CN110651047A - 用于在酵母中生产植物大麻素和植物大麻素类似物的方法和细胞系 - Google Patents

用于在酵母中生产植物大麻素和植物大麻素类似物的方法和细胞系 Download PDF

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Abstract

用于在酵母中生产植物大麻素和植物大麻素类似物的方法和细胞系。该方法应用，以及该细胞系包括，用聚酮化合物合成酶CDS和胞质异戊烯基转移酶CDS转化的酵母细胞。聚酮化合物合成酶催化橄榄醇或甲基橄榄醇的合成，并且可包括大麻橄榄醇酸合成酶或盘基网柄菌聚酮化合物合成酶(“DiPKS”)。可修饰酵母细胞，以包括磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶，用于增加DiPKS的活性。可修饰酵母细胞，以减轻线粒体乙醛分解代谢，用于增加合成橄榄醇或甲基橄榄醇可用的丙二酰基辅酶A。异戊烯基转移酶催化大麻萜酚或大麻萜酚类似物的合成，并且可包括来自链霉菌属CL190的αββα胞质异戊烯基转移酶。可修饰酵母细胞，以减轻焦磷酸香叶酯的消耗，用于增加用于异戊烯化可用的焦磷酸香叶酯。

Description

用于在酵母中生产植物大麻素和植物大麻素类似物的方法和 细胞系
相关申请的交叉引用
本申请要求于2017年2月17日提交的名称为用于在酵母中生产植物大麻素的方法和细胞系的美国临时专利申请号62/460,526的优先权的权益，该申请在此通过引用以其整体并入。
技术领域
本公开大体上涉及在酵母中生产植物大麻素和植物大麻素的类似物。
背景技术
植物大麻素是在大麻(Cannabis sativa)、其他植物和一些真菌中天然生产的。已知超过105种植物大麻素在大麻中生物合成，或由在大麻中生物合成的植物大麻素的热分解或其他分解得到。虽然大麻植物也是谷物、纤维和其他材料的有价值来源，但是种植用于生产植物大麻素的大麻，特别室内种植，耗费能量和劳动。来自大麻植物的植物大麻素的随后的提取、纯化和分馏也是劳动和能量密集型的。
植物大麻素是有助于大麻的医学和精神治疗作用的药理活性分子。大麻植物中植物大麻素的生物合成与其他农业项目规模类似。与其他农业项目一样，通过种植大麻大规模生产植物大麻素需要各种投入(例如营养物、光、害虫控制、CO2等)。必须提供培育大麻所需的投入。此外，在允许的情况下，在从该植物制备的产品用于商业用途的情况下，大麻的培育目前受到严格的管制、税收和严格的质量控制，进一步增加了成本。植物大麻素类似物是与植物大麻素结构相似的药理活性分子。植物大麻素类似物通常是化学合成的，这可能是劳动密集型的和昂贵的。因此，在强健且可扩展的可发酵生物体中生产植物大麻素和植物大麻素类似物可为经济的。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是已经用于生产工业规模的类似分子的可发酵生物体的例子。
种植用于生产天然存在的植物大麻素的大麻所涉及的时间、能量和劳动提供了制备用于在酵母中生产植物大麻素的转基因细胞系的动机。这种努力的一个例子提供在Poulos和Farnia的美国专利申请公开号US 2016/0010126中。
发明内容
本公开的目的是消除或减轻之前在酵母中生产植物大麻素的方法和之前生产植物大麻素类似物的方法的至少一个缺点。在大麻中发现的105种植物大麻素的许多种可在酵母中合成，并且可期望提高基于酵母的生产。类似地，可期望允许生产植物大麻素类似物而无需劳动密集型的合成的方法。
本文提供的方法和细胞系可应用并包括已经用编码来自天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)(“CL190”)的NphB异戊烯基转移酶(“AltPT”)的基因转化的转基因酿酒酵母。AltPT是αββα(“ABBA”)型异戊烯基转移酶。AltPT催化由橄榄醇酸和焦磷酸香叶酯(“GPP”)合成大麻萜酚酸(“CBGa”)。AltPT还催化由橄榄醇和GPP合成大麻萜酚(“CBG”)。在大麻中，异戊烯基转移酶催化由橄榄醇酸和GPP合成CBGa。大麻异戊烯基转移酶是膜结合的，使得在酿酒酵母中的表达复杂。相反，AltPT是胞质的并且在酿酒酵母中以比大麻异戊烯基转移酶更高的水平表达。当在酿酒酵母中表达以催化由橄榄醇酸和GPP合成CBGa或由橄榄醇和GPP合成CBG时，AltPT可提供优于膜结合的大麻异戊烯基转移酶的优势。酿酒酵母可在Erg20、Maf1或UPC2，或支持耗尽GPP的代谢途径的酶或其他蛋白质的其他基因中具有一个或多个突变，该一个或多个突变用于增加可用的GPP。可选地，可应用其他种类的酵母，包括解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、红冬孢酵母(Rhodosporidiumtoruloides)、弯曲隐球菌(Cryptococcus curvatus)、普鲁兰丝孢酵母(Trichosporonpullulan)和产油油脂酵母(Lipomyces lipoferetc)。
在本文提供的一些方法和细胞系中，转基因酿酒酵母包括大麻聚酮化合物合成酶(也称为橄榄醇酸合成酶或“OAS”)的基因。OAS催化由丙二酰基辅酶A和己酰基辅酶A合成橄榄醇。该反应的丙二酰基辅酶A与己酰基辅酶A与橄榄醇酸的化学计量比为2:1:1。在大麻中，橄榄醇在存在橄榄醇酸环化酶(“OAC”)或另一聚酮化合物环化酶的情况下被羧化成橄榄醇酸，橄榄醇酸被送到上面结合AltPT和其他胞质异戊烯基转移酶描述的通过大麻中的膜结合的异戊烯基转移酶催化的CBGa合成代谢途径中。来自大麻的OAC酶可从转基因酿酒酵母中排除，以促进通过AltPT合成CBG而不是CBGa。
在本文提供的一些方法和细胞系中，转基因酿酒酵母包括盘基网柄菌(Dictyostelium discoideum)聚酮化合物合成酶(“DiPKS”)的基因。DiPKS是由I型脂肪酸合成酶(“FAS”)和聚酮化合物合成酶组成的融合蛋白，并且被称为杂合“FAS-PKS”蛋白。DiPKS催化由丙二酰基辅酶A合成甲基橄榄醇。该反应的丙二酰基辅酶A与甲基橄榄醇的化学计量比为6:1。AltPT催化由甲基橄榄醇合成甲基大麻萜酚(“meCBG”)，类似于上述由橄榄醇合成CBG。己酸对酿酒酵母有毒。当应用OAS时，己酰基辅酶A是用于合成橄榄醇的必要前体。当使用DiPKS生产甲基橄榄醇而不是OAS，以生产橄榄醇或橄榄醇酸时(如果，不需要将己酸添加到生长培养基中。与使用OAS时的CBG产量相比，生长培养基中没有己酸可使得酿酒酵母培养物的生长增加以及meCBG的产量更高。
对于一些应用，meCBG和可由meCBG合成的甲基化的下游植物大麻素类似物(类似于在大麻中由CBGa合成的下游植物大麻素)为有价值的。在其他情况下，可更期望结构上与脱羧形式的天然存在的植物大麻素相同的植物大麻素。为了生产结构上与脱羧形式的天然存在的植物大麻素相同的植物大麻素，可相对于野生型DiPKS而修饰DiPKS以减少橄榄醇的甲基化，使得合成CBG而不是meCBG。酿酒酵母可包括增加DiPKS的活性的辅因子加载酶。
通过增加胞质中丙二酰基辅酶A的水平可促进橄榄醇和甲基橄榄醇的合成。酿酒酵母可具有天然的乙醛脱氢酶的过表达和突变型乙酰基辅酶A合成酶或其他基因的表达，这些突变使得减轻线粒体乙醛分解代谢。通过将乙醛转移至乙酰基辅酶A生产来减少线粒体乙醛分解代谢，增加了合成橄榄醇可用的丙二酰基辅酶A。Acc1是天然的酵母丙二酰基辅酶A合成酶。酿酒酵母可具有Acc1的过表达或Acc1的修饰用于增加的活性和增加的可用的丙二酰基辅酶A。酿酒酵母可包括Maf1的修饰的表达或tRNA生物合成的其他调节剂。已经显示，过表达天然的Maf1减少tRNA生物合成的焦磷酸异戊酯(“IPP”)的损失，从而提高酵母中的单萜产量。IPP是甲羟戊酸途径的中间体。Upc2是酿酒酵母中甾醇生物合成的活化剂，并且Upc2的Glu888Asp突变可增加酵母中的单萜生产。
在第一方面中，本文提供了用于在酵母中生产植物大麻素和植物大麻素类似物的方法和细胞系。该方法应用，并且该细胞系包括，用聚酮化合物合成酶CDS和胞质异戊烯基转移酶CDS转化的酵母细胞。聚酮化合物合成酶催化橄榄醇或甲基橄榄醇的合成，并且可包括大麻橄榄醇酸合成酶或盘基网柄菌聚酮化合物合成酶(“DiPKS”)。可修饰酵母细胞以包括用于增加DiPKS的活性的磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶。可修饰酵母细胞，以减轻线粒体乙醛分解代谢，用于增加可用于合成橄榄醇或甲基橄榄醇的丙二酰基辅酶A。异戊烯基转移酶催化大麻萜酚或大麻萜酚类似物的合成，并且可包括来自链霉菌属CL190的αββα胞质异戊烯基转移酶。可修饰酵母细胞，以减轻焦磷酸香叶酯的消耗，用于增加异戊烯化可用的焦磷酸香叶酯。
在进一步的方面中，本文提供了生产植物大麻素或植物大麻素类似物的方法，该方法包括：提供包括编码聚酮化合物合成酶的第一多核苷酸和编码胞质异戊烯基转移酶的第二多核苷酸的酵母细胞，和使酵母细胞繁殖，用于提供酵母细胞培养物。该聚酮化合物合成酶用于由丙二酰基辅酶A生产至少一种前体化学物质，该前体化学物质具有结构I：
Figure BDA0002234502010000041
在结构I上，R1是链长为1、2、3、4或5个碳的烷基，R2是H、羧基或甲基，并且R3是H、羧基或甲基。该胞质异戊烯基转移酶用于使至少一种前体化学物质异戊烯化，提供至少一个种类的植物大麻素或植物大麻素类似物。
在一些实施方式中，酵母细胞包括编码己酰基合成酶的第三多核苷酸；聚酮化合物合成酶包括来自大麻的OAS酶；并且使酵母细胞繁殖包括使酵母细胞在包括己酸的营养制剂中繁殖。在一些实施方式中，酵母细胞不包括大麻聚酮化合物环化酶，并且至少一个种类的植物大麻素或植物大麻素类似物包括脱羧的植物大麻素或植物大麻素类似物。在一些实施方式中，第一多核苷酸包括来自大麻的OAS酶的编码序列，其中OAS酶的一级结构与由SEQ ID NO:45的碱基3841至4995限定的阅读框编码的蛋白质具有80％和100％之间的氨基酸残基序列同源性。在一些实施方式中，第一多核苷酸与SEQ ID NO:45的碱基3841至4995具有80％和100％之间的碱基序列同源性。在一些实施方式中，第一多核苷酸与SEQ ID NO:45的碱基3841至4995具有80％和100％之间的碱基序列同源性。
在一些实施方式中，R1是链长为3个碳的烷基，R2是H，并且R3是H。
在一些实施方式中，R1是链长为3个碳的烷基，R2是羧基，并且R3是H。
在一些实施方式中，R1是链长为3个碳的烷基，R2是甲基，并且R3是H。
在一些实施方式中，R1是链长为3个碳的烷基，R2是羧基，并且R3是甲基。
在一些实施方式中，聚酮化合物合成酶包括来自盘基网柄菌的DiPKS聚酮化合物合成酶。在一些实施方式中，第一多核苷酸包括用于DiPKS聚酮化合物合成酶的编码序列，其中DiPKS聚酮化合物合成酶的一级结构与由SEQ ID NO:46的碱基535至9978限定的阅读框编码的蛋白质具有80％和100％之间的氨基酸残基序列同源性。在一些实施方式中，第一多核苷酸与SEQ ID NO:46的碱基535至9978具有80％和100％之间的碱基序列同源性。在一些实施方式中，至少一种前体化学物质在R2处包括甲基，并且至少一个种类的植物大麻素或植物大麻素类似物包括甲基化的植物大麻素类似物。在一些实施方式中，DiPKS聚酮化合物合成酶包括影响C-Met结构域的活性位点的突变，用于减轻至少一种前体化学物质的甲基化，使得至少一种前体化学物质包括其中R2是甲基并且R3是H的第一前体化学物质，和其中R2是H并且R3是H的第二前体化学物质；并且至少一个种类的植物大麻素或植物大麻素类似物包括甲基化的植物大麻素类似物和未甲基化的植物大麻素。在一些实施方式中，DiPKS聚酮化合物合成酶包括DiPKSG1516D；G1518A聚酮化合物合成酶。在一些实施方式中，第一多核苷酸包括用于DiPKSG1516D；G1518A聚酮化合物合成酶的编码序列，其中DiPKSG1516D；G1518A聚酮化合物合成酶的一级结构与由SEQ ID NO:37的碱基523至9966限定的阅读框编码的蛋白质具有80％和100％之间的氨基酸残基序列同源性。在一些实施方式中，第一多核苷酸与SEQ ID NO:37的碱基523至9966具有80％和100％之间的碱基序列同源性。在一些实施方式中，DiPKS聚酮化合物合成酶包括DiPKSG1516R聚酮化合物合成酶。在一些实施方式中，第一多核苷酸包括DiPKSG1516R聚酮化合物合成酶的编码序列，该DiPKSG1516R聚酮化合物合成酶的一级结构与由SEQ ID NO:38的碱基523至9966限定的阅读框编码的蛋白质具有80％和100％之间的氨基酸残基序列同源性。在一些实施方式中，第一多核苷酸与SEQ IDNO:38的碱基523至9966具有80％和100％之间的碱基序列同源性。在一些实施方式中，DiPKS聚酮化合物合成酶包括降低在DiPKS聚酮化合物合成酶的C-Met结构域的活性位点处的活性的突变，用于防止至少一种前体化学物质的甲基化，使得至少一种前体化学物质具有氢R2基团和氢R3基团；并且至少一个种类的植物大麻素或植物大麻素类似物包括脱羧的植物大麻素或植物大麻素类似物。在一些实施方式中，酵母细胞包括编码磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的第三多核苷酸，用于增加DiPKS的活性。在一些实施方式中，磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶包括来自构巢曲霉(A.nidulans)的NpgA磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶。在一些实施方式中，第三多核苷酸包括用于来自构巢曲霉的NpgA磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的编码序列，其中NpgA磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的一级结构与由SEQ ID NO:10的碱基1170至2201限定的阅读框编码的蛋白质具有80％和100％之间的氨基酸残基序列同源性。在一些实施方式中，第三多核苷酸与SEQ ID NO:10的碱基1170至2201具有80％和100％之间的碱基序列同源性。
在一些实施方式中，聚酮化合物合成酶包括用于由丙二酰基辅酶A合成至少一种前体化学物质的活性位点，而不需要较长链的羰游基辅酶A。在一些实施方式中，至少一种前体化学物质在R1处包括戊基，并且至少一个种类的植物大麻素或植物大麻素类似物包括戊基植物大麻素或甲基化的戊基植物大麻素类似物。在一些实施方式中，至少一种前体化学物质包括橄榄醇橄榄醇酸、甲基橄榄醇或甲基橄榄醇酸中的至少一种，并且至少一个种类的植物大麻素或植物大麻素类似物包括CBG、CBGa、meCBG或meCBGa中的至少一种。
在一些实施方式中，胞质异戊烯基转移酶包括来自链霉菌属CL190的NphB异戊烯基转移酶。在一些实施方式中，第二多核苷酸包括用于来自链霉菌属CL190的NphB异戊烯基转移酶的编码序列，其中NphB异戊烯基转移酶的一级结构与由SEQ ID NO:44的碱基987至1913限定的阅读框编码的蛋白质具有80％和100％之间的氨基酸残基序列同源性。在一些实施方式中，第二多核苷酸与SEQ ID NO:44的碱基987至1913具有80％和100％之间的碱基序列同源性。
在一些实施方式中，R1是链长为5个碳的烷基，R2是H，并且R3是H。
在一些实施方式中，R1是链长为5个碳的烷基，R2是羧基，并且R3是H。
在一些实施方式中，R1是链长为5个碳的烷基，R2是甲基，并且R3是H。
在一些实施方式中，R1是链长为5个碳的烷基，R2是羧基，并且R3是甲基。
在一些实施方式中，酵母细胞包括增加可用的焦磷酸香叶酯的遗传修饰。在一些实施方式中，遗传修饰包括Erg20酶的失活。在一些实施方式中，酵母细胞包括第三多核苷酸，第三多核苷酸包括用于Erg20K197E的编码序列，其中Erg20K197E的一级结构与由SEQID NO:3限定的阅读框编码的蛋白质具有80％和100％之间的氨基酸残基序列同源性。在一些实施方式中，第三多核苷酸与SEQ ID NO:3具有80％和100％之间的碱基序列同源性。
在一些实施方式中，酵母细胞包括增加可用的丙二酰基辅酶A的遗传修饰。在一些实施方式中，遗传修饰包括Mafl的增加的表达。在一些实施方式中，酵母细胞包括第三多核苷酸，第三多核苷酸包括用于Maf1的编码序列，其中Maf1的一级结构与由SEQ ID NO:8的碱基936至2123限定的阅读框编码的蛋白质具有80％和100％之间的氨基酸残基序列同源性。在一些实施方式中，第三多核苷酸进一步包括启动子序列、终止子序列和整合序列，并且与SEQ ID NO:8具有80％和100％之间的碱基序列同源性。在一些实施方式中，遗传修饰包括用于增加醛脱氢酶和乙酰基辅酶A合成酶的胞质表达的修饰。在一些实施方式中，酵母细胞包括第三多核苷酸，第三多核苷酸包括用于来自肠道沙门氏菌的AcsL641P的编码序列和用于来自酿酒酵母的Ald6的编码序列，其中AcsL641P的一级结构与由SEQ ID NO:4的碱基3938至5893限定的阅读框编码的蛋白质具有80％和100％之间的氨基酸残基序列同源性，并且其中Ald6的一级结构与由SEQ ID NO:4的碱基1494至2999限定的阅读框编码的蛋白质具有80％和100％之间的氨基酸残基序列同源性。在一些实施方式中，第三多核苷酸进一步包括启动子序列、终止子序列和整合序列，并且与SEQ ID NO:4的碱基51至7114具有80％和100％之间的碱基序列同源性。在一些实施方式中，遗传修饰包括用于增加丙二酰基辅酶A合成酶活性的修饰。在一些实施方式中，酵母细胞包括第三多核苷酸，第三多核苷酸包括用于来自酿酒酵母的Acc1S659A；S1167A的编码序列。在一些实施方式中，第三多核苷酸包括用于Acc1S659A；S1167A酶的编码序列，其中Acc1S659A；S1167A酶的一部分的一级结构与由SEQ ID NO:7的碱基9至1716限定的阅读框编码的蛋白质部分具有80％和100％之间的氨基酸残基序列同源性。在一些实施方式中，第三多核苷酸进一步包括启动子序列、终止子序列和整合序列，并且与SEQ ID NO:7具有80％和100％之间的碱基序列同源性。在一些实施方式中，酵母细胞包括第三多核苷酸，第三多核苷酸包括用于由组成型启动子调节的来自酿酒酵母的Acc1的编码序列。在一些实施方式中，组成型启动子包括来自酿酒酵母的PGK1启动子。在一些实施方式中，PGK1启动子与SEQ ID NO:6的碱基7至750具有80％和100％之间的核苷酸同源性。在一些实施方式中，遗传修饰包括用于甾醇生物合成的活化剂的增加的表达。在一些实施方式中，酵母细胞包括第三多核苷酸，第三多核苷酸包括用于来自酿酒酵母的Upc2E888D的编码序列，其中Upc2E888D的一级结构与由SEQ ID NO:9的碱基975至3701限定的阅读框编码的蛋白质具有80％和100％之间的氨基酸残基序列同源性。在一些实施方式中，第三多核苷酸进一步包括启动子序列、终止子序列和整合序列，并且与SEQ ID NO:9具有80％和100％之间的碱基序列同源性。
在一些实施方式中，第二多核苷酸包括用于胞质异戊烯基转移酶的编码序列，其中胞质异戊烯基转移酶的一级结构与下述中的任何一个具有80％和100％之间的氨基酸残基序列同源性：SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ IDNO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ IDNO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ IDNO:34、SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:36。
在一些实施方式中，方法包括从酵母细胞培养物中提取至少一个种类的植物大麻素或植物大麻素类似物。
在进一步的方面中，本文提供了用于生产植物大麻素或植物大麻素类似物的酵母细胞，酵母细胞包括：编码聚酮化合物合成酶的第一多核苷酸；和编码胞质异戊烯基转移酶的第二多核苷酸。
在一些实施方式中，酵母细胞中包括本文所述的酵母细胞、第一多核苷酸或第二多核苷酸中的一个或多个的特征。
在进一步的方面中，本文提供了转化用于生产植物大麻素或植物大麻素类似物的酵母细胞的方法。方法包括：将用于编码聚酮化合物合成酶的第一多核苷酸引入酵母细胞系中；和将用于编码胞质异戊烯基转移酶的第二多核苷酸引入酵母中。
在一些实施方式中，本文所述的酵母细胞、第一多核苷酸或第二多核苷酸中的一个或多个的特征应用于转化酵母细胞中。
在进一步的方面中，本文提供了具有下述结构II的植物大麻素类似物：在结构II上，R1是链长为1、2、3、4或5个碳的烷基。R2是甲基。R3是H、羧基或甲基。
在一些实施方式中，R1具有5个碳的链长并且R3是H。在一些实施方式中，植物大麻素类似物通过酵母中的生物合成生产。
在进一步的方面中，本文提供了具有下述结构III的植物大麻素类似物：
Figure BDA0002234502010000082
在结构III上，R1是戊基；R2是甲基；并且R3是H。
通过结合附图阅读下述具体实施方式的描述时，本公开的其他方面和特征将对于本领域普通技术人员变得显而易见。
附图说明
现在将参考附图仅通过实施例的方式描述本公开的实施方式。
图1是在大麻中橄榄醇酸和具有不同烷基链长度的相关化合物的生物合成的示意图；
图2是在大麻中由己酸、丙二酰基辅酶A和焦磷酸香叶酯生物合成CBGa的示意图；
图3是在大麻中由CBGa生物合成酸形式的下游植物大麻素的示意图；
图4是在转化的酵母细胞中通过OAS和AltPT生物合成CBG的示意图；
图5是在转化的酵母细胞中由CBG生物合成下游植物大麻素的示意图；
图6是在转化的酵母细胞中由DiPKS和AltPT生物合成meCBG的示意图；
图7是在转化的酵母细胞中由meCBG生物合成下游甲基化的植物大麻素类似物的示意图；
图8是在转化的酵母细胞中由meCBG生物合成下游甲基化的植物大麻素类似物的示意图；
图9是DiPKS中的功能结构域的示意图，其具有用于降低橄榄醇的甲基化的C-甲基转移酶的突变；
图10是在转化的酵母细胞中通过DiPKSG1516D；G1518A和AltPT生物合成meCBG和CBG的示意图；
图11是在转化的酵母细胞中通过DiPKSG1516R和AltPT生物合成CBG的示意图；
图12显示了在不同浓度的己酸下酿酒酵母的生长；
图13显示了在引入己酸之前和之后的酿酒酵母生长和橄榄醇生产；
图14显示了在引入己酸之前和之后的酵母生长和CBG生产；
图15显示了在引入己酸之前和之后的酵母生长和酿酒酵母中的己酸消耗；
图16显示了在酿酒酵母中，大麻膜结合的异戊烯基转移酶和AltPT的胞质表达。
图17显示了在酿酒酵母中，用大麻OAS和AltPT生产CBG以及用DiPKS和AltPT生产meCBG；
图18显示了通过DiPKS生产甲基橄榄醇，以及通过DiPKSG1516D；G1518A生产甲基橄榄醇和橄榄醇二者；
图19显示了在两个单独的酿酒酵母菌株中通过DiPKS生产甲基橄榄醇；
图20显示了在两个单独的酿酒酵母菌株中通过DiPKS生产甲基橄榄醇；
图21显示了在两个单独的酿酒酵母菌株中通过AltPT生产meCBG；
图22显示了在两个单独的酿酒酵母菌株中通过DiPKS生产甲基橄榄醇以及通过DiPKSG1516R生产甲基橄榄醇和橄榄醇二者；
图23显示了在三个单独的酿酒酵母菌株中通过DiPKSG1516R生产橄榄醇；和
图24显示了在三个酿酒酵母菌株中通过大麻OAS和AltPT生产CBG，通过DiPKS和AltPT生产meCBG，以及通过DiPKSG1516R和AltPT生产CBG。
具体实施方式
大体上，本公开提供了用于生产在大麻植物中天然生物合成的植物大麻素和由甲基橄榄醇生物合成的甲基化的植物大麻素类似物的方法和酵母细胞系。植物大麻素和植物大麻素类似物在转基因酵母中生产。本文提供的方法和细胞系包括应用大麻植物中不存在的酶的基因。应用在大麻植物中编码在生物合成途径中得至植物大麻素的酶的完整的基因组之外的基因，可提供一种或多种益处，包括在不用投入对于酿酒酵母和其他种类的酵母有毒的己酸的情况下生物合成脱羧的植物大麻素、生物合成甲基化的植物大麻素类似物和生物合成植物大麻素。
如本文所用的修饰语“脱羧的”是指在Δ9-四氢大麻酚(“THC”)的例如第2位或第4位处，或在其他植物大麻素或类似物中与橄榄醇酸(其是大麻中生物合成大麻萜酚酸(“CBGa”)的前体)的4位相对应的等同位置处缺乏酸基的植物大麻素或植物大麻素类似物的形式。在大麻中，酸形式的植物大麻素由橄榄醇酸生物合成。当酸形式的植物大麻素被加热时，植物大麻素的芳环与羧基之间的键断裂。脱羧源自加热大麻中生产的羧化的植物大麻素，其在燃烧或加热至一般高于约110℃的温度期间迅速发生。为简单起见，如本文所用，“脱羧的”是指缺乏酸基的植物大麻素，无论该植物大麻素是包括在真正脱羧期间失去的酸基，还是在没有羧基的情况下被生物合成的。
图1显示了如在大麻中发生的由丙二酰基辅酶A和己酰基辅酶A的聚酮化合物缩合产物生物合成橄榄醇酸。橄榄醇酸是CBGa的代谢前体。如下面进一步详细描述的，CBGa是大量下游植物大麻素的前体。在大多数品种的大麻中，大部分植物大麻素是由橄榄醇酸生物合成的戊基大麻素，而橄榄醇酸由丙二酰基辅酶A和己酰基辅酶A以2:1的化学计量比合成。观察到了一些丙基大麻素，并且经常在广泛使用的三字母缩写中用“v”后缀标识(例如，四氢次大麻酚通常被称为“THCv”，次大麻二酚通常被称为“CBDv”等)。图1还显示了由丙二酰基辅酶A与正丁基辅酶A缩合来生物合成二酚酸(divarinolic acid)，其将提供下游丙基植物大麻素。
图1还显示了由丙二酰基辅酶A与乙酰基辅酶A的缩合来生物合成苔色酸，其可提供下游甲基植物大麻素。在该上下文中，术语“甲基植物大麻素”意思是它们的烷基侧链是甲基，其中大多数植物大麻素在烷基侧链上具有戊基，并且酚酸(varinnic)植物大麻素在烷基侧链上具有丙基。其中meCBG和其他甲基化的植物大麻素类似物被称为“甲基化”的上下文与“甲基植物大麻素”中和图1中“甲基”作为前缀的使用不同并且平行。类似地，由于橄榄醇具有限定长度的侧链(否则其将是图1中所示的另外三个聚酮化合物之一而不是“橄榄醇”)，所以甲基橄榄醇是指环上的甲基化而不是指较短的侧链。
图1还显示了由丙二酰基辅酶A与戊酰基辅酶A的缩合来生物合成2,4-二醇-6-丙基苯甲酸，其将提供下游丁基植物大麻素。
图2显示了在大麻中由己酸、丙二酰基辅酶A和焦磷酸香叶酯(“GPP”)生物合成CBGa，其包括图1中所示的橄榄醇酸生物合成步骤。己酸通过己酰基辅酶A合成酶用辅酶A活化(“Hex1；图2中的反应1)。OAS(也称为橄榄醇酸合成酶，但是合成橄榄醇而不是橄榄醇酸)和OAC一起催化由己酰基辅酶A和丙二酰基辅酶A生产橄榄醇酸(图2中的反应2)。异戊烯基转移酶将橄榄醇酸与GPP组合，提供CBGa(图2中的步骤3)。
图3显示了在大麻中由CBGa生物合成下游酸形式的植物大麻素。CBGa通过THCa合成酶被氧化环化成Δ9-四氢大麻酚酸(“THCa”)。CBGa通过CBDa合成酶氧化环化成大麻二酚酸(“CBDa”)。通过其他合成酶或通过以影响针对所生产的植物大麻素结构的酶活性的方式改变植物细胞中的条件，也在大麻中合成其他植物大麻素，比如大麻色烯酸(“CBCa”)、大麻伊索因酸(cannabielsoinic acid)(“CBEa”)、异-四氢大麻酚酸(“异-THCa”)、大麻环酚酸(“CBLa”)或大麻西川酸(“CBTa”)。这些一般的植物大麻素类型中的每一种的酸形式显示在图3中，其中通用的“R”基团显示烷基侧链，在由己酰基辅酶A和丙二酰基辅酶A合成橄榄醇酸的情况下其将是5碳链。在某些情况下，可替换地在与图3所示的R基团位置相对的环位置上出现羧基(例如，THC的4位而不是图3所示的2位等)。图3所示的脱羧形式的植物大麻素分别为THC、大麻二酚(“CBD”)、大麻色烯(“CBC”)、大麻伊索因(“CBE”)、异-四氢大麻酚(“异-THC”)、大麻环酚(“CBL”)或大麻西川(“CBT”)。
Poulos等人的美国公开号2016/0010126描述了酿酒酵母和马克斯克鲁维酵母中的五种天然的大麻基因的表达。用于生产植物大麻素的来自酵母中天然的大麻途径的基因的表达可能带来缺点。大麻OAS使用己酰基辅酶A作为聚酮化合物底物。己酸对于酿酒酵母和一些其他酵母菌株有毒。此外，由橄榄醇酸合成CBGa需要膜结合的大麻异戊烯基转移酶，其在真菌中的表达较差。
本文提供的用于生产植物大麻素和植物大麻素类似物的方法和酵母细胞可应用和包括用来自链霉菌属CL 190的异戊烯基转移酶NphB的基因转化的酿酒酵母。链霉菌属CL190NphB异戊烯基转移酶为大麻异戊烯基转移酶提供了替代方案，并在下文称为“AltPT”。AltPT是αββα(“ABBA”)型异戊烯基转移酶。AltPT是高度混杂的，接受大部分聚酮化合物作为用于异戊烯化的底物。AltPT针对作为萜类化合物供体的GPP是特异的。AltPT是在链霉菌属CL 190(革兰氏阳性细菌)中表达的胞质酶，相对照，膜结合的异戊烯基转移酶在大麻(植物)中表达。细菌胞质酶在酵母中的表达水平高于植物膜结合成酶。AltPT将橄榄醇酸异戊烯化为CBGa，类似于在大麻中被膜结合的异戊烯基转移酶催化的反应。AltPT还将橄榄醇异戊烯化为大麻萜酚(“CBG”)，或将甲基橄榄醇异戊烯化为甲基大麻萜酚(“meCBG”)。针对酵母密码子优化的AltPT的合成序列在此包括在SEQ ID NO:1中。AltPT的完整编码DNA序列(“CDS”)可在NCBI GenBank在线数据库获得，登录号为NCBI-AB187169。
图4显示了在转基因酵母中用于由己酸、丙二酰基辅酶A和GPP生产CBG的生物合成途径。如图4所示的本文提供的用于生产CBG的酵母菌株可包括用于编码链霉菌属CL190AltPT、大麻Hex1和大麻OAS的基因。这样的酵母菌株的实施例以“HB37”和“HB88”提供，其中的每个描述在表7中。
图5显示了由CBG生物合成下游植物大麻素。CBG被氧化环化成THC、CBD、CBC、CBE、异-THC、CBL或CBT。这些一般的植物大麻素类型中的每一种的脱羧形式显示在图5中，其中通用的“R”基团显示烷基侧链，其在由橄榄醇生物合成的植物大麻素中将是5碳链。
图4显示了通过Hex1由己酸生产己酰基辅酶A。通过Hex1，用辅酶A将己酸活化(图4中的反应1)。OAS催化由己酰基辅酶A和丙二酰基辅酶A生产橄榄醇(图4中的反应2)。AltPT将橄榄醇酸与GPP缩合，提供CBG(图4中的反应3)。
图4中所示的途径包括大麻HEx1和大麻OAS。图4中所示的途径不包括大麻OAC。用于实施图4的途径的转基因酵母细胞将相应地包括用于OAS的基因，但不包括用于大麻OAC的基因。在橄榄醇酸的生物合成期间，大麻OAC将橄榄醇羧化为橄榄醇酸。在存在OAS且不存在OAC或其他聚酮化合物环化酶的情况下，生产橄榄醇而不是在大麻中生产的橄榄醇酸。结果，被AltPT催化的反应得到CBG而不是CBGa。接着，生产植物大麻素的下游反应将相应地生产脱羧种类的植物大麻素，包括
图5中的植物大麻素，而在也存在OAC或另一种聚酮化合物环化酶的情况下(比如在大麻中)，将生产酸形式的植物大麻素，包括图3中的植物大麻素。
在图4的反应2中的由OAS催化的己酰基辅酶A转化为橄榄醇被确认为图4途径中的代谢瓶颈。为了增加图4的反应2的产量，功能性筛选了多种酶，并且确认了一种酶，来自盘基网柄菌的称为“DiPKS”的聚酮化合物合成酶，其可直接由丙二酰基辅酶A生产甲基橄榄醇。针对酵母密码子优化的DiPKS的合成序列在此包括在SEQ ID NO:2中。DiPKS的CDS可在NCBI GenBank在线数据库中获得，登录号为NC_007087.3。
图6显示了在转基因酵母中用于由丙二酰基辅酶A和GPP生产meCBG的生物合成途径。如图6所示的本文提供的用于生产CBG的酵母菌株可包括用于AltPT的基因和用于DiPKS的基因(其支持仅由丙二酰基辅酶A生产聚酮化合物)，在培养基中不需要己酸。DiPKS包括与在脂肪酸合成酶中发现的结构域类似的功能结构域、甲基转移酶结构域和Pks III结构域(见图9)。包括编码野生型DiPKS基因的密码子优化的合成序列的酵母菌株的实施例被提供为“HB84”、“HB90”和“HB105”，其各自描述在表7中。
图6显示了由被DiPKS催化的丙二酰基辅酶A生产甲基橄榄醇(图6中的反应1)。AltPT以GPP作为异戊烯基团供体将甲基橄榄醇异戊烯化，提供meCBG(图6中的反应2)。应用DiPKS而不是OAS，促进了植物大麻素和植物大麻素类似物的生产，而不需要补充己酸。由于己酸对酿酒酵母有毒，因此在CBG或meCBG的生物合成途径中消除己酸的需求可提供相比表达OAS和Hex1的酵母细胞中的CBG的产量更大的CBG或meCBG的产量。
图7和图8显示了对应于甲基-四氢大麻酚(“meTHC”)、甲基-大麻二酚(“meCBD”)、甲基-大麻色烯(“meCBC”)、甲基-大麻伊索因(“meCBE”)、异甲基-四氢大麻酚(“异-meTHC”)、甲基-大麻环酚(“meCBL”)或甲基-大麻西川(“meCBT”)的下游甲基化的植物大麻素类似物，它们分别是THC、CBD、CBC、CBE、异-THC、CBL和CBT的甲基化类似物，当提供甲基橄榄醇而不是橄榄醇酸或橄榄醇作为前体化学物质时可制备它们。这些甲基化的植物大麻素类似物中的每一种的脱羧形式示于图7和图8中，其中通用的“R”基团显示烷基侧链，其在由己酰基辅酶A和丙二酰基辅酶A或只有丙二酰基辅酶A使得合成的情况下是5碳链。
除了meCBD之外，图7和图8中所示的每种下游植物大麻素类似物的结构的一部分包括与芳环键合的旋转受限基团。结果，除了meCBD之外的图7和图8中所示的每种下游植物大麻素类似物可由以两种旋转异构体之一的meCBG合成。取决于合成期间meCBG的旋转异构体，所得环化的甲基化的植物大麻素类似物中的甲基可在针对图7中的meTHC、meCBC、meCBE、异-meTHC、meCBL或meCBT的异构体所示的位置处，或针对图8中的meTHC、meCBC、meCBE、异-meTHC、meCBL或meCBT的异构体所示的位置处。本文参考meTHC、meCBC、meCBE、异-meTHC、meCBL或meCBT包括图7和图8中所示的异构体之一或二者。
DiPKS包括C-甲基转移酶结构域，其在芳环上的4位处使橄榄醇甲基化。结果，AltPT使甲基橄榄醇异戊烯化，得到meCBG，一种植物大麻素类似物，而不是已知在大麻中合成的CBGa。可能生产植物大麻素的任何下游反应当使用CBGa或CBG作为投入时将相应地生产图7和图8所示的甲基化的植物大麻素类似物的脱羧种类，而在大麻中生产未甲基化的酸形式的植物大麻素(如图3中)。如果包括OAC或另一种聚酮化合物环化酶，则甲基橄榄醇可通过OAC或其他聚酮化合物环化酶转化为meCBGa，因为甲基化和羧化碳可在不同的位置上。例如，由meCBG合成的meTHC可在碳4处甲基化，并且可羧化成甲基-四氢大麻酚酸(“meTHCa”)，其中THCa的羧基可在2位。可选地，由meCBG合成的meTHC可在碳2处甲基化，在该情况下，THCa的羧基可在4位。在大麻中观察到的THCa的羧基在2位或4位。
图9是DiPKS的功能结构域的示意图，显示了β-酮酰基-合成酶(“KS”)、酰基转乙酰基酶(“AT”)、脱水酶(“DH”)、C-甲基转移酶(“C-Met”)、烯酰还原酶(“ER”)、酮还原酶(“KR”)和酰基载体蛋白(“ACP”)。“TYPE III”结构域是3型聚酮化合物合成酶。KS、AT、DH、ER、KR和ACP部分提供通常与脂肪酸合成酶相关的功能，显示DiPKS是FAS-PKS蛋白。C-Met结构域为在碳4处甲基化橄榄醇提供催化活性。
图9中划掉了C-Met结构域，示意性地说明了对DiPKS蛋白的修饰，其使C-Met结构域失活并减轻或消除甲基化功能。TYPE III结构域催化迭代的聚酮化合物延伸和从ACP转移到TYPE III结构域的己酸硫酯的环化。
图10显示了在转基因酵母中由丙二酰基辅酶A和GPP生产meCBG和CBG二者的生物合成途径。如图10所示，本文提供的用于生产CBG和meCBG二者的酵母菌株可包括用于AltPT的基因和用于如图9示意性示出的在C-Met结构域处具有降低活性的突变DiPKS的基因。DiPKS蛋白的C-Met结构域包括DiPKS的氨基酸残基1510至1633。C-Met结构域包括三个基序。第一基序包括残基1510至1518。第二基序包括残基1596至1603。第三基序包括残基1623至1633。破坏这三个基序中的一个或多个可使得C-Met结构域处的活性降低。
表达在C-Met结构域中具有降低的活性的修饰的DiPKS的酵母菌株的例子在下面的实施例V中提供为“HB80A”。HB80A包括编码野生型DiPKS蛋白的酵母-密码子优化基因的修饰。HB80A包括DiPKS基因的修饰，使得DiPKS蛋白在C-Met结构域的第一基序中被修饰。由于对DiPKS基因的这些修饰，DiPKS蛋白具有Gly1516Asp和Gly1518Ala的替换。HB80A仅包括DiPKSG1516D；G1518A而不包括AltPT，结果仅催化图10的步骤1A和1B，而不催化反应2A和2B。HB80A生产甲基橄榄醇和橄榄醇。可修饰HB80A菌株以包括AltPT，比如通过用pAltPT质粒转化HB80A(见表6)。
图10显示了由丙二酰基辅酶A生产甲基橄榄醇(图10中的反应1A)和由丙二酰基辅酶A生产橄榄醇(图10中的反应1B)二者。反应1A和1B各自被DiPKSG1516D；G1518A催化。Gly1516Asp和Gly1518Ala替换在C-Met结构域的活性位点中，并且减少了DiPKSG1516D；G1518A对橄榄醇环的4位上的甲基化的催化作用，允许一部分投入的丙二酰基辅酶A根据反应1B而不是反应1A被催化。AltPT，一种混杂的ABBA异戊烯基转移酶，催化甲基橄榄醇与GPP以及橄榄醇与GPP的异戊烯化二者。接着生产meCBG(图10中的反应2A)和CBG(图10中的反应2B)二者。然后，生产其他植物大麻素的任何下游反应将相应地生产甲基化的植物大麻素类似物的混合物和在CBG的芳环上的4位(或下游植物大麻素中的相应位置)处没有官能团的种类，而在大麻中将生产酸形式。
图11显示了在转基因酵母中由丙二酰基辅酶A和GPP仅生产CBG的生物合成途径。如图11所示，本文提供的用于仅生产CBG的酵母菌株可包括用于AltPT的基因和用于如图9中示意性示出的在C-Met结构域处具有降低活性的突变DiPKS基因。
表达在C-Met结构域中基本上没有活性的修饰的DiPKS的酵母菌株的例子在下面的实施例VIII、IX和X中提供为“HB135”、“HB137”、“HB138”和“HB139”。HB135、HB137、HB138和HB139各自包括编码野生型DiPKS蛋白的酵母-密码子优化基因的修饰。HB135、HB137、HB138和HB139各自包括DiPKS基因的修饰，使得DiPKS蛋白在C-Met结构域的第一基序中被修饰。由于这种对DiPKS基因的修饰，DiPKS蛋白具有Gly1516Arg的替换。
DiPKSG1516R催化图11中的反应1。Gly1516Arg替换在C-Met结构域的活性位点上，并且减少DiPKSG1516R对橄榄醇环的4位上的甲基化的催化作用。根据图11的反应1催化投入的丙二酰基辅酶A。HB139还包括AltPT，并且随后生产橄榄醇和CBG(图11中的反应2)。然后，生产其他植物大麻素的任何下游反应将相应地生产在CBG的芳环上的4位或下游植物大麻素中的相应位置上没有官能团的植物大麻素种类，而在大麻中将生产酸形式。
增加生物合成前体的可用性
图4、6、10和11中显示的生物合成途径各自需要丙二酰基辅酶A和GPP以分别生产CBGa、CBG或meCBG。除了引入聚酮化合物合成酶(比如OAS或DiPKS)，并且除了引入胞质异戊烯基转移酶(比如AltPT)以外，可使酵母细胞突变，可引入来自其他种类的基因，可上调或下调基因，或以其他方式对酵母细胞进行基因修饰，来增加丙二酰基辅酶A、GPP或支持图4、6、10和11中任一个的生物合成途径所需的其他投入代谢物的可用性。
可修饰酵母细胞，以增加可用的GPP。酿酒酵母可在Erg20或其他支持消耗GPP的代谢途径的酶的基因中具有一个或多个其他突变。Erg20催化酵母细胞中的GPP生产。Erg20还向GPP添加一个3-异戊基焦磷酸(“IPP”)的亚单元，得到焦磷酸法呢基酯(“FPP”)，一种用于下游倍半萜和甾醇生物合成的代谢物。已经证实了Erg20中的一些突变减少GPP转化成FPP，增加细胞中可用的GPP。Erg20中的替换突变Lys197Glu降低了Erg20将GPP转化成FPP。如下表4中所示，所有修饰碱基的菌株表达Erg20K197E突变蛋白(“HB42”、“HB82”、“HB100”、“HB106”和“HB110”)。类似地，基于HB42、HB82、HB100、HB106或HB110中的任一个的每个修饰的酵母菌株包括编码整合至酵母基因组中的Erg20K197E突变体的整合多核苷酸。SEQ ID NO:3是编码Erg20K197E蛋白的CDS和用于同源重组的侧翼序列。
可修饰酵母菌株用于增加可用的丙二酰基辅酶A。降低的线粒体乙醛分解代谢使得乙醛从乙醇分解代谢转向乙酰基辅酶A生产，这进而驱动丙二酰基辅酶A和下游聚酮化合物和萜类化合物的生产。可修饰酿酒酵母以表达来自肠道沙门氏菌(Salmonellaenterica)的在残基641处具有亮氨酸至脯氨酸的替换修饰的乙酰基辅酶A合成酶(“AcsL641P”)和来自酿酒酵母的醛脱氢酶6(“Ald6”)。Leu641 Pro突变去除了Acs的下游调节，与野生型Acs相比，AcsL641P突变体具有更高的活性。这两种酶的胞质表达一起增加了胞质中乙酰基辅酶A的浓度。胞质中较大的乙酰基辅酶A浓度使得线粒体分解代谢降低，绕过线粒体丙酮酸脱氢酶(“PDH”)，提供PDH旁路。结果，更多的乙酰基辅酶A可用于丙二酰基辅酶A生产。SEQ ID NO:4是基于pGREG质粒的质粒，并且其包括编码Ald6和SeAcsL641P的基因的DNA序列、启动子、终止子和整合位点同源序列，该整合位点同源序列用于通过重组应用规律成簇的间隔短回文重复序列(“CRISPR”)整合至酿酒酵母基因组中的Flagfeldt-位点19处。如下表4所示(术语“PDH旁路”)，基础菌株HB82、HB100、HB106和HB110具有在TDH3启动子下编码Ald6的SEQ ID NO:4的从碱基1494至2999的一部分，以及在Tef1P启动子下编码SeAcsL641P的SEQ ID NO:4的从基因3948至5893的一部分。类似地，基于HB82、HB100、HB106或HB110中的任一个的每个修饰的酵母菌株包括编码Ald6和SeAcsL641P的多核苷酸。
用来增加胞质丙二酰基辅酶A的另一种方法是上调Acc1，Acc1是天然的酵母丙二酰基辅酶A合成酶。Acc1基因的启动子序列被PGK1基因的组成型酵母启动子替换。来自PGK1基因的启动子允许Acc1的多个拷贝存在于细胞中。天然的Acc1启动子一次仅允许蛋白质的单个拷贝存在于细胞中。天然的启动子区域显示在SEQ ID NO:5中。修饰的启动子区域显示在SEQ ID NO:6中。
除了上调Acc1的表达之外，酿酒酵母还可包括一个或多个Acc1的修饰，以增加Acc1活性和胞质乙酰基辅酶A浓度。在文献中确认了调节序列中的两个突变，其消除了Acc1的抑制，使得更高的Acc1表达和更高的丙二酰基辅酶A生产。SEQ ID NO:7是可用于通过同源重组来修饰酿酒酵母基因组的天然的Acc1基因的多核苷酸。SEQ ID NO:7包括用于具有Ser659Ala和Ser1167Ala修饰的Acc1基因的编码序列的一部分。结果，用该序列转化的酿酒酵母将表达Acc1S659A；S1167A。例如，通过在任何合适的位点将序列与Tef1启动子、具有Ser659Ala和Ser1167Ala修饰的Acc1和Prm9终止子整合，可实现类似的结果。最终结果将是Tef1、Acc1S659A；S1167A和Prm9的侧翼是用于促进整合至酿酒酵母基因组中的基因组DNA序列。这是在Flagfeldt位点18处尝试的，但是由于构建体的大小，接下来改为上述用SEQ ID NO:7的方法。
酿酒酵母可包括Maf1或其他tRNA生物合成调节剂的修饰表达。已经显示，过表达天然的Maf1可减少IPP对于tRNA生物合成的损失，从而提高酵母中的单萜产量。IPP是甲羟戊酸途径的中间体。SEQ ID NO:8是整合至酿酒酵母基因组中Maf1位点5处的多核苷酸，其用于在Tef1启动子下Maf1的基因组整合。SEQ ID NO:8包括Tef1启动子、天然的Maf1基因和Prm9终止子。Tef1、Maf1和Prm9一起的侧翼是用于促进整合至酿酒酵母基因组中的基因组DNA序列。如下表4所示，基础菌株HB100、HB106和HB110在Tefl启动子下表达Mafl。类似地，基于HB100、HB106或HB110中的任一个的每个修饰的酵母菌株包括含有在Tef1启动子下Maf1的编码序列的多核苷酸。
Upc2是用于酿酒酵母中甾醇生物合成的活化剂。Upc2的Glu888Asp突变增加了酵母中单萜的生产。SEQ ID NO:9是可整合至基因组中以提供在Tef1启动子下表达Upc2E888D的多核苷酸。SEQ ID NO:9包括Tef1启动子、Upc2E888D基因和Prm9终止子。Tef1、Upc2E888D和Prm9一起的侧翼是用于促进整合至酿酒酵母基因组中的基因组DNA序列。
上述基因，Erg20K197E、AcsL641P、Ald6、Maf1、Acc1S659A；S1167A或Upc2E888D，中的任一个可从质粒表达或整合至酿酒酵母的基因组中。基因组整合可通过同源重组，包括CRISPR重组，或任何合适的方法。可类似地通过重组修饰Acc1的启动子。SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9中的每一个中的编码序列和调节序列可包括在质粒中用于表达(例如pYES等)或包括在线性多核苷酸中用于整合至酿酒酵母基因组中。基础菌株HB42、HB82、HB100、HB106或HB110中的每一个包括一个或多个整合的SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:10(见下文)。可通过类似方法应用SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9的整合。
