농도, 및 실시예 III으로부터 HB98("Methyl_ Olivetol HB98")에 의해 생산되는 메틸-올리베톨의 농도를 도시한다. 배양액의 시료를 72시간에 취했다. HB98은 29.85 mg/L의 메틸-올리베톨을 생산하지만, HB80은 배양액의 L 당 오직 3.26 mg의 메틸-올리베톨을 생산한다. HB98은 HB80로서 거의 10 x 많은 메틸-올리베톨을 생산한다.
실시예 IV
표 3에 상기 기재되는 바와 같이 효모 균주 HB102를 YNB + 2% 라피노오스 + 2% 갈락토오스 + 1.6g/L 4DO* 배지에서 배양했다. 라피노오스 및 갈락토오스로부터 메틸-올리베톨의 생산을 관측했으며, 이는 단지 29.85 mg/L의 메틸-올리베톨을 생산하는 균주 HB98과 비교하여 42.44 mg/L에서 메틸-올리베톨의 효모에서의 생산이 증가되는 것을 입증한다. 이는 NpgA의 게놈적으로 통합된 버전이 기능적인 것을 입증한다.
도 12는 실시예 IV에서 균주 HB98("메틸 _ 올리베톨 HB98")로부터 메틸-올리베톨의 생산과 비교하여 실시예 III으로부터 HB102("메틸 - 올리베톨 HB102")에 의해 생산되는 메틸-올리베톨의 농도를 도시한다.
실시예 V
표 3에서 상기 기재된 바와 같이 효모 균주 HB135를 YNB + 2% 라피노오스 + 2% 갈락토오스 + 1.6g/L 4DO* 배지에서 배양했다. 라피노오스 및 갈락토오스로부터 올리베톨의 생산을 관측했고, 이는 임의의 헥사노익산이 없고, 49.24 mg/L의 높은 역가에서, 메틸-올리베톨을 생산하지 않는 올리베톨의 효모에서 생산을 입증한다. 이는 균주 HB102에 의한 메틸-올리베톨의 생산과 비교할 수 있는데, 이는 DIPKS의 변이가 메틸-올리베톨과 대조적으로 올리베톨의 생산에 효과적임을 입증한다.
도 13은 실시예 VI에서 균주 HB102("메틸 _ 올리베톨 HB102")로부터 메틸-올리베톨의 생산과 비교하여 실시예 IV로부터 HB135(각각 "메틸 _ 올리베톨 HB135" 및 "Olivetol HB135)에 의해 생산되는 올리베톨 및 메틸-올리베톨의 농도를 도시한다.
실시예 VII
표 3에 상기 기재되는 바와 같이 효모 균주 HB137 및 HB138을 YNB + 2% 라피노오스 + 2% 갈락토오스 + 1.6g/L 4DO* 배지에서 배양했다. 라피노오스 및 갈락토오스로부터 올리베톨의 생산을 이들 균주들에서 관측했다. 균주 HB137은 61.26 mg/L의 올리베톨을 생산하고, 균주 HB138은 74.26 mg/L의 올리베톨을 생산하는데, 이는 올리베톨 역가에 대한 Maf1 통합 및 Acc1-프로모터 교체(promoter swap)의 포지티브 효과를 입증한다. HB137 및 HB138은 AltPT가 부족하기 때문에, CBG로의 전환은 이어지지 않는다.
도 14는 실시예 VII에서 HB135 ("올리베톨 HB135")에 의해 생산되는 올리베톨과 비교하여 실시예 VI로부터 HB137 ("올리베톨 HB137") 및 HB138 ("올리베톨 HB138")에 의해 생산되는 올리베톨의 농도를 도시한다.
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Yeast optimized DiPKS from Dictyostelium discoideum
<220>
<221> Motif 1
<222> (4528)..(4554)
<220>
<221> C-methyltransferase domain
<222> (4528)..(4890)
<220>
<221> Motif 2
<222> (4787)..(4809)
<220>
<221> Motif 3
<222> (4867)..(4899)
<400> 1
atgaacaaga actccaaaat ccagtcccca aactcttctg atgttgctgt tattggtgtt 60
ggttttagat tcccaggtaa ctctaatgac ccagaatctt tgtggaacaa cttgttggat 120
ggtttcgatg ctattaccca agtcccaaaa gaaagatggg ctacttcttt tagagagatg 180
ggtttgatca agaacaagtt cggtggtttc ttgaaggatt ctgaatggaa gaatttcgac 240
cctttgttct ttggtatcgg tccaaaagaa gctccattca ttgatccaca acaaaggttg 300
ttgttgtcca tcgtttggga atctttggaa gatgcttaca tcagaccaga tgaattgaga 360
ggttctaaca ctggtgtttt catcggtgtt tctaacaacg attacaccaa gttgggtttc 420
caagacaact actctatttc tccatacact atgaccggct ctaactcttc attgaactcc 480
aacagaattt cctactgctt cgattttaga ggtccatcca ttactgttga taccgcttgt 540
tcttcttcct tggtttctgt taatttgggt gtccaatcca tccaaatggg tgaatgtaag 600
attgctattt gcggtggtgt taacgctttg tttgatccat ctacatctgt tgccttttcc 660
aagttgggtg ttttgtctga aaatggcaga tgcaactctt ttagtgatca agcctctggt 720
tacgttagat ctgaaggtgc tggtgttgtt gttttgaagt ctttggaaca agctaagttg 780
gatggtgata gaatctacgg tgttatcaag ggtgtttcct ctaatgaaga tggtgcttct 840
aatggtgaca agaactcttt gactactcca tcttgtgaag cccaatccat taacatttct 900
aaggctatgg aaaaggcctc cttgtctcca tctgatatct attacattga agcccatggt 960
actggtactc cagttggtga tccaattgaa gttaaggcct tgtccaagat cttctccaac 1020
tctaacaaca accagttgaa caacttctct accgatggta atgataacga tgatgatgat 1080
gacgataaca cctctccaga accattattg attggctcat tcaagtccaa catcggtcat 1140
ttggaatctg ctgctggtat tgcttctttg attaagtgtt gcttgatgtt gaagaacagg 1200
atgttggttc catccattaa ctgctctaat ttgaacccat ccattccatt cgatcagtac 1260
aacatctccg ttatcagaga aatcagacaa ttcccaaccg ataagttggt taacatcggt 1320
atcaattctt tcggtttcgg tggttctaac tgccatttga ttattcaaga gtacaacaac 1380
aacttcaaga acaactctac catctgcaat aacaacaaca acaacaataa caacatcgac 1440
tacttgatcc caatctcctc taagactaag aagtccttgg ataagtactt gattttgatc 1500
aagaccaact ccaactacca caaggatatt tctttcgatg acttcgtcaa gttccaaatc 1560
aagtctaagc agtacaactt gtccaacaga atgactacca ttgctaacga ttggaactcc 1620
ttcattaagg gttctaacga attccacaac ttgatcgaat ctaaggatgg tgaaggtggt 1680
tcttcatctt ctaacagagg tattgattcc gccaatcaaa tcaacactac tactacctct 1740
accatcaacg atatcgaacc tttgttggtt ttcgttttct gtggtcaagg tccacaatgg 1800
aatggtatga ttaagacctt gtacaactcc gagaacgttt tcaagaacac cgttgatcat 1860
gttgacagca tcttgtacaa gtacttcggt tactccattt tgaacgtctt gtctaagatc 1920
gatgataacg acgattccat caaccatcca atagttgctc aaccatcttt gttcttgttg 1980
caaattggtt tggtcgagtt gtttaagtac tggggtatct acccatctat ctctgttggt 2040
cattctttcg gtgaagtctc ttcttattac ttgtccggta tcatctcttt ggaaaccgct 2100
tgtaaaatcg tctacgtcag atcctctaat cagaacaaaa ctatgggttc cggtaagatg 2160
ttggttgttt ctatgggttt taagcaatgg aacgatcaat tctctgctga atggtccgat 2220
attgaaattg cttgttacaa cgctccagat tccatagttg ttactggtaa cgaagaaaga 2280
ttgaaagaat tgtccatcaa gttgtccgac gaatccaatc aaattttcaa caccttcttg 2340
aggtccccat gttcttttca ttcttcccat caagaagtca tcaagggttc tatgttcgaa 2400
gagttgtcta acttgcaatc tactggtgaa accgaaatcc ctttgttctc tactgttact 2460
ggtagacaag ttttgtctgg tcatgttact gctcaacaca tctacgataa tgttagagaa 2520
ccagtcttgt tccaaaagac gattgaatcc attacctcct acatcaagtc tcactaccca 2580
tccaatcaaa aggttatcta cgttgaaatt gctccacacc caaccttgtt ttcattgatc 2640
aaaaagtcca tcccatcctc caacaagaat tcctcttctg ttttgtgtcc attgaacaga 2700
aaagaaaact ccaacaactc ctacaagaag ttcgtttctc agttgtactt caacggtgtt 2760
aacgttgact tcaacttcca gttgaactcc atttgcgata acgttaacaa cgatcaccat 2820
ttgaacaacg tcaagcaaaa ctccttcaaa gagactacca attccttgcc aagataccaa 2880
tgggaacaag atgaatattg gtccgaacca ttgatctcca gaaagaatag attggaaggt 2940
ccaactactt ccttgttggg tcatagaatt atctacagct tcccagtttt ccaatccgtt 3000
ttggacttgc aatctgacaa ctacaaatac ttgttggacc acttggttaa cggtaagcca 3060
gtttttccag gtgctggtta tttggatatc atcatcgaat tcttcgacta ccaaaagcag 3120
cagttgaatt cctctgattc ctctaactcc tacatcatca acgttgacaa gatccaattc 3180
ttgaacccaa ttcacttgac cgaaaacaag ttgcaaacct tgcaatcttc tttcgaacct 3240
atcgttacta agaagtctgc cttctctgtt aacttcttca tcaaggatac cgtcgaggat 3300
caatctaagg ttaagtctat gtctgacgaa acttggacta acacttgtaa ggctaccatt 3360
tccttggaac aacaacagcc atctccatct tctactttga ctttgtctaa gaagcaagac 3420
ttgcagatct tgagaaacag atgcgatatt agcaagctag acaagtttga gttgtacgac 3480
aagatctcta agaatttggg cttgcagtac aactccttgt ttcaagttgt tgataccatc 3540
gaaactggta aggattgctc ttttgctact ttgtctttgc cagaagatac tttgttcacc 3600
accattttga acccatgctt gttggataac tgtttccatg gtttgttgac cttgatcaac 3660
gaaaagggtt ctttcgttgt cgagtccatt tcttctgttt ctatctactt ggagaacatc 3720
ggttccttca atcaaacttc tgttggtaac gtccagttct acttgtacac cactatttct 3780
aaagccacct cctttagttc tgaaggtact tgtaagttgt tcaccaagga tggttccttg 3840
attttgtcta tcggtaagtt catcatcaag tccaccaatc caaagtctac taagaccaac 3900
gaaactatcg aatctccatt ggacgaaacc ttctctattg aatggcaatc taaggattct 3960
ccaattccaa ccccacaaca aatccaacaa caatctccat tgaactctaa cccatccttc 4020
attagatcta ccatcttgaa ggacatccag ttcgaacaat actgctcctc cattatccac 4080
aaagaattga tcaaccacga aaagtacaag aaccagcaat ccttcgatat caactccttg 4140
gaaaaccact tgaacgatga ccaattgatg gaatccttgt ccatctccaa agaatacttg 4200
agattcttca ccaggatcat ctccatcatt aagcaatacc caaagatctt gaacgaaaaa 4260
gagctaaaag aattgaaaga aatcatcgaa ttgaagtacc catccgaagt tcagttgttg 4320
gaattcgaag ttatcgagaa ggtgtccatg attatcccaa agttgttgtt cgaaaacgac 4380
aagcaatctt ccatgacctt gttccaagat aacttgttga ccaggttcta ctccaattct 4440
aactctacca gattctactt ggaaagggtt tccgaaatgg tcttggaatc tattagacca 4500
atcgtcagag aaaagagggt gttcagaatt ttggaaattg gtgctggtac aggctctttg 4560
tctaatgttg ttttgactaa gttgaacacc tacttgtcca ccttgaattc taatggtggt 4620
tctggttaca acatcatcat tgagtacacc ttcaccgata tttccgccaa cttcattatt 4680
ggtgaaatcc aagaaaccat gtgcaacttg tacccaaacg ttactttcaa gttctccgtc 4740
ttggacttgg agaaagagat tattaactcc tccgatttct tgatgggtga ttacgatata 4800
gttttgatgg cctacgttat ccatgccgtt tctaacatta agttctccat cgaacagttg 4860
tacaagttgt tgtctccaag aggttggttg ttgtgtattg aacctaagtc caacgttgtg 4920
ttctccgatt tggttttcgg ttgttttaat cagtggtgga actactacga tgatattaga 4980
actacccact gctccttgtc tgaatctcaa tggaatcagt tgttgttgaa ccagtccttg 5040
aacaacgaat cctcttcttc ttctaactgt tacggtggtt tctccaacgt ttcttttatt 5100
ggtggtgaaa aggatgtcga ctcccattct ttcatattgc actgccaaaa agaatccatc 5160
tcccaaatga agttagccac cactattaac aacggtttgt catctggttc catcgttatc 5220
gttttgaact ctcaacaatt gaccaacatg aagtcctacc caaaggttat tgagtatatt 5280
caagaggcta cctctttgtg caagaccatt gaaattatcg attccaagga cgtcttgaac 5340
tctaccaatt cagttttgga aaagatccaa aagtccttgt tggtgttctg tttgttgggt 5400
tatgacttgt tggagaacaa ctaccaagaa cagtctttcg aatacgttaa gttgttgaac 5460
ttgatctcta ctaccgcctc ttcatctaat gataagaaac caccaaaggt cttgttgatc 5520
accaagcaat ctgaaagaat ctccaggtct ttctactcca gatccttgat tggtatttcc 5580
agaacctcta tgaacgagta cccaaatttg tccattacct ctatcgattt ggataccaac 5640
gactactcat tgcagtcttt gttgaagcca atcttcagca actctaagtt ttccgacaac 5700
gagttcatct tcaaaaaggg cttgatgttc gtgtccagga tctttaagaa caagcagttg 5760
ctagaatcct ccaacgcttt tgaaactgac tcttctaact tgtactgtaa ggcctcttct 5820
gacttgtctt acaagtacgc tattaagcag tctatgttga ccgaaaatca gatcgaaatc 5880
aaggttgaat gcgtcggtat taacttcaag gacaacctat tctacaaggg cttgttgcca 5940
caagaaattt tcagaatggg tgacatctac aatccaccat atggtttgga atgctctggt 6000
gttattacca gaattggttc taacgtcacc gaatactcag ttggtcaaaa tgtttttggt 6060
ttcgccagac attctttggg ttctcatgtt gttaccaaca aggatttggt tatcttgaag 6120
ccagatacca tctcattttc tgaagctgct tctatcccag ttgtttactg tactgcttgg 6180
tactccttgt tcaacattgg tcagttgtct aacgaagaat ccatcctaat tcattctgct 6240
actggtggtg taggtttggc ttctttgaat ttgttgaaaa tgaagaatca gcaacagcaa 6300
ccattgacca atgtttatgc tactgttggc tctaacgaga agaagaagtt cttgatcgat 6360
aacttcaaca acttgttcaa agaggacggc gaaaacattt tctctaccag agacaaagaa 6420
tactccaacc agttggaatc caagatcgat gttattttga acaccttgtc cggtgaattc 6480
gtcgaatcta atttcaagtc cttgagatcc ttcggtagat tgattgattt gtctgctact 6540
cacgtttacg ccaatcaaca aattggtcta ggtaacttca agttcgacca cttgtattct 6600
gctgttgact tggaaagatt gatcgacgaa aaacctaagt tgttgcagtc catcttgcaa 6660
agaattacca actctatcgt caacggttcc ttggaaaaaa ttccaattac catcttccca 6720
tccaccgaaa ctaaggatgc tatcgaatta ttgtccaaga gatcccatat cggtaaagtt 6780
gttgtagatt gcaccgatat ctctaagtgt aatcctgttg gtgatgtgat caccaacttc 6840
tctatgagat tgccaaagcc aaactaccag ttgaatttga actccacctt gttgattact 6900
ggtcagtctg gtttgtctat ccctttgttg aattggttgt tgtctaagtc tggtggtaac 6960
gttaagaacg ttgtcatcat ttctaagtcc accatgaagt ggaagttgca gactatgatt 7020
tcccatttcg tttccggttt cggtatccat tttaactacg ttcaagtcga catctccaac 7080
tacgatgctt tgtctgaagc tattaagcaa ttgccatctg atttgccacc aatcacctct 7140
gtttttcatt tggctgctat ctacaacgat gttccaatgg atcaagttac catgtctacc 7200
gttgaatctg ttcataaccc taaagttttg ggtgccgtta acttgcatag aatctctgtt 7260
tcttttggtt ggaagttgaa ccacttcgtc ttgttctctt ctattactgc tattaccggt 7320
tacccagacc aatctatcta caattctgcc aactctattt tggacgcttt gtccaacttt 7380
agaaggttta tgggtttgcc atccttctcc attaacttgg gtccaatgaa ggatgaaggt 7440
aaggtttcta ccaacaagag catcaagaag ctattcaagt ctagaggttt gccaagccta 7500
tccttgaaca agttatttgg tttgttggag gtcgtcatca acaacccatc taatcatgtt 7560
atcccatccc aattgatttg ctccccaatc gatttcaaga cctacatcga atctttctca 7620
actatgaggc caaagttgtt acacttgcaa cctaccattt ccaagcagca atcttctatc 7680
attaacgatt ctaccaaggc ttcctccaac atttcattgc aagataagat cacctccaag 7740
gtgtctgatt tgttgtccat tccaatctcc aagatcaact tcgatcatcc attgaaacac 7800
tacggcttgg attctttgtt gaccgttcaa ttcaaatcct ggatcgacaa agaattcgaa 7860
aagaacttgt tcacccatat ccaattggcc accatctcta ttaactcatt cttggaaaag 7920
gtgaacggct tgtctacaaa caataacaac aacaacaatt ccaacgtcaa gtcctctcca 7980
tccattgtca aagaagaaat cgttaccttg gacaaggatc aacaaccatt gctattgaaa 8040
gaacaccagc acattatcat ctccccagat attagaatca acaagccaaa gagggaatcc 8100
ttgattagaa ccccaatctt gaacaaattc aaccagatca ccgaatccat tatcactcca 8160
tctacaccat ctttgtccca atccgatgtt ttgaaaactc caccaatcaa gtctttgaac 8220
aacactaaga actccagctt gattaacacc ccaccaattc aatctgtcca acaacatcaa 8280
aagcaacaac aaaaggtcca agtcatccaa caacagcaac aaccattatc cagattgtcc 8340
tacaagagca acaacaactc tttcgttttg ggtatcggta tttctgttcc aggtgaacct 8400
atttcccaac aatccttgaa agactccatc tccaatgact tttctgataa ggctgaaact 8460
aacgagaagg tcaagagaat ctttgagcaa tctcaaatca agaccagaca cttggttaga 8520
gattacacta agccagagaa ctccatcaag ttcagacatt tggaaaccat taccgatgtg 8580
aacaaccagt tcaagaaagt tgttccagat ttggctcaac aagcctgttt gagagctttg 8640
aaagattggg gtggtgataa gggtgatatt acccatatag tttctgttac ctccaccggt 8700
attatcatcc cagatgttaa tttcaagttg atcgacttgt tgggcttgaa caaggatgtt 8760
gaaagagtgt ctttgaacct aatgggttgt ttggctggtt tgagttcttt gagaactgct 8820
gcttctttgg ctaaggcttc tccaagaaat agaattttgg ttgtctgtac cgaagtctgc 8880
tccttgcatt tttctaatac tgatggtggt gatcaaatgg tcgcctcttc tatttttgct 8940
gatggttctg ctgcttacat tattggttgt aacccaagaa ttgaagaaac cccattatac 9000
gaagtcatgt gctccattaa cagatctttc ccaaataccg aaaacgccat ggtttgggat 9060
ttggaaaaag aaggttggaa cttgggtttg gatgcttcta ttccaattgt cattggttct 9120
ggtattgaag ccttcgttga tactttgttg gataaggcta agttgcaaac ttccactgct 9180
atttctgcta aggattgcga attcttgatt catactggtg gcaagtccat cttgatgaac 9240
atcgaaaatt ccttgggtat cgacccaaag caaactaaga atacttggga tgtttaccat 9300
gcctacggca atatgtcatc tgcctctgtt attttcgtta tggatcatgc cagaaagtcc 9360
aagtctttgc caacttactc aatttctttg gcttttggtc caggtttggc ttttgaaggt 9420
tgtttcttga agaacgtcgt ctaa 9444
<210> 2
<211> 14025
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Plasmid
<220>
<221> C1:p506 primer homology
<222> (1)..(50)
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<221> 19 UP
<222> (51)..(761)
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<221> L0
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<221> THD3p
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<221> L1
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<221> ALD6
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<221> L2
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<220>
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<222> (6472)..(6511)
<400> 2
taaccctcac taaagggaac aaaagctgga gctcgtttaa acggcgcgcc caccggagct 60
tggatatgat aaacgaaata ttcttgaatc gtgagatcgc ctgttttcaa aaccgttgga 120
ggcagaaaca attttgtcac aagatgggca ttctacccca tccttgctgt attattgtag 180
tctcgctttc ttttatgctg gacaaatgag actactgcac atttttatac gttcttggtt 240
ttttttaaag gtgtggtttc ggcattatcc tgccgcacgt ttcttggata attcatcctg 300
attctctatt ttaaacgctt cagcctatca ggatttggtt ttgatacata ctgcaagagt 360
gtatctcggg aacagtcatt tattccgcaa caaacttaat tgcggaacgc gttaggcgat 420
ttctagcata tatcaaatac cgttcgcgat ttcttctggg ttcgtctctt ttcttttaaa 480
tacttattaa cgtactcaaa caactacact tcgttgtatc tcagaatgag atccctcagt 540
atgacaatac atcattctaa acgttcgtaa aacacatatg aaacaacttt ataacaaagc 600
gaacaaaatg ggcaacatga gatgaaactc cgcgtccctt agctgaacta cccaaacgta 660
cgaatgcctg aacaattagt ttagatccga gattccgcgc ttccatcatt tagtataatc 720
catattttat ataatatata ggataagtaa cagcccgcga aaaacaacaa ataatcataa 780
aaattttaga actagacata tcgagtttat cattatcaat actgccattt caaagaatac 840
gtaaataatt aatagtagtg attttcctaa ctttatttag tcaaaaaatt agccttttaa 900
ttctgctgta acccgtacat gcccaaaata gggggcgggt tacacagaat atataacatc 960
gtaggtgtct gggtgaacag tttattcctg gcatccacta aatataatgg agcccgcttt 1020
ttaagctggc atccagaaaa aaaaagaatc ccagcaccaa aatattgttt tcttcaccaa 1080
ccatcagttc ataggtccat tctcttagcg caactacaga gaacaggggc acaaacaggc 1140
aaaaaacggg cacaacctca atggagtgat gcaacctgcc tggagtaaat gatgacacaa 1200
ggcaattgac ccacgcatgt atctatctca ttttcttaca ccttctatta ccttctgctc 1260
tctctgattt ggaaaaagct gaaaaaaaag gttgaaacca gttccctgaa attattcccc 1320
tacttgacta ataagtatat aaagacggta ggtattgatt gtaattctgt aaatctattt 1380
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aagatgttga atatgctatc gaatgtgccg accgtgcttt ccacgacact gaatgggcta 1740
cccaagaccc aagagaaaga ggccgtctac taagtaagtt ggctgacgaa ttggaaagcc 1800
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tcgccccagc attggccatg ggtaacgtct gtatcttgaa acccgctgct gtcacacctt 2100
taaatgccct atactttgct tctttatgta agaaggttgg tattccagct ggtgtcgtca 2160
acatcgttcc aggtcctggt agaactgttg gtgctgcttt gaccaacgac ccaagaatca 2220
gaaagctggc ttttaccggt tctacagaag tcggtaagag tgttgctgtc gactcttctg 2280
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gactccgcgc atcgccgtac cacttcaaaa cacccaagca cagcatacta aatttcccct 3600