增加的DiPKS功能
如图9所示，DiPKS包括ACP结构域。DiPKS的ACP结构域需要磷酸泛酰巯基乙胺基团作为辅因子。NpgA是来自构巢曲霉(Aspergillus nidulans)的4’-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶。可将用于酿酒酵母的密码子优化的NpgA的拷贝引入酿酒酵母中并转化至酿酒酵母中，包括通过同源重组。将NpgA基因盒整合至酿酒酵母的基因组中的Flagfeldt位点14处以产生菌株HB100。整合的DNA的序列显示在SEQ ID NO:10中，并且包括Tef1启动子、NpgA编码序列和Prm9终止子。Tef1p、NpgA和Prm9t的侧翼是促进整合至酿酒酵母基因组中的Flagfeldt位点14中的基因组DNA序列。如下表4所示，基础菌株HB100、HB106和HB110包括该整合的盒。可选地，SEQ ID NO:10的碱基636至2782可包括在表达质粒上，如菌株HB98中那样。
NpgA的表达提供了构巢曲霉磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶，用于将磷酸泛酰巯基乙胺基团加载到DiPKS的ACP结构域上的更大催化作用。结果，由DiPKS催化的反应(图6中的反应1)可以以更大的速率发生，提供更大量的甲基橄榄醇用于异戊烯化为meCBG。
其他异戊烯基转移酶
基于DELTA BLAST检索ABBA异戊烯基转移酶结构来限定NphB变体。通过查找适合于GPP而非IPP、二甲基烯丙基焦磷酸或其他异戊烯基的结合口袋来重新限定该列表。SEQID NO:12至SEQ ID NO:33提供了位于DELTA BLAST检索中的来自真菌和细菌的胞质异戊烯基转移酶的一级结构氨基酸残基序列。还进行了大麻基因组的DELTA BLAST检索，并且膜结合的异戊烯基转移酶位于这些检索中。一些大麻膜结合的异戊烯基转移酶在一些酵母种类中表达较差，而不会被引入本文提供的制备植物大麻素或植物大麻素类似物的酵母菌株中。
SEQ ID NO:33至SEQ ID NO:36提供了位于手工文献检索中的来自真菌和细菌的胞质异戊烯基转移酶的一级结构氨基酸残基序列。SEQ ID NO:33至SEQ ID NO:36分别是名为FNQ26、FNQ28、FUR7和NAPT9的胞质异戊烯基转移酶的一级结构氨基酸残基序列。
SEQ ID NO:11至SEQ ID NO:36中的任一个可作为胞质异戊烯基转移酶应用于本文所述的酵母菌株。这些异戊烯基转移酶中的每一个总结在表1中。
Figure BDA0002234502010000191
Figure BDA0002234502010000201
表1：异戊烯基转移酶
DiPKS的修饰
可修饰DiPKS以降低或消除C-Met的活性。
SEQ ID NO:37是针对酵母密码子优化的DIPKS的合成序列的修饰形式，其中DiPKS包括Gly1516Asp替换和Gly1518Ala替换，其共同破坏C-met结构域的活性。下述关于包括菌株HB80A的实施例IV提供了酿酒酵母培养物中DiPKSG1516D，G1518A表达的结果。可将其他修饰引入DiPKS中以破坏或消除C-Met的全部活性位点或所有C-Met。如针对野生型DiPKS所描述的，可将这些修饰的DiPKS酶中的每一个引入酿酒酵母中。
SEQ ID NO:38是针对酵母密码子优化的DIPKS的合成序列的修饰形式，其中DiPKS包括破坏C-met结构域活性的Gly1516Arg替换。下述结合包括菌株HB135的实施例VIII和包括菌株HB135、HB137和HB138的实施例IX提供酿酒酵母培养物中DiPKSG1516R表达的结果。
除了具体地DiPKSG1516D，G1518A和DiPKSG1516R外，还将其他修饰引入DiPKS中以破坏或消除C-Met的全部活性位点或所有C-Met：(a)用GGGSGGGSG替换基序1，(b)基序1中的Gly1516Arg替换和用GGGSGGGS替换基序2，(c)Glu1634Ala，其恰好在基序3的外部并破坏C-Met结构域中活性位点处的三级结构，和(d)通过His1608Gln替换破坏C-Met结构域中的活性位点。将针对(a)至(d)中每一个的密码子优化序列引入酵母中的表达质粒上，类似于表达DiPKSG1516D，G1518A和DiPKSG1516R，引入基础菌株HB100中。在每种情况下，未观察到橄榄醇的生产。用GGGSGGGS替换基序1或基序2也消除了甲基橄榄醇的生产。在一个实施例批次中，表达DiPKSG1634A突变体的酵母的培养物每1培养物提供2.67mg甲基橄榄醇。在一个实施例批次中，表达DiPKSH1608N突变体的酵母的培养物每1培养物提供3.19mg甲基橄榄醇。
转化和生长酵母细胞
根据本说明书进行的方法和制备的酵母细胞的具体实施例的细节在下面作为实施例I至实施例X提供。这10个具体实施例中的每一个应用了类似的方法来构建质粒，转化酵母，定量菌株生长，和定量细胞内代谢物。下述描述10个实施例中的这些共同特征，随后是与10个实施例中的一个或多个相关的结果和其他细节。
质粒构建
被组装用来应用和制备本文提供的方法和酵母细胞的实施例的质粒显示在表2中。在表2中，对于表达质粒pYES和pYES2，SEQ ID NO 39和40分别在没有表达盒的情况下提供整个质粒。可包括SEQ ID NO:10、37、38和41至47的表达盒以制备表2中所示的质粒。SEQID NO:4是pGREG质粒，包括PDH旁路基因的盒。
Figure BDA0002234502010000211
表2：用于制备酵母菌株的质粒和盒
使用Eppendorf Mastercycler ep Gradient 5341根据制造商推荐的方案，用来自Operon Eurofins和Phusion HF聚合酶(ThermoFisheRF-530S)的引物通过聚合酶链反应(“PCR”)扩增用于引入酿酒酵母中的质粒。
在酿酒酵母中使用重叠DNA部分和转化辅助重组来组装所有质粒。使用如Gietz，R.D.和Schiestl，R.H.，“High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SScarrier DNA/PEG method.”Nat.Protoc.2，31–34(2007)所述的乙酸锂热激法将质粒转化至酿酒酵母中。用于组装质粒的基础酵母菌株如表3所示：
菌株 背景 修饰 注释
HB24 -LEU 无 用于组装质粒的具有亮氨酸营养缺陷型的未修饰的酵母
HB25 -URA 无 用于组装质粒的具有尿嘧啶营养缺陷型的未修饰的酵母
表3：基础酵母菌株
将pAltPT质粒组装在HB24亮氨酸营养缺陷型中。将pNPGA、pDiPKSm1、pDiPKSm2、pGFP、pPTGFP、pAPTGFP、pH1OAS、pDiPKS、pCRISPR和pPDH质粒组装在HB25尿嘧啶营养缺陷型中。在琼脂培养皿上通过营养缺陷选择来选择转化的酿酒酵母细胞。从培养皿中回收的菌落在液体选择性培养基中于30℃下生长16小时，同时在250RPM下振荡。
在液体选择性培养基中生长后，收集转化的酿酒酵母细胞并提取质粒DNA。将提取的质粒DNA转化至大肠杆菌(Escherichia coli)中。通过在包括氨苄青霉素的琼脂培养皿上生长来选择转化的大肠杆菌。培养大肠杆菌以扩增质粒。提取在大肠杆菌中生长的质粒并用Sanger双脱氧测序进行测序以验证精确的构建。然后将序列验证的质粒用于基因组修饰或酿酒酵母的稳定转化。
酿酒酵母的基因组修饰
本文所述的酿酒酵母菌株可通过质粒的稳定转化或基因组修饰来制备。基因组修饰可通过同源重组来实现，包括通过利用CRISPR的方法。
采用应用CRISPR的方法来从酿酒酵母基因组中删除DNA并将异源DNA引入至酿酒酵母基因组中。用Benchling在线DNA编辑软件设计用于将Cas9核酸内切酶靶向至酿酒酵母基因组上期望位置的引导RNA(“gRNA”)序列。应用通过重叠延伸(“SOEing”)和PCR进行的DNA剪接来组装gRNA序列并扩增包括功能性gRNA盒的DNA序列。
将功能性gRNA盒、表达Cas9的基因盒和pYes2(URA)质粒组装至pCRISPR质粒中并转化至酿酒酵母中，用于促进靶向DNA双链切割。通过添加靶向DNA的线性片段修复所得的DNA切割。
通过同源重组将SEQ ID NO:3中所示的Erg20K197E蛋白的CDS整合至HB13的基因组中，得到HB42基础菌株。
通过CRISPR将SEQ ID NO:4的碱基51至7114整合至HB42菌株中，以提供在酿酒酵母中具有PDH旁路基因的HB82基础菌株。在酿酒酵母中组装后，对pPDH质粒进行序列验证。序列验证的pPDH质粒在大肠杆菌中生长，纯化，并用BciV1限制酶消化。如表2中，通过BciV1消化提供了包括Ald6和SeAcsL641P的基因、启动子、终止子和整合位点同源序列的多核苷酸，该整合位点同源序列用于整合至酿酒酵母基因组中的Cas9旁边的PDH-位点19处。通过凝胶分离纯化得到的线性PDH旁路供体多核苷酸，如SEQ ID NO:4的碱基51至7114所示。
在两个PDH旁路基因(Ald6和AcsL641P)在单个PDH旁路多核苷酸上的情况下，将PDH旁路供体多核苷酸共转化至具有pCRISPR的酿酒酵母中。通过Gietz所述的乙酸锂热激法进行转化。pCRISPR质粒表达Cas9，其通过gRNA分子靶向至酿酒酵母基因组的选定位置。在该位置处，Cas9蛋白造成DNA中的双链断裂。PDH旁路供体多核苷酸用作CRISPR反应中的供体多核苷酸。包括Ald6、AcsL641P、启动子和终止子的PDH旁路供体多核苷酸通过同源重组整合至基因组中的断裂位点，位点19，得到菌株HB82。
制备并扩增SEQ ID NO:10中所示的NpgA供体多核苷酸。使用DNA SOEing来从3个多核苷酸产生单个供体DNA片段用于NpgA整合。第一多核苷酸是基因组同源性的5'区域，其允许供体重组至基因组中的特定基因座处。第二多核苷酸编码NpgA基因盒。NpgA基因盒包括Tef1启动子、NpgA编码序列和Prm9终止子。第三多核苷酸包括基因组同源性的3’区域，以促进靶向整合至酿酒酵母基因组中。
将NpgA供体多核苷酸与pCRISPR质粒共转化至菌株HB82中。表达pCRISPR质粒，并通过gRNA分子将核酸内切酶Cas9靶向至酿酒酵母基因组上的位置。在该位置处，Cas9蛋白产生DNA中的双链断裂，并且通过同源重组将NpgA供体多核苷酸整合至基因组中的断裂处，以提供HB100基础菌株。
制备并扩增SEQ ID NO:8中所示的Maf1供体多核苷酸。使用DNA SOEing来从3个多核苷酸产生单个供体DNA片段，用于Maf1整合。第一多核苷酸是基因组同源性的5’区域，其允许供体重组至基因组中的特定基因座处。第二多核苷酸编码Maf1基因盒。Maf1基因盒包括Tef1启动子、Maf1编码序列和Prm9终止子。第三多核苷酸包括基因组同源性的3’区域，以促进靶向整合至酿酒酵母基因组中。
将Maf1供体多核苷酸与pCRISPR质粒共转化至菌株HB100中。可表达pCRISPR质粒，并通过gRNA分子将核酸内切酶Cas9靶向至酿酒酵母基因组上的位置。在该位置处，Cas9蛋白可产生DNA中的双链断裂，并且可通过同源重组将Maf1供体多核苷酸整合至基因组中的断裂处。Maf1供体多核苷酸的稳定转化至HB100菌株中提供了HB106基础菌株。
制备并扩增SEQ ID NO:6中所示的Acc1-PGK1p供体多核苷酸。使用DNA SOEing来从3个多核苷酸产生单个供体DNA片段，用于Acc1-PGK1整合。第一多核苷酸是基因组同源性的5’区域，其允许供体重组至基因组中的特定基因座处。第二多核苷酸编码PGK1启动子区域。第三多核苷酸包括基因组同源性的3’区域，以促进靶向整合至酿酒酵母基因组中。
将Acc1-PGK1供体多核苷酸与pCRISPR质粒共转化。表达pCRISPR质粒，并通过gRNA分子将核酸内切酶Cas9靶向至酿酒酵母基因组上的位置。在该位置处，Cas9蛋白产生DNA中的双链断裂，并且通过同源重组将Acc1-PGK1供体多核苷酸整合至基因组中的断裂处。供体多核苷酸的稳定转化至HB100菌株提供了具有由PGK1启动子调节的Acc1的HB110基础菌株。
表4提供了通过酿酒酵母的基因组修饰制备的基础菌株的总结。表4中所示的每个基础菌株是亮氨酸和尿嘧啶营养缺陷型，并且它们都不包括质粒。
Figure BDA0002234502010000251
表4：用于确认蛋白质表达和植物大麻素生产制备的碱基转化菌株
用于菌株构建的稳定转化
使用如Gietz所述的乙酸锂热激法将质粒转化至酿酒酵母中。
如下表5中所示，通过将表2中的质粒引入HB25中，由HB25基础菌株制备转基因酿酒酵母菌株HB1、HB6和HB7。菌株HB1、HB6和HB7用于比较酿酒酵母中大麻异戊烯基转移酶和AltPT的蛋白质表达水平。
菌株 基础菌株 质粒
HB1 HB25 pGFP
HB6 HB25 pPTGFP
HB7 HB25 pAPTGFP
HB13 HB25 pEV
表5：用于确认蛋白质表达和植物大麻素生产而制备的包括表达质粒的转化酵母菌株
如下表6所示，通过用表达质粒转化HB42，由HB42、HB100、HB106和HB110基础菌株制备转基因酿酒酵母HB80、HB80A、HB98、HB102、HB135、HB137和HB138，并且通过转化HB80制备HB80A。HB80、HB98和HB102各自包括和表达DiPKS。HB80A包括和表达DiPKSG1516D；G1518A。HB135、HB137和HB138各自包括和表达DiPKSG1516R。HB98包括和表达来自质粒的DiPKS和NPGa。
表6：包括表达聚酮化合物合成酶的质粒的菌株
通过用下表7中所示的表达质粒转化基础菌株，由表7中所示的基础菌株制备转基因酿酒酵母HB37、HB84、HB88、HB90、HB105和HB130。HB37和HB88各自包括和表达AltPT和OAS。HB80、HB90和HB105各自包括和表达AltPT和DiPKS。HB139包括和表达AltPT和DiPKSG1516R。
菌株 基础菌株 质粒1 质粒2
HB37 HB42 pAltPT pH1OAS
HB84 HB42 pAltPT pDiPKS
HB88 HB82 pAltPT pH1OAS
HB90 HB82 pAltPT pDiPKS
HB105 HB100 pAltPT pDIPKS
HB139 HB106 pAltPT pDIPKSm2
表7：包括表达胞质异戊烯基转移酶的质粒的菌株
酵母生长和饲养条件
用选择性培养基在过夜培养物中生长酵母培养物以提供起始培养物。然后将得到的起始培养物用于接种一式三份50ml培养物至光密度为在600nm处的吸收率(“A600”)为0.1。表6显示了用于生长每种菌株的培养基的细节。
菌株 生长培养基
HB13-HA YNB+2％葡萄糖+1.6g/L 4DO*+0.5mM己酸
HB13-No YNB+2％棉子糖+2％半乳糖+1.6g/L 4DO*
HB37-HA YNB+2％葡萄糖+1.6g/L 4DO*+0.5mM己酸
HB84-No YNB+2％棉子糖+2％半乳糖+1.6g/L 4DO*
表8：用于酵母的生长培养基
在表8中，“4DO*”指缺乏亮氨酸和尿嘧啶的酵母合成缺失培养基补充剂。就菌株HB13而言，“HB13-HΑ”指在存在0.5mM己酸的情况下生长的HB13，并且“HB13-No”指在不存在己酸的情况下生长的HB13。在表8中，“YNB”是包括表9的前两列中列出的化学物质的营养肉汤。表9的第3和第4列中列出的化学物质包括在4DO*补充剂中。
Figure BDA0002234502010000271
Figure BDA0002234502010000281
表9：YNB营养肉汤和4DO*补充剂
代谢物的定量
使用甲醇提取从酿酒酵母细胞中提取细胞内代谢物。将1mL液体培养物以12,000×g离心3分钟。将250μl所得上清液用于细胞外代谢物定量。将得到的细胞团块悬浮于200μl的-40℃80％甲醇中。使混合物起旋涡并在冰上冷却10分钟。在冰上冷却10分钟后，将混合物在15,000×g，4℃下旋转14分钟。收集所得上清液。将另外200μl的-40℃80％甲醇加入至细胞碎片团块中，并且使混合物起旋涡并在冰上冷却10分钟。在冰上冷却10分钟后，将混合物在15,000×g，4℃下离心14分钟。将得到的200μl上清液加入到之前收集的200μl上清液中，提供总共400μl的80％甲醇和细胞内代谢物。
使用高效液相色谱(“HPLC”)和质谱(“MS”)方法定量细胞内代谢物。使用连接至ThermoFinnigan LTQ质谱仪的Agilent 1260自动进样器和HPLC系统。HPLC系统包括ZorbaxEclipseC18 2.1μm×5.6mm×100mm柱。
使用自动进样器将代谢物注入至10μl样品中，并在HPLC上使用1ml/min的流速分离。HPLC分离方案总共20分钟，其中(a)0-2分钟，98％溶剂A和2％溶剂B；(b)2-15分钟，达到98％溶剂B；(c)15-16.5分钟处于98％溶剂B；(d)16.5-17.5分钟达到98％A；和(e)在98％溶剂A下最终平衡2.5分钟。溶剂A是MS水中的乙腈+0.1％甲酸，并且溶剂B是MS水中的0.1％甲酸。
HPLC分离后，通过电喷雾电离将样品注入至质谱仪中并以正模式分析。毛细管温度保持在380℃。管透镜电压为30V，毛细管电压为0V，并且喷射电压为5kV。在HPLC-MS/MS后，CBG分析为母离子在317.2处且子离子在193.1处，而meCBG分析为母离子为331.2。类似地，在HPLC-MS/MS后，橄榄醇分析为母离子在181.2处且子离子在111处，而甲基橄榄醇分析为母离子在193.2处且子离子在125处。
注入不同浓度的已知标准品以产生线性标准曲线。CBG和meCBG的标准品购自Toronto Research Chemicals。meCBG是根据要求定制的，因为Toronto ResearchChemicals在被要求该标准品之前没有合成过该化学物质。橄榄醇和甲基橄榄醇标准品购自Sigma Aldrich。
己酸对酿酒酵母生长的影响
编码己酸生物合成所需的酶的基因未引入酿酒酵母中。而是，在包括OAS基因的酵母细胞，比如HB37中，将己酸包括在生长培养基中。
图12显示了己酸补充对酿酒酵母生长的影响。HB13在YNB+2％葡萄糖+1.6g/L4DO*+0.5mM己酸中培养。在培养36小时时加入己酸。分别以0、0.5、1.0和3.0mM的浓度将己酸加入到培养样品中。己酸对酿酒酵母有毒。在存在己酸的情况下观察到了生长减少。酿酒酵母生长减少的程度对应于生长培养基中己酸的浓度。培养物悬浮液的A600值定量了生长速率，其在图12中显示为0、0.5、1.0和3.0mM的己酸浓度。
在存在0.5mM己酸的情况下，HB13和HB37生长96小时，其中在24小时、36小时、48小时、60小时、72小时、84小时和96小时的点取样。在不存在己酸的情况下，生长HB13和HB84，并且在72小时采取单个时间点。在两个实验中都使用HB13作为对照。上面结合表8和9描述了生长培养基。
时间点 HB13-HA HB13-No HB37-HA HB84-No
24小时 5.33 (无数据) 3.33 (无数据)
36小时 5.80 (无数据) 3.43 (无数据)
48小时 4.67 (无数据) 3.33 (无数据)
60小时 6.07 (无数据) 3.53 (无数据)
72小时 8.96 10.7 4.48 6.9
84小时 7.23 (无数据) 4.13 (无数据)
96小时 8.28 (无数据) 4.33 (无数据)
表10：HB13和HB37(0.5mM己酸)和HB13和HB84(无己酸)生长
如表10中所示，HB84生长快于HB37。此外，HB84不需要己酸来生产meCBG，而HB37需要己酸来生产CBG。类似地，与存在0.5mM己酸相比，HB13在不存在己酸的情况下在72小时显示出更好的生长，与图12中显示的数据一致。
图13至15各自显示表10中列出的HB37培养物的A600值(具有三角形数据点的虚线)。另外，图13至15中的每一个显示具有圆形数据点的实线的另一数据系列。
图13以具有圆形数据点的实线显示了橄榄醇产量(μg橄榄醇/L培养基)。
图14以具有圆形数据点的实线显示了CBG产量(μgCBG/L培养基)。
图15以具有圆形数据点的实线显示了培养物中存在的己酸(mg己酸/L培养基)。
图13至15一起与在50和60小时之间发生的二次转变(dioxic shift)一致。二次转变包括从葡萄糖分解代谢到乙酸和乙醇分解代谢的代谢转变。利用二次转变，许多次级代谢途径变得更加活跃，并且AltPT和OAS活性类似地增加。
图12至15和表10显示了与下述一致的数据：通过消耗己酸生产植物大麻素似乎没有在很大程度上减轻己酸毒性，直到在50和60小时之间己酸水平下降，然后继续下降。如图12和13中所示，从引入己酸开始生产橄榄醇和CBG。然而，当生产CBG并且己酸转化为橄榄醇时，培养物的A600随着橄榄醇和CBG的生产没有大幅度增加。如图15所示，仅在50和60小时之间己酸开始耗尽之后A600才增加。耗尽至少部分由于橄榄醇生产。然而，在36小时引入己酸后生产橄榄醇和CBG期间没有观察到培养物A600显著增加，直至己酸浓度耗尽。
胞质和膜结合的异戊烯基转移酶的表达
大麻异戊烯基转移酶是膜结合植物蛋白，而AltPT是胞质细菌蛋白。在酿酒酵母中应用AltPT而不是大麻异戊烯基转移酶在酵母细胞中提供更高的蛋白质表达水平。表5中所示的HB1、HB6、HB7和HB13各自在YNB、2％葡萄糖和1.6g/L 4DO*中生长过夜。在生长过夜后，将所得培养物归一化至1.0A600，然后在YNB、2％葡萄糖和1.6g/L 4DO*中生长4小时。使用BDAcuri C6流式细胞仪测量每个培养物悬浮液的荧光。
HB1表达绿色荧光蛋白(“GFP”)。HB6和HB7各自表达GFP-异戊烯基转移酶融合蛋白。HB6和HB7都不包括来自pDiPKS或pH1OAS质粒的基因。相应地，HB6和HB7都不表达聚酮化合物合成酶基因或都不包括实现图4、6或9中任何一个中的生物合成途径的所有酶。
图16显示了来自HB13(“阴性”)、HB1(“阳性”)、HB6(“异戊烯基转移酶_大麻”)和HB7(“异戊烯基转移酶_Alt”)的细胞培养物样品的平均荧光水平。荧光水平对应于蛋白质表达水平，显示HB6的大麻异戊烯基转移酶和HB7的AltPT的相对表达水平。普通膜结合的大麻异戊烯基转移酶在酿酒酵母的胞质中具有低的表达。胞质AltPT在酿酒酵母的胞质中的表达水平高于普通膜结合的大麻异戊烯基转移酶。
实施例I
如上表7中所述的酵母菌株HB37在YNB+2％葡萄糖+1.6g/L 4DO*+0.5mM己酸培养基中培养。观察到了由葡萄糖和己酸生产CBG，表明在酵母中直接生产CBG。
用0.85mM己酸以10μg/L的浓度生产CBG。在优化己酸进料和生长条件后，用0.5mM己酸生产50μg/L的CBG。
实施例II
如上表7中所述的酵母菌株HB84在YNB+2％棉子糖+2％半乳糖+1.6g/L 4DO*培养基中培养。观察到了由棉子糖和半乳糖生产meCBG，表明在没有己酸的情况下，在酵母中直接生产meCBG。生产的meCBG为42.63mg/L。与HB37的CBG产量相比，HB84生产的meCBG产量增加了近1,000倍。
图17显示了实施例I中由HB37的CBG(“CBG_C_sativa”)的产量相比于实施例II中由HB84的meCBG(“HB_CBG_me”)的产量。
实施例III
如上表6中所述的酵母菌株HB80在YNB+2％棉子糖+2％半乳糖+1.6g/L 4DO*培养基中培养。观察到了由棉子糖和半乳糖生产甲基橄榄醇，表明在酵母中直接生产甲基橄榄醇而不转化为meCBG，因为HB80缺乏AltPT。生产的甲基橄榄醇的浓度为3.259mg/L。在包括HB80的特征和AltPT或另一种异戊烯基转移酶的菌株，比如HB139中将预期发生转化为meCBG。
实施例IV
如上表6中所述的酵母菌株HB80A在YNB+2％棉子糖+2％半乳糖+1.6g/L 4DO*培养基中培养。观察到了由DiPKSG1516D；G1518A催化，由棉子糖和半乳糖生产橄榄醇和甲基橄榄醇二者。该数据表明了在没有己酸的情况下，在酵母中直接生产橄榄醇和甲基橄榄醇二者。由于HB80A缺乏AltPT，因此未发生转化为CBG和meCBG。在包括HB80A的特征和AltPT或另一种异戊烯基转移酶的菌株，比如通过用pAltPT转化HB80A中将预期发生转化为CBG和meCBG。
图18显示来自实施例III的由HB80生产的甲基橄榄醇(“甲基橄榄醇HB80”)的浓度和HB80A生产的橄榄醇和甲基橄榄醇(分别为“甲基橄榄醇HB80A”和“橄榄醇HB80A”)的浓度。在72小时对培养物取样。HB80A主要生产甲基橄榄醇(每L培养物1.4mg甲基橄榄醇，相比于每L培养物0.010mg橄榄醇)，并且生产的甲基橄榄醇和橄榄醇总量少于HB80生产的甲基橄榄醇(3.26mg/L)。
实施例V
如上表6中所述的酵母菌株HB98在YNB+2％棉子糖+2％半乳糖+1.6g/L 4DO*培养基中培养。观察到了由DiPKS催化，由棉子糖和半乳糖生产甲基橄榄醇。该数据表明，与实施例III中所述的HB80相比，甲基橄榄醇的产量增加，并且也是在不包括己酸的情况下。由于HB80A缺乏AltPT，因此未发生转化为meCBG。在包括HB98的特征和AltPT或另一种异戊烯基转移酶的菌株，比如通过用pAltPT转化HB98或用pNPGa转化的HB84中将预期发生转化为meCBG。
图19显示来自实施例III的HB80生产的甲基橄榄醇(“甲基橄榄醇HB80”)的浓度和来自实施例V的HB98生产的甲基橄榄醇(“甲基橄榄醇HB98”)的浓度。在72小时对培养物取样。HB98生产29.85mg/L甲基橄榄醇，而HB80每L培养物仅生产3.26mg甲基橄榄醇。HB98生产的甲基橄榄醇几乎是HB80的10倍。
实施例VI
如上表6中所述的酵母菌株HB102在YNB+2％棉子糖+2％半乳糖+1.6g/L 4DO*培养基中培养。观察到了由棉子糖和半乳糖生产甲基橄榄醇，表明与HB98菌株相比，甲基橄榄醇在酵母中的增加的产量为42.44mg/L，而HB98仅生产29.85mg/L甲基橄榄醇。这表明NpgA的基因整合形式是起作用的。由于HB102缺乏AltPT，因此未发生转化为meCBG。在包括HB102的特征和AltPT或另一种异戊烯基转移酶的菌株，比如HB105中将预期发生转化为meCBG。
图20显示了与实施例V中来自菌株HB98的甲基橄榄醇(“甲基橄榄醇HB98”)的生产相比，来自实施例VI的HB102生产的甲基橄榄醇(“甲基橄榄醇HB102”)的浓度。
实施例VII
如上表7中所述的酵母菌株HB105在YNB+2％棉子糖+2％半乳糖+1.6g/L 4DO*培养基中培养。观察到了以66.3mg/L的滴度由棉子糖和半乳糖生产meCBG，表明与HB84的CBG的产量相比，增加的meCBG的生产。这表明了PDH旁路和整合的NpgA对meCBG滴度的积极作用。
图21显示了与实施例II中来自菌株HB84的meCBG(“甲基_CBG HB84”)生产相比，来自实施例VII的HB105生产的meCBG(“甲基_CBG HB105”)的滴度。
实施例VIII
将如上表6中所述的酵母菌株HB135在YNB+2％棉子糖+2％半乳糖+1.6g/L4DO*培养基中培养。观察到了由棉子糖和半乳糖生产橄榄醇，表明在不含任何己酸的酵母中且以49.24mg/L的高滴度生产橄榄醇，且不生产甲基橄榄醇。这与由菌株HB102的甲基橄榄醇产量相当，表明DIPKS的突变对于生产橄榄醇而不是甲基橄榄醇有效。由于HB135缺乏AltPT，因此未发生转化为CBG和meCBG。在包括HB135的特征和AltPT或另一种异戊烯基转移酶的菌株中将预期发生转化为CBG和meCBG。
图22显示了与实施例VI中来自菌株HB102的甲基橄榄醇(“甲基橄榄醇HB102”)的生产相比，来自实施例VIII的HB135生产的橄榄醇和甲基橄榄醇(分别为“甲基橄榄醇HB135”和“橄榄醇HB135”)的浓度。
实施例IX
如上表6中所述的酵母菌株HB137和HB138在YNB+2％棉子糖+2％半乳糖+1.6g/L4DO*培养基中培养。在两个菌株中均观察到了由棉子糖和半乳糖生产橄榄醇。菌株HB137生产61.26mg/L的橄榄醇，并且菌株HB138生产74.26mg/L的橄榄醇，表明Mafl整合和Acc1-启动子交换对橄榄醇滴度的积极作用。由于HB137和HB138缺乏AltPT，因此未发生转化为CBG。在包括HB137和HB138的特征和AltPT或另一种异戊烯基转移酶的菌株中将预期发生转化为CBG。
图23显示了与相比于实施例VIII中由HB135生产的橄榄醇(“橄榄醇HB135”)的浓度相比，来自实施例IX的HB137生产的橄榄醇(“橄榄醇HB137”)的浓度和HB138生产的橄榄醇(“橄榄醇HB138”)的浓度。
实施例X
如上表7中所述的酵母菌株HB139在YNB+2％棉子糖+2％半乳糖+1.6g/L 4DO*培养基中培养。观察到了由棉子糖和半乳糖以0.03mg/L的滴度直接生产CBG。这远小于菌株HB105生产的meCBG的滴度。
图24显示了与来自实施例VII的HB105的meCBG(“meCBG HB105”)的产量和在实施例I中HB37的CBG(“CBG HB37”)的产量相比，来自实施例X的HB139由半乳糖和棉子糖直接生产的CBG(“CBG HB139”)的浓度。
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序列
下述序列以电子方式随本申请提交，但也包括在此。
Figure BDA0002234502010000351
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Figure BDA0002234502010000901
Figure BDA0002234502010000911
只是实施例
在前面的描述中，出于解释的目的，阐述了许多细节以便提供对实施方式的透彻理解。然而，对于本领域技术人员将明显的是这些具体细节不是必须的。
上述实施方式仅期望作为实施例。在不背离仅由本文所附权利要求限定的范围的情况下，本领域技术人员可对特定实施方式进行变更、修改和变化。
序列表
<110> 海牙森生物公司
<120> 用于在酵母中产生植物大麻素和植物大麻素类似物的方法和细胞系
<130> PAT 85146W-90
<150> US 62/460,526
<151> 2017-02-17
<160> 47
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 927
<212> DNA
<213> 天蓝色链霉菌属190
<400> 1
atgtctgaag ccgctgatgt cgaaagagtt tacgccgcta tggaagaggc cgctggtttg 60
ttgggtgttg cctgtgctag agacaagatt tacccattgt tatccacctt ccaagatact 120
ttggttgaag gtggttctgt tgtcgttttc tctatggcct ccggtagaca ctccaccgaa 180
ttggacttct ctatttctgt tccaacttct catggtgatc catacgccac tgtcgttgaa 240
aagggtttat ttcctgctac tggtcaccca gttgacgatt tgttagctga cactcaaaag 300
cacttacctg tttctatgtt cgctattgac ggtgaagtta ccggtggttt caaaaagact 360
tacgccttct tcccaactga caatatgcca ggtgttgctg aattgtctgc tatcccatcc 420
atgccaccag ccgttgccga gaatgctgaa ttgttcgctc gttatggttt ggacaaggtc 480
caaatgacct ccatggacta caagaaaaga caagtcaact tgtatttctc cgaattgtct 540
gctcaaactt tagaagccga atctgttttg gctttggtta gagaattagg tttgcacgtt 600
ccaaacgaat tgggtttgaa gttttgtaaa cgttctttct ctgtttatcc aactttgaac 660
tgggaaaccg gtaaaatcga cagattgtgc ttcgctgtca tctctaacga cccaaccttg 720
gtcccatcct ccgatgaagg tgatatcgaa aagttccaca actacgccac taaggctcct 780
tacgcttacg tcggtgagaa acgtaccttg gtctatggtt tgactttatc cccaaaggag 840
gaatactaca agttgggtgc ttactaccac attaccgacg tccaaagagg tttgttaaag 900
gccttcgact ctttagaaga cggctga 927
<210> 2
<211> 9444
<212> DNA
<213> 盘基网柄菌
<220>
<221> 基序1
<222> (4528)..(4554)
<220>
<221> C-甲基转移酶结构域
<222> (4528)..(4890)
<220>
<221> 基序2
<222> (4787)..(4809)
<220>
<221> 基序3
<222> (4867)..(4899)
<400> 2
atgaacaaga actccaaaat ccagtcccca aactcttctg atgttgctgt tattggtgtt 60
ggttttagat tcccaggtaa ctctaatgac ccagaatctt tgtggaacaa cttgttggat 120
ggtttcgatg ctattaccca agtcccaaaa gaaagatggg ctacttcttt tagagagatg 180
ggtttgatca agaacaagtt cggtggtttc ttgaaggatt ctgaatggaa gaatttcgac 240
cctttgttct ttggtatcgg tccaaaagaa gctccattca ttgatccaca acaaaggttg 300
ttgttgtcca tcgtttggga atctttggaa gatgcttaca tcagaccaga tgaattgaga 360
ggttctaaca ctggtgtttt catcggtgtt tctaacaacg attacaccaa gttgggtttc 420
caagacaact actctatttc tccatacact atgaccggct ctaactcttc attgaactcc 480
aacagaattt cctactgctt cgattttaga ggtccatcca ttactgttga taccgcttgt 540
tcttcttcct tggtttctgt taatttgggt gtccaatcca tccaaatggg tgaatgtaag 600
attgctattt gcggtggtgt taacgctttg tttgatccat ctacatctgt tgccttttcc 660
aagttgggtg ttttgtctga aaatggcaga tgcaactctt ttagtgatca agcctctggt 720
tacgttagat ctgaaggtgc tggtgttgtt gttttgaagt ctttggaaca agctaagttg 780
gatggtgata gaatctacgg tgttatcaag ggtgtttcct ctaatgaaga tggtgcttct 840
aatggtgaca agaactcttt gactactcca tcttgtgaag cccaatccat taacatttct 900
aaggctatgg aaaaggcctc cttgtctcca tctgatatct attacattga agcccatggt 960
actggtactc cagttggtga tccaattgaa gttaaggcct tgtccaagat cttctccaac 1020
tctaacaaca accagttgaa caacttctct accgatggta atgataacga tgatgatgat 1080
gacgataaca cctctccaga accattattg attggctcat tcaagtccaa catcggtcat 1140
ttggaatctg ctgctggtat tgcttctttg attaagtgtt gcttgatgtt gaagaacagg 1200
atgttggttc catccattaa ctgctctaat ttgaacccat ccattccatt cgatcagtac 1260
aacatctccg ttatcagaga aatcagacaa ttcccaaccg ataagttggt taacatcggt 1320
atcaattctt tcggtttcgg tggttctaac tgccatttga ttattcaaga gtacaacaac 1380
aacttcaaga acaactctac catctgcaat aacaacaaca acaacaataa caacatcgac 1440
tacttgatcc caatctcctc taagactaag aagtccttgg ataagtactt gattttgatc 1500
aagaccaact ccaactacca caaggatatt tctttcgatg acttcgtcaa gttccaaatc 1560
aagtctaagc agtacaactt gtccaacaga atgactacca ttgctaacga ttggaactcc 1620
ttcattaagg gttctaacga attccacaac ttgatcgaat ctaaggatgg tgaaggtggt 1680
tcttcatctt ctaacagagg tattgattcc gccaatcaaa tcaacactac tactacctct 1740
accatcaacg atatcgaacc tttgttggtt ttcgttttct gtggtcaagg tccacaatgg 1800
aatggtatga ttaagacctt gtacaactcc gagaacgttt tcaagaacac cgttgatcat 1860
gttgacagca tcttgtacaa gtacttcggt tactccattt tgaacgtctt gtctaagatc 1920
gatgataacg acgattccat caaccatcca atagttgctc aaccatcttt gttcttgttg 1980
caaattggtt tggtcgagtt gtttaagtac tggggtatct acccatctat ctctgttggt 2040
cattctttcg gtgaagtctc ttcttattac ttgtccggta tcatctcttt ggaaaccgct 2100
tgtaaaatcg tctacgtcag atcctctaat cagaacaaaa ctatgggttc cggtaagatg 2160
ttggttgttt ctatgggttt taagcaatgg aacgatcaat tctctgctga atggtccgat 2220
attgaaattg cttgttacaa cgctccagat tccatagttg ttactggtaa cgaagaaaga 2280
ttgaaagaat tgtccatcaa gttgtccgac gaatccaatc aaattttcaa caccttcttg 2340
aggtccccat gttcttttca ttcttcccat caagaagtca tcaagggttc tatgttcgaa 2400
gagttgtcta acttgcaatc tactggtgaa accgaaatcc ctttgttctc tactgttact 2460
ggtagacaag ttttgtctgg tcatgttact gctcaacaca tctacgataa tgttagagaa 2520
ccagtcttgt tccaaaagac gattgaatcc attacctcct acatcaagtc tcactaccca 2580
tccaatcaaa aggttatcta cgttgaaatt gctccacacc caaccttgtt ttcattgatc 2640
aaaaagtcca tcccatcctc caacaagaat tcctcttctg ttttgtgtcc attgaacaga 2700
aaagaaaact ccaacaactc ctacaagaag ttcgtttctc agttgtactt caacggtgtt 2760
aacgttgact tcaacttcca gttgaactcc atttgcgata acgttaacaa cgatcaccat 2820
ttgaacaacg tcaagcaaaa ctccttcaaa gagactacca attccttgcc aagataccaa 2880
tgggaacaag atgaatattg gtccgaacca ttgatctcca gaaagaatag attggaaggt 2940
ccaactactt ccttgttggg tcatagaatt atctacagct tcccagtttt ccaatccgtt 3000
ttggacttgc aatctgacaa ctacaaatac ttgttggacc acttggttaa cggtaagcca 3060
gtttttccag gtgctggtta tttggatatc atcatcgaat tcttcgacta ccaaaagcag 3120
cagttgaatt cctctgattc ctctaactcc tacatcatca acgttgacaa gatccaattc 3180
ttgaacccaa ttcacttgac cgaaaacaag ttgcaaacct tgcaatcttc tttcgaacct 3240
atcgttacta agaagtctgc cttctctgtt aacttcttca tcaaggatac cgtcgaggat 3300
caatctaagg ttaagtctat gtctgacgaa acttggacta acacttgtaa ggctaccatt 3360
tccttggaac aacaacagcc atctccatct tctactttga ctttgtctaa gaagcaagac 3420
ttgcagatct tgagaaacag atgcgatatt agcaagctag acaagtttga gttgtacgac 3480
aagatctcta agaatttggg cttgcagtac aactccttgt ttcaagttgt tgataccatc 3540
gaaactggta aggattgctc ttttgctact ttgtctttgc cagaagatac tttgttcacc 3600
accattttga acccatgctt gttggataac tgtttccatg gtttgttgac cttgatcaac 3660
gaaaagggtt ctttcgttgt cgagtccatt tcttctgttt ctatctactt ggagaacatc 3720
ggttccttca atcaaacttc tgttggtaac gtccagttct acttgtacac cactatttct 3780
aaagccacct cctttagttc tgaaggtact tgtaagttgt tcaccaagga tggttccttg 3840
attttgtcta tcggtaagtt catcatcaag tccaccaatc caaagtctac taagaccaac 3900
gaaactatcg aatctccatt ggacgaaacc ttctctattg aatggcaatc taaggattct 3960
ccaattccaa ccccacaaca aatccaacaa caatctccat tgaactctaa cccatccttc 4020
attagatcta ccatcttgaa ggacatccag ttcgaacaat actgctcctc cattatccac 4080
aaagaattga tcaaccacga aaagtacaag aaccagcaat ccttcgatat caactccttg 4140
gaaaaccact tgaacgatga ccaattgatg gaatccttgt ccatctccaa agaatacttg 4200
agattcttca ccaggatcat ctccatcatt aagcaatacc caaagatctt gaacgaaaaa 4260
gagctaaaag aattgaaaga aatcatcgaa ttgaagtacc catccgaagt tcagttgttg 4320
gaattcgaag ttatcgagaa ggtgtccatg attatcccaa agttgttgtt cgaaaacgac 4380
aagcaatctt ccatgacctt gttccaagat aacttgttga ccaggttcta ctccaattct 4440
aactctacca gattctactt ggaaagggtt tccgaaatgg tcttggaatc tattagacca 4500
atcgtcagag aaaagagggt gttcagaatt ttggaaattg gtgctggtac aggctctttg 4560
tctaatgttg ttttgactaa gttgaacacc tacttgtcca ccttgaattc taatggtggt 4620