ctttcttcct ctagggtgtc gttaattacc cgtactaaag gtttggaaaa gaaaaaagag 3660
accgcctcgt ttctttttct tcgtcgaaaa aggcaataaa aatttttatc acgtttcttt 3720
ttcttgaaaa tttttttttt tgattttttt ctctttcgat gacctcccat tgatatttaa 3780
gttaataaac ggtcttcaat ttctcaagtt tcagtttcat ttttcttgtt ctattacaac 3840
tttttttact tcttgctcat tagaaagaaa gcatagcaat ctaatctaag ttttaataca 3900
tctaccagtc aacagccaac aattaactaa ttaaacaatg tcccaaactc ataagcacgc 3960
tattccagct aatattgctg atagatgctt gatcaaccca gaacagtacg aaactaagta 4020
caagcaatcc atcaacgatc cagatacttt ttggggtgaa caaggtaaga ttttggattg 4080
gattacccca taccaaaagg tcaagaatac ttcttttgct ccaggcaacg tttccattaa 4140
gtggtatgaa gatggtactt tgaacttggc tgctaactgt ttggatagac acttgcaaga 4200
aaacggtgat agaaccgcta ttatttggga aggtgatgat acctcccaat ccaaacatat 4260
ctcttacaga gaattgcaca gagatgtctg tagattcgct aacactttgt tggatttggg 4320
catcaaaaag ggtgatgttg ttgctatcta tatgccaatg gttcctgaag ctgctgttgc 4380
tatgttggct tgtgctagaa ttggtgctgt tcattctgtt attttcggtg gtttttcacc 4440
agaagctgtt gccggtagaa ttatcgattc ttcatccaga ttggttatca ccgctgatga 4500
aggtgttaga gctggtagat ctattccatt gaaaaagaac gttgatgacg ccttgaagaa 4560
cccaaatgtt acttctgttg aacacgtcat cgttttgaag agaactggtt ctgatatcga 4620
ttggcaagag ggtagagatt tgtggtggag agatttgatt gaaaaggctt ctccagaaca 4680
tcaaccagaa gctatgaacg ctgaagatcc tttgtttatc ttgtacactt ctggttctac 4740
tggtaagcca aaaggtgttt tacacactac tggtggttat ttggtttacg ctgctactac 4800
tttcaagtac gttttcgatt atcacccagg tgatatctat tggtgtactg ctgatgttgg 4860
ttgggttact ggtcattctt atttgttgta tggtccattg gcttgtggtg ctactacatt 4920
gatgtttgaa ggtgttccaa attggccaac tccagctaga atgtgtcaag ttgttgacaa 4980
acaccaagtc aacatcttgt atactgctcc aactgctatt agagctttga tggctgaagg 5040
tgataaggct attgaaggta ctgatagatc ctccttgaga atcttgggtt ctgttggtga 5100
acctattaac cctgaagcct gggaatggta ttggaagaaa attggtaaag aaaagtgccc 5160
agttgttgat acttggtggc aaactgaaac tggtggtttt atgattactc cattgccagg 5220
tgctattgaa ttgaaagctg gttctgctac tagaccattt tttggtgttc aaccagcttt 5280
ggttgataac gaaggtcatc cacaagaagg tgctactgaa ggtaatttgg ttattactga 5340
ttcttggcca ggtcaagcta gaactttgtt tggtgatcac gaaagattcg aacagactta 5400
cttctctacc ttcaagaaca tgtacttctc tggtgatggt gctagaagag atgaagatgg 5460
ttactattgg attaccggta gagttgatga tgtcttgaat gtttctggtc acagattagg 5520
tactgccgaa attgaatctg ctttggttgc tcatccaaag attgctgaag ctgcagttgt 5580
tggtattcca catgctatta agggtcaagc tatctacgct tacgttactt tgaatcatgg 5640
tgaagaacca tctccagaat tatacgctga agttagaaac tgggtcagaa aagaaattgg 5700
tccattagct accccagatg ttttacattg gactgattct ttgccaaaga ccagatcagg 5760
taagatcatg agaagaatct tgagaaagat tgctgctggt gatacttcta acttgggtga 5820
tacttcaaca ttagctgatc caggtgttgt tgaaaagcct ttggaagaaa aacaagctat 5880
tgccatgcca tcctaataat taaatactat tttcaaaatt ctacttaaaa ataacagaag 5940
acgggagaca ctagcacaca actttaccag gcaaggtatt tgacgctagc atgtgtccaa 6000
ttcagtgtca tttatgattt tttgtagtag gatataaata tatacagcgc tccaaatagt 6060
gcggttgccc caaaaacacc acggaacctc atctgttctc gtactttgtt gtgacaaagt 6120
agctcactgc cttattatca cattttcatt atgcaacgct tcggaaaata cgatgttgaa 6180
aatgcctcta gagatgaaaa acaatcgtaa aagggtcctg cgtaattgaa acatttgatc 6240
agtatgcagt ggcacagaaa caaccaggaa tactatagtc ataggcaata caaggtatat 6300
attggctatg cagacccctc cagaaagtac cgacgtcaag ttagatacac ttaacgaacc 6360
tagtgcacat ttaattgaga aaaatgtggc tcttcctaag gacatattcc gttcgtactt 6420
gagttattgg atctatgaaa tcgctcgcta tacaccagtc atgattttgt cattgcgaag 6480
actatactga tatatgaatt taaactagag cggaccaact atcatccgct aattactgac 6540
attaccaaat gagatctgtg aatgggcaag ataaaaaaca aaaattgaaa tgtttgacgt 6600
tatgtaaaac tattaattcc ttcgctttcg gcggtcacag aatttgcgtg tagctgactc 6660
ttgttcaatc aatatcattt gttactttat ttgaaagtct gtattactgc gcctattgtc 6720
atccgtacca aagaacgtca aaaagaaaca agataatttt tgtgcttaca ccatttatag 6780
atcactgagc ccagaatatc gctggagctc agtgtaagtg gcatgaacac aactctgact 6840
gatcgcacat attgccgtta tcataaatac tagttgtact tgtcaatgcg acgaatggca 6900
tcatgcctat tattacgttc ctctttttcc gtttcatgtt tccagaatgc tattgaatct 6960
aacacttcaa ttataaaaaa gaataaatcc gcaataattt taggctaatt gttgtactgt 7020
caagcgaacc taatggttaa aattcagagg aaccttcgac gtagtctgat cgctacttct 7080
atatcttatg ttcccagtca atcaaaagtt gatactataa tagctgccat ttatacctgt 7140
tagttatggc gatcgtttat cacggcggcc gcggtaccta ataacttcgt atagcataca 7200
ttatacgaag ttatattaag ggttctcgac gttttcgaca ctggatggcg gcgttagtat 7260
cgaatcgaca gcagtatagc gaccagcatt cacatacgat tgacgcatga tattactttc 7320
tgcgcactta acttcgcatc tgggcagatg atgtcgaggc gaaaaaaaat ataaatcacg 7380
ctaacatttg attaaaatag aacaactaca atataaaaaa actatacaaa tgacaagttc 7440
ttgaaaacaa gaatcttttt attgtcagta ctgattagaa aaactcatcg agcatcaaat 7500
gaaactgcaa tttattcata tcaggattat caataccata tttttgaaaa agccgtttct 7560
gtaatgaagg agaaaactca ccgaggcagt tccataggat ggcaagatcc tggtatcggt 7620
ctgcgattcc gactcgtcca acatcaatac aacctattaa tttcccctcg tcaaaaataa 7680
ggttatcaag tgagaaatca ccatgagtga cgactgaatc cggtgagaat ggcaaaagct 7740
tatgcatttc tttccagact tgttcaacag gccagccatt acgctcgtca tcaaaatcac 7800
tcgcatcaac caaaccgtta ttcattcgtg attgcgcctg agcgagacga aatacgcgat 7860
cgctgttaaa aggacaatta caaacaggaa tcgaatgcaa ccggcgcagg aacactgcca 7920
gcgcatcaac aatattttca cctgaatcag gatattcttc taatacctgg aatgctgttt 7980
tgccggggat cgcagtggtg agtaaccatg catcatcagg agtacggata aaatgcttga 8040
tggtcggaag aggcataaat tccgtcagcc agtttagtct gaccatctca tctgtaacat 8100
cattggcaac gctacctttg ccatgtttca gaaacaactc tggcgcatcg ggcttcccat 8160
acaatcgata gattgtcgca cctgattgcc cgacattatc gcgagcccat ttatacccat 8220
ataaatcagc atccatgttg gaatttaatc gcggcctcga aacgtgagtc ttttccttac 8280
ccatggttgt ttatgttcgg atgtgatgtg agaactgtat cctagcaaga ttttaaaagg 8340
aagtatatga aagaagaacc tcagtggcaa atcctaacct tttatatttc tctacagggg 8400
cgcggcgtgg ggacaattca acgcgtctgt gaggggagcg tttccctgct cgcaggtctg 8460
cagcgaggag ccgtaatttt tgcttcgcgc cgtgcggcca tcaaaatgta tggatgcaaa 8520
tgattataca tggggatgta tgggctaaat gtacgggcga cagtcacatc atgcccctga 8580
gctgcgcacg tcaagactgt caaggagggt attctgggcc tccatgtcgc tggccgggtg 8640
acccggcggg gacgaggcaa gctaaacaga tctctagacc taataacttc gtatagcata 8700
cattatacga agttatatta agggttgtct taattaaggg tgcccaattc gccctatagt 8760
gagtcgtatt acgcgcgctc actggccgtc gttttacaac gtcgtgactg ggaaaaccct 8820
ggcgttaccc aacttaatcg ccttgcagca catccccctt tcgccagctg gcgtaatagc 8880
gaagaggccc gcaccgatcg cccttcccaa cagttgcgca gcctgaatgg cgaatggcgc 8940
gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg cagcgtgacc 9000
gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc ctttctcgcc 9060
acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg gttccgattt 9120
agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc acgtagtggg 9180
ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt ctttaatagt 9240
ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc ttttgattta 9300
taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta acaaaaattt 9360
aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcct gatgcggtat tttctcctta 9420
cgcatctgtg cggtatttca caccgcatag atccgtcgag ttcaagagaa aaaaaaagaa 9480
aaagcaaaaa gaaaaaagga aagcgcgcct cgttcagaat gacacgtata gaatgatgca 9540
ttaccttgtc atcttcagta tcatactgtt cgtatacata cttactgaca ttcataggta 9600
tacatatata cacatgtata tatatcgtat gctgcagctt taaataatcg gtgtcaatgt 9660
ctgcccctat gtctgcccct aagaagatcg tcgttttgcc aggtgaccac gttggtcaag 9720
aaatcacagc cgaagccatt aaggttctta aagctatttc tgatgttcgt tccaatgtca 9780
agttcgattt cgaaaatcat ttaattggtg gtgctgctat cgatgctaca ggtgtcccac 9840
ttccagatga ggcgctggaa gcctccaaga aggttgatgc cgttttgtta ggtgctgtgg 9900
gtggtcctaa atggggtgcc ggtagtgtta gacctgaaca aggtttacta aaaatccgta 9960
aagaacttca attgtacgcc aacttaagac catgtaactt tgcatccgac tctcttttag 10020
acttatctcc aatcaagcca caatttgcta aaggtactga cttcgttgtt gtcagagaat 10080
tagtgggagg tatttacttt ggtaagagaa aggaagacga tggtgatggt gtcgcttggg 10140
atagtgaaca atacaccgtt ccagaagtgc aaagaatcac aagaatggcc gctttcatgg 10200
ccctacaaca tgagccacca ttgcctattt ggtccttgga taaagctaat gttttggcct 10260
cttcaagatt atggagaaaa actgtggagg aaaccatcaa gaacgaattc cctacattga 10320
aggttcaaca tcaattgatt gattctgccg ccatgatcct agttaagaac ccaacccacc 10380
taaatggtat tataatcacc agcaacatgt ttggtgatat catctccgat gaagcctccg 10440
ttatcccagg ttccttgggt ttgttgccat ctgcgtcctt ggcctctttg ccagacaaga 10500
acaccgcatt tggtttgtac gaaccatgcc acggttctgc tccagatttg ccaaagaata 10560
aggttgaccc tatcgccact atcttgtctg ctgcaatgat gttgaaattg tcattgaact 10620
tgcctgaaga aggtaaggcc attgaagatg cagttaaaaa ggttttggat gcaggtatca 10680
gaactggtga tttaggtggt tccaacagta ccaccgaagt cggtgatgct gtcgccgaag 10740
aagttaagaa aatccttgct taactttgcc ttcgtttatc ttgcctgctc attttttagt 10800
atattcttcg aagaaatcac attactttat ataatgtata attcattatg tgataatgcc 10860
aatcgctaag aaaaaaaaag agtcatccgc taggggaaaa aaaaaaatga aaatcattac 10920
cgaggcataa aaaaatatag agtgtactag aggaggccaa gagtaataga aaaagaaaat 10980
tgcgggaaag gactgtgtta tgacttccct gactaatgcc gtgttcaaac gatacctggc 11040
agtgactcct agcgctcacc aagctcttaa aacgggaatt tatggtgcac tctcagtaca 11100
atctgctctg atgccgcata gttaagccag ccccgacacc cgccaacacg cgctgacgcg 11160
ccctgacggg cttgtctgct cccggcatcc gcttacagac aagctgtgac cgtctccggg 11220
agctgcatgt gtcagaggtt ttcaccgtca tcaccgaaac gcgcgagacg aaagggcctc 11280
gtgatacgcc tatttttata ggttaatgtc atgataataa tggtttctta ggacggatcg 11340
cttgcctgta acttacacgc gcctcgtatc ttttaatgat ggaataattt gggaatttac 11400
tctgtgttta tttattttta tgttttgtat ttggatttta gaaagtaaat aaagaaggta 11460
gaagagttac ggaatgaaga aaaaaaaata aacaaaggtt taaaaaattt caacaaaaag 11520
cgtactttac atatatattt attagacaag aaaagcagat taaatagata tacattcgat 11580
taacgataag taaaatgtaa aatcacagga ttttcgtgtg tggtcttcta cacagacaag 11640
atgaaacaat tcggcattaa tacctgagag caggaagagc aagataaaag gtagtatttg 11700
ttggcgatcc ccctagagtc ttttacatct tcggaaaaca aaaactattt tttctttaat 11760
ttcttttttt actttctatt tttaatttat atatttatat taaaaaattt aaattataat 11820
tatttttata gcacgtgatg aaaaggaccc aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg 11880
aacccctatt tgtttatttt tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata 11940
accctgataa atgcttcaat aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc aacatttccg 12000
tgtcgccctt attccctttt ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac 12060
gctggtgaaa gtaaaagatg ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact 12120
ggatctcaac agcggtaaga tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat 12180
gagcactttt aaagttctgc tatgtggcgc ggtattatcc cgtattgacg ccgggcaaga 12240
gcaactcggt cgccgcatac actattctca gaatgacttg gttgagtact caccagtcac 12300
agaaaagcat cttacggatg gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat 12360
gagtgataac actgcggcca acttacttct gacaacgatc ggaggaccga aggagctaac 12420
cgcttttttg cacaacatgg gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg aaccggagct 12480
gaatgaagcc ataccaaacg acgagcgtga caccacgatg cctgtagcaa tggcaacaac 12540
gttgcgcaaa ctattaactg gcgaactact tactctagct tcccggcaac aattaataga 12600
ctggatggag gcggataaag ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg 12660
gtttattgct gataaatctg gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca ttgcagcact 12720
ggggccagat ggtaagccct cccgtatcgt agttatctac acgacgggga gtcaggcaac 12780
tatggatgaa cgaaatagac agatcgctga gataggtgcc tcactgatta agcattggta 12840
actgtcagac caagtttact catatatact ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt 12900
taaaaggatc taggtgaaga tcctttttga taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga 12960
gttttcgttc cactgagcgt cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc 13020
tttttttctg cgcgtaatct gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt 13080
ttgtttgccg gatcaagagc taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc 13140
gcagatacca aatactgtcc ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc 13200
tgtagcaccg cctacatacc tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg 13260
cgataagtcg tgtcttaccg ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg 13320
gtcgggctga acggggggtt cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga 13380
actgagatac ctacagcgtg agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc 13440
ggacaggtat ccggtaagcg gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg 13500
gggaaacgcc tggtatcttt atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg 13560
atttttgtga tgctcgtcag gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt 13620
tttacggttc ctggcctttt gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc 13680
tgattctgtg gataaccgta ttaccgcctt tgagtgagct gataccgctc gccgcagccg 13740
aacgaccgag cgcagcgagt cagtgagcga ggaagcggaa gagcgcccaa tacgcaaacc 13800
gcctctcccc gcgcgttggc cgattcatta atgcagctgg cacgacaggt ttcccgactg 13860
gaaagcgggc agtgagcgca acgcaattaa tgtgagttac ctcactcatt aggcacccca 13920
ggctttacac tttatgcttc cggctcctat gttgtgtgga attgtgagcg gataacaatt 13980
tcacacagga aacagctatg accatgatta cgccaagcgc gcaat 14025
<210> 3
<211> 684
<212> DNA
<213> Saccharomyces cerevisiae
<220>
<221> Acc1 promoter
<222> (1)..(463)
<220>
<221> gRNA_3
<222> (53)..(72)
<220>
<221> gRNA_2
<222> (265)..(284)
<220>
<221> gRNA_1
<222> (339)..(358)
<400> 3
ggtagaaact tgattttttc taattttctg cgctgtttcg ggaacggaaa aaaattaagc 60
tagaagacga atcggttatt atactattat atttgtatag tatagtagcg tgtcgtatcg 120
tatcgtgtcg tatcgtatcg tatcgttaaa agaaaataca cgaataaata ataatatgtg 180
gagaagaaaa agggaagttt cttgtctctt gctctgaatc tgaattccaa ttcaagttca 240
aattgttctc tagtttattg tccaaaaata aggatgaagc gggagggaag ggcagaggga 300
aaagttcgta tagtagaatg aataaacttt tataaacaca tgcaccgatc actcacagag 360
gataaaaaaa tggcacaaca aatatatata tatagatgca aatggcgatt gcaaattagg 420
gaattggctt tgttgttttt tatcttcagg taaactgtac gaaagggata aaaagagtag 480
aataaggaaa ggaaaattga agagagcaga acaattgtag aaccgataac aattgtgaca 540
gtgattgtgc taggctatac tgtgccagaa tacgactggg agtgctgttc ttcttatata 600
tcttggcgct gattgagcgt atagcctagt tcaccaagca gtagagagag tggcaatgag 660
cggttgaatt tcgactgcga cttg 684
<210> 4
<211> 971
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PGK1 promoter and integration sequences for Saccharomyces
cerevisiae Acc1 promoter
<220>
<221> PGK1p
<222> (7)..(750)
<400> 4
tgttttatat ttgttgtaaa aagtagataa ttacttcctt gatgatctgt aaaaaagaga 60
aaaagaaagc atctaagaac ttgaaaaact acgaattaga aaagaccaaa tatgtatttc 120
ttgcattgac caatttatgc aagtttatat atatgtaaat gtaagtttca cgaggttcta 180
ctaaactaaa ccaccccctt ggttagaaga aaagagtgtg tgagaacagg ctgttgttgt 240
cacacgattc ggacaattct gtttgaaaga gagagagtaa cagtacgatc gaacgaactt 300
tgctctggag atcacagtgg gcatcatagc atgtggtact aaaccctttc ccgccattcc 360
agaaccttcg attgcttgtt acaaaacctg tgagccgtcg ctaggacctt gttgtgtgac 420
gaaattggaa gctgcaatca ataggaagac aggaagtcga gcgtgtctgg gttttttcag 480
ttttgttctt tttgcaaaca aatcacgagc gacggtaatt tctttctcga taagaggcca 540
cgtgctttat gagggtaaca tcaattcaag aaggagggaa acacttcctt tttctggccc 600
tgataatagt atgagggtga agccaaaata aaggattcgc gcccaaatcg gcatctttaa 660
atgcaggtat gcgatagttc ctcactcttt ccttactcac gagtaattct tgcaaatgcc 720
tattatgcag atgttataat atctgtgcgt agggataaaa agagtagaat aaggaaagga 780
aaattgaaga gagcagaaca attgtagaac cgataacaat tgtgacagtg attgtgctag 840
gctatactgt gccagaatac gactgggagt gctgttcttc ttatatatct tggcgctgat 900
tgagcgtata gcctagttca ccaagcagta gagagagtgg caatgagcgg ttgaatttcg 960
actgcgactt g 971
<210> 5
<211> 1724
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cassette with Saccharomyces cerevisiae Acc1 (S659A; S1167A)
coding sequence, regulatory sequences and integration sequences
<220>
<221> T-G Ser659Ala
<222> (108)..(108)
<220>
<221> T-G ser1167ala
<222> (1602)..(1602)
<400> 5
ggcgcgccga gggtaaaaga tacaagttca cggtcgctaa atccggtaat gaccgctaca 60
cattatttat caatggttct aaatgtgata tcatactgcg tcaactagct gatggtgggc 120
tgctgatcgc tatcggcgct aaatcgcata ccatctattg gaaagaagaa gttgctgcta 180
caagattatc cgttgactct atgactactt tgttggaagt tgaaaacgat ccaacccagt 240
tgcgtactcc atcccctggt aaattggtta aattcttggt ggaaaatggt gaacacatta 300
tcaagggcca accatatgca gaaattgaag ttatgaaaat gcaaatgcct ttggtttctc 360
aagaaaatgg tatcgtccag ttattaaagc aacctggttc taccattgtt gcaggtgata 420
tcatggctat tatgactctt gacgatccat ccaaggtcaa gcacgctcta ccatttgaag 480
gtatgctgcc agattttggt tctccagtta tcgaaggaac caaacctgcc tataaattca 540
agtcattagt gtctactttg gaaaacattt tgaagggtta tgacaaccaa gttattatga 600
acgcttcctt gcaacaattg atagaagttt tgagaaatcc aaaactgcct tactcagaat 660
ggaaactaca catctctgct ttacattcaa gattgcctgc taagctagat gaacaaatgg 720
aagagttagt tgcacgttct ttgagacgtg gtgctgtttt cccagctaga caattaagta 780
aattgattga tatggccgtg aagaatcctg aatacaaccc cgacaaattg ctgggcgcag 840
tcgtggaacc attggcggat attgctcata agtactctaa cgggttagaa gcccatgaac 900
attctatatt tgtccatttc ttggaagaat attacgaagt tgaaaagtta ttcaatggtc 960
caaatgttcg tgaggaaaat atcattctga aattgcgtga tgaaaaccct aaagatctag 1020
ataaagttgc gctaactgtt ttgtctcatt cgaaagtttc agcgaagaat aacctgatcc 1080
tagctatctt gaaacattat caaccattgt gcaagttatc ttctaaagtt tctgccattt 1140
tctctactcc tctacaacat attgttgaac tagaatctaa ggctaccgct aaggtcgctc 1200
tacaagcaag agaaattttg attcaaggcg ctttaccttc ggtcaaggaa agaactgaac 1260
aaattgaaca tatcttaaaa tcctctgttg tgaaggttgc ctatggctca tccaatccaa 1320
agcgctctga accagatttg aatatcttga aggacttgat cgattctaat tacgttgtgt 1380
tcgatgtttt acttcaattc ctaacccatc aagacccagt tgtgactgct gcagctgctc 1440
aagtctatat tcgtcgtgct tatcgtgctt acaccatagg agatattaga gttcacgaag 1500
gtgtcacagt tccaattgtt gaatggaaat tccaactacc ttcagctgcg ttctccacct 1560
ttccgactgt gaagtctaag atgggtatga acagggctgt tgctgtttca gatttgtcat 1620
atgttgcaaa cagtcagtca tctccgttaa gagaaggtat tttgatggct gtggatcatt 1680
tagatgatgt tgatgaaatt ttgtcacaaa gtttggggcg cgcc 1724
<210> 6
<211> 3256
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cassette with Saccharomyces cerevisiae Maf1 coding sequence,
regulatory sequences and integration sequences
<220>
<221> L0
<222> (362)..(401)
<220>
<221> Tef1
<222> (402)..(895)
<220>
<221> L1
<222> (896)..(935)
<220>
<221> MAF1
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<220>
<221> L2
<222> (2124)..(2163)
<220>
<221> PRM9t
<222> (2164)..(2701)
<220>
<221> LTP2
<222> (2702)..(2741)
<400> 6
aatgatttaa gcgtgcgtga agataacact acaatccatt ttaaagcaac atccacattg 60
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attattaatg gaacttacaa cgtttccaaa agttagttaa atacatacgt ctatttacta 180
agcaagaaat atatcatgac aagcccaaat attatattgt tatgtttaca aaaaaaaaat 240
ggctatatac atcaagtctg gaggcttttt ataacaagca agtggggtaa cttagacata 300
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ataaacaaca aataatcata aaaattttag aactagacat aaagcaacag gcgcgttgga 420
cttttaattt tcgaggaccg cgaatcctta catcacaccc aatcccccac aagtgatccc 480
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ttcttcctct agggtgtcgt taattacccg tactaaaggt ttggaaaaga aaaaagagac 660
cgcctcgttt ctttttcttc gtcgaaaaag gcaataaaaa tttttatcac gtttcttttt 720
cttgaaaatt tttttttttg atttttttct ctttcgatga cctcccattg atatttaagt 780
taataaacgg tcttcaattt ctcaagtttc agtttcattt ttcttgttct attacaactt 840
tttttacttc ttgctcatta gaaagaaagc atagcaatct aatctaagtt ttaatctaga 900
aaatttatta taaaaggaag agaaataatt aaacaatgaa atttattgat gagctagata 960
tagagagagt gaatcaaact ctcaatttcg agacaaatga ctgtaaaatc gtgggcagtt 1020
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agcatttgga tactatttta caggaaaatg agaattacaa tgctaccctt cagcaacagc 1140
tagctgctcc cgaaacaaac caatcaccct gctcgtcgcc attttattct aataggaggg 1200
atagcaactc tttttgggag caaaagagaa gaatatcttt tagtgaatac aatagcaata 1260
ataacactaa caacagtaat ggcaatagca gtaataacaa taactattct ggacctaatg 1320
gttcttctcc agcaactttt cccaaaagtg ccaagctaaa tgaccaaaat ttaaaagaat 1380
tagtctcgaa ttacgattct ggctctatga gctcatcgtc tcttgattct tcttctaaga 1440
atgatgagag gataagaaga aggagcagta gcagtattag cagtttcaaa agtggtaaat 1500
catcgaacaa taattacagt tctggtacag caaccaacaa tgttaacaaa agaagaaaat 1560
cttcgataaa cgaaaggcca agcaatttaa gtttgggtcc gtttggtccc ataaacgaac 1620
cgtcaagccg caaaatattt gcttatctga ttgctatcct caacgcttct tatcctgacc 1680
atgatttttc atcggttgag ccaacggatt ttgtcaaaac atcattgaaa acttttattt 1740
ccaaatttga aaacacctta tattctcttg gtagacaacc agaggaatgg gtctgggagg 1800
taattaattc tcacatgact ctttctgatt gcgtcctttt tcaatattca ccttcaaact 1860
cttttttgga agatgagcct ggctatcttt ggaatcttat aggttttctt tacaacagga 1920
aaaggaaaag agtggcttac ctttacttga tttgctcgcg tctaaattcg agtacaggcg 1980
aagtggaaga tgccttggca aaaaaacctc agggaaagct tataatagat gatggctcaa 2040
atgaatacga aggagaatac gatttcactt atgatgagaa tgtaatagat gataaatcag 2100
atcaagaaga atccctacag tagagacata aaactgaaac aacaccaatt aataatagac 2160
tttacagaag acgggagaca ctagcacaca actttaccag gcaaggtatt tgacgctagc 2220
atgtgtccaa ttcagtgtca tttatgattt tttgtagtag gatataaata tatacagcgc 2280
tccaaatagt gcggttgccc caaaaacacc acggaacctc atctgttctc gtactttgtt 2340
gtgacaaagt agctcactgc cttattatca cattttcatt atgcaacgct tcggaaaata 2400
cgatgttgaa aatgcctcta gagatgaaaa acaatcgtaa aagggtcctg cgtaattgaa 2460
acatttgatc agtatgcagt ggcacagaaa caaccaggaa tactatagtc ataggcaata 2520
caaggtatat attggctatg cagacccctc cagaaagtac cgacgtcaag ttagatacac 2580
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gttcgtactt gagttattgg atctatgaaa tcgctcgcta tacaccagtc atgattttgt 2700
ccttaaataa catactcatc actaaacatt cttaacaatc agaaaacaac gcgtcatgaa 2760
aaagagttac tgaaccttca gatcctactt attgtaatgc ttcgcgacat ccaatccatt 2820
taataatcaa tttaaaacta gagttggtag agttccttgt tgaacgtgat aacccaaaag 2880
cataatacga gtaatgtttc agtattgcta ttatatgttt acacaaggaa aacatataat 2940
aacaaacctc taatccggta gtacttaaga aactatagtt tctatgtaca aaaaggtaac 3000
tatgtaattc ttacatttac ataacgtata gaagggtcca ataaacttac taaacttact 3060
accttgttgt atataggcta gatcgtaatc cactacgtca acataaaaaa aacttaagaa 3120
gtttgaattt tatgtacaaa cagattgtta aaatataata taagattatg gaaacgaact 3180
tgctctaaaa aaaatttaaa gttttataaa atcctcgaac tatcgctgtt atacatgatg 3240
tccccaaagc gtgtac 3256
<210> 7
<211> 4662
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cassette with Saccharomyces cerevisiae UPC2E888D coding sequence,
regulatory sequences and integration sequences
<220>
<221> L0
<222> (401)..(440)
<220>
<221> Tef1
<222> (441)..(934)
<220>
<221> L1
<222> (935)..(974)
<220>
<221> UPC2-1
<222> (975)..(3701)
<220>
<221> g-a G888D
<222> (3637)..(3637)
<220>
<221> L2
<222> (3702)..(3741)
<220>
<221> PRM9t
<222> (3742)..(4279)
<220>
<221> LTP2
<222> (4280)..(4319)
<400> 7
cccagttgtt tgtagctggt tcatatttag cggcaattct ctgttgcgta aatgaaaata 60
ttaatgtaaa caaaaaaaga ccaaaacatt ttagcagtgt aagaaggtgt actgatacaa 120
aatgtgttta gagtctactg atatgttact gaccgttcgt tgggaaaaaa atactgtatc 180
atttattaat caaaagcgac ttttggtgga atattatgat atgtgttgtt aaaatatgac 240
gtaattttag aattgtctga ttcgtattca aatttggtga aggaataacg cagagttgac 300
aatttaatag aatggattaa tcgtaatttt cagaaacgta gaaaaagaaa aacaattaaa 360
acattatatt aagattattg atttgccttt taagggtcca taaacaacaa ataatcataa 420
aaattttaga actagacata aagcaacagg cgcgttggac ttttaatttt cgaggaccgc 480
gaatccttac atcacaccca atcccccaca agtgatcccc cacacaccat agcttcaaaa 540
tgtttctact ccttttttac tcttccagat tttctcggac tccgcgcatc gccgtaccac 600
ttcaaaacac ccaagcacag catactaaat ttcccctctt tcttcctcta gggtgtcgtt 660
aattacccgt actaaaggtt tggaaaagaa aaaagagacc gcctcgtttc tttttcttcg 720
tcgaaaaagg caataaaaat ttttatcacg tttctttttc ttgaaaattt ttttttttga 780
tttttttctc tttcgatgac ctcccattga tatttaagtt aataaacggt cttcaatttc 840
tcaagtttca gtttcatttt tcttgttcta ttacaacttt ttttacttct tgctcattag 900
aaagaaagca tagcaatcta atctaagttt taatctagaa aatttattat aaaaggaaga 960
gaaataatta aacaatgagc gaagtcggta tacagaatca caagaaagcg gtgacaaaac 1020
ccagaagaag agaaaaagtc atcgagctaa ttgaagtgga cggcaaaaag gtgagtacga 1080
cttcaaccgg taaacgtaaa ttccataaca aatcaaagaa tgggtgcgat aactgtaaaa 1140
gaagaagagt taagtgtgat gaagggaagc cagcctgtag gaagtgcaca aatatgaagt 1200
tggaatgtca gtatacacca atccatttaa ggaaaggtag aggagcaaca gtagtgaagt 1260
atgtcacgag aaaggcagac ggtagcgtgg agtctgattc atcggtagat ttacctccta 1320
cgatcaagaa ggagcagaca ccgttcaatg atatccaatc agcggtaaaa gcttcaggct 1380
catccaatga ttcctttcca tcaagcgcct ctacaactaa gagtgagagc gaggaaaagt 1440
catcggcccc tatagaggac aaaaacaata tgactcctct aagtatgggc ctccagggta 1500
ccatcaataa gaaagatatg atgaataact ttttctctca aaatggcact attggttttg 1560
gttctcctga aagattgaat tcaggtatcg atggcttact attaccgcca ttgccttctg 1620
gaaatatggg tgcgttccaa cttcagcaac agcagcaagt gcagcagcaa tctcaaccac 1680
agacccaagc gcagcaagca agtggaactc caaacgagag atatggttca ttcgatcttg 1740
cgggtagtcc tgcattgcaa tccacgggaa tgagcttatc aaatagtcta agcgggatgt 1800
tactatgtaa caggattcct tccggccaaa actacactca acaacaatta caatatcaat 1860
tacaccagca gctgcaattg caacagcatc agcaagttca gctgcagcag tatcaacaat 1920
tacgtcagga acaacaccaa caagttcagc aacaacaaca ggaacaactc cagcaatacc 1980
aacaacattt tttgcaacag cagcaacaag tactgcttca gcaagagcaa caacctaacg 2040
atgaggaagg tggcgttcag gaagaaaaca gcaaaaaggt aaaggaaggg cctttacaat 2100
cacaaacaag cgaaactact ttaaacagcg atgctgctac attacaagct gatgcattat 2160
ctcagttaag taagatgggg ctaagcctaa agtcgttaag tacctttcca acagctggta 2220
ttggtggtgt ttcctatgac tttcaggaac tgttaggtat taagtttcca ataaataacg 2280
gcaattcaag agctactaag gccagcaacg cagaggaagc tttggccaat atgcaagagc 2340
atcatgaacg tgcagctgct tctgtaaagg agaatgatgg tcagctctct gatacgaaga 2400
gtccagcgcc atcgaataac gcccaagggg gaagtgctag tattatggaa cctcaggcgg 2460
ctgatgcggt ttcgacaatg gcgcctatat caatgattga aagaaacatg aacagaaaca 2520
gcaacatttc tccatcaacg ccctctgcag tgttgaatga taggcaagag atgcaagatt 2580
ctataagttc tctaggaaat ctgacaaaag cagccttgga gaacaacgaa ccaacgataa 2640
gtttacaaac atcacagaca gagaatgaag acgatgcatc gcggcaagac atgacctcaa 2700
aaattaataa cgaagctgac cgaagttctg tttctgctgg taccagtaac atcgctaagc 2760
ttttagatct ttctaccaaa ggcaatctga acctgataga catgaaactg tttcatcatt 2820
attgcacaaa ggtctggcct acgattacag cggccaaagt ttctgggcct gaaatatgga 2880
gggactacat accggagtta gcatttgact atccattttt aatgcacgct ttgttggcat 2940
tcagtgccac ccatctttcg aggactgaaa ctggactgga gcaatacgtt tcatctcacc 3000
gcctagacgc tctgagatta ttaagagaag ctgttttaga aatatctgag aataacaccg 3060
atgcgctagt tgccagcgcc ctgatactaa tcatggactc gttagcaaat gctagtggta 3120
acggcactgt aggaaaccaa agtttgaata gcatgtcacc aagcgcttgg atctttcatg 3180
tcaaaggtgc tgcaacaatt ttaaccgctg tgtggccttt gagtgaaaga tctaaatttc 3240
ataacattat atctgttgat cttagcgatt taggcgatgt cattaaccct gatgttggaa 3300
caattactga attggtatgt tttgatgaaa gtattgccga tttgtatcct gtcggcttag 3360
attcgccata tttgataaca ctagcttatt tagataaatt gcaccgtgaa aaaaaccagg 3420
gtgattttat tctgcgggta tttacatttc cagcattgct agacaagaca ttcctggcat 3480
tactgatgac aggtgattta ggtgcaatga gaattatgag atcatattat aaactacttc 3540
gaggatttgc cacagaggtc aaggataaag tctggtttct cgaaggagtc acgcaggtgc 3600
tgcctcaaga cgttgatgag tacaggggag gtggtgatat gcatatgatg ctaggattac 3660
catcgatgac aacaacaaat ttctctgatt tttcgttatg aagacataaa actgaaacaa 3720
caccaattaa taatagactt tacagaagac gggagacact agcacacaac tttaccaggc 3780
aaggtatttg acgctagcat gtgtccaatt cagtgtcatt tatgattttt tgtagtagga 3840
tataaatata tacagcgctc caaatagtgc ggttgcccca aaaacaccac ggaacctcat 3900
ctgttctcgt actttgttgt gacaaagtag ctcactgcct tattatcaca ttttcattat 3960
gcaacgcttc ggaaaatacg atgttgaaaa tgcctctaga gatgaaaaac aatcgtaaaa 4020
gggtcctgcg taattgaaac atttgatcag tatgcagtgg cacagaaaca accaggaata 4080
ctatagtcat aggcaataca aggtatatat tggctatgca gacccctcca gaaagtaccg 4140
acgtcaagtt agatacactt aacgaaccta gtgcacattt aattgagaaa aatgtggctc 4200
ttcctaagga catattccgt tcgtacttga gttattggat ctatgaaatc gctcgctata 4260
caccagtcat gattttgtcc ttaaataaca tactcatcac taaacattct taacaatcac 4320
gatggatgat gattggttct tatcataatt tgatttcggc agaagcaata ttagaggtat 4380
tgttgtaacg aaattccaat gtcatctgct tagtattatt aatgttacct gcatattatc 4440
acatgccgct taaaaatgtg ttataagtat taaaatctag tgaaagttga aatgtaatct 4500
aataggataa tgaaacatat gaaacggaat gaggaataat cgttgtatta ctatgtagag 4560
atatcgattt cattttgagg attcctatat tcttggggag aacttctact atattctgta 4620
tacatgatat aatagccttt accaacaatg gaatgccaac aa 4662
<210> 8
<211> 3564
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cassette with Aspergillus nidulans NpgA coding sequence,
regulatory sequences and integration sequences
<220>
<221> LTP1 (L0)
<222> (596)..(635)
<220>
<221> Tef1p
<222> (636)..(1129)
<220>
<221> L1
<222> (1130)..(1169)
<220>
<221> NpgA
<222> (1170)..(2201)
<220>
<221> L2
<222> (2205)..(2244)
<220>
<221> PRM9t
<222> (2245)..(2782)
<220>
<221> LTP2
<222> (2783)..(2822)
<400> 8
tcaatcaaag caacccacaa atcctaggct gaatcatgat atcgatggaa gcaatcaaca 60
attttatcaa gaccgcacca aagcacgact atctgacagg cggagttcat cattctggta 120
atgtagacgt gttacaatta agcggcaata aagaagatgg tagtttagta tggaaccata 180
cttttgttga tgtagacaac aatgtggtag ctaagtttga agacgctctc gaaaaacttg 240
aaagtttgca ccggcgctca tcctcatcca caggcaatga agaacacgct aacgtttaac 300
cgaggggagt cacttcataa tgatgtgaga aataagtgaa tattgtaata attgttggga 360
ctccattgtc aacaaaagct ataatgtagg tatacagtat atactagaag ttctcctcga 420
ggatcttgga atccacaaaa gggagtcgat aaatctatat aataaaaatt actttatctt 480
ctttcgtttt atacgttgtc gtttattatc ctattacgtt atcaatcttc gcatttcagc 540
tttcattaga tttgatgact gtttctcaaa ctttatgtca ttttcttaca ccgcataaac 600
aacaaataat cataaaaatt ttagaactag acataaagca acaggcgcgt tggactttta 660
attttcgagg accgcgaatc cttacatcac acccaatccc ccacaagtga tcccccacac 720
accatagctt caaaatgttt ctactccttt tttactcttc cagattttct cggactccgc 780
gcatcgccgt accacttcaa aacacccaag cacagcatac taaatttccc ctctttcttc 840
ctctagggtg tcgttaatta cccgtactaa aggtttggaa aagaaaaaag agaccgcctc 900
gtttcttttt cttcgtcgaa aaaggcaata aaaattttta tcacgtttct ttttcttgaa 960
aatttttttt tttgattttt ttctctttcg atgacctccc attgatattt aagttaataa 1020
acggtcttca atttctcaag tttcagtttc atttttcttg ttctattaca acttttttta 1080
cttcttgctc attagaaaga aagcatagca atctaatcta agttttaatc tagaaaattt 1140
attataaaag gaagagaaat aattaaacaa tggttcaaga tacctcttct gcttctacct 1200
ctccaatttt gactagatgg tacattgata ccagaccatt gactgcttct actgctgctt 1260
tgccattatt ggaaacttta caaccagccg atcaaatctc cgttcaaaag tactatcact 1320
tgaaggacaa gcacatgtct ttggcttcta acttgttgaa gtacttgttc gttcacagaa 1380
actgcagaat tccatggtcc tctatcgtta tttctagaac tccagatcca catagaaggc 1440
catgttatat tccaccatct ggttctcaag aggattcttt taaagatggt tacaccggta 1500
tcaacgtcga gtttaatgtt tctcatcaag cctccatggt tgctattgct ggtactgctt 1560
ttactccaaa ttctggtggt gattctaagt tgaaaccaga agttggtatc gatattacct 1620
gcgtcaacga aagacaaggt agaaatggtg aagaaaggtc cttggaatct ttgagacagt 1680
acatcgatat cttctccgaa gttttctcta ctgctgaaat ggccaacatt agaagattgg 1740
atggtgtctc ttcttcctca ttgtctgctg atagattggt tgattatggc tacaggttgt 1800
tctatactta ctgggctttg aaagaagcct acattaagat gactggtgaa gccttgttgg 1860
ctccatggtt gagagaattg gaattctcta atgttgttgc tccagctgct gttgctgaat 1920
ctggtgattc tgctggtgat tttggtgaac catatactgg tgttagaacc accttgtaca 1980
agaacttggt tgaagatgtt agaattgaag ttgctgcttt gggtggtgat tacttgtttg 2040
ctactgctgc tagaggtggt ggtattggtg cttcttctag accaggtggt ggtccagatg 2100
gttctggtat tagatctcaa gatccttgga ggccattcaa gaagttggat attgaaaggg 2160
atattcaacc atgtgctact ggtgtatgta actgcttgtc ttaaagacat aaaactgaaa 2220
caacaccaat taataataga ctttacagaa gacgggagac actagcacac aactttacca 2280
ggcaaggtat ttgacgctag catgtgtcca attcagtgtc atttatgatt ttttgtagta 2340
ggatataaat atatacagcg ctccaaatag tgcggttgcc ccaaaaacac cacggaacct 2400
catctgttct cgtactttgt tgtgacaaag tagctcactg ccttattatc acattttcat 2460
tatgcaacgc ttcggaaaat acgatgttga aaatgcctct agagatgaaa aacaatcgta 2520
aaagggtcct gcgtaattga aacatttgat cagtatgcag tggcacagaa acaaccagga 2580
atactatagt cataggcaat acaaggtata tattggctat gcagacccct ccagaaagta 2640
ccgacgtcaa gttagataca cttaacgaac ctagtgcaca tttaattgag aaaaatgtgg 2700
ctcttcctaa ggacatattc cgttcgtact tgagttattg gatctatgaa atcgctcgct 2760
atacaccagt catgattttg tccttaaata acatactcat cactaaacat tcttaacaat 2820
cagaaaatgc aaccgataaa acattataaa tcttcgcggt tatctggcat tgttattaac 2880
caaaaaaatg ccggcctatt acaagctact gttcaataaa tattgttgta atgaagacgg 2940
tccaactgta caaatacagc aaactgtcat atataaggtg tcttatgtga cagcacttgc 3000
gttattgtca gccggagtat gtctttgtcg cattctgggc tttttacttt ctgctcagaa 3060
ggaagtacga acaagaaaaa aaaatcacca atgcttccct tttcagtatt agtttcatat 3120
ttgtttacgt tcaaactcgt cgtttgcgcg ataacctcta aaaaagtcag ttacgtaact 3180