tctggttaca acatcatcat tgagtacacc ttcaccgata tttccgccaa cttcattatt 4680
ggtgaaatcc aagaaaccat gtgcaacttg tacccaaacg ttactttcaa gttctccgtc 4740
ttggacttgg agaaagagat tattaactcc tccgatttct tgatgggtga ttacgatata 4800
gttttgatgg cctacgttat ccatgccgtt tctaacatta agttctccat cgaacagttg 4860
tacaagttgt tgtctccaag aggttggttg ttgtgtattg aacctaagtc caacgttgtg 4920
ttctccgatt tggttttcgg ttgttttaat cagtggtgga actactacga tgatattaga 4980
actacccact gctccttgtc tgaatctcaa tggaatcagt tgttgttgaa ccagtccttg 5040
aacaacgaat cctcttcttc ttctaactgt tacggtggtt tctccaacgt ttcttttatt 5100
ggtggtgaaa aggatgtcga ctcccattct ttcatattgc actgccaaaa agaatccatc 5160
tcccaaatga agttagccac cactattaac aacggtttgt catctggttc catcgttatc 5220
gttttgaact ctcaacaatt gaccaacatg aagtcctacc caaaggttat tgagtatatt 5280
caagaggcta cctctttgtg caagaccatt gaaattatcg attccaagga cgtcttgaac 5340
tctaccaatt cagttttgga aaagatccaa aagtccttgt tggtgttctg tttgttgggt 5400
tatgacttgt tggagaacaa ctaccaagaa cagtctttcg aatacgttaa gttgttgaac 5460
ttgatctcta ctaccgcctc ttcatctaat gataagaaac caccaaaggt cttgttgatc 5520
accaagcaat ctgaaagaat ctccaggtct ttctactcca gatccttgat tggtatttcc 5580
agaacctcta tgaacgagta cccaaatttg tccattacct ctatcgattt ggataccaac 5640
gactactcat tgcagtcttt gttgaagcca atcttcagca actctaagtt ttccgacaac 5700
gagttcatct tcaaaaaggg cttgatgttc gtgtccagga tctttaagaa caagcagttg 5760
ctagaatcct ccaacgcttt tgaaactgac tcttctaact tgtactgtaa ggcctcttct 5820
gacttgtctt acaagtacgc tattaagcag tctatgttga ccgaaaatca gatcgaaatc 5880
aaggttgaat gcgtcggtat taacttcaag gacaacctat tctacaaggg cttgttgcca 5940
caagaaattt tcagaatggg tgacatctac aatccaccat atggtttgga atgctctggt 6000
gttattacca gaattggttc taacgtcacc gaatactcag ttggtcaaaa tgtttttggt 6060
ttcgccagac attctttggg ttctcatgtt gttaccaaca aggatttggt tatcttgaag 6120
ccagatacca tctcattttc tgaagctgct tctatcccag ttgtttactg tactgcttgg 6180
tactccttgt tcaacattgg tcagttgtct aacgaagaat ccatcctaat tcattctgct 6240
actggtggtg taggtttggc ttctttgaat ttgttgaaaa tgaagaatca gcaacagcaa 6300
ccattgacca atgtttatgc tactgttggc tctaacgaga agaagaagtt cttgatcgat 6360
aacttcaaca acttgttcaa agaggacggc gaaaacattt tctctaccag agacaaagaa 6420
tactccaacc agttggaatc caagatcgat gttattttga acaccttgtc cggtgaattc 6480
gtcgaatcta atttcaagtc cttgagatcc ttcggtagat tgattgattt gtctgctact 6540
cacgtttacg ccaatcaaca aattggtcta ggtaacttca agttcgacca cttgtattct 6600
gctgttgact tggaaagatt gatcgacgaa aaacctaagt tgttgcagtc catcttgcaa 6660
agaattacca actctatcgt caacggttcc ttggaaaaaa ttccaattac catcttccca 6720
tccaccgaaa ctaaggatgc tatcgaatta ttgtccaaga gatcccatat cggtaaagtt 6780
gttgtagatt gcaccgatat ctctaagtgt aatcctgttg gtgatgtgat caccaacttc 6840
tctatgagat tgccaaagcc aaactaccag ttgaatttga actccacctt gttgattact 6900
ggtcagtctg gtttgtctat ccctttgttg aattggttgt tgtctaagtc tggtggtaac 6960
gttaagaacg ttgtcatcat ttctaagtcc accatgaagt ggaagttgca gactatgatt 7020
tcccatttcg tttccggttt cggtatccat tttaactacg ttcaagtcga catctccaac 7080
tacgatgctt tgtctgaagc tattaagcaa ttgccatctg atttgccacc aatcacctct 7140
gtttttcatt tggctgctat ctacaacgat gttccaatgg atcaagttac catgtctacc 7200
gttgaatctg ttcataaccc taaagttttg ggtgccgtta acttgcatag aatctctgtt 7260
tcttttggtt ggaagttgaa ccacttcgtc ttgttctctt ctattactgc tattaccggt 7320
tacccagacc aatctatcta caattctgcc aactctattt tggacgcttt gtccaacttt 7380
agaaggttta tgggtttgcc atccttctcc attaacttgg gtccaatgaa ggatgaaggt 7440
aaggtttcta ccaacaagag catcaagaag ctattcaagt ctagaggttt gccaagccta 7500
tccttgaaca agttatttgg tttgttggag gtcgtcatca acaacccatc taatcatgtt 7560
atcccatccc aattgatttg ctccccaatc gatttcaaga cctacatcga atctttctca 7620
actatgaggc caaagttgtt acacttgcaa cctaccattt ccaagcagca atcttctatc 7680
attaacgatt ctaccaaggc ttcctccaac atttcattgc aagataagat cacctccaag 7740
gtgtctgatt tgttgtccat tccaatctcc aagatcaact tcgatcatcc attgaaacac 7800
tacggcttgg attctttgtt gaccgttcaa ttcaaatcct ggatcgacaa agaattcgaa 7860
aagaacttgt tcacccatat ccaattggcc accatctcta ttaactcatt cttggaaaag 7920
gtgaacggct tgtctacaaa caataacaac aacaacaatt ccaacgtcaa gtcctctcca 7980
tccattgtca aagaagaaat cgttaccttg gacaaggatc aacaaccatt gctattgaaa 8040
gaacaccagc acattatcat ctccccagat attagaatca acaagccaaa gagggaatcc 8100
ttgattagaa ccccaatctt gaacaaattc aaccagatca ccgaatccat tatcactcca 8160
tctacaccat ctttgtccca atccgatgtt ttgaaaactc caccaatcaa gtctttgaac 8220
aacactaaga actccagctt gattaacacc ccaccaattc aatctgtcca acaacatcaa 8280
aagcaacaac aaaaggtcca agtcatccaa caacagcaac aaccattatc cagattgtcc 8340
tacaagagca acaacaactc tttcgttttg ggtatcggta tttctgttcc aggtgaacct 8400
atttcccaac aatccttgaa agactccatc tccaatgact tttctgataa ggctgaaact 8460
aacgagaagg tcaagagaat ctttgagcaa tctcaaatca agaccagaca cttggttaga 8520
gattacacta agccagagaa ctccatcaag ttcagacatt tggaaaccat taccgatgtg 8580
aacaaccagt tcaagaaagt tgttccagat ttggctcaac aagcctgttt gagagctttg 8640
aaagattggg gtggtgataa gggtgatatt acccatatag tttctgttac ctccaccggt 8700
attatcatcc cagatgttaa tttcaagttg atcgacttgt tgggcttgaa caaggatgtt 8760
gaaagagtgt ctttgaacct aatgggttgt ttggctggtt tgagttcttt gagaactgct 8820
gcttctttgg ctaaggcttc tccaagaaat agaattttgg ttgtctgtac cgaagtctgc 8880
tccttgcatt tttctaatac tgatggtggt gatcaaatgg tcgcctcttc tatttttgct 8940
gatggttctg ctgcttacat tattggttgt aacccaagaa ttgaagaaac cccattatac 9000
gaagtcatgt gctccattaa cagatctttc ccaaataccg aaaacgccat ggtttgggat 9060
ttggaaaaag aaggttggaa cttgggtttg gatgcttcta ttccaattgt cattggttct 9120
ggtattgaag ccttcgttga tactttgttg gataaggcta agttgcaaac ttccactgct 9180
atttctgcta aggattgcga attcttgatt catactggtg gcaagtccat cttgatgaac 9240
atcgaaaatt ccttgggtat cgacccaaag caaactaaga atacttggga tgtttaccat 9300
gcctacggca atatgtcatc tgcctctgtt attttcgtta tggatcatgc cagaaagtcc 9360
aagtctttgc caacttactc aatttctttg gcttttggtc caggtttggc ttttgaaggt 9420
tgtttcttga agaacgtcgt ctaa 9444
<210> 3
<211> 1059
<212> DNA
<213> 酿酒酵母
<400> 3
atggcttcag aaaaagaaat taggagagag agattcttga acgttttccc taaattagta 60
gaggaattga acgcatcgct tttggcttac ggtatgccta aggaagcatg tgactggtat 120
gcccactcat tgaactacaa cactccaggc ggtaagctaa atagaggttt gtccgttgtg 180
gacacgtatg ctattctctc caacaagacc gttgaacaat tggggcaaga agaatacgaa 240
aaggttgcca ttctaggttg gtgcattgag ttgttgcagg cttacttctt ggtcgccgat 300
gatatgatgg acaagtccat taccagaaga ggccaaccat gttggtacaa ggttcctgaa 360
gttggggaaa ttgccatcaa tgacgcattc atgttagagg ctgctatcta caagcttttg 420
aaatctcact tcagaaacga aaaatactac atagatatca ccgaattgtt ccatgaggtc 480
accttccaaa ccgaattggg ccaattgatg gacttaatca ctgcacctga agacaaagtc 540
gacttgagta agttctccct aaagaagcac tccttcatag ttactttcga gactgcttac 600
tattctttct acttgcctgt cgcattggcc atgtacgttg ccggtatcac ggatgaaaag 660
gatttgaaac aagccagaga tgtcttgatt ccattgggtg aatacttcca aattcaagat 720
gactacttag actgcttcgg taccccagaa cagatcggta agatcggtac agatatccaa 780
gataacaaat gttcttgggt aatcaacaag gcattggaac ttgcttccgc agaacaaaga 840
aagactttag acgaaaatta cggtaagaag gactcagtcg cagaagccaa atgcaaaaag 900
attttcaatg acttgaaaat tgaacagcta taccacgaat atgaagagtc tattgccaag 960
gatttgaagg ccaaaatttc tcaggtcgat gagtctcgtg gcttcaaagc tgatgtctta 1020
actgcgttct tgaacaaagt ttacaagaga agcaaataa 1059
<210> 4
<211> 14025
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 质粒
<220>
<221> C1:p506同源引物
<222> (1)..(50)
<220>
<221> 19 UP
<222> (51)..(761)
<220>
<221> L0
<222> (762)..(800)
<220>
<221> THD3p
<222> (801)..(1453)
<220>
<221> L1
<222> (1454)..(1493)
<220>
<221> ALD6
<222> (1494)..(2999)
<220>
<221> L2
<222> (3000)..(3039)
<220>
<221> LTP1
<222> (3364)..(3403)
<220>
<221> Tef1p
<222> (3404)..(3897)
<220>
<221> L3
<222> (3898)..(3937)
<220>
<221> Acs L641P
<222> (3938)..(5893)
<220>
<221> L4
<222> (5894)..(5933)
<220>
<221> PRM9t
<222> (5934)..(6471)
<220>
<221> LTP2
<222> (6472)..(6511)
<400> 4
taaccctcac taaagggaac aaaagctgga gctcgtttaa acggcgcgcc caccggagct 60
tggatatgat aaacgaaata ttcttgaatc gtgagatcgc ctgttttcaa aaccgttgga 120
ggcagaaaca attttgtcac aagatgggca ttctacccca tccttgctgt attattgtag 180
tctcgctttc ttttatgctg gacaaatgag actactgcac atttttatac gttcttggtt 240
ttttttaaag gtgtggtttc ggcattatcc tgccgcacgt ttcttggata attcatcctg 300
attctctatt ttaaacgctt cagcctatca ggatttggtt ttgatacata ctgcaagagt 360
gtatctcggg aacagtcatt tattccgcaa caaacttaat tgcggaacgc gttaggcgat 420
ttctagcata tatcaaatac cgttcgcgat ttcttctggg ttcgtctctt ttcttttaaa 480
tacttattaa cgtactcaaa caactacact tcgttgtatc tcagaatgag atccctcagt 540
atgacaatac atcattctaa acgttcgtaa aacacatatg aaacaacttt ataacaaagc 600
gaacaaaatg ggcaacatga gatgaaactc cgcgtccctt agctgaacta cccaaacgta 660
cgaatgcctg aacaattagt ttagatccga gattccgcgc ttccatcatt tagtataatc 720
catattttat ataatatata ggataagtaa cagcccgcga aaaacaacaa ataatcataa 780
aaattttaga actagacata tcgagtttat cattatcaat actgccattt caaagaatac 840
gtaaataatt aatagtagtg attttcctaa ctttatttag tcaaaaaatt agccttttaa 900
ttctgctgta acccgtacat gcccaaaata gggggcgggt tacacagaat atataacatc 960
gtaggtgtct gggtgaacag tttattcctg gcatccacta aatataatgg agcccgcttt 1020
ttaagctggc atccagaaaa aaaaagaatc ccagcaccaa aatattgttt tcttcaccaa 1080
ccatcagttc ataggtccat tctcttagcg caactacaga gaacaggggc acaaacaggc 1140
aaaaaacggg cacaacctca atggagtgat gcaacctgcc tggagtaaat gatgacacaa 1200
ggcaattgac ccacgcatgt atctatctca ttttcttaca ccttctatta ccttctgctc 1260
tctctgattt ggaaaaagct gaaaaaaaag gttgaaacca gttccctgaa attattcccc 1320
tacttgacta ataagtatat aaagacggta ggtattgatt gtaattctgt aaatctattt 1380
cttaaacttc ttaaattcta cttttatagt tagtcttttt tttagtttta aaacaccaag 1440
aacttagttt cgactagaaa atttattata aaaggaagag aaataattaa acaatgacta 1500
agctacactt tgacactgct gaaccagtca agatcacact tccaaatggt ttgacatacg 1560
agcaaccaac cggtctattc attaacaaca agtttatgaa agctcaagac ggtaagacct 1620
atcccgtcga agatccttcc actgaaaaca ccgtttgtga ggtctcttct gccaccactg 1680
aagatgttga atatgctatc gaatgtgccg accgtgcttt ccacgacact gaatgggcta 1740
cccaagaccc aagagaaaga ggccgtctac taagtaagtt ggctgacgaa ttggaaagcc 1800
aaattgactt ggtttcttcc attgaagctt tggacaatgg taaaactttg gccttagccc 1860
gtggggatgt taccattgca atcaactgtc taagagatgc tgctgcctat gccgacaaag 1920
tcaacggtag aacaatcaac accggtgacg gctacatgaa cttcaccacc ttagagccaa 1980
tcggtgtctg tggtcaaatt attccatgga actttccaat aatgatgttg gcttggaaga 2040
tcgccccagc attggccatg ggtaacgtct gtatcttgaa acccgctgct gtcacacctt 2100
taaatgccct atactttgct tctttatgta agaaggttgg tattccagct ggtgtcgtca 2160
acatcgttcc aggtcctggt agaactgttg gtgctgcttt gaccaacgac ccaagaatca 2220
gaaagctggc ttttaccggt tctacagaag tcggtaagag tgttgctgtc gactcttctg 2280
aatctaactt gaagaaaatc actttggaac taggtggtaa gtccgcccat ttggtctttg 2340
acgatgctaa cattaagaag actttaccaa atctagtaaa cggtattttc aagaacgctg 2400
gtcaaatttg ttcctctggt tctagaattt acgttcaaga aggtatttac gacgaactat 2460
tggctgcttt caaggcttac ttggaaaccg aaatcaaagt tggtaatcca tttgacaagg 2520
ctaacttcca aggtgctatc actaaccgtc aacaattcga cacaattatg aactacatcg 2580
atatcggtaa gaaagaaggc gccaagatct taactggtgg cgaaaaagtt ggtgacaagg 2640
gttacttcat cagaccaacc gttttctacg atgttaatga agacatgaga attgttaagg 2700
aagaaatttt tggaccagtt gtcactgtcg caaagttcaa gactttagaa gaaggtgtcg 2760
aaatggctaa cagctctgaa ttcggtctag gttctatggg tatcgaaaca gaatctttga 2820
gcacaggttt gaaggtggcc aagatgttga aggccggtac cgtctggatc aacacataca 2880
acgattttga ctccagagtt ccattcggtg gtgttaagca atctggttac ggtagagaaa 2940
tgggtgaaga agtctaccat gcatacactg aagtaaaagc tgtcagaatt aagttgtaaa 3000
gacataaaac tgaaacaaca ccaattaata atagactttt ggacttcttc gccagaggtt 3060
tggtcaagtc tccaatcaag gttgtcggct tgtctacctt gccagaaatt tacgaaaaga 3120
tggaaaaggg tcaaatcgtt ggtagatacg ttgttgacac ttctaaataa gcgaatttct 3180
tatgatttat gatttttatt attaaataag ttataaaaaa aataagtgta tacaaatttt 3240
aaagtgactc ttaggtttta aaacgaaaat tcttattctt gagtaactct ttcctgtagg 3300
tcaggttgct ttctcaggta tagcatgagg tcgctcttat tgaccacacc tctaccggca 3360
tggcttaaat aacatactca tcactaaaca ttcttaacaa tcaaagcaac aggcgcgttg 3420
gacttttaat tttcgaggac cgcgaatcct tacatcacac ccaatccccc acaagtgatc 3480
ccccacacac catagcttca aaatgtttct actccttttt tactcttcca gattttctcg 3540
gactccgcgc atcgccgtac cacttcaaaa cacccaagca cagcatacta aatttcccct 3600
ctttcttcct ctagggtgtc gttaattacc cgtactaaag gtttggaaaa gaaaaaagag 3660
accgcctcgt ttctttttct tcgtcgaaaa aggcaataaa aatttttatc acgtttcttt 3720
ttcttgaaaa tttttttttt tgattttttt ctctttcgat gacctcccat tgatatttaa 3780
gttaataaac ggtcttcaat ttctcaagtt tcagtttcat ttttcttgtt ctattacaac 3840
tttttttact tcttgctcat tagaaagaaa gcatagcaat ctaatctaag ttttaataca 3900
tctaccagtc aacagccaac aattaactaa ttaaacaatg tcccaaactc ataagcacgc 3960
tattccagct aatattgctg atagatgctt gatcaaccca gaacagtacg aaactaagta 4020
caagcaatcc atcaacgatc cagatacttt ttggggtgaa caaggtaaga ttttggattg 4080
gattacccca taccaaaagg tcaagaatac ttcttttgct ccaggcaacg tttccattaa 4140
gtggtatgaa gatggtactt tgaacttggc tgctaactgt ttggatagac acttgcaaga 4200
aaacggtgat agaaccgcta ttatttggga aggtgatgat acctcccaat ccaaacatat 4260
ctcttacaga gaattgcaca gagatgtctg tagattcgct aacactttgt tggatttggg 4320
catcaaaaag ggtgatgttg ttgctatcta tatgccaatg gttcctgaag ctgctgttgc 4380
tatgttggct tgtgctagaa ttggtgctgt tcattctgtt attttcggtg gtttttcacc 4440
agaagctgtt gccggtagaa ttatcgattc ttcatccaga ttggttatca ccgctgatga 4500
aggtgttaga gctggtagat ctattccatt gaaaaagaac gttgatgacg ccttgaagaa 4560
cccaaatgtt acttctgttg aacacgtcat cgttttgaag agaactggtt ctgatatcga 4620
ttggcaagag ggtagagatt tgtggtggag agatttgatt gaaaaggctt ctccagaaca 4680
tcaaccagaa gctatgaacg ctgaagatcc tttgtttatc ttgtacactt ctggttctac 4740
tggtaagcca aaaggtgttt tacacactac tggtggttat ttggtttacg ctgctactac 4800
tttcaagtac gttttcgatt atcacccagg tgatatctat tggtgtactg ctgatgttgg 4860
ttgggttact ggtcattctt atttgttgta tggtccattg gcttgtggtg ctactacatt 4920
gatgtttgaa ggtgttccaa attggccaac tccagctaga atgtgtcaag ttgttgacaa 4980
acaccaagtc aacatcttgt atactgctcc aactgctatt agagctttga tggctgaagg 5040
tgataaggct attgaaggta ctgatagatc ctccttgaga atcttgggtt ctgttggtga 5100
acctattaac cctgaagcct gggaatggta ttggaagaaa attggtaaag aaaagtgccc 5160
agttgttgat acttggtggc aaactgaaac tggtggtttt atgattactc cattgccagg 5220
tgctattgaa ttgaaagctg gttctgctac tagaccattt tttggtgttc aaccagcttt 5280
ggttgataac gaaggtcatc cacaagaagg tgctactgaa ggtaatttgg ttattactga 5340
ttcttggcca ggtcaagcta gaactttgtt tggtgatcac gaaagattcg aacagactta 5400
cttctctacc ttcaagaaca tgtacttctc tggtgatggt gctagaagag atgaagatgg 5460
ttactattgg attaccggta gagttgatga tgtcttgaat gtttctggtc acagattagg 5520
tactgccgaa attgaatctg ctttggttgc tcatccaaag attgctgaag ctgcagttgt 5580
tggtattcca catgctatta agggtcaagc tatctacgct tacgttactt tgaatcatgg 5640
tgaagaacca tctccagaat tatacgctga agttagaaac tgggtcagaa aagaaattgg 5700
tccattagct accccagatg ttttacattg gactgattct ttgccaaaga ccagatcagg 5760
taagatcatg agaagaatct tgagaaagat tgctgctggt gatacttcta acttgggtga 5820
tacttcaaca ttagctgatc caggtgttgt tgaaaagcct ttggaagaaa aacaagctat 5880
tgccatgcca tcctaataat taaatactat tttcaaaatt ctacttaaaa ataacagaag 5940
acgggagaca ctagcacaca actttaccag gcaaggtatt tgacgctagc atgtgtccaa 6000
ttcagtgtca tttatgattt tttgtagtag gatataaata tatacagcgc tccaaatagt 6060
gcggttgccc caaaaacacc acggaacctc atctgttctc gtactttgtt gtgacaaagt 6120
agctcactgc cttattatca cattttcatt atgcaacgct tcggaaaata cgatgttgaa 6180
aatgcctcta gagatgaaaa acaatcgtaa aagggtcctg cgtaattgaa acatttgatc 6240
agtatgcagt ggcacagaaa caaccaggaa tactatagtc ataggcaata caaggtatat 6300
attggctatg cagacccctc cagaaagtac cgacgtcaag ttagatacac ttaacgaacc 6360
tagtgcacat ttaattgaga aaaatgtggc tcttcctaag gacatattcc gttcgtactt 6420
gagttattgg atctatgaaa tcgctcgcta tacaccagtc atgattttgt cattgcgaag 6480
actatactga tatatgaatt taaactagag cggaccaact atcatccgct aattactgac 6540
attaccaaat gagatctgtg aatgggcaag ataaaaaaca aaaattgaaa tgtttgacgt 6600
tatgtaaaac tattaattcc ttcgctttcg gcggtcacag aatttgcgtg tagctgactc 6660
ttgttcaatc aatatcattt gttactttat ttgaaagtct gtattactgc gcctattgtc 6720
atccgtacca aagaacgtca aaaagaaaca agataatttt tgtgcttaca ccatttatag 6780
atcactgagc ccagaatatc gctggagctc agtgtaagtg gcatgaacac aactctgact 6840
gatcgcacat attgccgtta tcataaatac tagttgtact tgtcaatgcg acgaatggca 6900
tcatgcctat tattacgttc ctctttttcc gtttcatgtt tccagaatgc tattgaatct 6960
aacacttcaa ttataaaaaa gaataaatcc gcaataattt taggctaatt gttgtactgt 7020
caagcgaacc taatggttaa aattcagagg aaccttcgac gtagtctgat cgctacttct 7080
atatcttatg ttcccagtca atcaaaagtt gatactataa tagctgccat ttatacctgt 7140
tagttatggc gatcgtttat cacggcggcc gcggtaccta ataacttcgt atagcataca 7200
ttatacgaag ttatattaag ggttctcgac gttttcgaca ctggatggcg gcgttagtat 7260
cgaatcgaca gcagtatagc gaccagcatt cacatacgat tgacgcatga tattactttc 7320
tgcgcactta acttcgcatc tgggcagatg atgtcgaggc gaaaaaaaat ataaatcacg 7380
ctaacatttg attaaaatag aacaactaca atataaaaaa actatacaaa tgacaagttc 7440
ttgaaaacaa gaatcttttt attgtcagta ctgattagaa aaactcatcg agcatcaaat 7500
gaaactgcaa tttattcata tcaggattat caataccata tttttgaaaa agccgtttct 7560
gtaatgaagg agaaaactca ccgaggcagt tccataggat ggcaagatcc tggtatcggt 7620
ctgcgattcc gactcgtcca acatcaatac aacctattaa tttcccctcg tcaaaaataa 7680
ggttatcaag tgagaaatca ccatgagtga cgactgaatc cggtgagaat ggcaaaagct 7740
tatgcatttc tttccagact tgttcaacag gccagccatt acgctcgtca tcaaaatcac 7800
tcgcatcaac caaaccgtta ttcattcgtg attgcgcctg agcgagacga aatacgcgat 7860
cgctgttaaa aggacaatta caaacaggaa tcgaatgcaa ccggcgcagg aacactgcca 7920
gcgcatcaac aatattttca cctgaatcag gatattcttc taatacctgg aatgctgttt 7980
tgccggggat cgcagtggtg agtaaccatg catcatcagg agtacggata aaatgcttga 8040
tggtcggaag aggcataaat tccgtcagcc agtttagtct gaccatctca tctgtaacat 8100
cattggcaac gctacctttg ccatgtttca gaaacaactc tggcgcatcg ggcttcccat 8160
acaatcgata gattgtcgca cctgattgcc cgacattatc gcgagcccat ttatacccat 8220
ataaatcagc atccatgttg gaatttaatc gcggcctcga aacgtgagtc ttttccttac 8280
ccatggttgt ttatgttcgg atgtgatgtg agaactgtat cctagcaaga ttttaaaagg 8340
aagtatatga aagaagaacc tcagtggcaa atcctaacct tttatatttc tctacagggg 8400
cgcggcgtgg ggacaattca acgcgtctgt gaggggagcg tttccctgct cgcaggtctg 8460
cagcgaggag ccgtaatttt tgcttcgcgc cgtgcggcca tcaaaatgta tggatgcaaa 8520
tgattataca tggggatgta tgggctaaat gtacgggcga cagtcacatc atgcccctga 8580
gctgcgcacg tcaagactgt caaggagggt attctgggcc tccatgtcgc tggccgggtg 8640
acccggcggg gacgaggcaa gctaaacaga tctctagacc taataacttc gtatagcata 8700
cattatacga agttatatta agggttgtct taattaaggg tgcccaattc gccctatagt 8760
gagtcgtatt acgcgcgctc actggccgtc gttttacaac gtcgtgactg ggaaaaccct 8820
ggcgttaccc aacttaatcg ccttgcagca catccccctt tcgccagctg gcgtaatagc 8880
gaagaggccc gcaccgatcg cccttcccaa cagttgcgca gcctgaatgg cgaatggcgc 8940
gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg cagcgtgacc 9000
gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc ctttctcgcc 9060
acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg gttccgattt 9120
agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc acgtagtggg 9180
ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt ctttaatagt 9240
ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc ttttgattta 9300
taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta acaaaaattt 9360
aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcct gatgcggtat tttctcctta 9420
cgcatctgtg cggtatttca caccgcatag atccgtcgag ttcaagagaa aaaaaaagaa 9480
aaagcaaaaa gaaaaaagga aagcgcgcct cgttcagaat gacacgtata gaatgatgca 9540
ttaccttgtc atcttcagta tcatactgtt cgtatacata cttactgaca ttcataggta 9600
tacatatata cacatgtata tatatcgtat gctgcagctt taaataatcg gtgtcaatgt 9660
ctgcccctat gtctgcccct aagaagatcg tcgttttgcc aggtgaccac gttggtcaag 9720
aaatcacagc cgaagccatt aaggttctta aagctatttc tgatgttcgt tccaatgtca 9780
agttcgattt cgaaaatcat ttaattggtg gtgctgctat cgatgctaca ggtgtcccac 9840
ttccagatga ggcgctggaa gcctccaaga aggttgatgc cgttttgtta ggtgctgtgg 9900
gtggtcctaa atggggtgcc ggtagtgtta gacctgaaca aggtttacta aaaatccgta 9960
aagaacttca attgtacgcc aacttaagac catgtaactt tgcatccgac tctcttttag 10020
acttatctcc aatcaagcca caatttgcta aaggtactga cttcgttgtt gtcagagaat 10080
tagtgggagg tatttacttt ggtaagagaa aggaagacga tggtgatggt gtcgcttggg 10140
atagtgaaca atacaccgtt ccagaagtgc aaagaatcac aagaatggcc gctttcatgg 10200
ccctacaaca tgagccacca ttgcctattt ggtccttgga taaagctaat gttttggcct 10260
cttcaagatt atggagaaaa actgtggagg aaaccatcaa gaacgaattc cctacattga 10320
aggttcaaca tcaattgatt gattctgccg ccatgatcct agttaagaac ccaacccacc 10380
taaatggtat tataatcacc agcaacatgt ttggtgatat catctccgat gaagcctccg 10440
ttatcccagg ttccttgggt ttgttgccat ctgcgtcctt ggcctctttg ccagacaaga 10500
acaccgcatt tggtttgtac gaaccatgcc acggttctgc tccagatttg ccaaagaata 10560