atatcaatca gagaatgcaa aaagcactat cataaaaatg tctctagggg atgtgagaca 3240
tgtcaattat aagaagtgat ggtgtcatag tatatatatc ataaatgatt atcaaagttt 3300
caatcctttg tattttctag tttagcgcca acttttgaca aaacctaaac tttagataat 3360
catcattctt acaattttta tctggatggc aataatctcc tatataaagc ccagataaac 3420
tgtaaaaaga atccatcact atttgaaaaa aagtcatctg gcacgtttaa ttatcagagc 3480
agaaatgatg aagggtgtta gcgccgtcca ttgatgcgcc tggtagtcat gatttacgta 3540
taactaacac atcatgagga cggc 3564
<210> 9
<211> 10584
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cassette with Dictyostelium discoideum DiPKS (G1516D; G1518A)
coding sequence,
regulatory sequences and integration sequences
<220>
<221> LV3
<222> (1)..(40)
<220>
<221> S. cerevisiae GAL1 promoter
<222> (41)..(482)
<220>
<221> L1
<222> (483)..(522)
<220>
<221> DiPKS
<222> (523)..(9966)
<220>
<221> C-methyltransferase domain
<222> (5050)..(5412)
<220>
<221> Motif 1
<222> (5050)..(5076)
<220>
<221> G1516D
<222> (5068)..(5070)
<220>
<221> G1518A
<222> (5074)..(5076)
<220>
<221> Motif 2
<222> (5309)..(5331)
<220>
<221> Motif 3
<222> (5389)..(5421)
<220>
<221> L2
<222> (9967)..(10006)
<220>
<221> PRM9t
<222> (10007)..(10544)
<220>
<221> LV5
<222> (10545)..(10584)
<400> 9
aggaatactc tgaataaaac aacttatata ataaaaatgc cggattagaa gccgccgagc 60
gggtgacagc cctccgaagg aagactctcc tccgtgcgtc ctcgtcttca ccggtcgcgt 120
tcctgaaacg cagatgtgcc tcgcgccgca ctgctccgaa caataaagat tctacaatac 180
tagcttttat ggttatgaag aggaaaaatt ggcagtaacc tggccccaca aaccttcaaa 240
tgaacgaatc aaattaacaa ccataggatg ataatgcgat tagtttttta gccttatttc 300
tggggtaatt aatcagcgaa gcgatgattt ttgatctatt aacagatata taaatgcaaa 360
aactgcataa ccactttaac taatactttc aacattttcg gtttgtatta cttcttattc 420
aaatgtaata aaagtatcaa caaaaaattg ttaatatacc tctatacttt aacgtcaagg 480
agctagaaaa tttattataa aaggaagaga aataattaaa caatgaacaa gaactccaaa 540
atccagtccc caaactcttc tgatgttgct gttattggtg ttggttttag attcccaggt 600
aactctaatg acccagaatc tttgtggaac aacttgttgg atggtttcga tgctattacc 660
caagtcccaa aagaaagatg ggctacttct tttagagaga tgggtttgat caagaacaag 720
ttcggtggtt tcttgaagga ttctgaatgg aagaatttcg accctttgtt ctttggtatc 780
ggtccaaaag aagctccatt cattgatcca caacaaaggt tgttgttgtc catcgtttgg 840
gaatctttgg aagatgctta catcagacca gatgaattga gaggttctaa cactggtgtt 900
ttcatcggtg tttctaacaa cgattacacc aagttgggtt tccaagacaa ctactctatt 960
tctccataca ctatgaccgg ctctaactct tcattgaact ccaacagaat ttcctactgc 1020
ttcgatttta gaggtccatc cattactgtt gataccgctt gttcttcttc cttggtttct 1080
gttaatttgg gtgtccaatc catccaaatg ggtgaatgta agattgctat ttgcggtggt 1140
gttaacgctt tgtttgatcc atctacatct gttgcctttt ccaagttggg tgttttgtct 1200
gaaaatggca gatgcaactc ttttagtgat caagcctctg gttacgttag atctgaaggt 1260
gctggtgttg ttgttttgaa gtctttggaa caagctaagt tggatggtga tagaatctac 1320
ggtgttatca agggtgtttc ctctaatgaa gatggtgctt ctaatggtga caagaactct 1380
ttgactactc catcttgtga agcccaatcc attaacattt ctaaggctat ggaaaaggcc 1440
tccttgtctc catctgatat ctattacatt gaagcccatg gtactggtac tccagttggt 1500
gatccaattg aagttaaggc cttgtccaag atcttctcca actctaacaa caaccagttg 1560
aacaacttct ctaccgatgg taatgataac gatgatgatg atgacgataa cacctctcca 1620
gaaccattat tgattggctc attcaagtcc aacatcggtc atttggaatc tgctgctggt 1680
attgcttctt tgattaagtg ttgcttgatg ttgaagaaca ggatgttggt tccatccatt 1740
aactgctcta atttgaaccc atccattcca ttcgatcagt acaacatctc cgttatcaga 1800
gaaatcagac aattcccaac cgataagttg gttaacatcg gtatcaattc tttcggtttc 1860
ggtggttcta actgccattt gattattcaa gagtacaaca acaacttcaa gaacaactct 1920
accatctgca ataacaacaa caacaacaat aacaacatcg actacttgat cccaatctcc 1980
tctaagacta agaagtcctt ggataagtac ttgattttga tcaagaccaa ctccaactac 2040
cacaaggata tttctttcga tgacttcgtc aagttccaaa tcaagtctaa gcagtacaac 2100
ttgtccaaca gaatgactac cattgctaac gattggaact ccttcattaa gggttctaac 2160
gaattccaca acttgatcga atctaaggat ggtgaaggtg gttcttcatc ttctaacaga 2220
ggtattgatt ccgccaatca aatcaacact actactacct ctaccatcaa cgatatcgaa 2280
cctttgttgg ttttcgtttt ctgtggtcaa ggtccacaat ggaatggtat gattaagacc 2340
ttgtacaact ccgagaacgt tttcaagaac accgttgatc atgttgacag catcttgtac 2400
aagtacttcg gttactccat tttgaacgtc ttgtctaaga tcgatgataa cgacgattcc 2460
atcaaccatc caatagttgc tcaaccatct ttgttcttgt tgcaaattgg tttggtcgag 2520
ttgtttaagt actggggtat ctacccatct atctctgttg gtcattcttt cggtgaagtc 2580
tcttcttatt acttgtccgg tatcatctct ttggaaaccg cttgtaaaat cgtctacgtc 2640
agatcctcta atcagaacaa aactatgggt tccggtaaga tgttggttgt ttctatgggt 2700
tttaagcaat ggaacgatca attctctgct gaatggtccg atattgaaat tgcttgttac 2760
aacgctccag attccatagt tgttactggt aacgaagaaa gattgaaaga attgtccatc 2820
aagttgtccg acgaatccaa tcaaattttc aacaccttct tgaggtcccc atgttctttt 2880
cattcttccc atcaagaagt catcaagggt tctatgttcg aagagttgtc taacttgcaa 2940
tctactggtg aaaccgaaat ccctttgttc tctactgtta ctggtagaca agttttgtct 3000
ggtcatgtta ctgctcaaca catctacgat aatgttagag aaccagtctt gttccaaaag 3060
acgattgaat ccattacctc ctacatcaag tctcactacc catccaatca aaaggttatc 3120
tacgttgaaa ttgctccaca cccaaccttg ttttcattga tcaaaaagtc catcccatcc 3180
tccaacaaga attcctcttc tgttttgtgt ccattgaaca gaaaagaaaa ctccaacaac 3240
tcctacaaga agttcgtttc tcagttgtac ttcaacggtg ttaacgttga cttcaacttc 3300
cagttgaact ccatttgcga taacgttaac aacgatcacc atttgaacaa cgtcaagcaa 3360
aactccttca aagagactac caattccttg ccaagatacc aatgggaaca agatgaatat 3420
tggtccgaac cattgatctc cagaaagaat agattggaag gtccaactac ttccttgttg 3480
ggtcatagaa ttatctacag cttcccagtt ttccaatccg ttttggactt gcaatctgac 3540
aactacaaat acttgttgga ccacttggtt aacggtaagc cagtttttcc aggtgctggt 3600
tatttggata tcatcatcga attcttcgac taccaaaagc agcagttgaa ttcctctgat 3660
tcctctaact cctacatcat caacgttgac aagatccaat tcttgaaccc aattcacttg 3720
accgaaaaca agttgcaaac cttgcaatct tctttcgaac ctatcgttac taagaagtct 3780
gccttctctg ttaacttctt catcaaggat accgtcgagg atcaatctaa ggttaagtct 3840
atgtctgacg aaacttggac taacacttgt aaggctacca tttccttgga acaacaacag 3900
ccatctccat cttctacttt gactttgtct aagaagcaag acttgcagat cttgagaaac 3960
agatgcgata ttagcaagct agacaagttt gagttgtacg acaagatctc taagaatttg 4020
ggcttgcagt acaactcctt gtttcaagtt gttgatacca tcgaaactgg taaggattgc 4080
tcttttgcta ctttgtcttt gccagaagat actttgttca ccaccatttt gaacccatgc 4140
ttgttggata actgtttcca tggtttgttg accttgatca acgaaaaggg ttctttcgtt 4200
gtcgagtcca tttcttctgt ttctatctac ttggagaaca tcggttcctt caatcaaact 4260
tctgttggta acgtccagtt ctacttgtac accactattt ctaaagccac ctcctttagt 4320
tctgaaggta cttgtaagtt gttcaccaag gatggttcct tgattttgtc tatcggtaag 4380
ttcatcatca agtccaccaa tccaaagtct actaagacca acgaaactat cgaatctcca 4440
ttggacgaaa ccttctctat tgaatggcaa tctaaggatt ctccaattcc aaccccacaa 4500
caaatccaac aacaatctcc attgaactct aacccatcct tcattagatc taccatcttg 4560
aaggacatcc agttcgaaca atactgctcc tccattatcc acaaagaatt gatcaaccac 4620
gaaaagtaca agaaccagca atccttcgat atcaactcct tggaaaacca cttgaacgat 4680
gaccaattga tggaatcctt gtccatctcc aaagaatact tgagattctt caccaggatc 4740
atctccatca ttaagcaata cccaaagatc ttgaacgaaa aagagctaaa agaattgaaa 4800
gaaatcatcg aattgaagta cccatccgaa gttcagttgt tggaattcga agttatcgag 4860
aaggtgtcca tgattatccc aaagttgttg ttcgaaaacg acaagcaatc ttccatgacc 4920
ttgttccaag ataacttgtt gaccaggttc tactccaatt ctaactctac cagattctac 4980
ttggaaaggg tttccgaaat ggtcttggaa tctattagac caatcgtcag agaaaagagg 5040
gtgttcagaa ttttggaaat tggtgctgat acagcctctt tgtctaatgt tgttttgact 5100
aagttgaaca cctacttgtc caccttgaat tctaatggtg gttctggtta caacatcatc 5160
attgagtaca ccttcaccga tatttccgcc aacttcatta ttggtgaaat ccaagaaacc 5220
atgtgcaact tgtacccaaa cgttactttc aagttctccg tcttggactt ggagaaagag 5280
attattaact cctccgattt cttgatgggt gattacgata tagttttgat ggcctacgtt 5340
atccatgccg tttctaacat taagttctcc atcgaacagt tgtacaagtt gttgtctcca 5400
agaggttggt tgttgtgtat tgaacctaag tccaacgttg tgttctccga tttggttttc 5460
ggttgtttta atcagtggtg gaactactac gatgatatta gaactaccca ctgctccttg 5520
tctgaatctc aatggaatca gttgttgttg aaccagtcct tgaacaacga atcctcttct 5580
tcttctaact gttacggtgg tttctccaac gtttctttta ttggtggtga aaaggatgtc 5640
gactcccatt ctttcatatt gcactgccaa aaagaatcca tctcccaaat gaagttagcc 5700
accactatta acaacggttt gtcatctggt tccatcgtta tcgttttgaa ctctcaacaa 5760
ttgaccaaca tgaagtccta cccaaaggtt attgagtata ttcaagaggc tacctctttg 5820
tgcaagacca ttgaaattat cgattccaag gacgtcttga actctaccaa ttcagttttg 5880
gaaaagatcc aaaagtcctt gttggtgttc tgtttgttgg gttatgactt gttggagaac 5940
aactaccaag aacagtcttt cgaatacgtt aagttgttga acttgatctc tactaccgcc 6000
tcttcatcta atgataagaa accaccaaag gtcttgttga tcaccaagca atctgaaaga 6060
atctccaggt ctttctactc cagatccttg attggtattt ccagaacctc tatgaacgag 6120
tacccaaatt tgtccattac ctctatcgat ttggatacca acgactactc attgcagtct 6180
ttgttgaagc caatcttcag caactctaag ttttccgaca acgagttcat cttcaaaaag 6240
ggcttgatgt tcgtgtccag gatctttaag aacaagcagt tgctagaatc ctccaacgct 6300
tttgaaactg actcttctaa cttgtactgt aaggcctctt ctgacttgtc ttacaagtac 6360
gctattaagc agtctatgtt gaccgaaaat cagatcgaaa tcaaggttga atgcgtcggt 6420
attaacttca aggacaacct attctacaag ggcttgttgc cacaagaaat tttcagaatg 6480
ggtgacatct acaatccacc atatggtttg gaatgctctg gtgttattac cagaattggt 6540
tctaacgtca ccgaatactc agttggtcaa aatgtttttg gtttcgccag acattctttg 6600
ggttctcatg ttgttaccaa caaggatttg gttatcttga agccagatac catctcattt 6660
tctgaagctg cttctatccc agttgtttac tgtactgctt ggtactcctt gttcaacatt 6720
ggtcagttgt ctaacgaaga atccatccta attcattctg ctactggtgg tgtaggtttg 6780
gcttctttga atttgttgaa aatgaagaat cagcaacagc aaccattgac caatgtttat 6840
gctactgttg gctctaacga gaagaagaag ttcttgatcg ataacttcaa caacttgttc 6900
aaagaggacg gcgaaaacat tttctctacc agagacaaag aatactccaa ccagttggaa 6960
tccaagatcg atgttatttt gaacaccttg tccggtgaat tcgtcgaatc taatttcaag 7020
tccttgagat ccttcggtag attgattgat ttgtctgcta ctcacgttta cgccaatcaa 7080
caaattggtc taggtaactt caagttcgac cacttgtatt ctgctgttga cttggaaaga 7140
ttgatcgacg aaaaacctaa gttgttgcag tccatcttgc aaagaattac caactctatc 7200
gtcaacggtt ccttggaaaa aattccaatt accatcttcc catccaccga aactaaggat 7260
gctatcgaat tattgtccaa gagatcccat atcggtaaag ttgttgtaga ttgcaccgat 7320
atctctaagt gtaatcctgt tggtgatgtg atcaccaact tctctatgag attgccaaag 7380
ccaaactacc agttgaattt gaactccacc ttgttgatta ctggtcagtc tggtttgtct 7440
atccctttgt tgaattggtt gttgtctaag tctggtggta acgttaagaa cgttgtcatc 7500
atttctaagt ccaccatgaa gtggaagttg cagactatga tttcccattt cgtttccggt 7560
ttcggtatcc attttaacta cgttcaagtc gacatctcca actacgatgc tttgtctgaa 7620
gctattaagc aattgccatc tgatttgcca ccaatcacct ctgtttttca tttggctgct 7680
atctacaacg atgttccaat ggatcaagtt accatgtcta ccgttgaatc tgttcataac 7740
cctaaagttt tgggtgccgt taacttgcat agaatctctg tttcttttgg ttggaagttg 7800
aaccacttcg tcttgttctc ttctattact gctattaccg gttacccaga ccaatctatc 7860
tacaattctg ccaactctat tttggacgct ttgtccaact ttagaaggtt tatgggtttg 7920
ccatccttct ccattaactt gggtccaatg aaggatgaag gtaaggtttc taccaacaag 7980
agcatcaaga agctattcaa gtctagaggt ttgccaagcc tatccttgaa caagttattt 8040
ggtttgttgg aggtcgtcat caacaaccca tctaatcatg ttatcccatc ccaattgatt 8100
tgctccccaa tcgatttcaa gacctacatc gaatctttct caactatgag gccaaagttg 8160
ttacacttgc aacctaccat ttccaagcag caatcttcta tcattaacga ttctaccaag 8220
gcttcctcca acatttcatt gcaagataag atcacctcca aggtgtctga tttgttgtcc 8280
attccaatct ccaagatcaa cttcgatcat ccattgaaac actacggctt ggattctttg 8340
ttgaccgttc aattcaaatc ctggatcgac aaagaattcg aaaagaactt gttcacccat 8400
atccaattgg ccaccatctc tattaactca ttcttggaaa aggtgaacgg cttgtctaca 8460
aacaataaca acaacaacaa ttccaacgtc aagtcctctc catccattgt caaagaagaa 8520
atcgttacct tggacaagga tcaacaacca ttgctattga aagaacacca gcacattatc 8580
atctccccag atattagaat caacaagcca aagagggaat ccttgattag aaccccaatc 8640
ttgaacaaat tcaaccagat caccgaatcc attatcactc catctacacc atctttgtcc 8700
caatccgatg ttttgaaaac tccaccaatc aagtctttga acaacactaa gaactccagc 8760
ttgattaaca ccccaccaat tcaatctgtc caacaacatc aaaagcaaca acaaaaggtc 8820
caagtcatcc aacaacagca acaaccatta tccagattgt cctacaagag caacaacaac 8880
tctttcgttt tgggtatcgg tatttctgtt ccaggtgaac ctatttccca acaatccttg 8940
aaagactcca tctccaatga cttttctgat aaggctgaaa ctaacgagaa ggtcaagaga 9000
atctttgagc aatctcaaat caagaccaga cacttggtta gagattacac taagccagag 9060
aactccatca agttcagaca tttggaaacc attaccgatg tgaacaacca gttcaagaaa 9120
gttgttccag atttggctca acaagcctgt ttgagagctt tgaaagattg gggtggtgat 9180
aagggtgata ttacccatat agtttctgtt acctccaccg gtattatcat cccagatgtt 9240
aatttcaagt tgatcgactt gttgggcttg aacaaggatg ttgaaagagt gtctttgaac 9300
ctaatgggtt gtttggctgg tttgagttct ttgagaactg ctgcttcttt ggctaaggct 9360
tctccaagaa atagaatttt ggttgtctgt accgaagtct gctccttgca tttttctaat 9420
actgatggtg gtgatcaaat ggtcgcctct tctatttttg ctgatggttc tgctgcttac 9480
attattggtt gtaacccaag aattgaagaa accccattat acgaagtcat gtgctccatt 9540
aacagatctt tcccaaatac cgaaaacgcc atggtttggg atttggaaaa agaaggttgg 9600
aacttgggtt tggatgcttc tattccaatt gtcattggtt ctggtattga agccttcgtt 9660
gatactttgt tggataaggc taagttgcaa acttccactg ctatttctgc taaggattgc 9720
gaattcttga ttcatactgg tggcaagtcc atcttgatga acatcgaaaa ttccttgggt 9780
atcgacccaa agcaaactaa gaatacttgg gatgtttacc atgcctacgg caatatgtca 9840
tctgcctctg ttattttcgt tatggatcat gccagaaagt ccaagtcttt gccaacttac 9900
tcaatttctt tggcttttgg tccaggtttg gcttttgaag gttgtttctt gaagaacgtc 9960
gtctaaagac ataaaactga aacaacacca attaataata gactttacag aagacgggag 10020
acactagcac acaactttac caggcaaggt atttgacgct agcatgtgtc caattcagtg 10080
tcatttatga ttttttgtag taggatataa atatatacag cgctccaaat agtgcggttg 10140
ccccaaaaac accacggaac ctcatctgtt ctcgtacttt gttgtgacaa agtagctcac 10200
tgccttatta tcacattttc attatgcaac gcttcggaaa atacgatgtt gaaaatgcct 10260
ctagagatga aaaacaatcg taaaagggtc ctgcgtaatt gaaacatttg atcagtatgc 10320
agtggcacag aaacaaccag gaatactata gtcataggca atacaaggta tatattggct 10380
atgcagaccc ctccagaaag taccgacgtc aagttagata cacttaacga acctagtgca 10440
catttaattg agaaaaatgt ggctcttcct aaggacatat tccgttcgta cttgagttat 10500
tggatctatg aaatcgctcg ctatacacca gtcatgattt tgtccctctt tatattacat 10560
caaaataaga aaataattat aaca 10584
<210> 10
<211> 10584
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cassette with Dictyostelium discoideum DiPKS (G1516R) coding
sequence,
regulatory sequences and integration sequences
<220>
<221> LV3
<222> (1)..(40)
<220>
<221> S. cerevisiae GAL1 promoter
<222> (41)..(482)
<220>
<221> L1
<222> (483)..(522)
<220>
<221> DiPKS
<222> (523)..(9966)
<220>
<221> C-methyltransferase domain
<222> (5050)..(5412)
<220>
<221> G1516R
<222> (5069)..(5070)
<220>
<221> Motif 2
<222> (5309)..(5331)
<220>
<221> Motif 3
<222> (5389)..(5421)
<220>
<221> Type III PKS domain
<222> (8881)..(9966)
<220>
<221> L2
<222> (9967)..(10006)
<220>
<221> PRM9t
<222> (10007)..(10544)
<220>
<221> LV5
<222> (10545)..(10584)
<400> 10
aggaatactc tgaataaaac aacttatata ataaaaatgc cggattagaa gccgccgagc 60
gggtgacagc cctccgaagg aagactctcc tccgtgcgtc ctcgtcttca ccggtcgcgt 120
tcctgaaacg cagatgtgcc tcgcgccgca ctgctccgaa caataaagat tctacaatac 180
tagcttttat ggttatgaag aggaaaaatt ggcagtaacc tggccccaca aaccttcaaa 240
tgaacgaatc aaattaacaa ccataggatg ataatgcgat tagtttttta gccttatttc 300
tggggtaatt aatcagcgaa gcgatgattt ttgatctatt aacagatata taaatgcaaa 360
aactgcataa ccactttaac taatactttc aacattttcg gtttgtatta cttcttattc 420
aaatgtaata aaagtatcaa caaaaaattg ttaatatacc tctatacttt aacgtcaagg 480
agctagaaaa tttattataa aaggaagaga aataattaaa caatgaacaa gaactccaaa 540
atccagtccc caaactcttc tgatgttgct gttattggtg ttggttttag attcccaggt 600
aactctaatg acccagaatc tttgtggaac aacttgttgg atggtttcga tgctattacc 660
caagtcccaa aagaaagatg ggctacttct tttagagaga tgggtttgat caagaacaag 720
ttcggtggtt tcttgaagga ttctgaatgg aagaatttcg accctttgtt ctttggtatc 780
ggtccaaaag aagctccatt cattgatcca caacaaaggt tgttgttgtc catcgtttgg 840
gaatctttgg aagatgctta catcagacca gatgaattga gaggttctaa cactggtgtt 900
ttcatcggtg tttctaacaa cgattacacc aagttgggtt tccaagacaa ctactctatt 960
tctccataca ctatgaccgg ctctaactct tcattgaact ccaacagaat ttcctactgc 1020
ttcgatttta gaggtccatc cattactgtt gataccgctt gttcttcttc cttggtttct 1080
gttaatttgg gtgtccaatc catccaaatg ggtgaatgta agattgctat ttgcggtggt 1140
gttaacgctt tgtttgatcc atctacatct gttgcctttt ccaagttggg tgttttgtct 1200
gaaaatggca gatgcaactc ttttagtgat caagcctctg gttacgttag atctgaaggt 1260
gctggtgttg ttgttttgaa gtctttggaa caagctaagt tggatggtga tagaatctac 1320
ggtgttatca agggtgtttc ctctaatgaa gatggtgctt ctaatggtga caagaactct 1380
ttgactactc catcttgtga agcccaatcc attaacattt ctaaggctat ggaaaaggcc 1440
tccttgtctc catctgatat ctattacatt gaagcccatg gtactggtac tccagttggt 1500
gatccaattg aagttaaggc cttgtccaag atcttctcca actctaacaa caaccagttg 1560
aacaacttct ctaccgatgg taatgataac gatgatgatg atgacgataa cacctctcca 1620
gaaccattat tgattggctc attcaagtcc aacatcggtc atttggaatc tgctgctggt 1680
attgcttctt tgattaagtg ttgcttgatg ttgaagaaca ggatgttggt tccatccatt 1740
aactgctcta atttgaaccc atccattcca ttcgatcagt acaacatctc cgttatcaga 1800
gaaatcagac aattcccaac cgataagttg gttaacatcg gtatcaattc tttcggtttc 1860
ggtggttcta actgccattt gattattcaa gagtacaaca acaacttcaa gaacaactct 1920
accatctgca ataacaacaa caacaacaat aacaacatcg actacttgat cccaatctcc 1980
tctaagacta agaagtcctt ggataagtac ttgattttga tcaagaccaa ctccaactac 2040
cacaaggata tttctttcga tgacttcgtc aagttccaaa tcaagtctaa gcagtacaac 2100
ttgtccaaca gaatgactac cattgctaac gattggaact ccttcattaa gggttctaac 2160
gaattccaca acttgatcga atctaaggat ggtgaaggtg gttcttcatc ttctaacaga 2220
ggtattgatt ccgccaatca aatcaacact actactacct ctaccatcaa cgatatcgaa 2280
cctttgttgg ttttcgtttt ctgtggtcaa ggtccacaat ggaatggtat gattaagacc 2340
ttgtacaact ccgagaacgt tttcaagaac accgttgatc atgttgacag catcttgtac 2400
aagtacttcg gttactccat tttgaacgtc ttgtctaaga tcgatgataa cgacgattcc 2460
atcaaccatc caatagttgc tcaaccatct ttgttcttgt tgcaaattgg tttggtcgag 2520
ttgtttaagt actggggtat ctacccatct atctctgttg gtcattcttt cggtgaagtc 2580
tcttcttatt acttgtccgg tatcatctct ttggaaaccg cttgtaaaat cgtctacgtc 2640
agatcctcta atcagaacaa aactatgggt tccggtaaga tgttggttgt ttctatgggt 2700
tttaagcaat ggaacgatca attctctgct gaatggtccg atattgaaat tgcttgttac 2760
aacgctccag attccatagt tgttactggt aacgaagaaa gattgaaaga attgtccatc 2820
aagttgtccg acgaatccaa tcaaattttc aacaccttct tgaggtcccc atgttctttt 2880
cattcttccc atcaagaagt catcaagggt tctatgttcg aagagttgtc taacttgcaa 2940
tctactggtg aaaccgaaat ccctttgttc tctactgtta ctggtagaca agttttgtct 3000
ggtcatgtta ctgctcaaca catctacgat aatgttagag aaccagtctt gttccaaaag 3060
acgattgaat ccattacctc ctacatcaag tctcactacc catccaatca aaaggttatc 3120
tacgttgaaa ttgctccaca cccaaccttg ttttcattga tcaaaaagtc catcccatcc 3180
tccaacaaga attcctcttc tgttttgtgt ccattgaaca gaaaagaaaa ctccaacaac 3240
tcctacaaga agttcgtttc tcagttgtac ttcaacggtg ttaacgttga cttcaacttc 3300
cagttgaact ccatttgcga taacgttaac aacgatcacc atttgaacaa cgtcaagcaa 3360
aactccttca aagagactac caattccttg ccaagatacc aatgggaaca agatgaatat 3420
tggtccgaac cattgatctc cagaaagaat agattggaag gtccaactac ttccttgttg 3480
ggtcatagaa ttatctacag cttcccagtt ttccaatccg ttttggactt gcaatctgac 3540
aactacaaat acttgttgga ccacttggtt aacggtaagc cagtttttcc aggtgctggt 3600
tatttggata tcatcatcga attcttcgac taccaaaagc agcagttgaa ttcctctgat 3660
tcctctaact cctacatcat caacgttgac aagatccaat tcttgaaccc aattcacttg 3720
accgaaaaca agttgcaaac cttgcaatct tctttcgaac ctatcgttac taagaagtct 3780
gccttctctg ttaacttctt catcaaggat accgtcgagg atcaatctaa ggttaagtct 3840
atgtctgacg aaacttggac taacacttgt aaggctacca tttccttgga acaacaacag 3900
ccatctccat cttctacttt gactttgtct aagaagcaag acttgcagat cttgagaaac 3960
agatgcgata ttagcaagct agacaagttt gagttgtacg acaagatctc taagaatttg 4020
ggcttgcagt acaactcctt gtttcaagtt gttgatacca tcgaaactgg taaggattgc 4080
tcttttgcta ctttgtcttt gccagaagat actttgttca ccaccatttt gaacccatgc 4140
ttgttggata actgtttcca tggtttgttg accttgatca acgaaaaggg ttctttcgtt 4200
gtcgagtcca tttcttctgt ttctatctac ttggagaaca tcggttcctt caatcaaact 4260
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tctgaaggta cttgtaagtt gttcaccaag gatggttcct tgattttgtc tatcggtaag 4380
ttcatcatca agtccaccaa tccaaagtct actaagacca acgaaactat cgaatctcca 4440
ttggacgaaa ccttctctat tgaatggcaa tctaaggatt ctccaattcc aaccccacaa 4500
caaatccaac aacaatctcc attgaactct aacccatcct tcattagatc taccatcttg 4560
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gaaaagtaca agaaccagca atccttcgat atcaactcct tggaaaacca cttgaacgat 4680
gaccaattga tggaatcctt gtccatctcc aaagaatact tgagattctt caccaggatc 4740
atctccatca ttaagcaata cccaaagatc ttgaacgaaa aagagctaaa agaattgaaa 4800
gaaatcatcg aattgaagta cccatccgaa gttcagttgt tggaattcga agttatcgag 4860
aaggtgtcca tgattatccc aaagttgttg ttcgaaaacg acaagcaatc ttccatgacc 4920
ttgttccaag ataacttgtt gaccaggttc tactccaatt ctaactctac cagattctac 4980
ttggaaaggg tttccgaaat ggtcttggaa tctattagac caatcgtcag agaaaagagg 5040
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attattaact cctccgattt cttgatgggt gattacgata tagttttgat ggcctacgtt 5340
atccatgccg tttctaacat taagttctcc atcgaacagt tgtacaagtt gttgtctcca 5400
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ttgaccaaca tgaagtccta cccaaaggtt attgagtata ttcaagaggc tacctctttg 5820
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aactaccaag aacagtcttt cgaatacgtt aagttgttga acttgatctc tactaccgcc 6000
tcttcatcta atgataagaa accaccaaag gtcttgttga tcaccaagca atctgaaaga 6060
atctccaggt ctttctactc cagatccttg attggtattt ccagaacctc tatgaacgag 6120
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gctattaagc agtctatgtt gaccgaaaat cagatcgaaa tcaaggttga atgcgtcggt 6420
attaacttca aggacaacct attctacaag ggcttgttgc cacaagaaat tttcagaatg 6480
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tccttgagat ccttcggtag attgattgat ttgtctgcta ctcacgttta cgccaatcaa 7080
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atctacaacg atgttccaat ggatcaagtt accatgtcta ccgttgaatc tgttcataac 7740
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aaccacttcg tcttgttctc ttctattact gctattaccg gttacccaga ccaatctatc 7860
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ccatccttct ccattaactt gggtccaatg aaggatgaag gtaaggtttc taccaacaag 7980
agcatcaaga agctattcaa gtctagaggt ttgccaagcc tatccttgaa caagttattt 8040
ggtttgttgg aggtcgtcat caacaaccca tctaatcatg ttatcccatc ccaattgatt 8100
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attccaatct ccaagatcaa cttcgatcat ccattgaaac actacggctt ggattctttg 8340
ttgaccgttc aattcaaatc ctggatcgac aaagaattcg aaaagaactt gttcacccat 8400
atccaattgg ccaccatctc tattaactca ttcttggaaa aggtgaacgg cttgtctaca 8460
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caatccgatg ttttgaaaac tccaccaatc aagtctttga acaacactaa gaactccagc 8760
ttgattaaca ccccaccaat tcaatctgtc caacaacatc aaaagcaaca acaaaaggtc 8820
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atctttgagc aatctcaaat caagaccaga cacttggtta gagattacac taagccagag 9060
aactccatca agttcagaca tttggaaacc attaccgatg tgaacaacca gttcaagaaa 9120
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gatactttgt tggataaggc taagttgcaa acttccactg ctatttctgc taaggattgc 9720
gaattcttga ttcatactgg tggcaagtcc atcttgatga acatcgaaaa ttccttgggt 9780
atcgacccaa agcaaactaa gaatacttgg gatgtttacc atgcctacgg caatatgtca 9840
tctgcctctg ttattttcgt tatggatcat gccagaaagt ccaagtcttt gccaacttac 9900
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gtctaaagac ataaaactga aacaacacca attaataata gactttacag aagacgggag 10020
acactagcac acaactttac caggcaaggt atttgacgct agcatgtgtc caattcagtg 10080
tcatttatga ttttttgtag taggatataa atatatacag cgctccaaat agtgcggttg 10140
ccccaaaaac accacggaac ctcatctgtt ctcgtacttt gttgtgacaa agtagctcac 10200
tgccttatta tcacattttc attatgcaac gcttcggaaa atacgatgtt gaaaatgcct 10260
ctagagatga aaaacaatcg taaaagggtc ctgcgtaatt gaaacatttg atcagtatgc 10320
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catttaattg agaaaaatgt ggctcttcct aaggacatat tccgttcgta cttgagttat 10500
tggatctatg aaatcgctcg ctatacacca gtcatgattt tgtccctctt tatattacat 10560
caaaataaga aaataattat aaca 10584
<210> 11
<211> 6034
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Plasmid
<220>
<221> LV5
<222> (1)..(40)
<220>
<221> pYES2-LEU2
<222> (1915)..(4123)
<220>
<221> LEU2 ORF
<222> (1996)..(3090)
<220>
<221> LEU2 promoter
<222> (3091)..(3999)
<220>
<221> misc_feature
<222> (3759)..(3760)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> LV3
<222> (5995)..(6034)
<400> 11
cctctttata ttacatcaaa ataagaaaat aattataaca cctgcattaa tgaatcggcc 60
aacgcgcggg gagaggcggt ttgcgtattg ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact 120
cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac 180
ggttatccac agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa 240
agcccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg 300
acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa 360
gataccaggc gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc 420
ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac 480
gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac 540
cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg 600
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cttgatccgg caaacaaacc accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga 840
ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg 900
ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat gagattatca aaaaggatct 960
tcacctagat ccttttaaat taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt 1020
aaacttggtc tgacagttac caatgcttaa tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc 1080
tatttcgttc atccatagtt gcctgactcc ccgtcgtgta gataactacg atacgggagc 1140
gcttaccatc tggccccagt gctgcaatga taccgcgaga cccacgctca ccggctccag 1200
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tatccgcctc cattcagtct attaattgtt gccgggaagc tagagtaagt agttcgccag 1320
ttaatagttt gcgcaacgtt gttggcattg ctacaggcat cgtggtgtca ctctcgtcgt 1380
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tgttgtgcaa aaaagcggtt agctccttcg gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg 1500
ccgcagtgtt atcactcatg gttatggcag cactgcataa ttctcttact gtcatgccat 1560
ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta 1620
tgcggcgacc gagttgctct tgcccggcgt caatacggga taatagtgta tcacatagca 1680
gaactttaaa agtgctcatc attggaaaac gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct 1740
taccgctgtt gagatccagt tcgatgtaac ccactcgtgc acccaactga tcttcagcat 1800
cttttacttt caccagcgtt tctgggtgag caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa 1860
agggaataag ggcgacacgg aaatgttgaa tactcatact cttccttttt caatgggtaa 1920
taactgatat aattaaattg aagctctaat ttgtgagttt agtatacatg catttactta 1980
taatacagtt ttttattaag caaggatttt cttaacttct tcggcgacag catcaccgac 2040
ttcggtggta ctgttggaac cacctaaatc accagttctg atacctgcat ccaaaacctt 2100
tttaactgca tcttcaatgg ccttaccttc ttcaggcaag ttcaatgaca atttcaacat 2160
cattgcagca gacaagatag tggcgatagg gttgacctta ttctttggca aatctggagc 2220
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aatagcttta agaaccttaa tggcttcggc tgtgatttct tgaccaacgt ggtcacctgg 3060
caaaacgacg atcttcttag gggcagacat tagaatggta tatccttgaa atatatatat 3120
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tttagtcatg aacgcttctc tattctatat gaaaagccgg ttccggcgct ctcacctttc 3300
ctttttctcc caatttttca gttgaaaaag gtatatgcgt caggcgacct ctgaaattaa 3360
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atgttgagga aaaaaataat ggttgctaag agattcgaac tcttgcatct tacgatacct 3480
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cggccaaaca accaattact tgttgagaaa tagagtataa ttatcctata aatataacgt 3600
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cagcctaata tccgacaaac tgttttacag atttacgatc gtacttgtta cccatcattg 4380
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taataatata tagtctagcg ctttacggaa gacaatgtat gtatttcggt tcctggagaa 4500
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ttccatcttg cacttcaata gcatatcttt gttaacgaag catctgtgct tcattttgta 4620
gaacaaaaat gcaacgcgag agcgctaatt tttcaaacaa agaatctgag ctgcattttt 4680
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ttgtaaaaca aaaatgcaac gcgacgagag cgctaatttt tcaaacaaag aatctgagct 4800
gcatttttac agaacagaaa tgcaacgcga gagcgctatt ttaccaacaa agaatctata 4860
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tgtaggtccg ttaaggttag aagaaggcta ctttggtgtc tattttctct tccataaaaa 5040
aagcctgact ccacttcccg cgtttactga ttactagcga agctgcgggt gcattttttc 5100
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gcgagaaagg aagggaagaa agcgaaagga gcgggggcta gggcggtggg aagtgtaggg 5940
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actctgaata aaacaactta tataataaaa atgc 6034
<210> 12
<211> 5056
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Plasmid
<220>
<221> LV5
<222> (1)..(40)
<220>
<221> pYES backbone
<222> (41)..(5016)
<220>
<221> AmpR
<222> (1040)..(1699)
<220>
<221> URA3
<222> (1915)..(3022)
<220>
<221> LV3
<222> (5017)..(5056)
<400> 12
cctctttata ttacatcaaa ataagaaaat aattataaca cctgcattaa tgaatcggcc 60
aacgcgcggg gagaggcggt ttgcgtattg ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact 120
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ggttatccac agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa 240
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acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa 360
gataccaggc gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc 420
ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac 480
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cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg 600
taagacacga cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt 660
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tcacctagat ccttttaaat taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt 1020
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tatttcgttc atccatagtt gcctgactcc ccgtcgtgta gataactacg atacgggagc 1140
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ccgcagtgtt atcactcatg gttatggcag cactgcataa ttctcttact gtcatgccat 1560
ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta 1620
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gaactttaaa agtgctcatc attggaaaac gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct 1740
taccgctgtt gagatccagt tcgatgtaac ccactcgtgc acccaactga tcttcagcat 1800
cttttacttt caccagcgtt tctgggtgag caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa 1860
agggaataag ggcgacacgg aaatgttgaa tactcatact cttccttttt caatgggtaa 1920
taactgatat aattaaattg aagctctaat ttgtgagttt agtatacatg catttactta 1980
taatacagtt ttttagtttt gctggccgca tcttctcaaa tatgcttccc agcctgcttt 2040
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aataataatg tcagatcctg tagagaccac atcatccacg gttctatact gttgacccaa 2160
tgcgtctccc ttgtcatcta aacccacacc gggtgtcata atcaaccaat cgtaaccttc 2220
atctcttcca cccatgtctc tttgagcaat aaagccgata acaaaatctt tgtcgctctt 2280
cgcaatgtca acagtaccct tagtatattc tccagtagat agggagccct tgcatgacaa 2340
ttctgctaac atcaaaaggc ctctaggttc ctttgttact tcttctgccg cctgcttcaa 2400
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tattctgtat acacccgcag agtactgcaa tttgactgta ttaccaatgt cagcaaattt 2520
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gccctccatg gaaaaatcag tcaagatatc cacatgtgtt tttagtaaac aaattttggg 2640
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agtagcagca cgttccttat atgtagcttt cgacatgatt tatcttcgtt tcctgcaggt 2820
ttttgttctg tgcagttggg ttaagaatac tgggcaattt catgtttctt caacactaca 2880
tatgcgtata tataccaatc taagtctgtg ctccttcctt cgttcttcct tctgttcgga 2940
gattaccgaa tcaaaaaaat ttcaaagaaa ccgaaatcaa aaaaaagaat aaaaaaaaaa 3000
tgatgaattg aattgaaaag ctagcttatc gatgataagc tgtcaaagat gagaattaat 3060
tccacggact atagactata ctagatactc cgtctactgt acgatacact tccgctcagg 3120
tccttgtcct ttaacgaggc cttaccactc ttttgttact ctattgatcc agctcagcaa 3180
aggcagtgtg atctaagatt ctatcttcgc gatgtagtaa aactagctag accgagaaag 3240
agactagaaa tgcaaaaggc acttctacaa tggctgccat cattattatc cgatgtgacg 3300
ctgcagcttc tcaatgatat tcgaatacgc tttgaggaga tacagcctaa tatccgacaa 3360
actgttttac agatttacga tcgtacttgt tacccatcat tgaattttga acatccgaac 3420
ctgggagttt tccctgaaac agatagtata tttgaacctg tataataata tatagtctag 3480
cgctttacgg aagacaatgt atgtatttcg gttcctggag aaactattgc atctattgca 3540
taggtaatct tgcacgtcgc atccccggtt cattttctgc gtttccatct tgcacttcaa 3600
tagcatatct ttgttaacga agcatctgtg cttcattttg tagaacaaaa atgcaacgcg 3660