aggttgaccc tatcgccact atcttgtctg ctgcaatgat gttgaaattg tcattgaact 10620
tgcctgaaga aggtaaggcc attgaagatg cagttaaaaa ggttttggat gcaggtatca 10680
gaactggtga tttaggtggt tccaacagta ccaccgaagt cggtgatgct gtcgccgaag 10740
aagttaagaa aatccttgct taactttgcc ttcgtttatc ttgcctgctc attttttagt 10800
atattcttcg aagaaatcac attactttat ataatgtata attcattatg tgataatgcc 10860
aatcgctaag aaaaaaaaag agtcatccgc taggggaaaa aaaaaaatga aaatcattac 10920
cgaggcataa aaaaatatag agtgtactag aggaggccaa gagtaataga aaaagaaaat 10980
tgcgggaaag gactgtgtta tgacttccct gactaatgcc gtgttcaaac gatacctggc 11040
agtgactcct agcgctcacc aagctcttaa aacgggaatt tatggtgcac tctcagtaca 11100
atctgctctg atgccgcata gttaagccag ccccgacacc cgccaacacg cgctgacgcg 11160
ccctgacggg cttgtctgct cccggcatcc gcttacagac aagctgtgac cgtctccggg 11220
agctgcatgt gtcagaggtt ttcaccgtca tcaccgaaac gcgcgagacg aaagggcctc 11280
gtgatacgcc tatttttata ggttaatgtc atgataataa tggtttctta ggacggatcg 11340
cttgcctgta acttacacgc gcctcgtatc ttttaatgat ggaataattt gggaatttac 11400
tctgtgttta tttattttta tgttttgtat ttggatttta gaaagtaaat aaagaaggta 11460
gaagagttac ggaatgaaga aaaaaaaata aacaaaggtt taaaaaattt caacaaaaag 11520
cgtactttac atatatattt attagacaag aaaagcagat taaatagata tacattcgat 11580
taacgataag taaaatgtaa aatcacagga ttttcgtgtg tggtcttcta cacagacaag 11640
atgaaacaat tcggcattaa tacctgagag caggaagagc aagataaaag gtagtatttg 11700
ttggcgatcc ccctagagtc ttttacatct tcggaaaaca aaaactattt tttctttaat 11760
ttcttttttt actttctatt tttaatttat atatttatat taaaaaattt aaattataat 11820
tatttttata gcacgtgatg aaaaggaccc aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg 11880
aacccctatt tgtttatttt tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata 11940
accctgataa atgcttcaat aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc aacatttccg 12000
tgtcgccctt attccctttt ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac 12060
gctggtgaaa gtaaaagatg ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact 12120
ggatctcaac agcggtaaga tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat 12180
gagcactttt aaagttctgc tatgtggcgc ggtattatcc cgtattgacg ccgggcaaga 12240
gcaactcggt cgccgcatac actattctca gaatgacttg gttgagtact caccagtcac 12300
agaaaagcat cttacggatg gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat 12360
gagtgataac actgcggcca acttacttct gacaacgatc ggaggaccga aggagctaac 12420
cgcttttttg cacaacatgg gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg aaccggagct 12480
gaatgaagcc ataccaaacg acgagcgtga caccacgatg cctgtagcaa tggcaacaac 12540
gttgcgcaaa ctattaactg gcgaactact tactctagct tcccggcaac aattaataga 12600
ctggatggag gcggataaag ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg 12660
gtttattgct gataaatctg gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca ttgcagcact 12720
ggggccagat ggtaagccct cccgtatcgt agttatctac acgacgggga gtcaggcaac 12780
tatggatgaa cgaaatagac agatcgctga gataggtgcc tcactgatta agcattggta 12840
actgtcagac caagtttact catatatact ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt 12900
taaaaggatc taggtgaaga tcctttttga taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga 12960
gttttcgttc cactgagcgt cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc 13020
tttttttctg cgcgtaatct gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt 13080
ttgtttgccg gatcaagagc taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc 13140
gcagatacca aatactgtcc ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc 13200
tgtagcaccg cctacatacc tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg 13260
cgataagtcg tgtcttaccg ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg 13320
gtcgggctga acggggggtt cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga 13380
actgagatac ctacagcgtg agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc 13440
ggacaggtat ccggtaagcg gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg 13500
gggaaacgcc tggtatcttt atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg 13560
atttttgtga tgctcgtcag gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt 13620
tttacggttc ctggcctttt gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc 13680
tgattctgtg gataaccgta ttaccgcctt tgagtgagct gataccgctc gccgcagccg 13740
aacgaccgag cgcagcgagt cagtgagcga ggaagcggaa gagcgcccaa tacgcaaacc 13800
gcctctcccc gcgcgttggc cgattcatta atgcagctgg cacgacaggt ttcccgactg 13860
gaaagcgggc agtgagcgca acgcaattaa tgtgagttac ctcactcatt aggcacccca 13920
ggctttacac tttatgcttc cggctcctat gttgtgtgga attgtgagcg gataacaatt 13980
tcacacagga aacagctatg accatgatta cgccaagcgc gcaat 14025
<210> 5
<211> 684
<212> DNA
<213> 酿酒酵母
<220>
<221> Acc1启动子
<222> (1)..(463)
<220>
<221> gRNA_3
<222> (53)..(72)
<220>
<221> gRNA_2
<222> (265)..(284)
<220>
<221> gRNA_1
<222> (339)..(358)
<400> 5
ggtagaaact tgattttttc taattttctg cgctgtttcg ggaacggaaa aaaattaagc 60
tagaagacga atcggttatt atactattat atttgtatag tatagtagcg tgtcgtatcg 120
tatcgtgtcg tatcgtatcg tatcgttaaa agaaaataca cgaataaata ataatatgtg 180
gagaagaaaa agggaagttt cttgtctctt gctctgaatc tgaattccaa ttcaagttca 240
aattgttctc tagtttattg tccaaaaata aggatgaagc gggagggaag ggcagaggga 300
aaagttcgta tagtagaatg aataaacttt tataaacaca tgcaccgatc actcacagag 360
gataaaaaaa tggcacaaca aatatatata tatagatgca aatggcgatt gcaaattagg 420
gaattggctt tgttgttttt tatcttcagg taaactgtac gaaagggata aaaagagtag 480
aataaggaaa ggaaaattga agagagcaga acaattgtag aaccgataac aattgtgaca 540
gtgattgtgc taggctatac tgtgccagaa tacgactggg agtgctgttc ttcttatata 600
tcttggcgct gattgagcgt atagcctagt tcaccaagca gtagagagag tggcaatgag 660
cggttgaatt tcgactgcga cttg 684
<210> 6
<211> 971
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PGK1启动子和用于酿酒酵母Acc1启动子的整合序列
<220>
<221> PGK1p
<222> (7)..(750)
<400> 6
tgttttatat ttgttgtaaa aagtagataa ttacttcctt gatgatctgt aaaaaagaga 60
aaaagaaagc atctaagaac ttgaaaaact acgaattaga aaagaccaaa tatgtatttc 120
ttgcattgac caatttatgc aagtttatat atatgtaaat gtaagtttca cgaggttcta 180
ctaaactaaa ccaccccctt ggttagaaga aaagagtgtg tgagaacagg ctgttgttgt 240
cacacgattc ggacaattct gtttgaaaga gagagagtaa cagtacgatc gaacgaactt 300
tgctctggag atcacagtgg gcatcatagc atgtggtact aaaccctttc ccgccattcc 360
agaaccttcg attgcttgtt acaaaacctg tgagccgtcg ctaggacctt gttgtgtgac 420
gaaattggaa gctgcaatca ataggaagac aggaagtcga gcgtgtctgg gttttttcag 480
ttttgttctt tttgcaaaca aatcacgagc gacggtaatt tctttctcga taagaggcca 540
cgtgctttat gagggtaaca tcaattcaag aaggagggaa acacttcctt tttctggccc 600
tgataatagt atgagggtga agccaaaata aaggattcgc gcccaaatcg gcatctttaa 660
atgcaggtat gcgatagttc ctcactcttt ccttactcac gagtaattct tgcaaatgcc 720
tattatgcag atgttataat atctgtgcgt agggataaaa agagtagaat aaggaaagga 780
aaattgaaga gagcagaaca attgtagaac cgataacaat tgtgacagtg attgtgctag 840
gctatactgt gccagaatac gactgggagt gctgttcttc ttatatatct tggcgctgat 900
tgagcgtata gcctagttca ccaagcagta gagagagtgg caatgagcgg ttgaatttcg 960
actgcgactt g 971
<210> 7
<211> 1724
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有酿酒酵母Acc1(S659A; S1167A)编码序列、调节序列和整合序列的盒
<220>
<221> T-G Ser659Ala
<222> (108)..(108)
<220>
<221> T-G Ser1167Ala
<222> (1602)..(1602)
<400> 7
ggcgcgccga gggtaaaaga tacaagttca cggtcgctaa atccggtaat gaccgctaca 60
cattatttat caatggttct aaatgtgata tcatactgcg tcaactagct gatggtgggc 120
tgctgatcgc tatcggcgct aaatcgcata ccatctattg gaaagaagaa gttgctgcta 180
caagattatc cgttgactct atgactactt tgttggaagt tgaaaacgat ccaacccagt 240
tgcgtactcc atcccctggt aaattggtta aattcttggt ggaaaatggt gaacacatta 300
tcaagggcca accatatgca gaaattgaag ttatgaaaat gcaaatgcct ttggtttctc 360
aagaaaatgg tatcgtccag ttattaaagc aacctggttc taccattgtt gcaggtgata 420
tcatggctat tatgactctt gacgatccat ccaaggtcaa gcacgctcta ccatttgaag 480
gtatgctgcc agattttggt tctccagtta tcgaaggaac caaacctgcc tataaattca 540
agtcattagt gtctactttg gaaaacattt tgaagggtta tgacaaccaa gttattatga 600
acgcttcctt gcaacaattg atagaagttt tgagaaatcc aaaactgcct tactcagaat 660
ggaaactaca catctctgct ttacattcaa gattgcctgc taagctagat gaacaaatgg 720
aagagttagt tgcacgttct ttgagacgtg gtgctgtttt cccagctaga caattaagta 780
aattgattga tatggccgtg aagaatcctg aatacaaccc cgacaaattg ctgggcgcag 840
tcgtggaacc attggcggat attgctcata agtactctaa cgggttagaa gcccatgaac 900
attctatatt tgtccatttc ttggaagaat attacgaagt tgaaaagtta ttcaatggtc 960
caaatgttcg tgaggaaaat atcattctga aattgcgtga tgaaaaccct aaagatctag 1020
ataaagttgc gctaactgtt ttgtctcatt cgaaagtttc agcgaagaat aacctgatcc 1080
tagctatctt gaaacattat caaccattgt gcaagttatc ttctaaagtt tctgccattt 1140
tctctactcc tctacaacat attgttgaac tagaatctaa ggctaccgct aaggtcgctc 1200
tacaagcaag agaaattttg attcaaggcg ctttaccttc ggtcaaggaa agaactgaac 1260
aaattgaaca tatcttaaaa tcctctgttg tgaaggttgc ctatggctca tccaatccaa 1320
agcgctctga accagatttg aatatcttga aggacttgat cgattctaat tacgttgtgt 1380
tcgatgtttt acttcaattc ctaacccatc aagacccagt tgtgactgct gcagctgctc 1440
aagtctatat tcgtcgtgct tatcgtgctt acaccatagg agatattaga gttcacgaag 1500
gtgtcacagt tccaattgtt gaatggaaat tccaactacc ttcagctgcg ttctccacct 1560
ttccgactgt gaagtctaag atgggtatga acagggctgt tgctgtttca gatttgtcat 1620
atgttgcaaa cagtcagtca tctccgttaa gagaaggtat tttgatggct gtggatcatt 1680
tagatgatgt tgatgaaatt ttgtcacaaa gtttggggcg cgcc 1724
<210> 8
<211> 3256
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有酿酒酵母Maf1编码序列、调节序列和整合序列的盒
<220>
<221> L0
<222> (362)..(401)
<220>
<221> Tef1
<222> (402)..(895)
<220>
<221> L1
<222> (896)..(935)
<220>
<221> MAF1
<222> (936)..(2123)
<220>
<221> L2
<222> (2124)..(2163)
<220>
<221> PRM9t
<222> (2164)..(2701)
<220>
<221> LTP2
<222> (2702)..(2741)
<400> 8
aatgatttaa gcgtgcgtga agataacact acaatccatt ttaaagcaac atccacattg 60
agtgtataca ccacaaaggt tttttcaggg cgtttttctc gccactttat gttgaccaaa 120
attattaatg gaacttacaa cgtttccaaa agttagttaa atacatacgt ctatttacta 180
agcaagaaat atatcatgac aagcccaaat attatattgt tatgtttaca aaaaaaaaat 240
ggctatatac atcaagtctg gaggcttttt ataacaagca agtggggtaa cttagacata 300
agattgactt ctttgaattc aacaaaaata catacttttg atgatttcaa tggtagaagc 360
ataaacaaca aataatcata aaaattttag aactagacat aaagcaacag gcgcgttgga 420
cttttaattt tcgaggaccg cgaatcctta catcacaccc aatcccccac aagtgatccc 480
ccacacacca tagcttcaaa atgtttctac tcctttttta ctcttccaga ttttctcgga 540
ctccgcgcat cgccgtacca cttcaaaaca cccaagcaca gcatactaaa tttcccctct 600
ttcttcctct agggtgtcgt taattacccg tactaaaggt ttggaaaaga aaaaagagac 660
cgcctcgttt ctttttcttc gtcgaaaaag gcaataaaaa tttttatcac gtttcttttt 720
cttgaaaatt tttttttttg atttttttct ctttcgatga cctcccattg atatttaagt 780
taataaacgg tcttcaattt ctcaagtttc agtttcattt ttcttgttct attacaactt 840
tttttacttc ttgctcatta gaaagaaagc atagcaatct aatctaagtt ttaatctaga 900
aaatttatta taaaaggaag agaaataatt aaacaatgaa atttattgat gagctagata 960
tagagagagt gaatcaaact ctcaatttcg agacaaatga ctgtaaaatc gtgggcagtt 1020
gcgatatttt cacaacaaag gcggttgcat cagatagaaa attatataaa actattgatc 1080
agcatttgga tactatttta caggaaaatg agaattacaa tgctaccctt cagcaacagc 1140
tagctgctcc cgaaacaaac caatcaccct gctcgtcgcc attttattct aataggaggg 1200
atagcaactc tttttgggag caaaagagaa gaatatcttt tagtgaatac aatagcaata 1260
ataacactaa caacagtaat ggcaatagca gtaataacaa taactattct ggacctaatg 1320
gttcttctcc agcaactttt cccaaaagtg ccaagctaaa tgaccaaaat ttaaaagaat 1380
tagtctcgaa ttacgattct ggctctatga gctcatcgtc tcttgattct tcttctaaga 1440
atgatgagag gataagaaga aggagcagta gcagtattag cagtttcaaa agtggtaaat 1500
catcgaacaa taattacagt tctggtacag caaccaacaa tgttaacaaa agaagaaaat 1560
cttcgataaa cgaaaggcca agcaatttaa gtttgggtcc gtttggtccc ataaacgaac 1620
cgtcaagccg caaaatattt gcttatctga ttgctatcct caacgcttct tatcctgacc 1680
atgatttttc atcggttgag ccaacggatt ttgtcaaaac atcattgaaa acttttattt 1740
ccaaatttga aaacacctta tattctcttg gtagacaacc agaggaatgg gtctgggagg 1800
taattaattc tcacatgact ctttctgatt gcgtcctttt tcaatattca ccttcaaact 1860
cttttttgga agatgagcct ggctatcttt ggaatcttat aggttttctt tacaacagga 1920
aaaggaaaag agtggcttac ctttacttga tttgctcgcg tctaaattcg agtacaggcg 1980
aagtggaaga tgccttggca aaaaaacctc agggaaagct tataatagat gatggctcaa 2040
atgaatacga aggagaatac gatttcactt atgatgagaa tgtaatagat gataaatcag 2100
atcaagaaga atccctacag tagagacata aaactgaaac aacaccaatt aataatagac 2160
tttacagaag acgggagaca ctagcacaca actttaccag gcaaggtatt tgacgctagc 2220
atgtgtccaa ttcagtgtca tttatgattt tttgtagtag gatataaata tatacagcgc 2280
tccaaatagt gcggttgccc caaaaacacc acggaacctc atctgttctc gtactttgtt 2340
gtgacaaagt agctcactgc cttattatca cattttcatt atgcaacgct tcggaaaata 2400
cgatgttgaa aatgcctcta gagatgaaaa acaatcgtaa aagggtcctg cgtaattgaa 2460
acatttgatc agtatgcagt ggcacagaaa caaccaggaa tactatagtc ataggcaata 2520
caaggtatat attggctatg cagacccctc cagaaagtac cgacgtcaag ttagatacac 2580
ttaacgaacc tagtgcacat ttaattgaga aaaatgtggc tcttcctaag gacatattcc 2640
gttcgtactt gagttattgg atctatgaaa tcgctcgcta tacaccagtc atgattttgt 2700
ccttaaataa catactcatc actaaacatt cttaacaatc agaaaacaac gcgtcatgaa 2760
aaagagttac tgaaccttca gatcctactt attgtaatgc ttcgcgacat ccaatccatt 2820
taataatcaa tttaaaacta gagttggtag agttccttgt tgaacgtgat aacccaaaag 2880
cataatacga gtaatgtttc agtattgcta ttatatgttt acacaaggaa aacatataat 2940
aacaaacctc taatccggta gtacttaaga aactatagtt tctatgtaca aaaaggtaac 3000
tatgtaattc ttacatttac ataacgtata gaagggtcca ataaacttac taaacttact 3060
accttgttgt atataggcta gatcgtaatc cactacgtca acataaaaaa aacttaagaa 3120
gtttgaattt tatgtacaaa cagattgtta aaatataata taagattatg gaaacgaact 3180
tgctctaaaa aaaatttaaa gttttataaa atcctcgaac tatcgctgtt atacatgatg 3240
tccccaaagc gtgtac 3256
<210> 9
<211> 4662
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有酿酒酵母UPC2E888D编码序列、调节序列和整合序列的盒
<220>
<221> L0
<222> (401)..(440)
<220>
<221> Tef1
<222> (441)..(934)
<220>
<221> L1
<222> (935)..(974)
<220>
<221> UPC2-1
<222> (975)..(3701)
<220>
<221> g-a G888D
<222> (3637)..(3637)
<220>
<221> L2
<222> (3702)..(3741)
<220>
<221> PRM9t
<222> (3742)..(4279)
<220>
<221> LTP2
<222> (4280)..(4319)
<400> 9
cccagttgtt tgtagctggt tcatatttag cggcaattct ctgttgcgta aatgaaaata 60
ttaatgtaaa caaaaaaaga ccaaaacatt ttagcagtgt aagaaggtgt actgatacaa 120
aatgtgttta gagtctactg atatgttact gaccgttcgt tgggaaaaaa atactgtatc 180
atttattaat caaaagcgac ttttggtgga atattatgat atgtgttgtt aaaatatgac 240
gtaattttag aattgtctga ttcgtattca aatttggtga aggaataacg cagagttgac 300
aatttaatag aatggattaa tcgtaatttt cagaaacgta gaaaaagaaa aacaattaaa 360
acattatatt aagattattg atttgccttt taagggtcca taaacaacaa ataatcataa 420
aaattttaga actagacata aagcaacagg cgcgttggac ttttaatttt cgaggaccgc 480
gaatccttac atcacaccca atcccccaca agtgatcccc cacacaccat agcttcaaaa 540
tgtttctact ccttttttac tcttccagat tttctcggac tccgcgcatc gccgtaccac 600
ttcaaaacac ccaagcacag catactaaat ttcccctctt tcttcctcta gggtgtcgtt 660
aattacccgt actaaaggtt tggaaaagaa aaaagagacc gcctcgtttc tttttcttcg 720
tcgaaaaagg caataaaaat ttttatcacg tttctttttc ttgaaaattt ttttttttga 780
tttttttctc tttcgatgac ctcccattga tatttaagtt aataaacggt cttcaatttc 840
tcaagtttca gtttcatttt tcttgttcta ttacaacttt ttttacttct tgctcattag 900
aaagaaagca tagcaatcta atctaagttt taatctagaa aatttattat aaaaggaaga 960
gaaataatta aacaatgagc gaagtcggta tacagaatca caagaaagcg gtgacaaaac 1020
ccagaagaag agaaaaagtc atcgagctaa ttgaagtgga cggcaaaaag gtgagtacga 1080
cttcaaccgg taaacgtaaa ttccataaca aatcaaagaa tgggtgcgat aactgtaaaa 1140
gaagaagagt taagtgtgat gaagggaagc cagcctgtag gaagtgcaca aatatgaagt 1200
tggaatgtca gtatacacca atccatttaa ggaaaggtag aggagcaaca gtagtgaagt 1260
atgtcacgag aaaggcagac ggtagcgtgg agtctgattc atcggtagat ttacctccta 1320
cgatcaagaa ggagcagaca ccgttcaatg atatccaatc agcggtaaaa gcttcaggct 1380
catccaatga ttcctttcca tcaagcgcct ctacaactaa gagtgagagc gaggaaaagt 1440
catcggcccc tatagaggac aaaaacaata tgactcctct aagtatgggc ctccagggta 1500
ccatcaataa gaaagatatg atgaataact ttttctctca aaatggcact attggttttg 1560
gttctcctga aagattgaat tcaggtatcg atggcttact attaccgcca ttgccttctg 1620
gaaatatggg tgcgttccaa cttcagcaac agcagcaagt gcagcagcaa tctcaaccac 1680
agacccaagc gcagcaagca agtggaactc caaacgagag atatggttca ttcgatcttg 1740
cgggtagtcc tgcattgcaa tccacgggaa tgagcttatc aaatagtcta agcgggatgt 1800
tactatgtaa caggattcct tccggccaaa actacactca acaacaatta caatatcaat 1860
tacaccagca gctgcaattg caacagcatc agcaagttca gctgcagcag tatcaacaat 1920
tacgtcagga acaacaccaa caagttcagc aacaacaaca ggaacaactc cagcaatacc 1980
aacaacattt tttgcaacag cagcaacaag tactgcttca gcaagagcaa caacctaacg 2040
atgaggaagg tggcgttcag gaagaaaaca gcaaaaaggt aaaggaaggg cctttacaat 2100
cacaaacaag cgaaactact ttaaacagcg atgctgctac attacaagct gatgcattat 2160
ctcagttaag taagatgggg ctaagcctaa agtcgttaag tacctttcca acagctggta 2220
ttggtggtgt ttcctatgac tttcaggaac tgttaggtat taagtttcca ataaataacg 2280
gcaattcaag agctactaag gccagcaacg cagaggaagc tttggccaat atgcaagagc 2340
atcatgaacg tgcagctgct tctgtaaagg agaatgatgg tcagctctct gatacgaaga 2400
gtccagcgcc atcgaataac gcccaagggg gaagtgctag tattatggaa cctcaggcgg 2460
ctgatgcggt ttcgacaatg gcgcctatat caatgattga aagaaacatg aacagaaaca 2520
gcaacatttc tccatcaacg ccctctgcag tgttgaatga taggcaagag atgcaagatt 2580
ctataagttc tctaggaaat ctgacaaaag cagccttgga gaacaacgaa ccaacgataa 2640
gtttacaaac atcacagaca gagaatgaag acgatgcatc gcggcaagac atgacctcaa 2700
aaattaataa cgaagctgac cgaagttctg tttctgctgg taccagtaac atcgctaagc 2760
ttttagatct ttctaccaaa ggcaatctga acctgataga catgaaactg tttcatcatt 2820
attgcacaaa ggtctggcct acgattacag cggccaaagt ttctgggcct gaaatatgga 2880
gggactacat accggagtta gcatttgact atccattttt aatgcacgct ttgttggcat 2940
tcagtgccac ccatctttcg aggactgaaa ctggactgga gcaatacgtt tcatctcacc 3000
gcctagacgc tctgagatta ttaagagaag ctgttttaga aatatctgag aataacaccg 3060
atgcgctagt tgccagcgcc ctgatactaa tcatggactc gttagcaaat gctagtggta 3120
acggcactgt aggaaaccaa agtttgaata gcatgtcacc aagcgcttgg atctttcatg 3180
tcaaaggtgc tgcaacaatt ttaaccgctg tgtggccttt gagtgaaaga tctaaatttc 3240
ataacattat atctgttgat cttagcgatt taggcgatgt cattaaccct gatgttggaa 3300
caattactga attggtatgt tttgatgaaa gtattgccga tttgtatcct gtcggcttag 3360
attcgccata tttgataaca ctagcttatt tagataaatt gcaccgtgaa aaaaaccagg 3420
gtgattttat tctgcgggta tttacatttc cagcattgct agacaagaca ttcctggcat 3480
tactgatgac aggtgattta ggtgcaatga gaattatgag atcatattat aaactacttc 3540
gaggatttgc cacagaggtc aaggataaag tctggtttct cgaaggagtc acgcaggtgc 3600
tgcctcaaga cgttgatgag tacaggggag gtggtgatat gcatatgatg ctaggattac 3660
catcgatgac aacaacaaat ttctctgatt tttcgttatg aagacataaa actgaaacaa 3720
caccaattaa taatagactt tacagaagac gggagacact agcacacaac tttaccaggc 3780
aaggtatttg acgctagcat gtgtccaatt cagtgtcatt tatgattttt tgtagtagga 3840
tataaatata tacagcgctc caaatagtgc ggttgcccca aaaacaccac ggaacctcat 3900
ctgttctcgt actttgttgt gacaaagtag ctcactgcct tattatcaca ttttcattat 3960
gcaacgcttc ggaaaatacg atgttgaaaa tgcctctaga gatgaaaaac aatcgtaaaa 4020
gggtcctgcg taattgaaac atttgatcag tatgcagtgg cacagaaaca accaggaata 4080
ctatagtcat aggcaataca aggtatatat tggctatgca gacccctcca gaaagtaccg 4140
acgtcaagtt agatacactt aacgaaccta gtgcacattt aattgagaaa aatgtggctc 4200
ttcctaagga catattccgt tcgtacttga gttattggat ctatgaaatc gctcgctata 4260
caccagtcat gattttgtcc ttaaataaca tactcatcac taaacattct taacaatcac 4320
gatggatgat gattggttct tatcataatt tgatttcggc agaagcaata ttagaggtat 4380
tgttgtaacg aaattccaat gtcatctgct tagtattatt aatgttacct gcatattatc 4440
acatgccgct taaaaatgtg ttataagtat taaaatctag tgaaagttga aatgtaatct 4500
aataggataa tgaaacatat gaaacggaat gaggaataat cgttgtatta ctatgtagag 4560
atatcgattt cattttgagg attcctatat tcttggggag aacttctact atattctgta 4620
tacatgatat aatagccttt accaacaatg gaatgccaac aa 4662
<210> 10
<211> 3564
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有构巢曲霉NpgA编码序列、调节序列和整合序列的盒
<220>
<221> LTP1 (L0)
<222> (596)..(635)
<220>
<221> Tef1p
<222> (636)..(1129)
<220>
<221> L1
<222> (1130)..(1169)
<220>
<221> NpgA
<222> (1170)..(2201)
<220>
<221> L2
<222> (2205)..(2244)
<220>
<221> PRM9t
<222> (2245)..(2782)
<220>
<221> LTP2
<222> (2783)..(2822)
<400> 10
tcaatcaaag caacccacaa atcctaggct gaatcatgat atcgatggaa gcaatcaaca 60
attttatcaa gaccgcacca aagcacgact atctgacagg cggagttcat cattctggta 120
atgtagacgt gttacaatta agcggcaata aagaagatgg tagtttagta tggaaccata 180
cttttgttga tgtagacaac aatgtggtag ctaagtttga agacgctctc gaaaaacttg 240
aaagtttgca ccggcgctca tcctcatcca caggcaatga agaacacgct aacgtttaac 300
cgaggggagt cacttcataa tgatgtgaga aataagtgaa tattgtaata attgttggga 360
ctccattgtc aacaaaagct ataatgtagg tatacagtat atactagaag ttctcctcga 420