agagcgctaa tttttcaaac aaagaatctg agctgcattt ttacagaaca gaaatgcaac 3720
gcgaaagcgc tattttacca acgaagaatc tgtgcttcat ttttgtaaaa caaaaatgca 3780
acgcgacgag agcgctaatt tttcaaacaa agaatctgag ctgcattttt acagaacaga 3840
aatgcaacgc gagagcgcta ttttaccaac aaagaatcta tacttctttt ttgttctaca 3900
aaaatgcatc ccgagagcgc tatttttcta acaaagcatc ttagattact ttttttctcc 3960
tttgtgcgct ctataatgca gtctcttgat aactttttgc actgtaggtc cgttaaggtt 4020
agaagaaggc tactttggtg tctattttct cttccataaa aaaagcctga ctccacttcc 4080
cgcgtttact gattactagc gaagctgcgg gtgcattttt tcaagataaa ggcatccccg 4140
attatattct ataccgatgt ggattgcgca tactttgtga acagaaagtg atagcgttga 4200
tgattcttca ttggtcagaa aattatgaac ggtttcttct attttgtctc tatatactac 4260
gtataggaaa tgtttacatt ttcgtattgt tttcgattca ctctatgaat agttcttact 4320
acaatttttt tgtctaaaga gtaatactag agataaacat aaaaaatgta gaggtcgagt 4380
ttagatgcaa gttcaaggag cgaaaggtgg atgggtaggt tatataggga tatagcacag 4440
agatatatag caaagagata cttttgagca atgtttgtgg aagcggtatt cgcaatggga 4500
agctccaccc cggttgataa tcagaaaagc cccaaaaaca ggaagattgt ataagcaaat 4560
atttaaattg taaacgttaa tattttgtta aaattcgcgt taaatttttg ttaaatcagc 4620
tcatttttta acgaatagcc cgaaatcggc aaaatccctt ataaatcaaa agaatagacc 4680
gagatagggt tgagtgttgt tccagtttcc aacaagagtc cactattaaa gaacgtggac 4740
tccaacgtca aagggcgaaa aagggtctat cagggcgatg gcccactacg tgaaccatca 4800
ccctaatcaa gttttttggg gtcgaggtgc cgtaaagcag taaatcggaa gggtaaacgg 4860
atgcccccat ttagagcttg acggggaaag ccggcgaacg tggcgagaaa ggaagggaag 4920
aaagcgaaag gagcgggggc tagggcggtg ggaagtgtag gggtcacgct gggcgtaacc 4980
accacacccg ccgcgcttaa tggggcgcta cagggcagga atactctgaa taaaacaact 5040
tatataataa aaatgc 5056
<210> 13
<211> 10584
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cassette with Dictyostelium discoideum DiPKS coding sequence,
regulatory sequences and integration sequences
<220>
<221> LV3
<222> (1)..(40)
<220>
<221> S. cerevisiae GAL1 promoter
<222> (41)..(482)
<220>
<221> L1
<222> (483)..(522)
<220>
<221> DiPKS
<222> (523)..(9966)
<220>
<221> Motif 1
<222> (5050)..(5076)
<220>
<221> C-methyltransferase domain
<222> (5050)..(5412)
<220>
<221> Motif 2
<222> (5309)..(5331)
<220>
<221> Motif 3
<222> (5389)..(5421)
<220>
<221> L2
<222> (9967)..(10006)
<220>
<221> PRM9t
<222> (10007)..(10544)
<220>
<221> LV5
<222> (10545)..(10584)
<400> 13
aggaatactc tgaataaaac aacttatata ataaaaatgc cggattagaa gccgccgagc 60
gggtgacagc cctccgaagg aagactctcc tccgtgcgtc ctcgtcttca ccggtcgcgt 120
tcctgaaacg cagatgtgcc tcgcgccgca ctgctccgaa caataaagat tctacaatac 180
tagcttttat ggttatgaag aggaaaaatt ggcagtaacc tggccccaca aaccttcaaa 240
tgaacgaatc aaattaacaa ccataggatg ataatgcgat tagtttttta gccttatttc 300
tggggtaatt aatcagcgaa gcgatgattt ttgatctatt aacagatata taaatgcaaa 360
aactgcataa ccactttaac taatactttc aacattttcg gtttgtatta cttcttattc 420
aaatgtaata aaagtatcaa caaaaaattg ttaatatacc tctatacttt aacgtcaagg 480
agctagaaaa tttattataa aaggaagaga aataattaaa caatgaacaa gaactccaaa 540
atccagtccc caaactcttc tgatgttgct gttattggtg ttggttttag attcccaggt 600
aactctaatg acccagaatc tttgtggaac aacttgttgg atggtttcga tgctattacc 660
caagtcccaa aagaaagatg ggctacttct tttagagaga tgggtttgat caagaacaag 720
ttcggtggtt tcttgaagga ttctgaatgg aagaatttcg accctttgtt ctttggtatc 780
ggtccaaaag aagctccatt cattgatcca caacaaaggt tgttgttgtc catcgtttgg 840
gaatctttgg aagatgctta catcagacca gatgaattga gaggttctaa cactggtgtt 900
ttcatcggtg tttctaacaa cgattacacc aagttgggtt tccaagacaa ctactctatt 960
tctccataca ctatgaccgg ctctaactct tcattgaact ccaacagaat ttcctactgc 1020
ttcgatttta gaggtccatc cattactgtt gataccgctt gttcttcttc cttggtttct 1080
gttaatttgg gtgtccaatc catccaaatg ggtgaatgta agattgctat ttgcggtggt 1140
gttaacgctt tgtttgatcc atctacatct gttgcctttt ccaagttggg tgttttgtct 1200
gaaaatggca gatgcaactc ttttagtgat caagcctctg gttacgttag atctgaaggt 1260
gctggtgttg ttgttttgaa gtctttggaa caagctaagt tggatggtga tagaatctac 1320
ggtgttatca agggtgtttc ctctaatgaa gatggtgctt ctaatggtga caagaactct 1380
ttgactactc catcttgtga agcccaatcc attaacattt ctaaggctat ggaaaaggcc 1440
tccttgtctc catctgatat ctattacatt gaagcccatg gtactggtac tccagttggt 1500
gatccaattg aagttaaggc cttgtccaag atcttctcca actctaacaa caaccagttg 1560
aacaacttct ctaccgatgg taatgataac gatgatgatg atgacgataa cacctctcca 1620
gaaccattat tgattggctc attcaagtcc aacatcggtc atttggaatc tgctgctggt 1680
attgcttctt tgattaagtg ttgcttgatg ttgaagaaca ggatgttggt tccatccatt 1740
aactgctcta atttgaaccc atccattcca ttcgatcagt acaacatctc cgttatcaga 1800
gaaatcagac aattcccaac cgataagttg gttaacatcg gtatcaattc tttcggtttc 1860
ggtggttcta actgccattt gattattcaa gagtacaaca acaacttcaa gaacaactct 1920
accatctgca ataacaacaa caacaacaat aacaacatcg actacttgat cccaatctcc 1980
tctaagacta agaagtcctt ggataagtac ttgattttga tcaagaccaa ctccaactac 2040
cacaaggata tttctttcga tgacttcgtc aagttccaaa tcaagtctaa gcagtacaac 2100
ttgtccaaca gaatgactac cattgctaac gattggaact ccttcattaa gggttctaac 2160
gaattccaca acttgatcga atctaaggat ggtgaaggtg gttcttcatc ttctaacaga 2220
ggtattgatt ccgccaatca aatcaacact actactacct ctaccatcaa cgatatcgaa 2280
cctttgttgg ttttcgtttt ctgtggtcaa ggtccacaat ggaatggtat gattaagacc 2340
ttgtacaact ccgagaacgt tttcaagaac accgttgatc atgttgacag catcttgtac 2400
aagtacttcg gttactccat tttgaacgtc ttgtctaaga tcgatgataa cgacgattcc 2460
atcaaccatc caatagttgc tcaaccatct ttgttcttgt tgcaaattgg tttggtcgag 2520
ttgtttaagt actggggtat ctacccatct atctctgttg gtcattcttt cggtgaagtc 2580
tcttcttatt acttgtccgg tatcatctct ttggaaaccg cttgtaaaat cgtctacgtc 2640
agatcctcta atcagaacaa aactatgggt tccggtaaga tgttggttgt ttctatgggt 2700
tttaagcaat ggaacgatca attctctgct gaatggtccg atattgaaat tgcttgttac 2760
aacgctccag attccatagt tgttactggt aacgaagaaa gattgaaaga attgtccatc 2820
aagttgtccg acgaatccaa tcaaattttc aacaccttct tgaggtcccc atgttctttt 2880
cattcttccc atcaagaagt catcaagggt tctatgttcg aagagttgtc taacttgcaa 2940
tctactggtg aaaccgaaat ccctttgttc tctactgtta ctggtagaca agttttgtct 3000
ggtcatgtta ctgctcaaca catctacgat aatgttagag aaccagtctt gttccaaaag 3060
acgattgaat ccattacctc ctacatcaag tctcactacc catccaatca aaaggttatc 3120
tacgttgaaa ttgctccaca cccaaccttg ttttcattga tcaaaaagtc catcccatcc 3180
tccaacaaga attcctcttc tgttttgtgt ccattgaaca gaaaagaaaa ctccaacaac 3240
tcctacaaga agttcgtttc tcagttgtac ttcaacggtg ttaacgttga cttcaacttc 3300
cagttgaact ccatttgcga taacgttaac aacgatcacc atttgaacaa cgtcaagcaa 3360
aactccttca aagagactac caattccttg ccaagatacc aatgggaaca agatgaatat 3420
tggtccgaac cattgatctc cagaaagaat agattggaag gtccaactac ttccttgttg 3480
ggtcatagaa ttatctacag cttcccagtt ttccaatccg ttttggactt gcaatctgac 3540
aactacaaat acttgttgga ccacttggtt aacggtaagc cagtttttcc aggtgctggt 3600
tatttggata tcatcatcga attcttcgac taccaaaagc agcagttgaa ttcctctgat 3660
tcctctaact cctacatcat caacgttgac aagatccaat tcttgaaccc aattcacttg 3720
accgaaaaca agttgcaaac cttgcaatct tctttcgaac ctatcgttac taagaagtct 3780
gccttctctg ttaacttctt catcaaggat accgtcgagg atcaatctaa ggttaagtct 3840
atgtctgacg aaacttggac taacacttgt aaggctacca tttccttgga acaacaacag 3900
ccatctccat cttctacttt gactttgtct aagaagcaag acttgcagat cttgagaaac 3960
agatgcgata ttagcaagct agacaagttt gagttgtacg acaagatctc taagaatttg 4020
ggcttgcagt acaactcctt gtttcaagtt gttgatacca tcgaaactgg taaggattgc 4080
tcttttgcta ctttgtcttt gccagaagat actttgttca ccaccatttt gaacccatgc 4140
ttgttggata actgtttcca tggtttgttg accttgatca acgaaaaggg ttctttcgtt 4200
gtcgagtcca tttcttctgt ttctatctac ttggagaaca tcggttcctt caatcaaact 4260
tctgttggta acgtccagtt ctacttgtac accactattt ctaaagccac ctcctttagt 4320
tctgaaggta cttgtaagtt gttcaccaag gatggttcct tgattttgtc tatcggtaag 4380
ttcatcatca agtccaccaa tccaaagtct actaagacca acgaaactat cgaatctcca 4440
ttggacgaaa ccttctctat tgaatggcaa tctaaggatt ctccaattcc aaccccacaa 4500
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aaggacatcc agttcgaaca atactgctcc tccattatcc acaaagaatt gatcaaccac 4620
gaaaagtaca agaaccagca atccttcgat atcaactcct tggaaaacca cttgaacgat 4680
gaccaattga tggaatcctt gtccatctcc aaagaatact tgagattctt caccaggatc 4740
atctccatca ttaagcaata cccaaagatc ttgaacgaaa aagagctaaa agaattgaaa 4800
gaaatcatcg aattgaagta cccatccgaa gttcagttgt tggaattcga agttatcgag 4860
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ttggaaaggg tttccgaaat ggtcttggaa tctattagac caatcgtcag agaaaagagg 5040
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atccatgccg tttctaacat taagttctcc atcgaacagt tgtacaagtt gttgtctcca 5400
agaggttggt tgttgtgtat tgaacctaag tccaacgttg tgttctccga tttggttttc 5460
ggttgtttta atcagtggtg gaactactac gatgatatta gaactaccca ctgctccttg 5520
tctgaatctc aatggaatca gttgttgttg aaccagtcct tgaacaacga atcctcttct 5580
tcttctaact gttacggtgg tttctccaac gtttctttta ttggtggtga aaaggatgtc 5640
gactcccatt ctttcatatt gcactgccaa aaagaatcca tctcccaaat gaagttagcc 5700
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ggttctcatg ttgttaccaa caaggatttg gttatcttga agccagatac catctcattt 6660
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gctactgttg gctctaacga gaagaagaag ttcttgatcg ataacttcaa caacttgttc 6900
aaagaggacg gcgaaaacat tttctctacc agagacaaag aatactccaa ccagttggaa 6960
tccaagatcg atgttatttt gaacaccttg tccggtgaat tcgtcgaatc taatttcaag 7020
tccttgagat ccttcggtag attgattgat ttgtctgcta ctcacgttta cgccaatcaa 7080
caaattggtc taggtaactt caagttcgac cacttgtatt ctgctgttga cttggaaaga 7140
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atttctaagt ccaccatgaa gtggaagttg cagactatga tttcccattt cgtttccggt 7560
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ccatccttct ccattaactt gggtccaatg aaggatgaag gtaaggtttc taccaacaag 7980
agcatcaaga agctattcaa gtctagaggt ttgccaagcc tatccttgaa caagttattt 8040
ggtttgttgg aggtcgtcat caacaaccca tctaatcatg ttatcccatc ccaattgatt 8100
tgctccccaa tcgatttcaa gacctacatc gaatctttct caactatgag gccaaagttg 8160
ttacacttgc aacctaccat ttccaagcag caatcttcta tcattaacga ttctaccaag 8220
gcttcctcca acatttcatt gcaagataag atcacctcca aggtgtctga tttgttgtcc 8280
attccaatct ccaagatcaa cttcgatcat ccattgaaac actacggctt ggattctttg 8340
ttgaccgttc aattcaaatc ctggatcgac aaagaattcg aaaagaactt gttcacccat 8400
atccaattgg ccaccatctc tattaactca ttcttggaaa aggtgaacgg cttgtctaca 8460
aacaataaca acaacaacaa ttccaacgtc aagtcctctc catccattgt caaagaagaa 8520
atcgttacct tggacaagga tcaacaacca ttgctattga aagaacacca gcacattatc 8580
atctccccag atattagaat caacaagcca aagagggaat ccttgattag aaccccaatc 8640
ttgaacaaat tcaaccagat caccgaatcc attatcactc catctacacc atctttgtcc 8700
caatccgatg ttttgaaaac tccaccaatc aagtctttga acaacactaa gaactccagc 8760
ttgattaaca ccccaccaat tcaatctgtc caacaacatc aaaagcaaca acaaaaggtc 8820
caagtcatcc aacaacagca acaaccatta tccagattgt cctacaagag caacaacaac 8880
tctttcgttt tgggtatcgg tatttctgtt ccaggtgaac ctatttccca acaatccttg 8940
aaagactcca tctccaatga cttttctgat aaggctgaaa ctaacgagaa ggtcaagaga 9000
atctttgagc aatctcaaat caagaccaga cacttggtta gagattacac taagccagag 9060
aactccatca agttcagaca tttggaaacc attaccgatg tgaacaacca gttcaagaaa 9120
gttgttccag atttggctca acaagcctgt ttgagagctt tgaaagattg gggtggtgat 9180
aagggtgata ttacccatat agtttctgtt acctccaccg gtattatcat cccagatgtt 9240
aatttcaagt tgatcgactt gttgggcttg aacaaggatg ttgaaagagt gtctttgaac 9300
ctaatgggtt gtttggctgg tttgagttct ttgagaactg ctgcttcttt ggctaaggct 9360
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actgatggtg gtgatcaaat ggtcgcctct tctatttttg ctgatggttc tgctgcttac 9480
attattggtt gtaacccaag aattgaagaa accccattat acgaagtcat gtgctccatt 9540
aacagatctt tcccaaatac cgaaaacgcc atggtttggg atttggaaaa agaaggttgg 9600
aacttgggtt tggatgcttc tattccaatt gtcattggtt ctggtattga agccttcgtt 9660
gatactttgt tggataaggc taagttgcaa acttccactg ctatttctgc taaggattgc 9720
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tcaatttctt tggcttttgg tccaggtttg gcttttgaag gttgtttctt gaagaacgtc 9960
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agtggcacag aaacaaccag gaatactata gtcataggca atacaaggta tatattggct 10380
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tggatctatg aaatcgctcg ctatacacca gtcatgattt tgtccctctt tatattacat 10560
caaaataaga aaataattat aaca 10584
<210> 14
<211> 4909
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cassette with Cas9 coding sequence, regulatory sequences and
integration sequences
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<220>
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<400> 14
aggaatactc tgaataaaac aacttatata ataaaaatgc atagcttcaa aatgtttcta 60
ctcctttttt actcttccag attttctcgg actccgcgca tcgccgtacc acttcaaaac 120
acccaagcac agcatactaa atttcccctc tttcttcctc tagggtgtcg ttaattaccc 180
gtactaaagg tttggaaaag aaaaaagaga ccgcctcgtt tctttttctt cgtcgaaaaa 240
ggcaataaaa atttttatca cgtttctttt tcttgaaaat tttttttttg atttttttct 300
ctttcgatga cctcccattg atatttaagt taataaacgg tcttcaattt ctcaagtttc 360
agtttcattt ttcttgttct attacaactt tttttacttc ttgctcatta gaaagaaagc 420
atagcaatct aatctaagtt ttctagaact agtggatccc ccgggaaaaa tggacaagaa 480
gtactccatt gggctcgata tcggcacaaa cagcgtcggc tgggccgtca ttacggacga 540
gtacaaggtg ccgagcaaaa aattcaaagt tctgggcaat accgatcgcc acagcataaa 600
gaagaacctc attggcgccc tcctgttcga ctccggggag acggccgaag ccacgcggct 660
caaaagaaca gcacggcgca gatatacccg cagaaagaat cggatctgct acctgcagga 720
gatctttagt aatgagatgg ctaaggtgga tgactctttc ttccataggc tggaggagtc 780
ctttttggtg gaggaggata aaaagcacga gcgccaccca atctttggca atatcgtgga 840
cgaggtggcg taccatgaaa agtacccaac catatatcat ctgaggaaga agcttgtaga 900
cagtactgat aaggctgact tgcggttgat ctatctcgcg ctggcgcata tgatcaaatt 960
tcggggacac ttcctcatcg agggggacct gaacccagac aacagcgatg tcgacaaact 1020
ctttatccaa ctggttcaga cttacaatca gcttttcgaa gagaacccga tcaacgcatc 1080
cggagttgac gccaaagcaa tcctgagcgc taggctgtcc aaatcccggc ggctcgaaaa 1140
cctcatcgca cagctccctg gggagaagaa gaacggcctg tttggtaatc ttatcgccct 1200
gtcactcggg ctgaccccca actttaaatc taacttcgac ctggccgaag atgccaagct 1260
tcaactgagc aaagacacct acgatgatga tctcgacaat ctgctggccc agatcggcga 1320
ccagtacgca gacctttttt tggcggcaaa gaacctgtca gacgccattc tgctgagtga 1380
tattctgcga gtgaacacgg agatcaccaa agctccgctg agcgctagta tgatcaagcg 1440
ctatgatgag caccaccaag acttgacttt gctgaaggcc cttgtcagac agcaactgcc 1500
tgagaagtac aaggaaattt tcttcgatca gtctaaaaat ggctacgccg gatacattga 1560
cggcggagca agccaggagg aattttacaa atttattaag cccatcttgg aaaaaatgga 1620
cggcaccgag gagctgctgg taaagcttaa cagagaagat ctgttgcgca aacagcgcac 1680
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cacatttcgg ataccctact atgtaggccc cctcgcccgg ggaaattcca gattcgcgtg 1860
gatgactcgc aaatcagaag agaccatcac tccctggaac ttcgaggaag tcgtggataa 1920
gggggcctct gcccagtcct tcatcgaaag gatgactaac tttgataaaa atctgcctaa 1980
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gaagaaagct atcgtggacc tcctcttcaa gacgaaccgg aaagttaccg tgaaacagct 2160
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ggacttcctg gacaatgagg agaacgagga cattcttgag gacattgtcc tcacccttac 2340
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gtccgatgga tttgccaacc ggaacttcat gcagttgatc catgatgact ctctcacctt 2580
taaggaggac atccagaaag cacaagtttc tggccagggg gacagtcttc acgagcacat 2640
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ggatgaactc gtcaaagtaa tgggaaggca taagcccgag aatatcgtta tcgagatggc 2760
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ccagcttcag aatgagaagc tctacctgta ctacctgcag aacggcaggg acatgtacgt 2940
ggatcaggaa ctggacatca atcggctctc cgactacgac gtggatcata tcgtgcccca 3000
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gcagctgctg aacgccaaac tgatcacaca acggaagttc gataatctga ctaaggctga 3180
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acgccagatc accaagcacg tggcccaaat tctcgattca cgcatgaaca ccaagtacga 3300
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gtctgagcag gaaataggca aggccaccgc taagtacttc ttttacagca atattatgaa 3600
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tacgcatgta acattatact gaaaaccttg cttgagaagg ttttgggacg ctcgaaggct 4860
ttaatttgcc ctctttatat tacatcaaaa taagaaaata attataaca 4909
단지 실시예
앞선 설명에서, 설명의 목적으로, 양태의 충분한 이해를 제공하기 위해 다수의 세부 사항이 설명된다. 그러나, 이들 특정 세부 사항이 요구되지 않는 것이 당업자에게 명백할 것이다.
상기 기재된 양태는 단지 실시예로 의도된다. 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 당업자에 의해 특정 양태에 변형, 수정 및 변형이 이루어질 수 있으며, 이는 본 명세서에 첨부된 청구 범위에 의해서만 정의된다.