ggatcttgga atccacaaaa gggagtcgat aaatctatat aataaaaatt actttatctt 480
ctttcgtttt atacgttgtc gtttattatc ctattacgtt atcaatcttc gcatttcagc 540
tttcattaga tttgatgact gtttctcaaa ctttatgtca ttttcttaca ccgcataaac 600
aacaaataat cataaaaatt ttagaactag acataaagca acaggcgcgt tggactttta 660
attttcgagg accgcgaatc cttacatcac acccaatccc ccacaagtga tcccccacac 720
accatagctt caaaatgttt ctactccttt tttactcttc cagattttct cggactccgc 780
gcatcgccgt accacttcaa aacacccaag cacagcatac taaatttccc ctctttcttc 840
ctctagggtg tcgttaatta cccgtactaa aggtttggaa aagaaaaaag agaccgcctc 900
gtttcttttt cttcgtcgaa aaaggcaata aaaattttta tcacgtttct ttttcttgaa 960
aatttttttt tttgattttt ttctctttcg atgacctccc attgatattt aagttaataa 1020
acggtcttca atttctcaag tttcagtttc atttttcttg ttctattaca acttttttta 1080
cttcttgctc attagaaaga aagcatagca atctaatcta agttttaatc tagaaaattt 1140
attataaaag gaagagaaat aattaaacaa tggttcaaga tacctcttct gcttctacct 1200
ctccaatttt gactagatgg tacattgata ccagaccatt gactgcttct actgctgctt 1260
tgccattatt ggaaacttta caaccagccg atcaaatctc cgttcaaaag tactatcact 1320
tgaaggacaa gcacatgtct ttggcttcta acttgttgaa gtacttgttc gttcacagaa 1380
actgcagaat tccatggtcc tctatcgtta tttctagaac tccagatcca catagaaggc 1440
catgttatat tccaccatct ggttctcaag aggattcttt taaagatggt tacaccggta 1500
tcaacgtcga gtttaatgtt tctcatcaag cctccatggt tgctattgct ggtactgctt 1560
ttactccaaa ttctggtggt gattctaagt tgaaaccaga agttggtatc gatattacct 1620
gcgtcaacga aagacaaggt agaaatggtg aagaaaggtc cttggaatct ttgagacagt 1680
acatcgatat cttctccgaa gttttctcta ctgctgaaat ggccaacatt agaagattgg 1740
atggtgtctc ttcttcctca ttgtctgctg atagattggt tgattatggc tacaggttgt 1800
tctatactta ctgggctttg aaagaagcct acattaagat gactggtgaa gccttgttgg 1860
ctccatggtt gagagaattg gaattctcta atgttgttgc tccagctgct gttgctgaat 1920
ctggtgattc tgctggtgat tttggtgaac catatactgg tgttagaacc accttgtaca 1980
agaacttggt tgaagatgtt agaattgaag ttgctgcttt gggtggtgat tacttgtttg 2040
ctactgctgc tagaggtggt ggtattggtg cttcttctag accaggtggt ggtccagatg 2100
gttctggtat tagatctcaa gatccttgga ggccattcaa gaagttggat attgaaaggg 2160
atattcaacc atgtgctact ggtgtatgta actgcttgtc ttaaagacat aaaactgaaa 2220
caacaccaat taataataga ctttacagaa gacgggagac actagcacac aactttacca 2280
ggcaaggtat ttgacgctag catgtgtcca attcagtgtc atttatgatt ttttgtagta 2340
ggatataaat atatacagcg ctccaaatag tgcggttgcc ccaaaaacac cacggaacct 2400
catctgttct cgtactttgt tgtgacaaag tagctcactg ccttattatc acattttcat 2460
tatgcaacgc ttcggaaaat acgatgttga aaatgcctct agagatgaaa aacaatcgta 2520
aaagggtcct gcgtaattga aacatttgat cagtatgcag tggcacagaa acaaccagga 2580
atactatagt cataggcaat acaaggtata tattggctat gcagacccct ccagaaagta 2640
ccgacgtcaa gttagataca cttaacgaac ctagtgcaca tttaattgag aaaaatgtgg 2700
ctcttcctaa ggacatattc cgttcgtact tgagttattg gatctatgaa atcgctcgct 2760
atacaccagt catgattttg tccttaaata acatactcat cactaaacat tcttaacaat 2820
cagaaaatgc aaccgataaa acattataaa tcttcgcggt tatctggcat tgttattaac 2880
caaaaaaatg ccggcctatt acaagctact gttcaataaa tattgttgta atgaagacgg 2940
tccaactgta caaatacagc aaactgtcat atataaggtg tcttatgtga cagcacttgc 3000
gttattgtca gccggagtat gtctttgtcg cattctgggc tttttacttt ctgctcagaa 3060
ggaagtacga acaagaaaaa aaaatcacca atgcttccct tttcagtatt agtttcatat 3120
ttgtttacgt tcaaactcgt cgtttgcgcg ataacctcta aaaaagtcag ttacgtaact 3180
atatcaatca gagaatgcaa aaagcactat cataaaaatg tctctagggg atgtgagaca 3240
tgtcaattat aagaagtgat ggtgtcatag tatatatatc ataaatgatt atcaaagttt 3300
caatcctttg tattttctag tttagcgcca acttttgaca aaacctaaac tttagataat 3360
catcattctt acaattttta tctggatggc aataatctcc tatataaagc ccagataaac 3420
tgtaaaaaga atccatcact atttgaaaaa aagtcatctg gcacgtttaa ttatcagagc 3480
agaaatgatg aagggtgtta gcgccgtcca ttgatgcgcc tggtagtcat gatttacgta 3540
taactaacac atcatgagga cggc 3564
<210> 11
<211> 336
<212> PRT
<213> 土曲霉
<400> 11
Met Ile Gln Gln Val Gln Gln Ala Val Phe Asp Pro Glu Arg Phe Leu
1 5 10 15
Val Asp Ile Glu Glu Thr Cys Arg Ala Ile Gly Ala Pro Tyr Ser Gln
20 25 30
Glu Lys Thr Leu Lys Val Leu Glu Gly Phe Gln Ala Ser Phe Ala Arg
35 40 45
Gly Ala Val Leu Trp Arg Ile Thr Asn Arg Pro Gly Asp Ala Leu Asn
50 55 60
Tyr Arg Phe Tyr Glu Arg Val Ser Ile Asp Ala Val Ser Cys Ala Val
65 70 75 80
Glu Ala Lys Leu Phe Gln Pro Asn His Pro Leu Ser Glu Leu Ile Val
85 90 95
Ser Trp Thr Ala Leu Tyr Pro Gly Ala Ala Gln Gln Ser Cys Asp Phe
100 105 110
Asp Ala Glu Gln Gly Phe Ser Lys Ile Trp Val Tyr Leu Gly Asp Met
115 120 125
Arg Pro Leu Ser Asp Ile Leu Ser Ala Pro His Val Pro Leu Ser Ile
130 135 140
Arg Lys His Ala Thr Thr Phe Tyr Asn Leu Gly Leu Glu Leu Val Arg
145 150 155 160
His Val Ala Ala Asp Phe Thr Ser Asn Thr Ile Asn Ile Tyr Phe Arg
165 170 175
Val Gln Gly Leu Leu Thr Leu Glu Arg Ala Arg Ser Leu Val Arg Leu
180 185 190
Ser Asp Pro Ala Tyr Leu Leu Glu Cys Gly Glu Val Glu Glu Met Arg
195 200 205
Arg Leu Leu Asn Pro Val Gly Phe Thr Phe Ala Val Thr Met Asp Tyr
210 215 220
Ser Thr Gly Asp Ile Lys Arg Val Gly Ile Tyr Ala Leu Lys Leu Ala
225 230 235 240
Pro Gly Thr Tyr Pro Ala Met Asp Glu Arg Leu Lys Ala Thr Arg Ala
245 250 255
Ile Pro Leu Glu Lys Gln Ala Tyr Ile Leu Leu Ser Gln Gly Val Leu
260 265 270
Met Ala Lys Glu Val Ala Ala Ala Phe Pro Val Pro Ser Glu Thr Ala
275 280 285
Ala Val Asn Arg Pro Arg Glu Val Asp Val Glu Val Gly Val Gly Val
290 295 300
Ala Ser Phe Met Phe Gln Pro Thr Thr Pro Ile Ala Pro Thr Val Asp
305 310 315 320
Val Arg Asp Asn Val Val Val Ala Val Phe His Ala Val Glu Ser Pro
325 330 335
<210> 12
<211> 305
<212> PRT
<213> 链霉菌属CL190
<400> 12
Val Ser Gly Glu Thr Asp Ala Glu Glu Leu Cys Ser Ala Ile Glu Glu
1 5 10 15
Thr Ala Arg Leu Val Gly Ala Pro Cys Ser Arg Glu Lys Ile Trp Pro
20 25 30
Ile Leu Thr Glu Tyr Arg Ser Gly Phe Ala Glu Gly Gly Val Val Phe
35 40 45
Ser Ala Gln Ala Gly Glu Asn His Ala Gly Glu Leu Asp Tyr Gly Leu
50 55 60
Ala Val Pro Pro Arg Ile Asp Asp Pro Tyr Ala His Ala Leu Ala His
65 70 75 80
Gly Phe Val Thr Glu Thr Asp His Pro Val Ala Ala Leu Leu Ser Asp
85 90 95
Ile Arg Glu Arg Cys Ala Val Thr Glu His Phe Ala Asp Cys Gly Val
100 105 110
Val Gly Gly Phe Arg Lys Leu Tyr Ala His Phe Pro Arg Asp Leu Gln
115 120 125
Lys Val Ser Glu Ile Ala Asp Ile Pro Ser Met Pro Arg Ala Val Ala
130 135 140
Glu Asn Val Gly Leu Phe Thr Arg Tyr Gly Leu Glu Asn Val Val Met
145 150 155 160
Val Gly Val Asn Tyr Lys Asn Lys Thr Val Ser Leu Tyr Phe Gln Phe
165 170 175
Thr Ala Glu Gly Arg Pro Arg Pro Ser Ala Ile Arg Ser Met Leu Gly
180 185 190
Asp Ile Gly Met Thr Glu Pro Asn Glu Arg Met Leu Asp Phe Ala Ser
195 200 205
Asn Ser Phe Arg Ala Asn Ile Thr Leu Ser Trp Asp Ser Pro Lys Ile
210 215 220
Leu Arg Val Ala Phe Ala Pro Pro Pro Gly Ala Gly Leu Asn Leu Ser
225 230 235 240
Thr Val Pro Ile Pro Thr Gly Pro His Leu Glu Asp Phe Val Thr Arg
245 250 255
Ala Pro Arg Ala Tyr Asp Gly Glu Arg Met Asn Leu Phe Ala Val Lys
260 265 270
Trp Thr Gln Asp Lys Glu Phe Leu Glu Val Cys Ser Tyr Tyr Gln Leu
275 280 285
Pro Ala Gly Tyr Glu Pro Ile Arg Gln Met Glu Ile His Lys Glu Gln
290 295 300
Gly
305
<210> 13
<211> 299
<212> PRT
<213> 链霉菌属CL190
<400> 13
Met Pro Glu Ala Thr Lys Leu Glu Thr Val Phe Ser Ala Val Glu Glu
1 5 10 15
Thr Ala Arg Leu Val Asp Ala Pro Cys Ser Arg Glu Lys Val Trp Pro
20 25 30
Ala Leu Glu Thr Phe Gly Arg Trp Phe Asp Asp Ala His Ile Ile Phe
35 40 45
Ser Met Gly Thr Gly His Lys Tyr Arg Gly Glu Leu Ala Phe Asp Phe
50 55 60
Thr Val Pro Pro Glu Ala Gly Asp Pro Tyr Ala Ala Ala Val Ala Gly
65 70 75 80
Gly Leu Leu Glu Lys Val Asp His Pro Val Thr Gly Leu Phe Ser Glu
85 90 95
Ile Gly Asp Arg Phe Pro Val Asp Ala Tyr Ala Val Asp Tyr Gly Val
100 105 110
Arg Gly Gly Phe Lys Lys Ala Cys Val Phe Phe Pro Leu Ala Arg Pro
115 120 125
Gln Ser Met Lys Ala Leu Ala Glu Leu Pro Ser Ile Pro Pro Ala Leu
130 135 140
Ala Ala His Ala Glu Tyr Phe Ala Ala Ala Gly Leu Asp Gly Lys Val
145 150 155 160
Ser Cys Ile Gly Ile Asp Tyr Gly Ser Arg Thr Trp Asn Leu Tyr Ile
165 170 175
Ser Gly Leu Thr Pro Asp Tyr Thr Arg Pro Asp Ala Ile Val Ala Thr
180 185 190
Leu Gly Glu Met Gly Leu Ser Lys Pro Ser Glu His Met Leu Glu Phe
195 200 205
Ile Ser Thr Ser Phe Ala Met Tyr Pro Thr Phe Gly Trp Asp Thr Thr
210 215 220
Arg Ile Glu Arg Met Cys Phe Ser Thr Arg Thr Ser Asp Pro Asn Leu
225 230 235 240
Leu Pro Ala Arg Ile Glu Pro Asp Val Ala Lys Phe Ala Arg Asp Met
245 250 255
Pro Thr Val His Gly Gly Glu Pro Ser Tyr Val Tyr Ala Gly Thr Val
260 265 270
Ala Arg Gly Glu Glu Phe Phe Lys Leu Ala Ser Tyr Tyr Gln Met Ser
275 280 285
Ser Lys Val Ser Glu Arg Val Arg Pro Ala Asp
290 295
<210> 14
<211> 304
<212> PRT
<213> 链霉菌属CL190
<400> 14
Met Ser Gly Ala Lys Asp Val Glu Arg Val Tyr Ser Ala Met Glu Glu
1 5 10 15
Ala Ala Gly Leu Leu Asn Val Pro Val Ala Arg Asp Lys Ile Trp Pro
20 25 30
Val Leu Thr Ala Tyr Gln Asp Ala Leu Ala Asp Ala Val Ile Val Phe
35 40 45
Ser Met Ala Gly Gly Arg Arg Ser Thr Glu Leu Asp Phe Ser Ile Ser
50 55 60
Val Pro Thr Asp His Gly Asp Pro Phe Thr Thr Ala Leu Glu Arg Gly
65 70 75 80
Leu Thr Glu Lys Glu Asn His Pro Val Asp Asn Leu Leu Ala Glu Leu
85 90 95
Arg Asp Gly Phe Pro Leu Gly Met Tyr Ala Ile Asp Gly Met Val Thr
100 105 110
Thr Gly Phe Lys Lys Ala Tyr Ala Ser Phe Pro Thr Asn Glu Pro Gln
115 120 125
Pro Leu Thr Ala Leu Leu Asp Leu Pro Ser Met Pro Glu Ser Ala Arg
130 135 140
Ala Asn Ala Glu Leu Phe Ala Arg Tyr Gly Leu Asp Lys Val Gln Met
145 150 155 160
Val Ser Val Asp Tyr Pro Lys Arg Gln Val Asn Leu Tyr Phe Ser Asp
165 170 175
Leu Asn Ala Asp His Leu Thr Pro Glu Glu Val Lys Ser Thr Ala Ser
180 185 190
Glu Met Gly Leu Val Glu Pro Thr Asp Met Ala Leu Asp Phe Ala Thr
195 200 205
Gly Ser Phe Ala Val Tyr Pro Thr Leu Gly Tyr Asp Ser Asp Val Val
210 215 220
Asp Arg Ile Thr Tyr Ala Val Ile Ser Val Asp Pro Thr Leu Ala Pro
225 230 235 240
Thr Thr Ser Glu Pro Glu Lys Thr Gln Ile Thr Thr Tyr Ala Asn Ser
245 250 255
Ala Pro Tyr Ala Tyr Ala Gly Glu Asn Arg Thr Leu Val Tyr Gly Phe
260 265 270
Thr Leu Thr Ser Lys Glu Glu Tyr Tyr Lys Leu Gly Ser Tyr Tyr Gln
275 280 285
Ile Thr Asp Leu Gln Arg Thr Leu Val Lys Ala Phe Glu Ala Leu Asp
290 295 300
<210> 15
<211> 299
<212> PRT
<213> 链霉菌属CL190
<400> 15
Met Ser Ala Glu Pro Ala Ile Glu Arg Leu Cys Val Ala Ala Glu Asp
1 5 10 15
Ala Ala Gly Ile Val Gly Leu Glu Cys Pro Arg Glu Lys Met Thr Ala
20 25 30
Val Leu Thr Ala Phe Pro Asn Val Val Thr Asp Ser Thr Val Val Phe
35 40 45
Asn Val Val Asn Lys Gly Gly Arg Val Gly Asp Met Ser Phe Asp Phe
50 55 60
Thr Val Pro Leu Ala Ala Gly Asp Pro Tyr Glu Arg Ala Leu Ala His
65 70 75 80
Gly Leu Ala Glu Lys Thr Asn His Pro Val Arg Gly Met Phe Ala Asp
85 90 95
Met Leu Thr Thr Leu Pro Val Asp Cys Tyr Gly Val Asp Tyr Gly Val
100 105 110
Asn Gly Gly Phe Asn Lys Ala Tyr Ala Val Phe Pro Met Gly Arg Leu
115 120 125
Gln Glu Leu Asp Lys Leu Ala Ala Val Pro Ala Met Ala Asp Thr Leu
130 135 140
Ser Lys Trp Met Gly Gln Leu Val Asp Tyr Gly Leu Asp Gly Arg Val
145 150 155 160
Ser Thr Val Ala Val Asp His Ala Asn Arg Thr Trp Asn Val Tyr Phe
165 170 175
Asn Gly Leu Ser Ala Glu His Phe Glu Arg Pro Thr Leu Gln Ala Met
180 185 190
Ile Arg Asp Phe Gly Leu Pro Glu Pro Ser Ala Gln Leu Leu Asp Phe
195 200 205
Ala Glu Thr Ser Ser Ala Leu Tyr Pro Thr Phe Ser Trp Asp Ser Pro
210 215 220
Glu Ile Glu Arg Val Ser Phe Ser Thr Arg Thr Thr Asp Pro Asn Ala
225 230 235 240
Leu Pro Ala His Val Glu Pro Lys Leu Gly Ala Leu Ala Ala Asn Ala
245 250 255
Pro Tyr Thr Tyr Asp Gly Asp Arg Arg Leu Val Phe Ala Gly Ala Leu
260 265 270
Thr Thr Gly Gly Glu Tyr Tyr Lys Leu Ala Thr Tyr Tyr Gln Met Ala
275 280 285
Thr Ala Ala His Asp Arg Val Arg Arg Gly Ser
290 295
<210> 16
<211> 296
<212> PRT
<213> 链霉菌属CL190
<400> 16
Met Ser Ala Thr Ala Glu Met Asp Glu Leu Tyr Ala Val Ile Glu Gln
1 5 10 15
Ser Ala Arg Thr Leu Gly Val Pro Cys Ala Pro Glu Lys Val Arg Pro
20 25 30
Val Leu Ala Ala Tyr Glu Asp Ala Phe Gly His Ala Ala Thr Val Val
35 40 45
Ala Phe Arg Val Ala Thr Ser Ile Arg His Ala Gly Glu Leu Asp Cys
50 55 60
Arg Phe Thr Thr His Pro Asp Glu Arg Asp Pro Tyr Ala Thr Ala Leu
65 70 75 80
Ala Ala Gly Leu Ala Gly Arg Thr Asp His Pro Val Gly Ala Val Leu
85 90 95
Ala Gln Leu Gln Gly Arg Cys His Val Asp Ser His Gly Ile Asp Phe
100 105 110
Gly Val Val Gly Gly Phe Lys Lys Val Tyr Ala Phe Phe Thr Pro Asp
115 120 125
Asp Leu Gln Glu Val Ala Lys Phe Ala Asp Leu Pro Ala Met Pro Arg
130 135 140
Ala Leu Ala Glu His Thr Gly Phe Phe Ala Arg His Gly Leu Ala Asp
145 150 155 160
Arg Val Gly Val Val Gly Val Asp Tyr Gly His Arg Thr Leu Asn Val
165 170 175
Tyr Phe Asn Asp Val Pro Ala Gln Leu Phe Glu Pro Gly Thr Ile Thr
180 185 190
Ala Thr Leu Arg Glu Leu Gly Met Ala Arg Pro Ser Glu Gln Met Leu
195 200 205
Lys Leu Gly Arg Glu Ala Phe Gly Leu Tyr Val Thr Leu Gly Trp Asp
210 215 220
Ser Pro Arg Ile Glu Arg Ile Cys Tyr Ala Val Thr Thr Ala Asp Leu
225 230 235 240
Ala Ala Leu Pro Val Pro Val Glu Pro Glu Ile Glu Arg Phe Val Arg
245 250 255
Gly Val Pro Ala Asp Asp Gly Asp Arg Lys Phe Val Tyr Gly Val Ala
260 265 270
Val Ala Pro Glu Gly Glu Tyr Tyr Lys Leu Glu Ser His Tyr Arg Trp
275 280 285
Lys Pro Gly Thr Met Asp Phe Ile
290 295
<210> 17
<211> 305
<212> PRT
<213> 链霉菌属CL190
<400> 17
Met Ser Gly Thr Ala Glu Leu Glu Lys Val Tyr Ser Ala Ile Glu Glu
1 5 10 15
Ser Ala Arg Leu Val Gly Val Ala Cys Ser Arg Asp Asn Val Trp Pro
20 25 30
Ile Leu Thr Ala Phe Gly Glu Ser Ile Glu Asp Ala Leu Met Val Phe
35 40 45
Ser Leu Gln Thr Gly Gly Arg His Ala Gly Glu Leu Asp Tyr Ser Phe
50 55 60
Thr Ala Pro Pro Gly Ile Gly Asp Pro Tyr Pro Arg Ala Leu Ser Tyr
65 70 75 80
Gly Phe Val Thr Glu Thr Asp His Pro Val Gly Ser Val Leu Ser Asp
85 90 95
Leu Gln Gly Arg Trp Ala Ile Arg Glu His Phe Val Asp Cys Gly Val
100 105 110
Thr Gly Gly Phe Lys Lys Leu Tyr Ala His Phe Pro Gln Asp Leu Gln
115 120 125
Pro Ala Ala Arg Leu Ala Glu Ile Pro Ser Val Pro Arg Ala Val Ala
130 135 140
Asp Asn Ala Gly Leu Phe Ala Arg Tyr Gly Leu Asp Arg Val Ala Met
145 150 155 160
Val Gly Val Asp Tyr Gln Arg Arg Thr Met Asn Leu Tyr Phe Gln Phe
165 170 175
Thr Pro Asp Gly Arg Pro Glu Pro Gly Ala Leu Arg Ser Met Leu Arg
180 185 190
Glu Ile Gly Leu His Glu Ala Asp Glu Gly Met Leu Glu Phe Ala Ser
195 200 205
Arg Ser Met Arg Ala Asn Ile Thr Phe Ser Trp Asp Thr Ser Arg Ile
210 215 220
Val Arg Val Ala Phe Ala Pro Pro Pro Gly Lys Gly Leu Asp Pro Ala
225 230 235 240
Ala Val Pro Ala Pro Ile Glu Pro His Ile Ala Arg Phe Ala Thr Ser
245 250 255
Ala Pro Tyr Ala Tyr Ala Gly Glu Arg Met Asn Leu Phe Gly Val Lys
260 265 270
Trp Phe Pro Asp Gly Glu Phe Ile Asp Val Cys Ala Tyr Tyr Gln Leu
275 280 285
Ser Ala Gly Tyr Glu Pro Val Arg Leu Met Glu Thr His Lys Asn Pro
290 295 300
Thr
305
<210> 18
<211> 296
<212> PRT
<213> 暗黑链霉菌
<400> 18
Met Ser Gly Thr Pro Glu Val Ala Glu Leu Tyr Ser Ala Ile Glu Glu
1 5 10 15
Ser Ala Arg Leu Leu Asp Val Ala Cys Ser Arg Asp Lys Val Trp Pro
20 25 30
Ile Leu Thr Thr Tyr Gly Asp Ala Phe Ser His Ala Ala Thr Val Val
35 40 45
Ala Phe Arg Val Ala Thr Gly Gly Arg His Val Gly Glu Leu Asp Cys
50 55 60
Arg Phe Thr Thr His Pro Asn Asp Arg Asp Pro Tyr Ala Phe Ala Leu
65 70 75 80
Ser Asn Gly Leu Thr Arg Gln Thr Asp His Pro Val Gly Ala Leu Leu
85 90 95
Leu Asp Leu Gln Gly Arg Cys Pro Ile Asp Ser Tyr Gly Ile Asp Phe
100 105 110
Gly Val Val Gly Gly Phe Lys Lys Ile Tyr Ala Phe Phe Thr Pro Asp
115 120 125
Asn Leu Gln Lys Leu Ser Arg Ile Ala Asp Leu Pro Ser Met Pro Gly
130 135 140
Ser Leu Ala Glu Asn Gly Asp Phe Phe Ala Arg His Gly Leu Asp Asp
145 150 155 160
Arg Val Gly Val Ile Gly Ile Asp Tyr Pro His Arg Thr Val Asn Val
165 170 175
Tyr Phe Asn Glu Val Pro Ala Glu Cys Phe Glu Ser Lys Thr Ile Leu
180 185 190
Ser Met Leu Arg Glu Ile Gly Leu Pro Glu Pro Ser Glu Gln Met Leu
195 200 205
Arg Leu Gly Gln Glu Ala Phe Gly Leu Tyr Val Thr Leu Asn Trp Asp
210 215 220
Ser Ser Lys Ile Glu Arg Ile Cys Tyr Ala Val Thr Thr Ala Asp Leu
225 230 235 240
Ala Thr Leu Pro Val Arg Met Glu Pro Glu Ile Glu Gln Phe Val Lys
245 250 255
Asp Val Pro Asn Gly Gly Ala Asp Arg Lys Phe Val Tyr Gly Val Ala
260 265 270
Ser Ser Pro Glu Gly Glu Tyr Tyr Lys Leu Glu Ser His Tyr Lys Trp
275 280 285
Lys Pro Gly Met Met Asp Phe Ile
290 295
<210> 19
<211> 304
<212> PRT
<213> 肉桂地链霉菌
<400> 19
Met Ser Pro Val Thr Gly Thr Glu Glu Val Tyr Ala Ala Val Ala Ala
1 5 10 15
Ala Ala Arg Leu Ala Gly Val Pro Cys Thr Arg Glu Lys Val His Pro
20 25 30
Val Leu Ser Ala Tyr Gly Glu Gly Leu Glu Arg Ala Gly Val Val Tyr
35 40 45
Ser Val Ser Thr Ser His Ser Thr Pro Thr Glu Leu Asp Tyr Thr Val
50 55 60
Thr Val Pro Ala Ala Gly Glu Asp Pro Tyr Ala Thr Ala Val Arg His
65 70 75 80
Gly Phe Val Thr Pro Asp Gly His Pro Val His Thr Leu Leu Ser His
85 90 95
Leu Gln Ser Arg Cys Glu Ile Ser Glu Tyr Leu Val Asp Gly Gly Val
100 105 110
Val Gly Gly Phe Asn Lys Ile Tyr Ala His Phe Pro Gln Asp Val Gln
115 120 125
Lys Ile Ser Arg Leu Ala Glu Leu Pro Gly Met Pro Pro Ala Leu Ala
130 135 140
Arg Cys Ala Ala Leu Leu Glu Arg His Gly Leu Ser Asp Val Ala Met
145 150 155 160
Ile Gly Ile Asp Tyr Pro Arg Arg Thr Leu Asn Leu Tyr Phe Thr Gln
165 170 175
Leu Ser Glu Glu Cys Arg Ala Pro Gln Thr Ile Leu Ser Leu His Arg
180 185 190
Glu Ile Gly Leu Pro Ala Pro Gly Gln Pro Met Leu Asp Phe Ala Arg
195 200 205
Arg Ser Phe Arg Ile Tyr Thr Thr Leu Ser Trp Asp Ser Ala Gly Ile
210 215 220
Glu Arg Ile Cys Tyr Ala Pro Pro Pro Ala Arg Gly Trp Asp Pro Ala
225 230 235 240
Ala Leu Pro Ala Glu Ile Thr Glu Gln Val Arg Gly Phe Val Asp Gly
245 250 255
Ala Pro Arg Ala Tyr Glu Gly Glu Pro Ile Val Ile Ala Ala Val Lys
260 265 270
Trp Ala Pro Glu Gly Pro Tyr Leu Asn Leu Gly Pro Tyr Tyr Gln Leu
275 280 285
Ser Pro Leu Met Arg Lys Val Ile Ser Ala Val His Asn Lys Glu Ile
290 295 300
<210> 20
<211> 303
<212> PRT
<213> 绿青链霉菌
<400> 20
Met Glu Gly Glu Met Ser Glu Ala Ser Glu Leu Ala Val Ile Tyr Ser
1 5 10 15
Ala Ile Glu Glu Thr Ala Gln Leu Leu Asp Val Pro Cys Ser Arg Asp
20 25 30
Lys Val Gln Pro Ala Leu Ala Ala Phe Gly Asp Gly Leu Thr Asp Ala
35 40 45
His Ile Val Phe Ser Met Ala Thr Gly Glu Arg Tyr Lys Gly Glu Leu
50 55 60
Ala Phe Asp Phe Thr Val Pro Thr Ala Ala Gly Asp Pro Tyr Ala Ile
65 70 75 80
Ala Leu Ala Asn Gly Leu Val Asp Glu Thr Asp His Pro Ile Arg Ser
85 90 95
Leu Phe Ser Asp Val Gln Glu Arg Cys Pro Val Asp Ser Tyr Gly Val
100 105 110
Asp Tyr Gly Leu Val Gly Gly Phe Lys Lys Thr Tyr Val Ser Phe Pro
115 120 125
Leu Gly Asp Leu Gln Gly Leu Ser Thr Leu Val Asp Val Pro Ser Met
130 135 140
Pro Arg Ala Leu Ala Glu His Ala Asp Phe Phe Ala Ser His Gly Leu
145 150 155 160
Asp Asp Lys Val Ser Ala Ile Ala Ile Asp Tyr Ala His Arg Thr Trp
165 170 175
Asn Val Tyr Phe Ser Gly Ile Pro Ala Glu Val Lys Glu Pro Gln Thr
180 185 190
Leu Arg Ser Val Leu Gln Arg Phe Gly Leu Pro Glu Pro Ser Glu Arg
195 200 205
Leu Met Glu Phe Ile Arg Thr Ser Phe Ala Met Tyr Thr Thr Phe Gly
210 215 220
Trp Asp Ser Thr Lys Ala Glu Arg Ile Cys Phe Ser Ala Arg Ser Ser
225 230 235 240
Asp Pro Met Ala Leu Pro Ala Gln Phe Glu Pro Gln Ile Ala Lys Phe
245 250 255
Ala Lys Ser Ala Pro Tyr Thr Tyr Thr Gly Glu Arg Val Leu Thr Tyr
260 265 270
Ala Gly Ala Leu Ser Pro Ser Glu Glu Phe Tyr Lys Leu Ala Ser Phe
275 280 285
Tyr Gln Lys Thr Ser Lys Leu Ser Asp Arg Val Arg Pro Ala Thr
290 295 300
<210> 21
<211> 305
<212> PRT
<213> 唐德链霉菌
<400> 21
Met Ser Gly Ala Ala Asp Val Glu Arg Val Tyr Ala Ala Met Glu Glu
1 5 10 15
Ala Ala Gly Leu Leu Asp Val Ser Cys Ala Arg Glu Lys Ile Tyr Pro
20 25 30
Leu Leu Thr Val Phe Gln Asp Thr Leu Thr Asp Gly Val Val Val Phe
35 40 45
Ser Met Ala Ser Gly Arg Arg Ser Thr Glu Leu Asp Phe Ser Ile Ser
50 55 60
Val Pro Val Ser Gln Gly Asp Pro Tyr Ala Thr Val Val Lys Glu Gly
65 70 75 80
Leu Phe Arg Ala Thr Gly Ser Pro Val Asp Glu Leu Leu Ala Asp Thr
85 90 95
Val Lys His Leu Pro Val Ser Met Phe Ala Ile Asp Gly Glu Val Thr
100 105 110
Gly Gly Phe Lys Lys Thr Tyr Ala Phe Phe Pro Thr Asp Asp Met Pro
115 120 125
Gly Val Ala Gln Leu Thr Glu Ile Pro Ser Met Pro Ala Ser Val Ala
130 135 140
Glu Asn Ala Glu Leu Phe Ala Arg Tyr Gly Leu Asp Lys Val Gln Met
145 150 155 160
Thr Ser Met Asp Tyr Lys Lys Arg Gln Val Asn Leu Tyr Phe Ser Asp
165 170 175
Leu Lys Gln Glu Tyr Leu Gln Pro Glu Ala Val Val Ala Leu Ala Arg
180 185 190
Glu Leu Gly Leu Gln Val Pro Gly Glu Leu Gly Leu Glu Phe Cys Lys
195 200 205
Arg Ser Phe Ala Val Tyr Pro Thr Leu Asn Trp Asp Thr Gly Lys Ile
210 215 220
Asp Arg Leu Cys Phe Ala Ala Ile Ser Thr Asp Pro Thr Leu Val Pro
225 230 235 240
Ser Thr Asp Glu Arg Asp Ile Glu Met Phe Arg Glu Tyr Ala Thr Lys
245 250 255
Ala Pro Tyr Ala Tyr Val Gly Glu Lys Arg Thr Leu Val Tyr Gly Leu
260 265 270
Thr Leu Ser Ser Thr Glu Glu Tyr Tyr Lys Leu Gly Ala Tyr Tyr His
275 280 285