SEQUENCE LISTING <110> Hyasynth Biologicals Inc. <120> METHOD AND CELL LINE FOR PRODUCTION OF POLYKETIDES IN YEAST <130> PAT 85146W-90 <150> US 62/460,526 <151> 2017-02-17 <160> 14 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 9444 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Yeast optimized DiPKS from Dictyostelium discoideum <220> <221> Motif 1 <222> (4528)..(4554) <220> <221> C-methyltransferase domain <222> (4528)..(4890) <220> <221> Motif 2 <222> (4787)..(4809) <220> <221> Motif 3 <222> (4867)..(4899) <400> 1 atgaacaaga actccaaaat ccagtcccca aactcttctg atgttgctgt tattggtgtt 60 ggttttagat tcccaggtaa ctctaatgac ccagaatctt tgtggaacaa cttgttggat 120 ggtttcgatg ctattaccca agtcccaaaa gaaagatggg ctacttcttt tagagagatg 180 ggtttgatca agaacaagtt cggtggtttc ttgaaggatt ctgaatggaa gaatttcgac 240 cctttgttct ttggtatcgg tccaaaagaa gctccattca ttgatccaca acaaaggttg 300 ttgttgtcca tcgtttggga atctttggaa gatgcttaca tcagaccaga tgaattgaga 360 ggttctaaca ctggtgtttt catcggtgtt tctaacaacg attacaccaa 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tgcctgaaga aggtaaggcc attgaagatg cagttaaaaa ggttttggat gcaggtatca 10680 gaactggtga tttaggtggt tccaacagta ccaccgaagt cggtgatgct gtcgccgaag 10740 aagttaagaa aatccttgct taactttgcc ttcgtttatc ttgcctgctc attttttagt 10800 atattcttcg aagaaatcac attactttat ataatgtata attcattatg tgataatgcc 10860 aatcgctaag aaaaaaaaag agtcatccgc taggggaaaa aaaaaaatga aaatcattac 10920 cgaggcataa aaaaatatag agtgtactag aggaggccaa gagtaataga aaaagaaaat 10980 tgcgggaaag gactgtgtta tgacttccct gactaatgcc gtgttcaaac gatacctggc 11040 agtgactcct agcgctcacc aagctcttaa aacgggaatt tatggtgcac tctcagtaca 11100 atctgctctg atgccgcata gttaagccag ccccgacacc cgccaacacg cgctgacgcg 11160 ccctgacggg cttgtctgct cccggcatcc gcttacagac aagctgtgac cgtctccggg 11220 agctgcatgt gtcagaggtt ttcaccgtca tcaccgaaac gcgcgagacg aaagggcctc 11280 gtgatacgcc tatttttata ggttaatgtc atgataataa tggtttctta ggacggatcg 11340 cttgcctgta acttacacgc gcctcgtatc ttttaatgat ggaataattt gggaatttac 11400 tctgtgttta tttattttta tgttttgtat ttggatttta gaaagtaaat 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gttgagtact caccagtcac 12300 agaaaagcat cttacggatg gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat 12360 gagtgataac actgcggcca acttacttct gacaacgatc ggaggaccga aggagctaac 12420 cgcttttttg cacaacatgg gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg aaccggagct 12480 gaatgaagcc ataccaaacg acgagcgtga caccacgatg cctgtagcaa tggcaacaac 12540 gttgcgcaaa ctattaactg gcgaactact tactctagct tcccggcaac aattaataga 12600 ctggatggag gcggataaag ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg 12660 gtttattgct gataaatctg gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca ttgcagcact 12720 ggggccagat ggtaagccct cccgtatcgt agttatctac acgacgggga gtcaggcaac 12780 tatggatgaa cgaaatagac agatcgctga gataggtgcc tcactgatta agcattggta 12840 actgtcagac caagtttact catatatact ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt 12900 taaaaggatc taggtgaaga tcctttttga taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga 12960 gttttcgttc cactgagcgt cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc 13020 tttttttctg cgcgtaatct gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt 13080 ttgtttgccg gatcaagagc taccaactct 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<221> S. cerevisiae GAL1 promoter <222> (41)..(482) <220> <221> L1 <222> (483)..(522) <220> <221> DiPKS <222> (523)..(9966) <220> <221> C-methyltransferase domain <222> (5050)..(5412) <220> <221> Motif 1 <222> (5050)..(5076) <220> <221> G1516D <222> (5068)..(5070) <220> <221> G1518A <222> (5074)..(5076) <220> <221> Motif 2 <222> (5309)..(5331) <220> <221> Motif 3 <222> (5389)..(5421) <220> <221> L2 <222> (9967)..(10006) <220> <221> PRM9t <222> (10007)..(10544) <220> <221> LV5 <222> (10545)..(10584) <400> 9 aggaatactc tgaataaaac aacttatata ataaaaatgc cggattagaa gccgccgagc 60 gggtgacagc cctccgaagg aagactctcc tccgtgcgtc ctcgtcttca ccggtcgcgt 120 tcctgaaacg cagatgtgcc tcgcgccgca ctgctccgaa caataaagat tctacaatac 180 tagcttttat ggttatgaag aggaaaaatt ggcagtaacc tggccccaca aaccttcaaa 240 tgaacgaatc aaattaacaa ccataggatg ataatgcgat tagtttttta gccttatttc 300 tggggtaatt aatcagcgaa gcgatgattt ttgatctatt aacagatata taaatgcaaa 360 aactgcataa ccactttaac taatactttc aacattttcg gtttgtatta cttcttattc 420 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ttcctactgc 1020 ttcgatttta gaggtccatc cattactgtt gataccgctt gttcttcttc cttggtttct 1080 gttaatttgg gtgtccaatc catccaaatg ggtgaatgta agattgctat ttgcggtggt 1140 gttaacgctt tgtttgatcc atctacatct gttgcctttt ccaagttggg tgttttgtct 1200 gaaaatggca gatgcaactc ttttagtgat caagcctctg gttacgttag atctgaaggt 1260 gctggtgttg ttgttttgaa gtctttggaa caagctaagt tggatggtga tagaatctac 1320 ggtgttatca agggtgtttc ctctaatgaa gatggtgctt ctaatggtga caagaactct 1380 ttgactactc catcttgtga agcccaatcc attaacattt ctaaggctat ggaaaaggcc 1440 tccttgtctc catctgatat ctattacatt gaagcccatg gtactggtac tccagttggt 1500 gatccaattg aagttaaggc cttgtccaag atcttctcca actctaacaa caaccagttg 1560 aacaacttct ctaccgatgg taatgataac gatgatgatg atgacgataa cacctctcca 1620 gaaccattat tgattggctc attcaagtcc aacatcggtc atttggaatc tgctgctggt 1680 attgcttctt tgattaagtg ttgcttgatg ttgaagaaca ggatgttggt tccatccatt 1740 aactgctcta atttgaaccc atccattcca ttcgatcagt acaacatctc cgttatcaga 1800 gaaatcagac aattcccaac cgataagttg gttaacatcg gtatcaattc 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Plasmid <220> <221> LV5 <222> (1)..(40) <220> <221> pYES backbone <222> (41)..(5016) <220> <221> AmpR <222> (1040)..(1699) <220> <221> URA3 <222> (1915)..(3022) <220> <221> LV3 <222> (5017)..(5056) <400> 12 cctctttata ttacatcaaa ataagaaaat aattataaca cctgcattaa tgaatcggcc 60 aacgcgcggg gagaggcggt ttgcgtattg ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact 120 cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac 180 ggttatccac agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa 240 agcccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg 300 acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa 360 gataccaggc gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc 420 ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac 480 gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac 540 cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg 600 taagacacga cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt 660 atgtaggcgg tgctacagag 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ctatgaccgg ctctaactct tcattgaact ccaacagaat ttcctactgc 1020 ttcgatttta gaggtccatc cattactgtt gataccgctt gttcttcttc cttggtttct 1080 gttaatttgg gtgtccaatc catccaaatg ggtgaatgta agattgctat ttgcggtggt 1140 gttaacgctt tgtttgatcc atctacatct gttgcctttt ccaagttggg tgttttgtct 1200 gaaaatggca gatgcaactc ttttagtgat caagcctctg gttacgttag atctgaaggt 1260 gctggtgttg ttgttttgaa gtctttggaa caagctaagt tggatggtga tagaatctac 1320 ggtgttatca agggtgtttc ctctaatgaa gatggtgctt ctaatggtga caagaactct 1380 ttgactactc catcttgtga agcccaatcc attaacattt ctaaggctat ggaaaaggcc 1440 tccttgtctc catctgatat ctattacatt gaagcccatg gtactggtac tccagttggt 1500 gatccaattg aagttaaggc cttgtccaag atcttctcca actctaacaa caaccagttg 1560 aacaacttct ctaccgatgg taatgataac gatgatgatg atgacgataa cacctctcca 1620 gaaccattat tgattggctc attcaagtcc aacatcggtc atttggaatc tgctgctggt 1680 attgcttctt tgattaagtg ttgcttgatg ttgaagaaca ggatgttggt tccatccatt 1740 aactgctcta atttgaaccc atccattcca ttcgatcagt acaacatctc cgttatcaga 1800 gaaatcagac 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cttgtaagtt gttcaccaag gatggttcct tgattttgtc tatcggtaag 4380 ttcatcatca agtccaccaa tccaaagtct actaagacca acgaaactat cgaatctcca 4440 ttggacgaaa ccttctctat tgaatggcaa tctaaggatt ctccaattcc aaccccacaa 4500 caaatccaac aacaatctcc attgaactct aacccatcct tcattagatc taccatcttg 4560 aaggacatcc agttcgaaca atactgctcc tccattatcc acaaagaatt gatcaaccac 4620 gaaaagtaca agaaccagca atccttcgat atcaactcct tggaaaacca cttgaacgat 4680 gaccaattga tggaatcctt gtccatctcc aaagaatact tgagattctt caccaggatc 4740 atctccatca ttaagcaata cccaaagatc ttgaacgaaa aagagctaaa agaattgaaa 4800 gaaatcatcg aattgaagta cccatccgaa gttcagttgt tggaattcga agttatcgag 4860 aaggtgtcca tgattatccc aaagttgttg ttcgaaaacg acaagcaatc ttccatgacc 4920 ttgttccaag ataacttgtt gaccaggttc tactccaatt ctaactctac cagattctac 4980 ttggaaaggg tttccgaaat ggtcttggaa tctattagac caatcgtcag agaaaagagg 5040 gtgttcagaa ttttggaaat tggtgctggt acaggctctt tgtctaatgt tgttttgact 5100 aagttgaaca cctacttgtc caccttgaat tctaatggtg gttctggtta caacatcatc 5160 attgagtaca ccttcaccga tatttccgcc aacttcatta ttggtgaaat ccaagaaacc 5220 atgtgcaact tgtacccaaa cgttactttc aagttctccg tcttggactt ggagaaagag 5280 attattaact cctccgattt cttgatgggt gattacgata tagttttgat ggcctacgtt 5340 atccatgccg tttctaacat taagttctcc atcgaacagt tgtacaagtt gttgtctcca 5400 agaggttggt tgttgtgtat tgaacctaag tccaacgttg tgttctccga tttggttttc 5460 ggttgtttta atcagtggtg gaactactac gatgatatta gaactaccca ctgctccttg 5520 tctgaatctc aatggaatca gttgttgttg aaccagtcct tgaacaacga atcctcttct 5580 tcttctaact gttacggtgg tttctccaac gtttctttta ttggtggtga aaaggatgtc 5640 gactcccatt ctttcatatt gcactgccaa aaagaatcca tctcccaaat gaagttagcc 5700 accactatta acaacggttt gtcatctggt tccatcgtta tcgttttgaa ctctcaacaa 5760 ttgaccaaca tgaagtccta cccaaaggtt attgagtata ttcaagaggc tacctctttg 5820 tgcaagacca ttgaaattat cgattccaag gacgtcttga actctaccaa ttcagttttg 5880 gaaaagatcc aaaagtcctt gttggtgttc tgtttgttgg gttatgactt gttggagaac 5940 aactaccaag aacagtcttt cgaatacgtt aagttgttga acttgatctc tactaccgcc 6000 tcttcatcta atgataagaa accaccaaag gtcttgttga tcaccaagca atctgaaaga 6060 atctccaggt ctttctactc cagatccttg attggtattt ccagaacctc tatgaacgag 6120 tacccaaatt tgtccattac ctctatcgat ttggatacca acgactactc attgcagtct 6180 ttgttgaagc caatcttcag caactctaag ttttccgaca acgagttcat cttcaaaaag 6240 ggcttgatgt tcgtgtccag gatctttaag aacaagcagt tgctagaatc ctccaacgct 6300 tttgaaactg actcttctaa cttgtactgt aaggcctctt ctgacttgtc ttacaagtac 6360 gctattaagc agtctatgtt gaccgaaaat cagatcgaaa tcaaggttga atgcgtcggt 6420 attaacttca aggacaacct attctacaag ggcttgttgc cacaagaaat tttcagaatg 6480 ggtgacatct acaatccacc atatggtttg gaatgctctg gtgttattac cagaattggt 6540 tctaacgtca ccgaatactc agttggtcaa aatgtttttg gtttcgccag acattctttg 6600 ggttctcatg ttgttaccaa caaggatttg gttatcttga agccagatac catctcattt 6660 tctgaagctg cttctatccc agttgtttac tgtactgctt ggtactcctt gttcaacatt 6720 ggtcagttgt ctaacgaaga atccatccta attcattctg ctactggtgg tgtaggtttg 6780 gcttctttga atttgttgaa aatgaagaat cagcaacagc aaccattgac caatgtttat 6840 gctactgttg gctctaacga gaagaagaag ttcttgatcg ataacttcaa caacttgttc 6900 aaagaggacg gcgaaaacat tttctctacc agagacaaag aatactccaa ccagttggaa 6960 tccaagatcg atgttatttt gaacaccttg tccggtgaat tcgtcgaatc taatttcaag 7020 tccttgagat ccttcggtag attgattgat ttgtctgcta ctcacgttta cgccaatcaa 7080 caaattggtc taggtaactt caagttcgac cacttgtatt ctgctgttga cttggaaaga 7140 ttgatcgacg aaaaacctaa gttgttgcag tccatcttgc aaagaattac caactctatc 7200 gtcaacggtt ccttggaaaa aattccaatt accatcttcc catccaccga aactaaggat 7260 gctatcgaat tattgtccaa gagatcccat atcggtaaag ttgttgtaga ttgcaccgat 7320 atctctaagt gtaatcctgt tggtgatgtg atcaccaact tctctatgag attgccaaag 7380 ccaaactacc agttgaattt gaactccacc ttgttgatta ctggtcagtc tggtttgtct 7440 atccctttgt tgaattggtt gttgtctaag tctggtggta acgttaagaa cgttgtcatc 7500 atttctaagt ccaccatgaa gtggaagttg cagactatga tttcccattt cgtttccggt 7560 ttcggtatcc attttaacta cgttcaagtc gacatctcca actacgatgc tttgtctgaa 7620 gctattaagc aattgccatc tgatttgcca ccaatcacct ctgtttttca tttggctgct 7680 atctacaacg atgttccaat ggatcaagtt accatgtcta ccgttgaatc tgttcataac 7740 cctaaagttt tgggtgccgt taacttgcat agaatctctg tttcttttgg ttggaagttg 7800 aaccacttcg tcttgttctc ttctattact gctattaccg gttacccaga ccaatctatc 7860 tacaattctg ccaactctat tttggacgct ttgtccaact ttagaaggtt tatgggtttg 7920 ccatccttct ccattaactt gggtccaatg aaggatgaag gtaaggtttc taccaacaag 7980 agcatcaaga agctattcaa gtctagaggt ttgccaagcc tatccttgaa caagttattt 8040 ggtttgttgg aggtcgtcat caacaaccca tctaatcatg ttatcccatc ccaattgatt 8100 tgctccccaa tcgatttcaa gacctacatc gaatctttct caactatgag gccaaagttg 8160 ttacacttgc aacctaccat ttccaagcag caatcttcta tcattaacga ttctaccaag 8220 gcttcctcca acatttcatt gcaagataag atcacctcca aggtgtctga tttgttgtcc 8280 attccaatct ccaagatcaa cttcgatcat ccattgaaac actacggctt ggattctttg 8340 ttgaccgttc aattcaaatc ctggatcgac aaagaattcg aaaagaactt gttcacccat 8400 atccaattgg ccaccatctc tattaactca ttcttggaaa aggtgaacgg cttgtctaca 8460 aacaataaca acaacaacaa ttccaacgtc aagtcctctc catccattgt caaagaagaa 8520 atcgttacct tggacaagga tcaacaacca ttgctattga aagaacacca gcacattatc 8580 atctccccag atattagaat caacaagcca aagagggaat ccttgattag aaccccaatc 8640 ttgaacaaat tcaaccagat caccgaatcc attatcactc catctacacc atctttgtcc 8700 caatccgatg ttttgaaaac tccaccaatc aagtctttga acaacactaa gaactccagc 8760 ttgattaaca ccccaccaat tcaatctgtc caacaacatc aaaagcaaca acaaaaggtc 8820 caagtcatcc aacaacagca acaaccatta tccagattgt cctacaagag caacaacaac 8880 tctttcgttt tgggtatcgg tatttctgtt ccaggtgaac ctatttccca acaatccttg 8940 aaagactcca tctccaatga cttttctgat aaggctgaaa ctaacgagaa ggtcaagaga 9000 atctttgagc aatctcaaat caagaccaga cacttggtta gagattacac taagccagag 9060 aactccatca agttcagaca tttggaaacc attaccgatg tgaacaacca gttcaagaaa 9120 gttgttccag atttggctca acaagcctgt ttgagagctt tgaaagattg gggtggtgat 9180 aagggtgata ttacccatat agtttctgtt acctccaccg gtattatcat cccagatgtt 9240 aatttcaagt tgatcgactt gttgggcttg aacaaggatg ttgaaagagt gtctttgaac 9300 ctaatgggtt gtttggctgg tttgagttct ttgagaactg ctgcttcttt ggctaaggct 9360 tctccaagaa atagaatttt ggttgtctgt accgaagtct gctccttgca tttttctaat 9420 actgatggtg gtgatcaaat ggtcgcctct tctatttttg ctgatggttc tgctgcttac 9480 attattggtt gtaacccaag aattgaagaa accccattat acgaagtcat gtgctccatt 9540 aacagatctt tcccaaatac cgaaaacgcc atggtttggg atttggaaaa agaaggttgg 9600 aacttgggtt tggatgcttc tattccaatt gtcattggtt ctggtattga agccttcgtt 9660 gatactttgt tggataaggc taagttgcaa acttccactg ctatttctgc taaggattgc 9720 gaattcttga ttcatactgg tggcaagtcc atcttgatga acatcgaaaa ttccttgggt 9780 atcgacccaa agcaaactaa gaatacttgg gatgtttacc atgcctacgg caatatgtca 9840 tctgcctctg ttattttcgt tatggatcat gccagaaagt ccaagtcttt gccaacttac 9900 tcaatttctt tggcttttgg tccaggtttg gcttttgaag gttgtttctt gaagaacgtc 9960 gtctaaagac ataaaactga aacaacacca attaataata gactttacag aagacgggag 10020 acactagcac acaactttac caggcaaggt atttgacgct agcatgtgtc caattcagtg 10080 tcatttatga ttttttgtag taggatataa atatatacag cgctccaaat agtgcggttg 10140 ccccaaaaac accacggaac ctcatctgtt ctcgtacttt gttgtgacaa agtagctcac 10200 tgccttatta tcacattttc attatgcaac gcttcggaaa atacgatgtt gaaaatgcct 10260 ctagagatga aaaacaatcg taaaagggtc ctgcgtaatt gaaacatttg atcagtatgc 10320 agtggcacag aaacaaccag gaatactata gtcataggca atacaaggta tatattggct 10380 atgcagaccc ctccagaaag taccgacgtc aagttagata cacttaacga acctagtgca 10440 catttaattg agaaaaatgt ggctcttcct aaggacatat tccgttcgta cttgagttat 10500 tggatctatg aaatcgctcg ctatacacca gtcatgattt tgtccctctt tatattacat 10560 caaaataaga aaataattat aaca 10584 <210> 14 <211> 4909 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cassette with Cas9 coding sequence, regulatory sequences and integration sequences <220> <221> LV3 <222> (1)..