Ile Thr Asp Ile Gln Arg Gln Leu Leu Lys Ala Phe Asp Ala Leu Glu
290 295 300
Asp
305
<210> 22
<211> 296
<212> PRT
<213> 相模原小单孢菌
<400> 22
Met Pro Gly Thr Ser Glu Ala Ala Glu Leu Cys Ser Thr Ile Glu Glu
1 5 10 15
Ser Ala Arg Leu Leu Asn Val Ala Tyr Ser Arg Asp Arg Val Trp Ser
20 25 30
Leu Leu Ser Ala Tyr Gly Asp Ala Phe Ala His Pro Gly Ala Val Val
35 40 45
Ala Phe Arg Val Ala Thr Ala Met Arg His Val Gly Glu Leu Asp Cys
50 55 60
Arg Phe Thr Thr His Pro Asp Asp Arg Asp Pro Tyr Ala Arg Ala Leu
65 70 75 80
Ser His Gly Leu Thr Pro Glu Thr Asp His Pro Val Gly Ser Leu Leu
85 90 95
Ala Glu Val Gln Gly Arg Cys Pro Val Glu Ser His Gly Ile Asp Phe
100 105 110
Gly Val Val Gly Gly Phe Lys Lys Ile Tyr Ala Phe Phe Thr Pro Asp
115 120 125
Asp Leu Gln Lys Thr Ser Lys Leu Ala Glu Ile Pro Ala Met Pro Arg
130 135 140
Ser Leu Ala Gly Asn Val Glu Phe Phe Ala Arg His Gly Leu Asp Asp
145 150 155 160
Arg Val Gly Val Phe Gly Ile Asp Tyr Pro Ser Arg Thr Val Asn Val
165 170 175
Tyr Phe Asn Asp Val Pro Ala Gly Ser Phe Asp Pro Glu Thr Ile Arg
180 185 190
Ser Thr Leu Arg Glu Ile Gly Met Ala Ala Pro Ser Glu Arg Met Leu
195 200 205
Lys Leu Gly Glu Lys Ala Phe Gly Leu Tyr Val Thr Leu Gly Trp Glu
210 215 220
Ser Ser Arg Ile Glu Arg Ile Cys Tyr Ala Ala Ala Thr Thr Asp Leu
225 230 235 240
Thr Thr Leu Pro Val Pro Val Glu Pro Glu Ile Glu Lys Phe Val Arg
245 250 255
Ser Val Pro Tyr Gly Gly Asp Asp Arg Lys Phe Val Tyr Gly Val Ala
260 265 270
Leu Thr Pro Gln Gly Glu Tyr Tyr Lys Leu Glu Ser His Tyr Arg Trp
275 280 285
Lys Pro Gly Ala Met Asp Phe Ile
290 295
<210> 23
<211> 293
<212> PRT
<213> 链霉菌属
<400> 23
Met Ser Ala Gln Ala Asp Val Glu Thr Val His Ser Ala Ile Glu Lys
1 5 10 15
Ala Ala Gly Leu Leu Asn Leu Thr Cys Ser Pro Gly Thr Val Arg Pro
20 25 30
Ile Leu Glu Ala Phe Gly Pro Phe Glu Gly Gly Val Ile Phe Ser Ala
35 40 45
Ser Ala Gly Glu Gly His Ala Gly Asp Leu Asp Leu Thr Ile Gln Val
50 55 60
Pro Arg Ala Ile Asp Asp Pro Tyr Thr His Ala Leu Thr His Gly Phe
65 70 75 80
Val Pro His Thr Asp His Pro Val Ser Thr Leu Leu Ser Asp Leu Lys
85 90 95
Glu His Val Ser Val Asp Glu Phe Leu Ile Asp Phe Gly Val Ile Ala
100 105 110
Gly Phe Asn Lys Ile Tyr Val His Phe Pro Arg Asp Leu Gln Gly Val
115 120 125
Ala Gln Leu Ala Ala Leu Pro Ser Met Pro Arg Ala Leu Ala Asp Asn
130 135 140
Ala Gln Leu Phe Ala Arg His Gly Leu Asp Lys Val Ala Met Leu Ser
145 150 155 160
Ile Asp Tyr His Lys Arg Thr Ile Asn Pro Phe Phe Thr Phe Pro Asn
165 170 175
Gly Leu Glu Ala Lys Thr Ile Ser Ser Leu Leu His Glu Phe Gly Val
180 185 190
Glu Glu Pro Asp Glu Glu Leu Val Glu Ser Ser Ser Lys Ile Phe Arg
195 200 205
Ala Tyr Pro Thr Leu Gly Trp Glu Ser Ser Lys Ile Asp Arg Ile Ser
210 215 220
Phe Ala Arg Ser Leu Asp Leu Pro Thr Ile Arg Pro Arg Val Ala Pro
225 230 235 240
Glu Ile Val Arg Phe Val Thr Gly Thr Pro Tyr Thr Tyr Asp Gly Asp
245 250 255
Arg Phe Ser Ile Ser Ile Val Lys Trp Ser Pro Asp Asp Thr Trp Phe
260 265 270
Asn Val Gly Ser Tyr Phe Gln Phe Gly Pro Leu Gln Arg Glu Val Leu
275 280 285
Gly Lys Val Leu Arg
290
<210> 24
<211> 309
<212> PRT
<213> 嗜盐糖单孢菌
<400> 24
Val Pro Lys Asp Ala Asp Pro Arg Ser Ser Val Tyr Ser Ala Ile Glu
1 5 10 15
Glu Ala Ala Gly Leu Met Gly Ala Pro Cys Ser Arg Glu Arg Val Trp
20 25 30
Pro Ile Leu Thr Ala Tyr Gly Asp Gly Ile Ser Glu Ala Gly Ile Val
35 40 45
Phe Ser Val Gln Thr Gly Glu Arg His Ala Gly Glu Leu Asp Tyr Thr
50 55 60
Ile Thr Val Pro Ala Asp Gly Pro Asp Pro Tyr Thr Ser Ala Leu Ser
65 70 75 80
Asn Gly Phe Leu Glu Ala Thr Gln His Pro Val Gly Thr Leu Leu Ser
85 90 95
Asp Ile Arg Ala Arg Cys His Ile Ser Glu Tyr Phe Ile Asp Cys Gly
100 105 110
Val Val Gly Gly Phe Asn Lys Val Tyr Ala His Phe Pro His Asp Pro
115 120 125
Leu Ser Val Glu Arg Leu Ala Glu Val Pro Ser Leu Pro Arg Ser Leu
130 135 140
Ala Asp Asn Leu Gly Phe Phe Leu Arg His Ala Leu Arg Asp Val Ala
145 150 155 160
Met Ile Ala Ile Asp Tyr Arg Lys Lys Thr Val Asn Leu Tyr Phe Ala
165 170 175
Gln Leu Ser Ala Glu Cys Leu Arg Ser Ala Asn Ile Arg Ala Met Leu
180 185 190
Arg Glu Ser Gly Leu Ser Glu Leu Asp Gly Pro Met Leu Asp Phe Ala
195 200 205
Leu Gly Ser Phe Arg Ile Tyr Val Thr Leu Ala Trp Asp Ser Ala Gly
210 215 220
Val Glu Arg Ile Ser Phe Ala Ser Leu Met Ser Ser Gly Trp Val Asn
225 230 235 240
Ala Ala Leu Ser Glu Phe Pro Val Arg Ile Glu Pro Glu Ile Glu Arg
245 250 255
Phe Val Lys Asn Ala Pro Gln Ala Tyr Ser Gly Asp Arg Val Arg Ile
260 265 270
Leu Ala Ile Lys Ser Ser Pro Gly Asp Glu Cys Leu Asn Phe Gly Ser
275 280 285
Tyr Tyr Gln Ile Ser Pro Val Val Arg Asn Leu Leu Ala Ala Arg Ala
290 295 300
Gly Asp Ala Glu Gln
305
<210> 25
<211> 298
<212> PRT
<213> 链霉菌属
<400> 25
Met Ser Gly Thr Ala Asp Ile Glu Arg Leu Tyr Pro Val Val Glu Glu
1 5 10 15
Ala Ala Gly Leu Leu Asp Ile Ala Cys Pro Pro Glu Arg Met Arg Pro
20 25 30
Val Leu Thr Ala Phe Arg Asp Ala Leu Ala Asp Pro Val Val Phe Asn
35 40 45
Ala Val Thr Lys Gly Gly Arg Ile Ala Asp Leu Ser Phe Asp Phe Thr
50 55 60
Leu Pro Ala Ser Ala Gly Asp Pro Tyr Ala Ile Ala Val Ala His Gly
65 70 75 80
Leu Ala Glu Glu Thr Asp His Pro Ile Arg Thr Leu Phe Ser Asp Leu
85 90 95
Arg Ala Arg Leu Pro Val Gln Gly Tyr Gly Val Asp Tyr Gly Val Asn
100 105 110
Gly Gly Phe Asn Lys Thr Tyr Ala Phe Phe Pro Leu Gly Asp Leu Gln
115 120 125
Ala Leu Ala Glu Leu Ala Ala Leu Pro Ser Met Pro Pro Ala Leu Ser
130 135 140
Glu His Leu Ala Leu Phe Thr Glu His Gly Leu Gly His Lys Val Ser
145 150 155 160
Ala Leu Ala Ile Asp Tyr Ala Arg Arg Thr Trp Asn Val Tyr Phe Asn
165 170 175
Gly Leu Pro Ala Asp Phe Val Arg Arg Thr Ala Val Leu Pro Met Leu
180 185 190
Arg Ala Phe Gly Leu Pro Glu Pro Ser Glu Gln Leu Leu Asp Phe Ile
195 200 205
Glu Thr Ser Ser Ala Leu Tyr Pro Thr Phe Gly Trp Asp Ser Ser Lys
210 215 220
Ile Glu Arg Ile Ser Phe Ser Thr Arg Thr Thr Asn Pro Val Ala Leu
225 230 235 240
Pro Ala Arg Ile Glu Pro Lys Leu Glu Lys Phe Ala Arg Ser Ala Pro
245 250 255
Tyr Ala Tyr Glu Gly Glu Arg Val Leu Val Tyr Ala Gly Ala Leu Ser
260 265 270
Pro Ser Glu Glu Tyr Tyr Lys Leu Ala Thr Tyr Tyr Arg Met Ser Ala
275 280 285
Ala Ala His Asp Arg Val Arg Ala Ala Asn
290 295
<210> 26
<211> 306
<212> PRT
<213> 链霉菌属
<400> 26
Met Ser Lys Ala Thr Glu Val Asp Arg Val Tyr Ala Ala Val Glu Lys
1 5 10 15
Ala Ala Ala Leu Ala Gly Thr Thr Cys Ala Gly Asp Lys Val Arg Pro
20 25 30
Val Leu Thr Gly His Gln Asp Leu Leu Asp Glu Ala Val Ile Val Phe
35 40 45
Ser Met Thr Ala Ser Gly Ser His Ser Gly Gly Leu Asp Leu Ser Met
50 55 60
Thr Val Pro Ala Glu His Val Asp Pro Tyr Ser Phe Ala Leu Ser Glu
65 70 75 80
Gly Leu Ile Glu Pro Thr Asp His Pro Val Gly Ser Val Ile Ser Asp
85 90 95
Phe Gln Glu Arg Phe Pro Ile Gly Met Tyr Gly Ile Asp Val Asp Val
100 105 110
Ala Gly Gly Phe Lys Lys Ala Tyr Ala Ala Phe Pro Ser Asn Asp Leu
115 120 125
Arg Glu Leu Lys Gln Leu Phe Asp Leu Pro Ser Met Pro Ser Ala Ala
130 135 140
Ala Glu Asn Ala Glu Leu Phe Ala Arg Tyr Gly Leu Asp Arg Val Thr
145 150 155 160
Gly Val Ser Val Asp Tyr Lys Arg His Glu Leu Asn Leu Tyr Cys Asp
165 170 175
Arg Ala Thr Thr Glu Pro Leu Asp Pro Asp Tyr Val Gln Ser Met Leu
180 185 190
Arg Asp Met Gly Leu Lys Glu Ala Ser Glu Gln Gly Leu Glu Phe Ala
195 200 205
Lys Lys Thr Phe Ala Ile Tyr Pro Thr Leu Asn Trp Asp Ser Ser Glu
210 215 220
Ile Val Arg Ile Cys Phe Ala Val Ile Thr Thr Asp Pro Ala Thr Thr
225 230 235 240
Pro Thr Arg Ser Glu Pro Glu Leu Gly Gln Met Trp Glu Tyr Ala Asn
245 250 255
Thr Ala Pro Tyr Ala Tyr Val Gly Glu Gln Arg Ala Leu Val Tyr Gly
260 265 270
Leu Ala Leu Ser Pro Glu Lys Glu Tyr Tyr Lys Leu Gly Ala Tyr Tyr
275 280 285
Gln Ile Ser Asp Tyr Gln Arg Lys Leu Val Lys Ala Phe Asp Ala Leu
290 295 300
Pro Glu
305
<210> 27
<211> 311
<212> PRT
<213> 链霉菌属
<400> 27
Met Tyr Gly Gly Thr Glu Val Glu Glu Val Tyr Ser Ala Leu Glu Lys
1 5 10 15
Ser Ala Gly Leu Val Gly Val Pro Cys Asn Arg Asp Lys Val Trp Pro
20 25 30
Ala Leu Ser Thr Tyr Gln Asp Ala Leu Gly Glu Ala Val Ile Val Phe
35 40 45
Ser Val Ala Thr Asp Glu Arg His Ala Gly Glu Leu Asp Tyr Thr Ile
50 55 60
Thr Val Pro Thr Gly Gly Ala Asp Pro Tyr Ala Leu Ala Leu Ala Lys
65 70 75 80
Gly Leu Thr Pro Glu Thr Asp His Pro Val Gly Thr Leu Leu Ala Gly
85 90 95
Val Gln Glu Arg Cys Pro Val Ala Gly Tyr Ala Val Asp Cys Gly Val
100 105 110
Val Gly Gly Phe Lys Lys Ile Tyr Ser Phe Phe Pro Gln Asp Asp Leu
115 120 125
Gln Gly Leu Ala Lys Leu Ala Glu Ile Pro Ser Met Pro Arg Ala Leu
130 135 140
Ala Glu Asn Ala Ala Leu Phe Ala Arg His Gly Leu Asp His Lys Val
145 150 155 160
Thr Met Leu Gly Ile Asp Tyr Gln Arg Glu Ser Val Asn Leu Tyr Phe
165 170 175
Gly Lys Leu Pro Glu Glu Cys Leu Gln Pro Asp Ser Ile Arg Ala Ile
180 185 190
Leu Arg Asp Ile Gly Leu Pro Glu Pro Thr Glu Pro Met Leu Glu Phe
195 200 205
Ala Arg Lys Ser Phe Ala Ile Tyr Val Thr Leu Ser Trp Asp Ala Ala
210 215 220
Lys Val Glu Arg Ile Cys Phe Ala Val Pro Pro Gly Arg Asp Leu Ile
225 230 235 240
Thr Leu Asp Pro Ser Ala Leu Pro Ala Arg Ile Ala Pro Glu Ile Glu
245 250 255
His Phe Ala Arg Asn Ser Pro Tyr Ala Tyr Pro Gly Asp Arg Met Leu
260 265 270
Val Tyr Gly Val Thr Trp Ser Pro Glu Glu Glu Tyr Tyr Lys Leu Gly
275 280 285
Ser Tyr Tyr Gln Leu Pro Val Gln Thr Arg Lys Leu Leu Val Ala Phe
290 295 300
Asp Ser Val Lys Asp Gln Glu
305 310
<210> 28
<211> 310
<212> PRT
<213> 链霉菌属
<400> 28
Met Pro Glu Ser Lys Asn Ala Glu Ala Val Tyr Ser Ala Ile Glu Glu
1 5 10 15
Ser Ala Gly Leu Leu Asp Ile Pro Cys Ser Arg Gln Lys Val Met Ser
20 25 30
Val Leu Ser Ala Phe Gly Asp Gly Val Ser Glu Glu Ser Val Ile Val
35 40 45
Met Ala Met Ala Gly Gly Glu Arg His Gly Gly Asp Ile Asp Tyr Asn
50 55 60
Phe Thr Val Pro Thr Glu Val Gly Asp Pro Tyr Glu Ile Ala Val Ala
65 70 75 80
Asn Gly Trp Ile Glu Ala Leu Asp His Pro Ile Ala Asn Leu Leu Pro
85 90 95
Glu Ile Val Glu Ser Ser Pro Val Thr Phe Tyr Gly Val Glu Ala Gly
100 105 110
Val Val Glu Gly Phe Lys Lys Thr Tyr Ile Phe Phe Pro Leu Asp Asn
115 120 125
Leu Gly Lys Leu Ser Thr Leu Ala Ser Leu Pro Ser Met Pro Arg Ser
130 135 140
Val Ala Glu His Ala Arg Thr Phe Asp Gly Leu Asn Gly Met Gly Asp
145 150 155 160
Arg Ile Ser Ile Ile Gly Ile Asp Tyr Ile Lys Arg Thr Val Asn Val
165 170 175
Tyr Phe Met Ala Gly Thr Leu Gly Glu Lys Ser Val Leu Ser Leu Leu
180 185 190
Glu Asp Thr Asn Leu Pro Ala Pro Thr Pro Asp Phe Leu Glu Phe Val
195 200 205
Gln Asn Ser Phe Ser Ile Tyr Pro Thr Phe Thr Tyr Glu Ser Ser Asp
210 215 220
Ile His Arg Ile Cys Phe Ser Ser Val Ser Pro Asp Asp Thr Ala Tyr
225 230 235 240
Pro Thr Thr Leu His Glu Glu Ile Ala Arg Phe Thr Lys Asn Ala Pro
245 250 255
Tyr Glu Tyr Asp Gly Ala Arg Val Leu Val Tyr Gly Ala Thr Ile Ser
260 265 270
Arg Arg Glu Glu Tyr His Lys Leu Gly Val Tyr Phe Arg Arg Pro Pro
275 280 285
Ala Phe Trp Asp Asn Leu Pro Leu Ala Ala Thr Phe Glu Lys Leu Ala
290 295 300
Ala Ala His Arg Gly Ala
305 310
<210> 29
<211> 302
<212> PRT
<213> 链霉菌属
<400> 29
Met Ser Glu Thr Ala Glu Leu Thr Lys Leu Tyr Ser Ile Ile Glu Lys
1 5 10 15
Thr Ala Gln Val Val Asp Val Thr Ala Ser Arg Asp Lys Val Gln Pro
20 25 30
Ile Leu Gln Ala Phe Gln Asp Val Phe Gly Gln Ser Val Ile Ser Phe
35 40 45
Arg Ala Ser Thr Gly Arg Thr Ser Ser Glu Glu Leu Asp Cys Arg Phe
50 55 60
Thr Met Leu Pro Lys Gly Phe Asp Pro Tyr Ala Arg Ala Leu Glu His
65 70 75 80
Gly Leu Thr Pro Lys Gln Asp His Pro Val Gly Thr Leu Leu Lys Glu
85 90 95
Val His Gln Glu Leu Pro Ile Asp Ser Cys Gly Val Asp Phe Gly Val
100 105 110
Val Gly Gly Phe Ala Lys Thr Trp Ser Phe Pro Ser Ala Ala Asn Leu
115 120 125
Leu Ser Ile Ser Gln Leu Thr Glu Leu Pro Ser Ile Pro Gly Gly Val
130 135 140
Ala Glu Asn Leu Asp Phe Phe Lys Lys Tyr Gly Leu Asp Asp Ile Val
145 150 155 160
Ser Thr Val Gly Ile Asp Tyr Thr Asn Arg Thr Met Asn Leu Tyr Phe
165 170 175
Gly Ala Gly Glu His Arg Cys Arg Pro Asn Val Ser Arg Ala Lys Gly
180 185 190
Val Lys Ala Ile Leu Lys Glu Cys Gly Leu Pro Glu Pro Ser Glu Glu
195 200 205
Leu Leu Lys Leu Ala Glu Arg Ala Phe Ser Ile Tyr Ile Thr Met Asn
210 215 220
Trp Asp Ser Pro Lys Ile Leu Arg Val Ser Tyr Ala Ala Met Thr Pro
225 230 235 240
Lys Pro Arg Ser Leu Ala Val Lys Met Ala Pro Ala Phe Asp Gln Leu
245 250 255
Leu Asn Asn Ala Pro Tyr Ser Thr Glu Gly His Asn Phe Val Tyr Gly
260 265 270
Ile Ala Ala Thr Pro Lys Gly Glu Tyr His Lys Ile Ala Ser Tyr Tyr
275 280 285
Gln Trp Gln Thr Arg Val Glu Gly Leu Leu His Ser Glu Ser
290 295 300
<210> 30
<211> 300
<212> PRT
<213> 肉桂地链霉菌
<400> 30
Met Met Ser Gly Thr Ala Asp Leu Ala Gly Val Tyr Ala Ala Val Glu
1 5 10 15
Glu Ser Ala Gly Leu Leu Asp Val Ser Cys Ala Arg Glu Lys Val Trp
20 25 30
Pro Ile Leu Ala Ala Phe Glu Asp Val Leu Pro Thr Ala Val Ile Ala
35 40 45
Phe Arg Val Ala Thr Asn Ala Arg His Glu Gly Glu Phe Asp Cys Arg
50 55 60
Phe Thr Val Pro Gly Ser Ile Asp Pro Tyr Ala Val Ala Leu Asp Lys
65 70 75 80
Gly Leu Thr His Arg Ser Gly His Pro Ile Glu Thr Leu Val Ala Asp
85 90 95
Val Gln Lys His Cys Ala Val Asp Ser Tyr Gly Val Asp Phe Gly Val
100 105 110
Val Gly Gly Phe Lys Lys Ile Trp Val Tyr Phe Pro Gly Gly Arg His
115 120 125
Glu Ser Leu Ala His Leu Gly Glu Ile Pro Ser Met Pro Pro Gly Leu
130 135 140
Ala Ala Thr Glu Gly Phe Phe Ala Arg Tyr Gly Leu Ala Asp Lys Val
145 150 155 160
Asp Leu Ile Gly Val Asp Tyr Ala Ser Lys Thr Met Asn Val Tyr Phe
165 170 175
Ala Ala Ser Pro Glu Val Val Ser Ala Pro Thr Val Leu Ala Met His
180 185 190
Arg Glu Ile Gly Leu Pro Asp Pro Ser Glu Gln Met Leu Asp Phe Cys
195 200 205
Ser Arg Ala Phe Gly Val Tyr Thr Thr Leu Asn Trp Asp Ser Ser Lys
210 215 220
Val Glu Arg Ile Ala Tyr Ser Val Lys Thr Glu Asp Pro Leu Glu Leu
225 230 235 240
Ser Ala Arg Leu Gly Ser Lys Val Glu Gln Phe Leu Lys Ser Val Pro
245 250 255
Tyr Gly Ile Asp Thr Pro Lys Met Val Tyr Ala Ala Val Thr Ala Gly
260 265 270
Gly Glu Glu Tyr Tyr Lys Leu Gln Ser Tyr Tyr Gln Trp Arg Thr Asp
275 280 285
Ser Arg Leu Asn Leu Ser Tyr Ile Gly Gly Arg Ser
290 295 300
<210> 31
<211> 298
<212> PRT
<213> Nocardia concava
<400> 31
Met Gly Thr Ser Glu Leu Val Thr Leu Glu Arg Ile Arg Arg Asp Leu
1 5 10 15
Gln Glu Phe Ala Arg Leu Ala Glu Ala Pro Tyr Glu Ala Ala Ala Val
20 25 30
Asp Pro Val Leu Asp Ala Leu Glu Glu Leu Trp Thr Thr Ser Ile Leu
35 40 45
Gly Val Arg Thr Thr Thr His Pro Val Pro Arg Arg Arg Leu Asn Val
50 55 60
Arg Leu Met Asn Ser Gly Ser Gly Ala Asp Pro Val Thr Thr Leu Arg
65 70 75 80
Glu Ala Gly Leu Leu Glu Phe Thr Gly His Pro Met Glu Gln Leu Leu
85 90 95
Thr Glu Ile Pro Ala Ala Val Pro Val Leu Phe Gly Val Asp Val Gly
100 105 110
Val Ala Gln Gly Val Glu Lys Val Trp Met Met Phe Pro Glu Pro Ile
115 120 125
Ser Val Gln Arg Val Leu Ala Phe Pro Gly Ile Pro Asp Ala Ala Arg
130 135 140
Thr His Ala Pro His Leu Asn Arg Tyr Gly Gly Glu Ile Ala Ile Met
145 150 155 160
Ala Leu Asp Phe Ala Ser Arg Thr Met Asn Leu Tyr Ser Gln Val Phe
165 170 175
Ala Pro Gly Leu Leu Thr Ala Thr Asp Ile Thr Thr Ile Leu Ala Asp
180 185 190
Leu Glu Phe Ala Pro Pro Thr Asp Glu Glu Leu Ser Leu Leu Arg Gln
195 200 205
Thr Phe Asn Leu Tyr Arg Thr Phe Ser Trp Thr Ser Pro Arg Met Gln
210 215 220
Arg Ile Cys Phe Pro Val Arg His Gln Pro Ala Thr Phe Pro Thr His
225 230 235 240
Leu Asp Pro Val Leu Ala Arg Phe Val Ser Ala Ala Pro Tyr Ala Gly
245 250 255
Thr Gly Ser Gln Thr Phe Thr Phe Tyr Thr Ala Tyr Gly Pro Thr Asp
260 265 270
Arg Tyr Tyr Lys Ile Gln Ala Glu Tyr Thr Ser Pro Arg His Ile Pro
275 280 285
Phe Pro Gly Gly Thr Glu Pro Pro Val Asn
290 295
<210> 32
<211> 293
<212> PRT
<213> 叶柄粘球菌
<400> 32
Met Pro Ala Leu Ser Leu Gly Leu Glu Arg Leu Cys Ala Asp Val Glu
1 5 10 15
Ala Ala Ala Ala Leu Ala Gly Ala Ser Phe Ser Arg Glu Val Thr Arg
20 25 30
Asn Val Leu Lys Ser Tyr Pro Arg Phe Phe Thr Ser Ser Ala Val Ser
35 40 45
Phe Arg Thr Ser Thr Arg Lys Pro Glu Lys Arg Glu Leu Asn Val Arg
50 55 60
Phe Val Glu Leu Glu Thr Pro Glu Asp Pro His Ala Val Ala Leu Ala
65 70 75 80
Glu Gly Leu Ile His Arg Ser Gly His Pro Ile Asp Asp Leu Phe Glu
85 90 95
Gln Val Gln Arg Asn Val Pro Ile Leu Gly Tyr Gly Leu Asp Phe Gly
100 105 110
Val Ala Tyr Gly Val Glu Lys Ile Trp Pro Phe Phe Pro His Arg Pro
115 120 125
Gln Pro Leu Glu Val Leu Arg Thr Leu Pro Ser Leu Pro Gln Ser Val
130 135 140
Gln Ala His Ser Gly Phe Leu Val Glu His Asp Leu Thr Asp Leu Ser
145 150 155 160
Leu Phe Ala Leu Asp Tyr Arg Ser Arg Ser Val Asn Leu Tyr Phe Met
165 170 175
Cys Arg Pro Gly His Phe Ser Thr Ala Gln Leu Ala Asp Leu Leu Gly
180 185 190
Gly Leu Gly Phe Glu Ser Pro Gly Glu Glu Leu Leu Glu His Cys Thr
195 200 205
Arg Ala Val Pro Ile Tyr Phe Thr Phe Arg Trp Asp Arg Pro Arg Ile
210 215 220
Glu Arg Val Cys Phe Gly Val Ile Ala Pro Gly Pro Gly Leu Leu Pro
225 230 235 240
Thr His Leu His Pro Ile Ile Gly Gln Phe Ala Ala Gly Val Pro Phe
245 250 255
Ala Thr Glu Arg Arg Asn Phe Ile Tyr Ser Val Thr Val Ser Arg Glu
260 265 270
Glu Thr Phe Ile Lys Ile Glu Asn Asp Tyr Ser Gly Thr Met Thr Ala
275 280 285
Leu Met Gln Val Phe
290
<210> 33
<211> 300
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 细菌或真菌异戊二烯基转移酶
<400> 33
Met Met Ser Gly Thr Ala Asp Leu Ala Gly Val Tyr Ala Ala Val Glu
1 5 10 15
Glu Ser Ala Gly Leu Leu Asp Val Ser Cys Ala Arg Glu Lys Val Trp
20 25 30
Pro Ile Leu Ala Ala Phe Glu Asp Val Leu Pro Thr Ala Val Ile Ala
35 40 45
Phe Arg Val Ala Thr Asn Ala Arg His Glu Gly Glu Phe Asp Cys Arg
50 55 60
Phe Thr Val Pro Gly Ser Ile Asp Pro Tyr Ala Val Ala Leu Asp Lys
65 70 75 80
Gly Leu Thr His Arg Ser Gly His Pro Ile Glu Thr Leu Val Ala Asp
85 90 95
Val Gln Lys His Cys Ala Val Asp Ser Tyr Gly Val Asp Phe Gly Val
100 105 110
Val Gly Gly Phe Lys Lys Ile Trp Val Tyr Phe Pro Gly Gly Arg His
115 120 125
Glu Ser Leu Ala His Leu Gly Glu Ile Pro Ser Met Pro Pro Gly Leu
130 135 140
Ala Ala Thr Glu Gly Phe Phe Ala Arg Tyr Gly Leu Ala Asp Lys Val
145 150 155 160
Asp Leu Ile Gly Val Asp Tyr Ala Ser Lys Thr Met Asn Val Tyr Phe
165 170 175
Ala Ala Ser Pro Glu Val Val Ser Ala Pro Thr Val Leu Ala Met His
180 185 190
Arg Glu Ile Gly Leu Pro Asp Pro Ser Glu Gln Met Leu Asp Phe Cys
195 200 205
Ser Arg Ala Phe Gly Val Tyr Thr Thr Leu Asn Trp Asp Ser Ser Lys
210 215 220
Val Glu Arg Ile Ala Tyr Ser Val Lys Thr Glu Asp Pro Leu Glu Leu
225 230 235 240
Ser Ala Arg Leu Gly Ser Lys Val Glu Gln Phe Leu Lys Ser Val Pro
245 250 255
Tyr Gly Ile Asp Thr Pro Lys Met Val Tyr Ala Ala Val Thr Ala Gly
260 265 270
Gly Glu Glu Tyr Tyr Lys Leu Gln Ser Tyr Tyr Gln Trp Arg Thr Asp
275 280 285
Ser Arg Leu Asn Leu Ser Tyr Ile Gly Gly Arg Ser
290 295 300
<210> 34
<211> 304
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 未知
<400> 34
Met Ser Pro Val Thr Gly Thr Glu Glu Val Tyr Ala Ala Val Ala Ala
1 5 10 15
Ala Ala Arg Leu Ala Gly Val Pro Cys Thr Arg Glu Lys Val His Pro
20 25 30
Val Leu Ser Ala Tyr Gly Glu Gly Leu Glu Arg Ala Gly Val Val Tyr
35 40 45
Ser Val Ser Thr Ser His Ser Thr Pro Thr Glu Leu Asp Tyr Thr Val
50 55 60
Thr Val Pro Ala Ala Gly Glu Asp Pro Tyr Ala Thr Ala Val Arg His
65 70 75 80
Gly Phe Val Thr Pro Asp Gly His Pro Val His Thr Leu Leu Ser His
85 90 95
Leu Gln Ser Arg Cys Glu Ile Ser Glu Tyr Leu Val Asp Gly Gly Val
100 105 110
Val Gly Gly Phe Asn Lys Ile Tyr Ala His Phe Pro Gln Asp Val Gln
115 120 125
Lys Ile Ser Arg Leu Ala Glu Leu Pro Gly Met Pro Pro Ala Leu Ala
130 135 140
Arg Cys Ala Ala Leu Leu Glu Arg His Gly Leu Ser Asp Val Ala Met
145 150 155 160
Ile Gly Ile Asp Tyr Pro Arg Arg Thr Leu Asn Leu Tyr Phe Thr Gln
165 170 175
Leu Ser Glu Glu Cys Arg Ala Pro Gln Thr Ile Leu Ser Leu His Arg
180 185 190
Glu Ile Gly Leu Pro Ala Pro Gly Gln Pro Met Leu Asp Phe Ala Arg
195 200 205
Arg Ser Phe Arg Ile Tyr Thr Thr Leu Ser Trp Asp Ser Ala Gly Ile
210 215 220
Glu Arg Ile Cys Tyr Ala Pro Pro Pro Ala Arg Gly Trp Asp Pro Ala
225 230 235 240
Ala Leu Pro Ala Glu Ile Thr Glu Gln Val Arg Gly Phe Val Asp Gly
245 250 255
Ala Pro Arg Ala Tyr Glu Gly Glu Pro Ile Val Ile Ala Ala Val Lys
260 265 270
Trp Ala Pro Glu Gly Pro Tyr Leu Asn Leu Gly Pro Tyr Tyr Gln Leu
275 280 285
Ser Pro Leu Met Arg Lys Val Ile Ser Ala Val His Asn Lys Glu Ile
290 295 300
<210> 35
<211> 307
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 未知
<400> 35
Met Pro Gly Thr Asp Asp Val Ala Val Asp Val Ala Ser Val Tyr Ser
1 5 10 15
Ala Ile Glu Lys Ser Ala Gly Leu Leu Asp Val Thr Ala Ala Arg Glu
20 25 30
Val Val Trp Pro Val Leu Thr Ala Phe Glu Asp Val Leu Glu Gln Ala
35 40 45
Val Ile Ala Phe Arg Val Ala Thr Asn Ala Arg His Glu Gly Asp Phe
50 55 60
Asp Val Arg Phe Thr Val Pro Glu Glu Val Asp Pro Tyr Ala Val Ala
65 70 75 80
Leu Ser Arg Ser Leu Ile Ala Lys Thr Asp His Pro Val Gly Ser Leu
85 90 95
Leu Ser Asp Ile Gln Gln Leu Cys Ser Val Asp Thr Tyr Gly Val Asp
100 105 110
Leu Gly Val Lys Ser Gly Phe Lys Lys Val Trp Val Tyr Phe Pro Ala
115 120 125
Gly Glu His Glu Thr Leu Ala Arg Leu Thr Gly Leu Thr Ser Met Pro
130 135 140
Gly Ser Leu Ala Gly Asn Val Asp Phe Phe Thr Arg Tyr Gly Leu Ala
145 150 155 160
Asp Lys Val Asp Val Ile Gly Ile Asp Tyr Arg Ser Arg Thr Met Asn
165 170 175
Val Tyr Phe Ala Ala Pro Ser Glu Cys Phe Glu Arg Glu Thr Val Leu
180 185 190
Ala Met His Arg Asp Ile Gly Leu Pro Ser Pro Ser Glu Gln Met Phe
195 200 205
Lys Phe Cys Glu Asn Ser Phe Gly Leu Tyr Thr Thr Leu Asn Trp Asp
210 215 220
Thr Met Glu Ile Glu Arg Ile Ser Tyr Gly Val Lys Thr Glu Asn Pro
225 230 235 240
Met Thr Phe Phe Ala Arg Leu Gly Thr Lys Val Glu His Phe Val Lys
245 250 255
Asn Val Pro Tyr Gly Val Asp Thr Gln Lys Met Val Tyr Ala Ala Val
260 265 270
Thr Ser Ser Gly Glu Glu Tyr Tyr Lys Leu Gln Ser Tyr Tyr Arg Trp
275 280 285
Arg Ser Val Ser Arg Leu Asn Ala Ala Tyr Ile Ala Ala Arg Asp Lys
290 295 300
Glu Ser Thr
305
<210> 36
<211> 327
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 未知
<400> 36
Met Val Gly Ser His Thr Arg Ile Ser Gln Asn Leu Ile Gly Ile Asp
1 5 10 15
Cys Leu Glu Cys Leu Val Ser Gly Ala Thr Gly Ala Glu Lys Leu Tyr
20 25 30
Ser Ala Ile Glu Glu Ser Ala Arg Met Val Asp Ala Pro Phe Ser Arg
35 40 45
Asp Lys Val Trp Pro Thr Leu Ser Ala Phe Glu Gly Gly Phe Ser Asp
50 55 60
Ala Gly Gly Val Ile Leu Ser Leu Gln Ala Gly Thr His Val Pro Glu
65 70 75 80
Met Glu Tyr Ser Ala Gln Val Ser Pro Gly Ile Ser Asp Pro Tyr Ala
85 90 95
Arg Ala Leu Ala Ser Gly Ile Leu Thr Glu Thr Asp His Pro Val Ser
100 105 110
Thr Val Leu Ala Glu Ile Val Ser Leu Ala Pro Thr Ser Glu His Tyr
115 120 125
Ile Asp Cys Gly Ile Val Gly Gly Phe Lys Lys Ile Tyr Ala Asn Phe
130 135 140
Pro His Asp Gln Gln Thr Val Ala Ala Leu Ala Gly Leu Pro Ser Met
145 150 155 160
Pro Arg Ala Val Gly Gly Asn Ala Glu Phe Phe Ala Arg His Gly Leu
165 170 175
Asp Arg Val Ala Leu Ile Gly Val Asp Tyr Val Asn Lys Thr Ile Asn
180 185 190
Leu Tyr Phe Gln Val Ser Ala Ala Thr Ala Gly Asn Leu Asp Gln Lys
195 200 205
Thr Val Ser Ala Met Leu His Glu Thr Gly Met Ser Glu Pro Ser Asp
210 215 220
Ala Met Val Ala Tyr Ala Cys Gln Ala Tyr Arg Ile Tyr Thr Thr Leu
225 230 235 240
Ser Trp Asp Ala Glu Glu Ile Leu Arg Ile Ala Phe Ala Pro Lys Pro
245 250 255
Arg Arg Gly Ile Asp Pro Ala Asp Leu Pro Ala Arg Leu Glu Pro Arg
260 265 270
Ile Glu Lys Phe Leu Arg Ala Thr Pro His Lys Tyr Pro Gly Ala Leu
275 280 285
Ile Asn Ala Thr Ala Ala Lys Trp Ser Pro Glu Arg Glu Val Leu Asp
290 295 300
Leu Ala Ala His Tyr Gln Val Ser Ala Val Gln Met Lys Ala Ile Glu
305 310 315 320
Ala Glu Glu Gly Gln Ala Ser
325
<210> 37
<211> 10584
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有盘基网柄菌DiPKS(G1516D; G1518A)编码序列、调节序列和整合序列的盒
<220>
<221> LV3
<222> (1)..(40)
<220>
<221> 酿酒酵母GAL1启动子
<222> (41)..(482)
<220>
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<220>
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<220>
<221> C-甲基转移酶结构域
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<400> 37
aggaatactc tgaataaaac aacttatata ataaaaatgc cggattagaa gccgccgagc 60
gggtgacagc cctccgaagg aagactctcc tccgtgcgtc ctcgtcttca ccggtcgcgt 120
tcctgaaacg cagatgtgcc tcgcgccgca ctgctccgaa caataaagat tctacaatac 180
tagcttttat ggttatgaag aggaaaaatt ggcagtaacc tggccccaca aaccttcaaa 240
tgaacgaatc aaattaacaa ccataggatg ataatgcgat tagtttttta gccttatttc 300
tggggtaatt aatcagcgaa gcgatgattt ttgatctatt aacagatata taaatgcaaa 360
aactgcataa ccactttaac taatactttc aacattttcg gtttgtatta cttcttattc 420
aaatgtaata aaagtatcaa caaaaaattg ttaatatacc tctatacttt aacgtcaagg 480
agctagaaaa tttattataa aaggaagaga aataattaaa caatgaacaa gaactccaaa 540
atccagtccc caaactcttc tgatgttgct gttattggtg ttggttttag attcccaggt 600
aactctaatg acccagaatc tttgtggaac aacttgttgg atggtttcga tgctattacc 660
caagtcccaa aagaaagatg ggctacttct tttagagaga tgggtttgat caagaacaag 720
ttcggtggtt tcttgaagga ttctgaatgg aagaatttcg accctttgtt ctttggtatc 780
ggtccaaaag aagctccatt cattgatcca caacaaaggt tgttgttgtc catcgtttgg 840
gaatctttgg aagatgctta catcagacca gatgaattga gaggttctaa cactggtgtt 900
ttcatcggtg tttctaacaa cgattacacc aagttgggtt tccaagacaa ctactctatt 960
tctccataca ctatgaccgg ctctaactct tcattgaact ccaacagaat ttcctactgc 1020
ttcgatttta gaggtccatc cattactgtt gataccgctt gttcttcttc cttggtttct 1080
gttaatttgg gtgtccaatc catccaaatg ggtgaatgta agattgctat ttgcggtggt 1140
gttaacgctt tgtttgatcc atctacatct gttgcctttt ccaagttggg tgttttgtct 1200
gaaaatggca gatgcaactc ttttagtgat caagcctctg gttacgttag atctgaaggt 1260
gctggtgttg ttgttttgaa gtctttggaa caagctaagt tggatggtga tagaatctac 1320
ggtgttatca agggtgtttc ctctaatgaa gatggtgctt ctaatggtga caagaactct 1380
ttgactactc catcttgtga agcccaatcc attaacattt ctaaggctat ggaaaaggcc 1440
tccttgtctc catctgatat ctattacatt gaagcccatg gtactggtac tccagttggt 1500
gatccaattg aagttaaggc cttgtccaag atcttctcca actctaacaa caaccagttg 1560
aacaacttct ctaccgatgg taatgataac gatgatgatg atgacgataa cacctctcca 1620
gaaccattat tgattggctc attcaagtcc aacatcggtc atttggaatc tgctgctggt 1680
attgcttctt tgattaagtg ttgcttgatg ttgaagaaca ggatgttggt tccatccatt 1740
aactgctcta atttgaaccc atccattcca ttcgatcagt acaacatctc cgttatcaga 1800
gaaatcagac aattcccaac cgataagttg gttaacatcg gtatcaattc tttcggtttc 1860
ggtggttcta actgccattt gattattcaa gagtacaaca acaacttcaa gaacaactct 1920
accatctgca ataacaacaa caacaacaat aacaacatcg actacttgat cccaatctcc 1980
tctaagacta agaagtcctt ggataagtac ttgattttga tcaagaccaa ctccaactac 2040
cacaaggata tttctttcga tgacttcgtc aagttccaaa tcaagtctaa gcagtacaac 2100
ttgtccaaca gaatgactac cattgctaac gattggaact ccttcattaa gggttctaac 2160
gaattccaca acttgatcga atctaaggat ggtgaaggtg gttcttcatc ttctaacaga 2220
ggtattgatt ccgccaatca aatcaacact actactacct ctaccatcaa cgatatcgaa 2280
cctttgttgg ttttcgtttt ctgtggtcaa ggtccacaat ggaatggtat gattaagacc 2340
ttgtacaact ccgagaacgt tttcaagaac accgttgatc atgttgacag catcttgtac 2400
aagtacttcg gttactccat tttgaacgtc ttgtctaaga tcgatgataa cgacgattcc 2460
atcaaccatc caatagttgc tcaaccatct ttgttcttgt tgcaaattgg tttggtcgag 2520
ttgtttaagt actggggtat ctacccatct atctctgttg gtcattcttt cggtgaagtc 2580
tcttcttatt acttgtccgg tatcatctct ttggaaaccg cttgtaaaat cgtctacgtc 2640
agatcctcta atcagaacaa aactatgggt tccggtaaga tgttggttgt ttctatgggt 2700
tttaagcaat ggaacgatca attctctgct gaatggtccg atattgaaat tgcttgttac 2760
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ggtcatgtta ctgctcaaca catctacgat aatgttagag aaccagtctt gttccaaaag 3060
acgattgaat ccattacctc ctacatcaag tctcactacc catccaatca aaaggttatc 3120
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tatttggata tcatcatcga attcttcgac taccaaaagc agcagttgaa ttcctctgat 3660
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accgaaaaca agttgcaaac cttgcaatct tctttcgaac ctatcgttac taagaagtct 3780
gccttctctg ttaacttctt catcaaggat accgtcgagg atcaatctaa ggttaagtct 3840
atgtctgacg aaacttggac taacacttgt aaggctacca tttccttgga acaacaacag 3900
ccatctccat cttctacttt gactttgtct aagaagcaag acttgcagat cttgagaaac 3960
agatgcgata ttagcaagct agacaagttt gagttgtacg acaagatctc taagaatttg 4020
ggcttgcagt acaactcctt gtttcaagtt gttgatacca tcgaaactgg taaggattgc 4080
tcttttgcta ctttgtcttt gccagaagat actttgttca ccaccatttt gaacccatgc 4140
ttgttggata actgtttcca tggtttgttg accttgatca acgaaaaggg ttctttcgtt 4200
gtcgagtcca tttcttctgt ttctatctac ttggagaaca tcggttcctt caatcaaact 4260
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tctgaaggta cttgtaagtt gttcaccaag gatggttcct tgattttgtc tatcggtaag 4380
ttcatcatca agtccaccaa tccaaagtct actaagacca acgaaactat cgaatctcca 4440
ttggacgaaa ccttctctat tgaatggcaa tctaaggatt ctccaattcc aaccccacaa 4500
caaatccaac aacaatctcc attgaactct aacccatcct tcattagatc taccatcttg 4560
aaggacatcc agttcgaaca atactgctcc tccattatcc acaaagaatt gatcaaccac 4620
gaaaagtaca agaaccagca atccttcgat atcaactcct tggaaaacca cttgaacgat 4680
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atctccatca ttaagcaata cccaaagatc ttgaacgaaa aagagctaaa agaattgaaa 4800
gaaatcatcg aattgaagta cccatccgaa gttcagttgt tggaattcga agttatcgag 4860
aaggtgtcca tgattatccc aaagttgttg ttcgaaaacg acaagcaatc ttccatgacc 4920
ttgttccaag ataacttgtt gaccaggttc tactccaatt ctaactctac cagattctac 4980
ttggaaaggg tttccgaaat ggtcttggaa tctattagac caatcgtcag agaaaagagg 5040
gtgttcagaa ttttggaaat tggtgctgat acagcctctt tgtctaatgt tgttttgact 5100
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ggttgtttta atcagtggtg gaactactac gatgatatta gaactaccca ctgctccttg 5520
tctgaatctc aatggaatca gttgttgttg aaccagtcct tgaacaacga atcctcttct 5580
tcttctaact gttacggtgg tttctccaac gtttctttta ttggtggtga aaaggatgtc 5640
gactcccatt ctttcatatt gcactgccaa aaagaatcca tctcccaaat gaagttagcc 5700
accactatta acaacggttt gtcatctggt tccatcgtta tcgttttgaa ctctcaacaa 5760
ttgaccaaca tgaagtccta cccaaaggtt attgagtata ttcaagaggc tacctctttg 5820
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aactaccaag aacagtcttt cgaatacgtt aagttgttga acttgatctc tactaccgcc 6000
tcttcatcta atgataagaa accaccaaag gtcttgttga tcaccaagca atctgaaaga 6060
atctccaggt ctttctactc cagatccttg attggtattt ccagaacctc tatgaacgag 6120
tacccaaatt tgtccattac ctctatcgat ttggatacca acgactactc attgcagtct 6180
ttgttgaagc caatcttcag caactctaag ttttccgaca acgagttcat cttcaaaaag 6240
ggcttgatgt tcgtgtccag gatctttaag aacaagcagt tgctagaatc ctccaacgct 6300
tttgaaactg actcttctaa cttgtactgt aaggcctctt ctgacttgtc ttacaagtac 6360
gctattaagc agtctatgtt gaccgaaaat cagatcgaaa tcaaggttga atgcgtcggt 6420
attaacttca aggacaacct attctacaag ggcttgttgc cacaagaaat tttcagaatg 6480
ggtgacatct acaatccacc atatggtttg gaatgctctg gtgttattac cagaattggt 6540
tctaacgtca ccgaatactc agttggtcaa aatgtttttg gtttcgccag acattctttg 6600
ggttctcatg ttgttaccaa caaggatttg gttatcttga agccagatac catctcattt 6660
tctgaagctg cttctatccc agttgtttac tgtactgctt ggtactcctt gttcaacatt 6720
ggtcagttgt ctaacgaaga atccatccta attcattctg ctactggtgg tgtaggtttg 6780
gcttctttga atttgttgaa aatgaagaat cagcaacagc aaccattgac caatgtttat 6840
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gtcaacggtt ccttggaaaa aattccaatt accatcttcc catccaccga aactaaggat 7260
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ccatccttct ccattaactt gggtccaatg aaggatgaag gtaaggtttc taccaacaag 7980
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gcttcctcca acatttcatt gcaagataag atcacctcca aggtgtctga tttgttgtcc 8280
attccaatct ccaagatcaa cttcgatcat ccattgaaac actacggctt ggattctttg 8340
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caatccgatg ttttgaaaac tccaccaatc aagtctttga acaacactaa gaactccagc 8760
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acactagcac acaactttac caggcaaggt atttgacgct agcatgtgtc caattcagtg 10080
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tgccttatta tcacattttc attatgcaac gcttcggaaa atacgatgtt gaaaatgcct 10260
ctagagatga aaaacaatcg taaaagggtc ctgcgtaatt gaaacatttg atcagtatgc 10320
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catttaattg agaaaaatgt ggctcttcct aaggacatat tccgttcgta cttgagttat 10500
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<210> 38
<211> 10584
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有盘基网柄菌DiPKS(G1516R)编码序列、调节序列和整合序列的盒
<220>
<221> LV3
<222> (1)..(40)
<220>
<221> 酿酒酵母GAL1启动子
<222> (41)..(482)
<220>
<221> L1
<222> (483)..(522)
<220>
<221> DiPKS
<222> (523)..(9966)
<220>
<221> C-甲基转移酶结构域
<222> (5050)..(5412)
<220>
<221> G1516R
<222> (5069)..(5070)
<220>
<221> 基序2
<222> (5309)..(5331)
<220>
<221> 基序3
<222> (5389)..(5421)
<220>
<221> Type III PKS结构域
<222> (8881)..(9966)
<220>
<221> L2
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<220>
<221> PRM9t
<222> (10007)..(10544)
<220>
<221> LV5
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<400> 38
aggaatactc tgaataaaac aacttatata ataaaaatgc cggattagaa gccgccgagc 60
gggtgacagc cctccgaagg aagactctcc tccgtgcgtc ctcgtcttca ccggtcgcgt 120
tcctgaaacg cagatgtgcc tcgcgccgca ctgctccgaa caataaagat tctacaatac 180
tagcttttat ggttatgaag aggaaaaatt ggcagtaacc tggccccaca aaccttcaaa 240
tgaacgaatc aaattaacaa ccataggatg ataatgcgat tagtttttta gccttatttc 300
tggggtaatt aatcagcgaa gcgatgattt ttgatctatt aacagatata taaatgcaaa 360
aactgcataa ccactttaac taatactttc aacattttcg gtttgtatta cttcttattc 420
aaatgtaata aaagtatcaa caaaaaattg ttaatatacc tctatacttt aacgtcaagg 480
agctagaaaa tttattataa aaggaagaga aataattaaa caatgaacaa gaactccaaa 540
atccagtccc caaactcttc tgatgttgct gttattggtg ttggttttag attcccaggt 600
aactctaatg acccagaatc tttgtggaac aacttgttgg atggtttcga tgctattacc 660
caagtcccaa aagaaagatg ggctacttct tttagagaga tgggtttgat caagaacaag 720
ttcggtggtt tcttgaagga ttctgaatgg aagaatttcg accctttgtt ctttggtatc 780
ggtccaaaag aagctccatt cattgatcca caacaaaggt tgttgttgtc catcgtttgg 840
gaatctttgg aagatgctta catcagacca gatgaattga gaggttctaa cactggtgtt 900
ttcatcggtg tttctaacaa cgattacacc aagttgggtt tccaagacaa ctactctatt 960
tctccataca ctatgaccgg ctctaactct tcattgaact ccaacagaat ttcctactgc 1020
ttcgatttta gaggtccatc cattactgtt gataccgctt gttcttcttc cttggtttct 1080
gttaatttgg gtgtccaatc catccaaatg ggtgaatgta agattgctat ttgcggtggt 1140
gttaacgctt tgtttgatcc atctacatct gttgcctttt ccaagttggg tgttttgtct 1200
gaaaatggca gatgcaactc ttttagtgat caagcctctg gttacgttag atctgaaggt 1260
gctggtgttg ttgttttgaa gtctttggaa caagctaagt tggatggtga tagaatctac 1320
ggtgttatca agggtgtttc ctctaatgaa gatggtgctt ctaatggtga caagaactct 1380
ttgactactc catcttgtga agcccaatcc attaacattt ctaaggctat ggaaaaggcc 1440
tccttgtctc catctgatat ctattacatt gaagcccatg gtactggtac tccagttggt 1500
gatccaattg aagttaaggc cttgtccaag atcttctcca actctaacaa caaccagttg 1560
aacaacttct ctaccgatgg taatgataac gatgatgatg atgacgataa cacctctcca 1620
gaaccattat tgattggctc attcaagtcc aacatcggtc atttggaatc tgctgctggt 1680
attgcttctt tgattaagtg ttgcttgatg ttgaagaaca ggatgttggt tccatccatt 1740
aactgctcta atttgaaccc atccattcca ttcgatcagt acaacatctc cgttatcaga 1800
gaaatcagac aattcccaac cgataagttg gttaacatcg gtatcaattc tttcggtttc 1860
ggtggttcta actgccattt gattattcaa gagtacaaca acaacttcaa gaacaactct 1920
accatctgca ataacaacaa caacaacaat aacaacatcg actacttgat cccaatctcc 1980
tctaagacta agaagtcctt ggataagtac ttgattttga tcaagaccaa ctccaactac 2040
cacaaggata tttctttcga tgacttcgtc aagttccaaa tcaagtctaa gcagtacaac 2100
ttgtccaaca gaatgactac cattgctaac gattggaact ccttcattaa gggttctaac 2160
gaattccaca acttgatcga atctaaggat ggtgaaggtg gttcttcatc ttctaacaga 2220
ggtattgatt ccgccaatca aatcaacact actactacct ctaccatcaa cgatatcgaa 2280
cctttgttgg ttttcgtttt ctgtggtcaa ggtccacaat ggaatggtat gattaagacc 2340
ttgtacaact ccgagaacgt tttcaagaac accgttgatc atgttgacag catcttgtac 2400
aagtacttcg gttactccat tttgaacgtc ttgtctaaga tcgatgataa cgacgattcc 2460
atcaaccatc caatagttgc tcaaccatct ttgttcttgt tgcaaattgg tttggtcgag 2520
ttgtttaagt actggggtat ctacccatct atctctgttg gtcattcttt cggtgaagtc 2580
tcttcttatt acttgtccgg tatcatctct ttggaaaccg cttgtaaaat cgtctacgtc 2640
agatcctcta atcagaacaa aactatgggt tccggtaaga tgttggttgt ttctatgggt 2700
tttaagcaat ggaacgatca attctctgct gaatggtccg atattgaaat tgcttgttac 2760
aacgctccag attccatagt tgttactggt aacgaagaaa gattgaaaga attgtccatc 2820
aagttgtccg acgaatccaa tcaaattttc aacaccttct tgaggtcccc atgttctttt 2880
cattcttccc atcaagaagt catcaagggt tctatgttcg aagagttgtc taacttgcaa 2940
tctactggtg aaaccgaaat ccctttgttc tctactgtta ctggtagaca agttttgtct 3000
ggtcatgtta ctgctcaaca catctacgat aatgttagag aaccagtctt gttccaaaag 3060
acgattgaat ccattacctc ctacatcaag tctcactacc catccaatca aaaggttatc 3120
tacgttgaaa ttgctccaca cccaaccttg ttttcattga tcaaaaagtc catcccatcc 3180
tccaacaaga attcctcttc tgttttgtgt ccattgaaca gaaaagaaaa ctccaacaac 3240
tcctacaaga agttcgtttc tcagttgtac ttcaacggtg ttaacgttga cttcaacttc 3300
cagttgaact ccatttgcga taacgttaac aacgatcacc atttgaacaa cgtcaagcaa 3360
aactccttca aagagactac caattccttg ccaagatacc aatgggaaca agatgaatat 3420
tggtccgaac cattgatctc cagaaagaat agattggaag gtccaactac ttccttgttg 3480
ggtcatagaa ttatctacag cttcccagtt ttccaatccg ttttggactt gcaatctgac 3540
aactacaaat acttgttgga ccacttggtt aacggtaagc cagtttttcc aggtgctggt 3600
tatttggata tcatcatcga attcttcgac taccaaaagc agcagttgaa ttcctctgat 3660
tcctctaact cctacatcat caacgttgac aagatccaat tcttgaaccc aattcacttg 3720
accgaaaaca agttgcaaac cttgcaatct tctttcgaac ctatcgttac taagaagtct 3780
gccttctctg ttaacttctt catcaaggat accgtcgagg atcaatctaa ggttaagtct 3840
atgtctgacg aaacttggac taacacttgt aaggctacca tttccttgga acaacaacag 3900
ccatctccat cttctacttt gactttgtct aagaagcaag acttgcagat cttgagaaac 3960
agatgcgata ttagcaagct agacaagttt gagttgtacg acaagatctc taagaatttg 4020
ggcttgcagt acaactcctt gtttcaagtt gttgatacca tcgaaactgg taaggattgc 4080
tcttttgcta ctttgtcttt gccagaagat actttgttca ccaccatttt gaacccatgc 4140
ttgttggata actgtttcca tggtttgttg accttgatca acgaaaaggg ttctttcgtt 4200
gtcgagtcca tttcttctgt ttctatctac ttggagaaca tcggttcctt caatcaaact 4260
tctgttggta acgtccagtt ctacttgtac accactattt ctaaagccac ctcctttagt 4320
tctgaaggta cttgtaagtt gttcaccaag gatggttcct tgattttgtc tatcggtaag 4380
ttcatcatca agtccaccaa tccaaagtct actaagacca acgaaactat cgaatctcca 4440
ttggacgaaa ccttctctat tgaatggcaa tctaaggatt ctccaattcc aaccccacaa 4500
caaatccaac aacaatctcc attgaactct aacccatcct tcattagatc taccatcttg 4560
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gaaaagtaca agaaccagca atccttcgat atcaactcct tggaaaacca cttgaacgat 4680
gaccaattga tggaatcctt gtccatctcc aaagaatact tgagattctt caccaggatc 4740
atctccatca ttaagcaata cccaaagatc ttgaacgaaa aagagctaaa agaattgaaa 4800
gaaatcatcg aattgaagta cccatccgaa gttcagttgt tggaattcga agttatcgag 4860
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ttgttccaag ataacttgtt gaccaggttc tactccaatt ctaactctac cagattctac 4980
ttggaaaggg tttccgaaat ggtcttggaa tctattagac caatcgtcag agaaaagagg 5040
gtgttcagaa ttttagagat cggtgctcgt acaggctctt tgtctaatgt tgttttgact 5100
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attattaact cctccgattt cttgatgggt gattacgata tagttttgat ggcctacgtt 5340
atccatgccg tttctaacat taagttctcc atcgaacagt tgtacaagtt gttgtctcca 5400
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ggttgtttta atcagtggtg gaactactac gatgatatta gaactaccca ctgctccttg 5520
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tcttcatcta atgataagaa accaccaaag gtcttgttga tcaccaagca atctgaaaga 6060
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ttgttgaagc caatcttcag caactctaag ttttccgaca acgagttcat cttcaaaaag 6240
ggcttgatgt tcgtgtccag gatctttaag aacaagcagt tgctagaatc ctccaacgct 6300
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gctattaagc agtctatgtt gaccgaaaat cagatcgaaa tcaaggttga atgcgtcggt 6420
attaacttca aggacaacct attctacaag ggcttgttgc cacaagaaat tttcagaatg 6480
ggtgacatct acaatccacc atatggtttg gaatgctctg gtgttattac cagaattggt 6540
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ggttctcatg ttgttaccaa caaggatttg gttatcttga agccagatac catctcattt 6660
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gctactgttg gctctaacga gaagaagaag ttcttgatcg ataacttcaa caacttgttc 6900
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tccaagatcg atgttatttt gaacaccttg tccggtgaat tcgtcgaatc taatttcaag 7020
tccttgagat ccttcggtag attgattgat ttgtctgcta ctcacgttta cgccaatcaa 7080
caaattggtc taggtaactt caagttcgac cacttgtatt ctgctgttga cttggaaaga 7140
ttgatcgacg aaaaacctaa gttgttgcag tccatcttgc aaagaattac caactctatc 7200
gtcaacggtt ccttggaaaa aattccaatt accatcttcc catccaccga aactaaggat 7260
gctatcgaat tattgtccaa gagatcccat atcggtaaag ttgttgtaga ttgcaccgat 7320
atctctaagt gtaatcctgt tggtgatgtg atcaccaact tctctatgag attgccaaag 7380
ccaaactacc agttgaattt gaactccacc ttgttgatta ctggtcagtc tggtttgtct 7440
atccctttgt tgaattggtt gttgtctaag tctggtggta acgttaagaa cgttgtcatc 7500
atttctaagt ccaccatgaa gtggaagttg cagactatga tttcccattt cgtttccggt 7560
ttcggtatcc attttaacta cgttcaagtc gacatctcca actacgatgc tttgtctgaa 7620
gctattaagc aattgccatc tgatttgcca ccaatcacct ctgtttttca tttggctgct 7680
atctacaacg atgttccaat ggatcaagtt accatgtcta ccgttgaatc tgttcataac 7740
cctaaagttt tgggtgccgt taacttgcat agaatctctg tttcttttgg ttggaagttg 7800
aaccacttcg tcttgttctc ttctattact gctattaccg gttacccaga ccaatctatc 7860
tacaattctg ccaactctat tttggacgct ttgtccaact ttagaaggtt tatgggtttg 7920
ccatccttct ccattaactt gggtccaatg aaggatgaag gtaaggtttc taccaacaag 7980
agcatcaaga agctattcaa gtctagaggt ttgccaagcc tatccttgaa caagttattt 8040
ggtttgttgg aggtcgtcat caacaaccca tctaatcatg ttatcccatc ccaattgatt 8100
tgctccccaa tcgatttcaa gacctacatc gaatctttct caactatgag gccaaagttg 8160
ttacacttgc aacctaccat ttccaagcag caatcttcta tcattaacga ttctaccaag 8220