(40) <220> <221> TEF1p <222> (41)..(446) <220> <221> Cas9 <222> (470)..(4609) <220> <221> LV5 <222> (4870)..(4909) <400> 14 aggaatactc tgaataaaac aacttatata ataaaaatgc atagcttcaa aatgtttcta 60 ctcctttttt actcttccag attttctcgg actccgcgca tcgccgtacc acttcaaaac 120 acccaagcac agcatactaa atttcccctc tttcttcctc tagggtgtcg ttaattaccc 180 gtactaaagg tttggaaaag aaaaaagaga ccgcctcgtt tctttttctt cgtcgaaaaa 240 ggcaataaaa atttttatca cgtttctttt tcttgaaaat tttttttttg atttttttct 300 ctttcgatga cctcccattg atatttaagt taataaacgg tcttcaattt ctcaagtttc 360 agtttcattt ttcttgttct attacaactt tttttacttc ttgctcatta gaaagaaagc 420 atagcaatct aatctaagtt ttctagaact agtggatccc ccgggaaaaa tggacaagaa 480 gtactccatt gggctcgata tcggcacaaa cagcgtcggc tgggccgtca ttacggacga 540 gtacaaggtg ccgagcaaaa aattcaaagt tctgggcaat accgatcgcc acagcataaa 600 gaagaacctc attggcgccc tcctgttcga ctccggggag acggccgaag ccacgcggct 660 caaaagaaca gcacggcgca gatatacccg cagaaagaat cggatctgct acctgcagga 720 gatctttagt aatgagatgg ctaaggtgga tgactctttc ttccataggc tggaggagtc 780 ctttttggtg gaggaggata aaaagcacga gcgccaccca atctttggca atatcgtgga 840 cgaggtggcg taccatgaaa agtacccaac catatatcat ctgaggaaga agcttgtaga 900 cagtactgat aaggctgact tgcggttgat ctatctcgcg ctggcgcata tgatcaaatt 960 tcggggacac ttcctcatcg agggggacct gaacccagac aacagcgatg tcgacaaact 1020 ctttatccaa ctggttcaga cttacaatca gcttttcgaa gagaacccga tcaacgcatc 1080 cggagttgac gccaaagcaa tcctgagcgc taggctgtcc aaatcccggc ggctcgaaaa 1140 cctcatcgca cagctccctg gggagaagaa gaacggcctg tttggtaatc ttatcgccct 1200 gtcactcggg ctgaccccca actttaaatc taacttcgac ctggccgaag atgccaagct 1260 tcaactgagc aaagacacct acgatgatga tctcgacaat ctgctggccc agatcggcga 1320 ccagtacgca gacctttttt tggcggcaaa gaacctgtca gacgccattc tgctgagtga 1380 tattctgcga gtgaacacgg agatcaccaa agctccgctg agcgctagta tgatcaagcg 1440 ctatgatgag caccaccaag acttgacttt gctgaaggcc cttgtcagac agcaactgcc 1500 tgagaagtac aaggaaattt tcttcgatca gtctaaaaat ggctacgccg gatacattga 1560 cggcggagca agccaggagg aattttacaa atttattaag cccatcttgg aaaaaatgga 1620 cggcaccgag gagctgctgg taaagcttaa cagagaagat ctgttgcgca aacagcgcac 1680 tttcgacaat ggaagcatcc cccaccagat tcacctgggc gaactgcacg ctatcctcag 1740 gcggcaagag gatttctacc cctttttgaa agataacagg gaaaagattg agaaaatcct 1800 cacatttcgg ataccctact atgtaggccc cctcgcccgg ggaaattcca gattcgcgtg 1860 gatgactcgc aaatcagaag agaccatcac tccctggaac ttcgaggaag tcgtggataa 1920 gggggcctct gcccagtcct tcatcgaaag gatgactaac tttgataaaa atctgcctaa 1980 cgaaaaggtg cttcctaaac actctctgct gtacgagtac ttcacagttt ataacgagct 2040 caccaaggtc aaatacgtca cagaagggat gagaaagcca gcattcctgt ctggagagca 2100 gaagaaagct atcgtggacc tcctcttcaa gacgaaccgg aaagttaccg tgaaacagct 2160 caaagaagac tatttcaaaa agattgaatg tttcgactct gttgaaatca gcggagtgga 2220 ggatcgcttc aacgcatccc tgggaacgta tcacgatctc ctgaaaatca ttaaagacaa 2280 ggacttcctg gacaatgagg agaacgagga cattcttgag gacattgtcc tcacccttac 2340 gttgtttgaa gatagggaga tgattgaaga acgcttgaaa acttacgctc atctcttcga 2400 cgacaaagtc atgaaacagc tcaagaggcg ccgatataca ggatgggggc ggctgtcaag 2460 aaaactgatc aatgggatcc gagacaagca gagtggaaag acaatcctgg attttcttaa 2520 gtccgatgga tttgccaacc ggaacttcat gcagttgatc catgatgact ctctcacctt 2580 taaggaggac atccagaaag cacaagtttc tggccagggg gacagtcttc acgagcacat 2640 cgctaatctt gcaggtagcc cagctatcaa aaagggaata ctgcagaccg ttaaggtcgt 2700 ggatgaactc gtcaaagtaa tgggaaggca taagcccgag aatatcgtta tcgagatggc 2760 ccgagagaac caaactaccc agaagggaca gaagaacagt agggaaagga tgaagaggat 2820 tgaagagggt ataaaagaac tggggtccca aatccttaag gaacacccag ttgaaaacac 2880 ccagcttcag aatgagaagc tctacctgta ctacctgcag aacggcaggg acatgtacgt 2940 ggatcaggaa ctggacatca atcggctctc cgactacgac gtggatcata tcgtgcccca 3000 gtcttttctc aaagatgatt ctattgataa taaagtgttg acaagatccg ataaaaatag 3060 agggaagagt gataacgtcc cctcagaaga agttgtcaag aaaatgaaaa attattggcg 3120 gcagctgctg aacgccaaac tgatcacaca acggaagttc gataatctga ctaaggctga 3180 acgaggtggc ctgtctgagt tggataaagc cggcttcatc aaaaggcagc ttgttgagac 3240 acgccagatc accaagcacg tggcccaaat tctcgattca cgcatgaaca ccaagtacga 3300 tgaaaatgac aaactgattc gagaggtgaa agttattact ctgaagtcta agctggtctc 3360 agatttcaga aaggactttc agttttataa ggtgagagag atcaacaatt accaccatgc 3420 gcatgatgcc tacctgaatg cagtggtagg cactgcactt atcaaaaaat atcccaagct 3480 tgaatctgaa tttgtttacg gagactataa agtgtacgat gttaggaaaa tgatcgcaaa 3540 gtctgagcag gaaataggca aggccaccgc taagtacttc ttttacagca atattatgaa 3600 ttttttcaag accgagatta cactggccaa tggagagatt cggaagcgac cacttatcga 3660 aacaaacgga gaaacaggag aaatcgtgtg ggacaagggt agggatttcg cgacagtccg 3720 gaaggtcctg tccatgccgc aggtgaacat cgttaaaaag accgaagtac agaccggagg 3780 cttctccaag gaaagtatcc tcccgaaaag gaacagcgac aagctgatcg cacgcaaaaa 3840 agattgggac cccaagaaat acggcggatt cgattctcct acagtcgctt acagtgtact 3900 ggttgtggcc aaagtggaga aagggaagtc taaaaaactc aaaagcgtca aggaactgct 3960 gggcatcaca atcatggagc gatcaagctt cgaaaaaaac cccatcgact ttctcgaggc 4020 gaaaggatat aaagaggtca aaaaagacct catcattaag cttcccaagt actctctctt 4080 tgagcttgaa aacggccgga aacgaatgct cgctagtgcg ggcgagctgc agaaaggtaa 4140 cgagctggca ctgccctcta aatacgttaa tttcttgtat ctggccagcc actatgaaaa 4200 gctcaaaggg tctcccgaag ataatgagca gaagcagctg ttcgtggaac aacacaaaca 4260 ctaccttgat gagatcatcg agcaaataag cgaattctcc aaaagagtga tcctcgccga 4320 cgctaacctc gataaggtgc tttctgctta caataagcac agggataagc ccatcaggga 4380 gcaggcagaa aacattatcc acttgtttac tctgaccaac ttgggcgcgc ctgcagcctt 4440 caagtacttc gacaccacca tagacagaaa gcggtacacc tctacaaagg aggtcctgga 4500 cgccacactg attcatcagt caattacggg gctctatgaa acaagaatcg acctctctca 4560 gctcggtgga gacagcaggg ctgaccccaa gaagaagagg aaggtgtgat ctcttctcga 4620 gtcatgtaat tagttatgtc acgcttacat tcacgccctc cccccacatc cgctctaacc 4680 gaaaaggaag gagttagaca acctgaagtc taggtcccta tttatttttt tatagttatg 4740 ttagtattaa gaacgttatt tatatttcaa atttttcttt tttttctgta cagacgcgtg 4800 tacgcatgta acattatact gaaaaccttg cttgagaagg ttttgggacg ctcgaaggct 4860 ttaatttgcc ctctttatat tacatcaaaa taagaaaata attataaca 4909

Claims (52)

  1. 폴리케티드의 제조방법으로서,
    상기 방법은,
    폴리케티드 신타아제 효소(polyketide synthase enzyme)를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드를 포함하는 효모 세포를 제공하는 단계로, 상기 폴리케티드 신타아제 효소는 말로닐-CoA로부터 적어도 하나의 폴리케티드의 종을 생성하기 위한 것이고, 상기 폴리케티드는 하기 화학식 I을 갖는 것이고,
    [화학식 I]
    Figure pct00007

    상기 화학식 I에서, R1은 펜틸기이고, R2는 H, 카르복실, 또는 메틸이고, R3은 H, 카르복실, 또는 메틸인, 단계; 및
    효모 세포 배양액을 제공하기 위해 효모 세포를 증식시키는 단계;를 포함하는 것인, 폴리케티드의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 폴리케티드 신타아제 효소는 딕티오스텔리움 디스코이데움(D. discoideum)으로부터의 DiPKS 폴리케티드 신타아제 효소를 포함하는 것인, 폴리케티드의 제조방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 제1 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:13의 535 내지 9978번째 염기로 정의되는 리딩 프레임에 의해 코딩된 단백질과 80 % 내지 100 %의 아미노산 잔기 서열 상동성을 갖는 1차 구조를 갖는 DiPKS 폴리케티드 신타아제 효소에 대한 코딩 서열을 포함하는 것인, 폴리케티드의 제조방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 제1 폴리펩티드는 SEQ ID NO:13의 535 내지 9978번째 염기와 80 % 내지 100 %의 염기 서열 상동성을 갖는 것인, 폴리케티드의 제조방법.
  5. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 폴리케티드의 종은 R2에서 메틸기를 갖는 폴리케티드를 포함하는 것인, 폴리케티드의 제조방법.
  6. 제2항에 있어서,
    상기 DiPKS 폴리케티드 신타아제 효소는 적어도 하나의 폴리케티드의 종의 메틸화를 완화시키기 위해 C-Met 도메인의 활성 부위에 영향을 미치는 돌연변이를 포함하여, R2가 메틸이고, R3이 H인 제1 폴리케티드, 및 R2가 H이고, R3이 H인 제2 폴리케티드를 포함하는 적어도 하나의 폴리케티드의 종을 생성하는 것인, 폴리케티드의 제조방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 DiPKS 폴리케티드 신타아제는 DiPKSG1516D ; G1518A 폴리케티드 신타아제를 포함하는 것인, 폴리케티드의 제조방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 제1 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:9의 523 내지 9966번째 염기로 정의되는 리딩 프레임에 의해 코딩된 단백질과 80 % 내지 100 %의 아미노산 잔기 서열 상동성을 갖는 1차 구조를 갖는 DiPKSG1516D ; G1518A 폴리케티드 신타아제 효소에 대한 코딩 서열을 포함하는 것인, 폴리케티드의 제조방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 제1 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:9의 523 내지 9966번째 염기와 80 % 내지 100 %의 염기 서열 상동성을 갖는 것인, 폴리케티드의 제조방법.
  10. 제6항에 있어서,
    상기 DiPKS 폴리케티드 신타아제는 DiPKSG1516R 폴리케티드 신타아제를 포함하는 것인, 폴리케티드의 제조방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 제1 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:10의 523 내지 9966번째 염기로 정의되는 리딩 프레임에 의해 코딩된 단백질과 80 % 내지 100 %의 아미노산 잔기 서열 상동성을 갖는 1차 구조를 갖는 DiPKSG1516R 폴리케티드 신타아제 효소에 대한 코딩 서열을 포함하는 것인, 폴리케티드의 제조방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 제1 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:10의 523 내지 9966번째 염기와 80 % 내지 100 %의 염기 서열 상동성을 갖는 것인, 폴리케티드의 제조방법.
  13. 제2항에 있어서,
    상기 DiPKS 폴리케티드 신타아제 효소는 적어도 하나의 폴리케티드의 종의 메틸화를 억제하기 위해 DiPKS 폴리케티드 신타아제 효소의 C-Met 도메인의 활성 부위에서 변이 감소 활성을 포함하여, 수소 R2기 및 수소 R3기를 갖는 적어도 하나의 폴리케티드의 종을 생성하는 것인, 폴리케티드의 제조방법.
  14. 제2항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 효모 세포는 DiPKS의 활성을 증가시키기 위해 포스포판테테이닐 트랜스퍼라아제 효소(phosphopantetheinyl transferase enzyme)를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인, 폴리케티드의 제조방법.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 포스포판테테이닐 트랜스퍼라아제는 아스페르길루스 니둘란스(A. nidulans)로부터 NpgA 포스포판테테이닐 트랜스퍼라아제 효소를 포함하는 것인, 폴리케티드의 제조방법.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 제2 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:8의 1170 내지 2201번째 염기로 정의되는 리딩 프레임에 의해 코딩된 단백질과 80 % 내지 100 %의 아미노산 잔기 서열 상동성을 갖는 1차 구조를 갖는 아스페르길루스 니둘란스(A. nidulans)로부터의 NpgA 포스포판테테이닐 트랜스퍼라아제 효소에 대한 코딩 서열을 포함하는 것인, 폴리케티드의 제조방법.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 제2 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:8의 1170 내지 2201번째 염기와 80 % 내지 100 %의 염기 서열 상동성을 갖는 것인, 폴리케티드의 제조방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리케티드 신타아제 효소는 더 장쇄 케틸-CoA 없이 말로닐-CoA로부터 적어도 하나의 폴리케티드의 종을 합성하기 위한 활성 부위를 포함하는 것인, 폴리케티드의 제조방법.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 폴리케티드의 종은 올리베톨(olivetol), 올리베톨산(olivetolic acid), 메틸-올리베톨, 또는 메틸-올리베톨산 중 적어도 하나를 포함하는 것인, 폴리케티드의 제조방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    R2는 H이고, R3은 H인 것인, 폴리케티드의 제조방법.
  21. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    R2는 카르복실이고, R3은 H인 것인, 폴리케티드의 제조방법.
  22. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    R2는 메틸이고, R3은 H인 것인, 폴리케티드의 제조방법.
  23. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    R2는 카르복실이고, R3은 메틸인 것인, 폴리케티드의 제조방법.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 효모 세포는 이용 가능한 말로닐-CoA를 증가시키기 위한 유전적 변형을 포함하는 것인, 폴리케티드의 제조방법.
  25. 제24항에 있어서,
    상기 유전적 변형은 Maf1의 증가된 발현을 포함하는 것인, 폴리케티드의 제조방법.
  26. 제25항에 있어서,
    상기 효모 세포는 SEQ ID NO:6의 936 내지 2123번째 염기로 정의되는 리딩 프레임에 의해 코딩된 단백질과 80 % 내지 100 %의 아미노산 잔기 서열 상동성을 갖는 1차 구조를 갖는 Maf1에 대한 코딩 서열을 포함하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인, 폴리케티드의 제조방법.
  27. 제26항에 있어서,
    상기 제2 폴리뉴클레오티드는 프로모터 서열, 터미네이터 서열 및 인터그레이션 서열을 더 포함하고, SEQ ID NO:6과 80 % 내지 100 %의 염기 서열 상동성을 갖는 것인, 폴리케티드의 제조방법.
  28. 제24항에 있어서,
    상기 유전적 변형은 알데히드 데하이드로게나아제(aldehyde dehydrogenase) 및 아세틸-CoA 신타아제의 사이토솔릭 발현을 포함하는 것인, 폴리케티드의 제조방법.
  29. 제28항에 있어서,
    상기 효모 세포는 SEQ ID NO:2의 3938 내지 5893번째 염기로 정의되는 리딩 프레임에 의해 코딩된 단백질과 80 % 내지 100 %의 아미노산 잔기 서열 상동성을 갖는 1차 구조를 갖는 살모넬라 엔테리카(S. enterica)로부터의 AcsL641P에 대한 코딩 서열, 및 SEQ ID NO:2의 1494 내지 2999번째 염기로 정의되는 리딩 프레임에 의해 코딩된 단백질과 80 % 내지 100 %의 아미노산 잔기 서열 상동성을 갖는 1차 구조를 갖는 출아형 효모(S. cerevisiae)로부터의 Ald6에 대한 코딩 서열을 포함하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인, 폴리케티드의 제조방법.
  30. 제29항에 있어서,
    상기 제2 폴리뉴클레오티드는 프로모터 서열, 터미네이터 서열 및 인터그레이션 서열을 더 포함하고, SEQ ID NO:2의 51 내지 7114번째 염기와 80 % 내지 100 %의 염기 서열 상동성을 갖는 것인, 폴리케티드의 제조방법.
  31. 제24항에 있어서,
    상기 유전적 변형은 말로닐-CoA 신타아제의 증가된 발현을 포함하는 것인, 폴리케티드의 제조방법.
  32. 제31항에 있어서,
    상기 효모 세포는 출아형 효모(S. cerevisiae)로부터 Acc1S659A ; S1167A에 대한 코딩 서열의 코딩 서열을 포함하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인, 폴리케티드의 제조방법.
  33. 제32항에 있어서,
    상기 제2 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:5의 9 내지 1716번째 염기로 정의되는 리딩 프레임에 의해 코딩된 단백질과 80 % 내지 100 %의 아미노산 잔기 서열 상동성을 갖는 1차 구조를 갖는, Acc1S659A ; S1167A 효소에 대한 코딩 서열을 포함하는 것인, 폴리케티드의 제조방법.
  34. 제33항에 있어서,
    상기 제2 폴리뉴클레오티드는 프로모터 서열, 터미네이터 서열 및 인터그레이션 서열을 더 포함하고, SEQ ID NO:5와 80 % 내지 100 %의 염기 서열 상동성을 갖는 것인, 폴리케티드의 제조방법.
  35. 제24항에 있어서,
    상기 유전적 변형은 스테롤 생합성을 위한 활성화제의 증가된 발현을 포함하는 것인, 폴리케티드의 제조방법.
  36. 제35항에 있어서,
    상기 효모 세포는 SEQ ID NO:7의 975 내지 3701번째 염기로 정의되는 리딩 프레임에 의해 코딩된 단백질과 80 % 내지 100 %의 아미노산 잔기 서열 상동성을 갖는 1차 구조를 갖는, 출아형 효모(S. cerevisiae)로부터의 Upc2E888D에 대한 코딩 서열을 포함하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인, 폴리케티드의 제조방법.
  37. 제36항에 있어서,
    상기 제2 폴리뉴클레오티드는 프로모터 서열, 터미네이터 서열 및 인터그레이션 서열을 더 포함하고, SEQ ID NO:7과 80 % 내지 100 %의 염기 서열 상동성을 갖는 것인, 폴리케티드의 제조방법.
  38. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서,
    효모 세포 배양액으로부터 적어도 하나의 폴리케티드의 종을 추출하는 단계를 더 포함하는, 폴리케티드의 제조방법.
  39. 적어도 하나의 폴리케티드의 종을 제조하기 위한 효모 세포로서,
    상기 효모 세포는 폴리케타이드 신타아제 효소를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인, 효모 세포.
  40. 제39항에 있어서,
    제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 기재된 방법으로 제공되는 효모 세포와 관련하여 청구되는 효모 세포, 제1 폴리뉴클레오티드, 또는 제2 폴리뉴클레오티드 중 하나 이상의 특징들을 더 포함하는, 효모 세포.
  41. 적어도 하나의 폴리케티드의 종의 제조를 위한 효모 세포를 변형하는 방법으로서,
    상기 방법은,
    효모 세포주에 폴리케타이드 신타아제 효소를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드를 도입하는 단계를 포함하는 것인, 효모 세포를 변형하는 방법.
  42. 제41항에 있어서,
    제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 기재된 방법으로 제공되는 효모 세포와 관련하여 청구되는 효모 세포, 제1 폴리뉴클레오티드, 또는 제2 폴리뉴클레오티드 중 하나 이상의 특징들을 더 포함하는, 효모 세포를 변형하는 방법.
  43. 폴리케티드의 제조방법으로서,
    상기 방법은,
    폴리케티드 신타아제 효소(polyketide synthase enzyme)를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드를 포함하는 효모 세포를 제공하는 단계로, 상기 폴리케티드 신타아제 효소는 말로닐-CoA로부터 적어도 하나의 폴리케티드의 종을 생성하기 위한 것이고, 상기 폴리케티드는 하기 화학식 II를 갖는 것이고,
    [화학식 II]
    Figure pct00008

    상기 화학식 II에서, R1은 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 탄소원자의 쇄 길이를 갖는 알킬기이고, R2는 H, 카르복실, 또는 메틸이고, R3은 H, 카르복실, 또는 메틸인, 단계; 및
    효모 세포 배양액을 제공하기 위해 효모 세포를 증식시키는 단계;를 포함하는 것인, 폴리케티드의 제조방법.
  44. 제43항에 있어서,
    제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 기재된 방법으로 제공되는 효모 세포와 관련하여 청구되는 효모 세포, 제1 폴리뉴클레오티드, 또는 제2 폴리뉴클레오티드 중 하나 이상의 특징들을 더 포함하는, 폴리케티드의 제조방법.
  45. DiPKSG1516D ; G1518A 폴리케티드 신타아제에 대한 코딩 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
  46. 제45항에 있어서,
    상기 DiPKSG1516D ; G1518A 폴리케티드 신타아제 효소는 SEQ ID NO:9의 523 내지 9966번째 염기로 정의되는 리딩 프레임에 의해 코딩된 단백질과 80 % 내지 100 %의 아미노산 잔기 서열 상동성을 갖는 1차 구조를 갖는 것인, 폴리뉴클레오티드.
  47. 제46항에 있어서,
    제1 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:9의 523 내지 9966번째 염기와 80 % 내지 100 %의 염기 서열 상동성을 갖는 것인, 폴리뉴클레오티드.
  48. DiPKSG1516R 폴리케티드 신타아제에 대한 코딩 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
  49. 제48항에 있어서,
    상기 DiPKSG1516R 폴리케티드 신타아제 효소는 SEQ ID NO:10의 523 내지 9966번째 염기로 정의되는 리딩 프레임에 의해 코딩된 단백질과 80 % 내지 100 %의 아미노산 잔기 서열 상동성을 갖는 1차 구조를 갖는 것인, 폴리뉴클레오티드.
  50. 제49항에 있어서,
    제1 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:10의 523 내지 9966번째 염기와 80 % 내지 100 %의 염기 서열 상동성을 갖는 것인, 폴리뉴클레오티드.
  51. SEQ ID NO:9의 523 내지 9966번째 염기로 정의되는 리딩 프레임에 의해 코딩된 단백질과 80 % 내지 100 %의 아미노산 잔기 서열 상동성을 갖는 1차 구조를 갖는 DiPKSG1516D ; G1518A 폴리케티드 신타아제.
  52. SEQ ID NO:10의 523 내지 9966번째 염기로 정의되는 리딩 프레임에 의해 코딩된 단백질과 80 % 내지 100 %의 아미노산 잔기 서열 상동성을 갖는 1차 구조를 갖는 DiPKSG1516R 폴리케티드 신타아제.
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