gcttcctcca acatttcatt gcaagataag atcacctcca aggtgtctga tttgttgtcc 8280
attccaatct ccaagatcaa cttcgatcat ccattgaaac actacggctt ggattctttg 8340
ttgaccgttc aattcaaatc ctggatcgac aaagaattcg aaaagaactt gttcacccat 8400
atccaattgg ccaccatctc tattaactca ttcttggaaa aggtgaacgg cttgtctaca 8460
aacaataaca acaacaacaa ttccaacgtc aagtcctctc catccattgt caaagaagaa 8520
atcgttacct tggacaagga tcaacaacca ttgctattga aagaacacca gcacattatc 8580
atctccccag atattagaat caacaagcca aagagggaat ccttgattag aaccccaatc 8640
ttgaacaaat tcaaccagat caccgaatcc attatcactc catctacacc atctttgtcc 8700
caatccgatg ttttgaaaac tccaccaatc aagtctttga acaacactaa gaactccagc 8760
ttgattaaca ccccaccaat tcaatctgtc caacaacatc aaaagcaaca acaaaaggtc 8820
caagtcatcc aacaacagca acaaccatta tccagattgt cctacaagag caacaacaac 8880
tctttcgttt tgggtatcgg tatttctgtt ccaggtgaac ctatttccca acaatccttg 8940
aaagactcca tctccaatga cttttctgat aaggctgaaa ctaacgagaa ggtcaagaga 9000
atctttgagc aatctcaaat caagaccaga cacttggtta gagattacac taagccagag 9060
aactccatca agttcagaca tttggaaacc attaccgatg tgaacaacca gttcaagaaa 9120
gttgttccag atttggctca acaagcctgt ttgagagctt tgaaagattg gggtggtgat 9180
aagggtgata ttacccatat agtttctgtt acctccaccg gtattatcat cccagatgtt 9240
aatttcaagt tgatcgactt gttgggcttg aacaaggatg ttgaaagagt gtctttgaac 9300
ctaatgggtt gtttggctgg tttgagttct ttgagaactg ctgcttcttt ggctaaggct 9360
tctccaagaa atagaatttt ggttgtctgt accgaagtct gctccttgca tttttctaat 9420
actgatggtg gtgatcaaat ggtcgcctct tctatttttg ctgatggttc tgctgcttac 9480
attattggtt gtaacccaag aattgaagaa accccattat acgaagtcat gtgctccatt 9540
aacagatctt tcccaaatac cgaaaacgcc atggtttggg atttggaaaa agaaggttgg 9600
aacttgggtt tggatgcttc tattccaatt gtcattggtt ctggtattga agccttcgtt 9660
gatactttgt tggataaggc taagttgcaa acttccactg ctatttctgc taaggattgc 9720
gaattcttga ttcatactgg tggcaagtcc atcttgatga acatcgaaaa ttccttgggt 9780
atcgacccaa agcaaactaa gaatacttgg gatgtttacc atgcctacgg caatatgtca 9840
tctgcctctg ttattttcgt tatggatcat gccagaaagt ccaagtcttt gccaacttac 9900
tcaatttctt tggcttttgg tccaggtttg gcttttgaag gttgtttctt gaagaacgtc 9960
gtctaaagac ataaaactga aacaacacca attaataata gactttacag aagacgggag 10020
acactagcac acaactttac caggcaaggt atttgacgct agcatgtgtc caattcagtg 10080
tcatttatga ttttttgtag taggatataa atatatacag cgctccaaat agtgcggttg 10140
ccccaaaaac accacggaac ctcatctgtt ctcgtacttt gttgtgacaa agtagctcac 10200
tgccttatta tcacattttc attatgcaac gcttcggaaa atacgatgtt gaaaatgcct 10260
ctagagatga aaaacaatcg taaaagggtc ctgcgtaatt gaaacatttg atcagtatgc 10320
agtggcacag aaacaaccag gaatactata gtcataggca atacaaggta tatattggct 10380
atgcagaccc ctccagaaag taccgacgtc aagttagata cacttaacga acctagtgca 10440
catttaattg agaaaaatgt ggctcttcct aaggacatat tccgttcgta cttgagttat 10500
tggatctatg aaatcgctcg ctatacacca gtcatgattt tgtccctctt tatattacat 10560
caaaataaga aaataattat aaca 10584
<210> 39
<211> 6034
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 质粒
<220>
<221> LV5
<222> (1)..(40)
<220>
<221> pYES2-LEU2
<222> (1915)..(4123)
<220>
<221> LEU2 ORF
<222> (1996)..(3090)
<220>
<221> LEU2启动子
<222> (3091)..(3999)
<220>
<221> misc_feature
<222> (3759)..(3760)
<223> n为a、c、g或t
<220>
<221> LV3
<222> (5995)..(6034)
<400> 39
cctctttata ttacatcaaa ataagaaaat aattataaca cctgcattaa tgaatcggcc 60
aacgcgcggg gagaggcggt ttgcgtattg ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact 120
cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac 180
ggttatccac agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa 240
agcccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg 300
acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa 360
gataccaggc gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc 420
ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac 480
gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac 540
cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg 600
taagacacga cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt 660
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cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct 780
cttgatccgg caaacaaacc accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga 840
ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg 900
ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat gagattatca aaaaggatct 960
tcacctagat ccttttaaat taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt 1020
aaacttggtc tgacagttac caatgcttaa tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc 1080
tatttcgttc atccatagtt gcctgactcc ccgtcgtgta gataactacg atacgggagc 1140
gcttaccatc tggccccagt gctgcaatga taccgcgaga cccacgctca ccggctccag 1200
atttatcagc aataaaccag ccagccggaa gggccgagcg cagaagtggt cctgcaactt 1260
tatccgcctc cattcagtct attaattgtt gccgggaagc tagagtaagt agttcgccag 1320
ttaatagttt gcgcaacgtt gttggcattg ctacaggcat cgtggtgtca ctctcgtcgt 1380
ttggtatggc ttcattcagc tccggttccc aacgatcaag gcgagttaca tgatccccca 1440
tgttgtgcaa aaaagcggtt agctccttcg gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg 1500
ccgcagtgtt atcactcatg gttatggcag cactgcataa ttctcttact gtcatgccat 1560
ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta 1620
tgcggcgacc gagttgctct tgcccggcgt caatacggga taatagtgta tcacatagca 1680
gaactttaaa agtgctcatc attggaaaac gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct 1740
taccgctgtt gagatccagt tcgatgtaac ccactcgtgc acccaactga tcttcagcat 1800
cttttacttt caccagcgtt tctgggtgag caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa 1860
agggaataag ggcgacacgg aaatgttgaa tactcatact cttccttttt caatgggtaa 1920
taactgatat aattaaattg aagctctaat ttgtgagttt agtatacatg catttactta 1980
taatacagtt ttttattaag caaggatttt cttaacttct tcggcgacag catcaccgac 2040
ttcggtggta ctgttggaac cacctaaatc accagttctg atacctgcat ccaaaacctt 2100
tttaactgca tcttcaatgg ccttaccttc ttcaggcaag ttcaatgaca atttcaacat 2160
cattgcagca gacaagatag tggcgatagg gttgacctta ttctttggca aatctggagc 2220
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caaggaccaa ataggcaatg gtggctcatg ttgtagggcc atgaaagcgg ccattcttgt 2580
gattctttgc acttctggaa cggtgtattg ttcactatcc caagcgacac catcaccatc 2640
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agcagcacca ccaattaaat gattttcgaa atcgaacttg acattggaac gaacatcaga 3000
aatagcttta agaaccttaa tggcttcggc tgtgatttct tgaccaacgt ggtcacctgg 3060
caaaacgacg atcttcttag gggcagacat tagaatggta tatccttgaa atatatatat 3120
atattgctga aatgtaaaag gtaagaaaag ttagaaagta agacgattgc taaccaccta 3180
ttggaaaaaa caataggtcc ttaaataata ttgtcaactt caagtattgt gatgcaagca 3240
tttagtcatg aacgcttctc tattctatat gaaaagccgg ttccggcgct ctcacctttc 3300
ctttttctcc caatttttca gttgaaaaag gtatatgcgt caggcgacct ctgaaattaa 3360
caaaaaattt ccagtcatcg aatttgattc tgtgcgatag cgcccctgtg tgttctcgtt 3420
atgttgagga aaaaaataat ggttgctaag agattcgaac tcttgcatct tacgatacct 3480
gagtattccc acagttaact gcggtcaaga tatttcttga atcaggcgcc ttagaccgct 3540
cggccaaaca accaattact tgttgagaaa tagagtataa ttatcctata aatataacgt 3600
ttttgaacac acatgaacaa ggaagtacag gacaattgat tttgaagaga atgtggattt 3660
tgatgtaatt gttgggattc catttttaat aaggcaataa tattaggtat gtagatatac 3720
tagaagttct cctcgaggat ttaggaatcc ataaaaggnn atctgcaatt ctacacaatt 3780
ctagaaatat tattatcatc attttatatg ttaatattca ttgatcctat tacattatca 3840
atccttgcgt ttcagcttcc actaatttag atgactattt ctcatcattt gcgtcatctt 3900
ctaacaccgt atatgataat atactagtaa cgtaaatact agttagtaga tgatagttga 3960
tttttattcc aacataccac ccataatgta atagatctag cttatcgatg ataagctgtc 4020
aaagatgaga attaattcca cggactatag actataccta gtatactccg tctactgtac 4080
gatacacttc cgctcaggtc cttgtccttt aacgaggcct taccactctt ttgttactct 4140
attgatccag ctcagcaaag gcagtgtgat ctaagattct atcttcgcga tgtagtaaaa 4200
ctagctagac cgagaaagag actagaaatg caaaaggcac ttctacaatg gctgccatca 4260
ttattatccg atgtgacgct gcagcttctc aatgatattc gaatacgctt tgaggagata 4320
cagcctaata tccgacaaac tgttttacag atttacgatc gtacttgtta cccatcattg 4380
aattttgaac atccgaacct gggagttttc cctgaaacag atagtatatt tgaacctgta 4440
taataatata tagtctagcg ctttacggaa gacaatgtat gtatttcggt tcctggagaa 4500
actattgcat ctattgcata ggtaatcttg cacgtcgcat ccccggttca ttttctgcgt 4560
ttccatcttg cacttcaata gcatatcttt gttaacgaag catctgtgct tcattttgta 4620
gaacaaaaat gcaacgcgag agcgctaatt tttcaaacaa agaatctgag ctgcattttt 4680
acagaacaga aatgcaacgc gaaagcgcta ttttaccaac gaagaatctg tgcttcattt 4740
ttgtaaaaca aaaatgcaac gcgacgagag cgctaatttt tcaaacaaag aatctgagct 4800
gcatttttac agaacagaaa tgcaacgcga gagcgctatt ttaccaacaa agaatctata 4860
cttctttttt gttctacaaa aatgcatccc gagagcgcta tttttctaac aaagcatctt 4920
agattacttt ttttctcctt tgtgcgctct ataatgcagt ctcttgataa ctttttgcac 4980
tgtaggtccg ttaaggttag aagaaggcta ctttggtgtc tattttctct tccataaaaa 5040
aagcctgact ccacttcccg cgtttactga ttactagcga agctgcgggt gcattttttc 5100
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agaaagtgat agcgttgatg attcttcatt ggtcagaaaa ttatgaacgg tttcttctat 5220
tttgtctcta tatactacgt ataggaaatg tttacatttt cgtattgttt tcgattcact 5280
ctatgaatag ttcttactac aatttttttg tctaaagagt aatactagag ataaacataa 5340
aaaatgtaga ggtcgagttt agatgcaagt tcaaggagcg aaaggtggat gggtaggtta 5400
tatagggata tagcacagag atatatagca aagagatact tttgagcaat gtttgtggaa 5460
gcggtattcg caatgggaag ctccaccccg gttgataatc agaaaagccc caaaaacagg 5520
aagattgtat aagcaaatat ttaaattgta aacgttaata ttttgttaaa attcgcgtta 5580
aatttttgtt aaatcagctc attttttaac gaatagcccg aaatcggcaa aatcccttat 5640
aaatcaaaag aatagaccga gatagggttg agtgttgttc cagtttccaa caagagtcca 5700
ctattaaaga acgtggactc caacgtcaaa gggcgaaaaa gggtctatca gggcgatggc 5760
ccactacgtg aaccatcacc ctaatcaagt tttttggggt cgaggtgccg taaagcagta 5820
aatcggaagg gtaaacggat gcccccattt agagcttgac ggggaaagcc ggcgaacgtg 5880
gcgagaaagg aagggaagaa agcgaaagga gcgggggcta gggcggtggg aagtgtaggg 5940
gtcacgctgg gcgtaaccac cacacccgcc gcgcttaatg gggcgctaca gggcaggaat 6000
actctgaata aaacaactta tataataaaa atgc 6034
<210> 40
<211> 5056
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 质粒
<220>
<221> LV5
<222> (1)..(40)
<220>
<221> pYES骨架
<222> (41)..(5016)
<220>
<221> AmpR
<222> (1040)..(1699)
<220>
<221> URA3
<222> (1915)..(3022)
<220>
<221> LV3
<222> (5017)..(5056)
<400> 40
cctctttata ttacatcaaa ataagaaaat aattataaca cctgcattaa tgaatcggcc 60
aacgcgcggg gagaggcggt ttgcgtattg ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact 120
cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac 180
ggttatccac agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa 240
agcccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg 300
acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa 360
gataccaggc gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc 420
ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac 480
gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac 540
cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg 600
taagacacga cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt 660
atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagga 720
cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct 780
cttgatccgg caaacaaacc accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga 840
ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg 900
ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat gagattatca aaaaggatct 960
tcacctagat ccttttaaat taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt 1020
aaacttggtc tgacagttac caatgcttaa tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc 1080
tatttcgttc atccatagtt gcctgactcc ccgtcgtgta gataactacg atacgggagc 1140
gcttaccatc tggccccagt gctgcaatga taccgcgaga cccacgctca ccggctccag 1200
atttatcagc aataaaccag ccagccggaa gggccgagcg cagaagtggt cctgcaactt 1260
tatccgcctc cattcagtct attaattgtt gccgggaagc tagagtaagt agttcgccag 1320
ttaatagttt gcgcaacgtt gttggcattg ctacaggcat cgtggtgtca ctctcgtcgt 1380
ttggtatggc ttcattcagc tccggttccc aacgatcaag gcgagttaca tgatccccca 1440
tgttgtgcaa aaaagcggtt agctccttcg gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg 1500
ccgcagtgtt atcactcatg gttatggcag cactgcataa ttctcttact gtcatgccat 1560
ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta 1620
tgcggcgacc gagttgctct tgcccggcgt caatacggga taatagtgta tcacatagca 1680
gaactttaaa agtgctcatc attggaaaac gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct 1740
taccgctgtt gagatccagt tcgatgtaac ccactcgtgc acccaactga tcttcagcat 1800
cttttacttt caccagcgtt tctgggtgag caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa 1860
agggaataag ggcgacacgg aaatgttgaa tactcatact cttccttttt caatgggtaa 1920
taactgatat aattaaattg aagctctaat ttgtgagttt agtatacatg catttactta 1980
taatacagtt ttttagtttt gctggccgca tcttctcaaa tatgcttccc agcctgcttt 2040
tctgtaacgt tcaccctcta ccttagcatc ccttcccttt gcaaatagtc ctcttccaac 2100
aataataatg tcagatcctg tagagaccac atcatccacg gttctatact gttgacccaa 2160
tgcgtctccc ttgtcatcta aacccacacc gggtgtcata atcaaccaat cgtaaccttc 2220
atctcttcca cccatgtctc tttgagcaat aaagccgata acaaaatctt tgtcgctctt 2280
cgcaatgtca acagtaccct tagtatattc tccagtagat agggagccct tgcatgacaa 2340
ttctgctaac atcaaaaggc ctctaggttc ctttgttact tcttctgccg cctgcttcaa 2400
accgctaaca atacctgggc ccaccacacc gtgtgcattc gtaatgtctg cccattctgc 2460
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tctgtcttcg aagagtaaaa aattgtactt ggcggataat gcctttagcg gcttaactgt 2580
gccctccatg gaaaaatcag tcaagatatc cacatgtgtt tttagtaaac aaattttggg 2640
acctaatgct tcaactaact ccagtaattc cttggtggta cgaacatcca atgaagcaca 2700
caagtttgtt tgcttttcgt gcatgatatt aaatagcttg gcagcaacag gactaggatg 2760
agtagcagca cgttccttat atgtagcttt cgacatgatt tatcttcgtt tcctgcaggt 2820
ttttgttctg tgcagttggg ttaagaatac tgggcaattt catgtttctt caacactaca 2880
tatgcgtata tataccaatc taagtctgtg ctccttcctt cgttcttcct tctgttcgga 2940
gattaccgaa tcaaaaaaat ttcaaagaaa ccgaaatcaa aaaaaagaat aaaaaaaaaa 3000
tgatgaattg aattgaaaag ctagcttatc gatgataagc tgtcaaagat gagaattaat 3060
tccacggact atagactata ctagatactc cgtctactgt acgatacact tccgctcagg 3120
tccttgtcct ttaacgaggc cttaccactc ttttgttact ctattgatcc agctcagcaa 3180
aggcagtgtg atctaagatt ctatcttcgc gatgtagtaa aactagctag accgagaaag 3240
agactagaaa tgcaaaaggc acttctacaa tggctgccat cattattatc cgatgtgacg 3300
ctgcagcttc tcaatgatat tcgaatacgc tttgaggaga tacagcctaa tatccgacaa 3360
actgttttac agatttacga tcgtacttgt tacccatcat tgaattttga acatccgaac 3420
ctgggagttt tccctgaaac agatagtata tttgaacctg tataataata tatagtctag 3480
cgctttacgg aagacaatgt atgtatttcg gttcctggag aaactattgc atctattgca 3540
taggtaatct tgcacgtcgc atccccggtt cattttctgc gtttccatct tgcacttcaa 3600
tagcatatct ttgttaacga agcatctgtg cttcattttg tagaacaaaa atgcaacgcg 3660
agagcgctaa tttttcaaac aaagaatctg agctgcattt ttacagaaca gaaatgcaac 3720
gcgaaagcgc tattttacca acgaagaatc tgtgcttcat ttttgtaaaa caaaaatgca 3780
acgcgacgag agcgctaatt tttcaaacaa agaatctgag ctgcattttt acagaacaga 3840
aatgcaacgc gagagcgcta ttttaccaac aaagaatcta tacttctttt ttgttctaca 3900
aaaatgcatc ccgagagcgc tatttttcta acaaagcatc ttagattact ttttttctcc 3960
tttgtgcgct ctataatgca gtctcttgat aactttttgc actgtaggtc cgttaaggtt 4020
agaagaaggc tactttggtg tctattttct cttccataaa aaaagcctga ctccacttcc 4080
cgcgtttact gattactagc gaagctgcgg gtgcattttt tcaagataaa ggcatccccg 4140
attatattct ataccgatgt ggattgcgca tactttgtga acagaaagtg atagcgttga 4200
tgattcttca ttggtcagaa aattatgaac ggtttcttct attttgtctc tatatactac 4260
gtataggaaa tgtttacatt ttcgtattgt tttcgattca ctctatgaat agttcttact 4320
acaatttttt tgtctaaaga gtaatactag agataaacat aaaaaatgta gaggtcgagt 4380
ttagatgcaa gttcaaggag cgaaaggtgg atgggtaggt tatataggga tatagcacag 4440
agatatatag caaagagata cttttgagca atgtttgtgg aagcggtatt cgcaatggga 4500
agctccaccc cggttgataa tcagaaaagc cccaaaaaca ggaagattgt ataagcaaat 4560
atttaaattg taaacgttaa tattttgtta aaattcgcgt taaatttttg ttaaatcagc 4620
tcatttttta acgaatagcc cgaaatcggc aaaatccctt ataaatcaaa agaatagacc 4680
gagatagggt tgagtgttgt tccagtttcc aacaagagtc cactattaaa gaacgtggac 4740
tccaacgtca aagggcgaaa aagggtctat cagggcgatg gcccactacg tgaaccatca 4800
ccctaatcaa gttttttggg gtcgaggtgc cgtaaagcag taaatcggaa gggtaaacgg 4860
atgcccccat ttagagcttg acggggaaag ccggcgaacg tggcgagaaa ggaagggaag 4920
aaagcgaaag gagcgggggc tagggcggtg ggaagtgtag gggtcacgct gggcgtaacc 4980
accacacccg ccgcgcttaa tggggcgcta cagggcagga atactctgaa taaaacaact 5040
tatataataa aaatgc 5056
<210> 41
<211> 1703
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有绿色荧光蛋白编码序列、调节序列和整合序列的盒
<220>
<221> LV3
<222> (1)..(40)
<220>
<221> Tdh3p
<222> (41)..(693)
<220>
<221> S65T-GFP
<222> (700)..(1413)
<220>
<221> CYC1终止子
<222> (1414)..(1663)
<220>
<221> LV5
<222> (1664)..(1703)
<400> 41
aggaatactc tgaataaaac aacttatata ataaaaatgc tcgagtttat cattatcaat 60
actgccattt caaagaatac gtaaataatt aatagtagtg attttcctaa ctttatttag 120
tcaaaaaatt agccttttaa ttctgctgta acccgtacat gcccaaaata gggggcgggt 180
tacacagaat atataacatc gtaggtgtct gggtgaacag tttattcctg gcatccacta 240
aatataatgg agcccgcttt ttaagctggc atccagaaaa aaaaagaatc ccagcaccaa 300
aatattgttt tcttcaccaa ccatcagttc ataggtccat tctcttagcg caactacaga 360
gaacaggggc acaaacaggc aaaaaacggg cacaacctca atggagtgat gcaacctgcc 420
tggagtaaat gatgacacaa ggcaattgac ccacgcatgt atctatctca ttttcttaca 480
ccttctatta ccttctgctc tctctgattt ggaaaaagct gaaaaaaaag gttgaaacca 540
gttccctgaa attattcccc tacttgacta ataagtatat aaagacggta ggtattgatt 600
gtaattctgt aaatctattt cttaaacttc ttaaattcta cttttatagt tagtcttttt 660
tttagtttta aaacaccaag aacttagttt cgaaaaacaa tgagtaaagg agaagaactt 720
ttcactggag ttgtcccaat tcttgttgaa ttagatggtg atgttaatgg gcacaaattt 780
tctgtcagtg gagagggtga aggtgatgca acatacggaa aacttaccct taaatttatt 840
tgcactactg gaaaactacc tgttccatgg ccaacacttg tcactacttt cacttatggt 900
gttcaatgca tttcaagata cccagatcat atgaaagagc atgacttttt caagagtgcc 960
atgcccgaag gttatgtaca ggaaagaact atatttttca aagatgacgg gaactacaag 1020
acacgtgctg aagtcaagtt tgaaggtgat acccttgtta atagaatcga gttaaaaggt 1080
attgatttta aagaagatgg aaacattctt ggacacaaat tggaatacaa ctataactca 1140
cacaatgtat acatcatggc agacaaacaa aagaatggaa tcaaagttaa cttcaaaatt 1200
agacacaaca ttgaagatgg aagcgttcaa ctagcagacc attatcaaca aaatactcca 1260
attggcgatg gccctgtcct tttaccagac aaccattacc tgtccacaca atctgccctt 1320
tcgaaagatc ccaacgaaaa gagagaccac atggtccttc ttgagtttgt aacagctgct 1380
gggattacac atggcatgga tgaactatac aaatcatgta attagttatg tcacgcttac 1440
attcacgccc tcctcccaca tccgctctaa ccgaaaagga aggagttaga caacctgaag 1500
tctaggtccc tatttatttt ttttaatagt tatgttagta ttaagaacgt tatttatatt 1560
tcaaattttt cttttttttc tgtacaaacg cgtgtacgca tgtaacatta tactgaaaac 1620
cttgcttgag aaggttttgg gacgctcgaa ggctttaatt tgccctcttt atattacatc 1680
aaaataagaa aataattata aca 1703
<210> 42
<211> 2942
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有大麻异戊二烯基转移酶-绿色荧光蛋白融合蛋白编码序列、调节序列和整合序列的盒
<220>
<221> LV3
<222> (1)..(40)
<220>
<221> TDH3
<222> (41)..(692)
<220>
<221> CBGA合成酶
<222> (702)..(1892)
<220>
<221> GFP_接头
<222> (1893)..(1928)
<220>
<221> GFP
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<220>
<221> LV5
<222> (2903)..(2942)
<400> 42
aggaatactc tgaataaaac aacttatata ataaaaatgc tcgagtttat cattatcaat 60
actgccattt caaagaatac gtaaataatt aatagtagtg attttcctaa ctttatttag 120
tcaaaaaatt agccttttaa ttctgctgta acccgtacat gcccaaaata gggggcgggt 180
tacacagaat atataacatc gtaggtgtct gggtgaacag tttattcctg gcatccacta 240
aatataatgg agcccgcttt ttaagctggc atccagaaaa aaaaagaatc ccagcaccaa 300
aatattgttt tcttcaccaa ccatcagttc ataggtccat tctcttagcg caactacaga 360
gaacaggggc acaaacaggc aaaaaacggg cacaacctca atggagtgat gcaacctgcc 420
tggagtaaat gatgacacaa ggcaattgac ccacgcatgt atctatctca ttttcttaca 480
ccttctatta ccttctgctc tctctgattt ggaaaaagct gaaaaaaaag gttgaaacca 540
gttccctgaa attattcccc tacttgacta ataagtatat aaagacggta ggtattgatt 600
gtaattctgt aaatctattt cttaaacttc ttaaattcta cttttatagt tagtcttttt 660
tttagtttta aaacaccaag aacttagttt cgaaaacaat gatgggttta tcttctgttt 720
gtactttctc tttccaaacc aactatcaca ctttgttgaa tccacataac aacaacccaa 780
agacttcttt gttatgttac agacatccaa agaccccaat caagtactct tacaacaact 840
tcccatctaa gcactgttct accaagtctt tccacttgca aaataagtgt tctgaatctt 900
tgtctattgc taagaattcc attagagctg ctaccactaa ccaaaccgaa ccaccagaat 960
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tgttgcataa caccaacttg atctcttggt ctttaatgtt caaggctttt tttttcttgg 1140
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ttgaccgtat caataagcca gatttgccat tggcctctgg tgaaatttcc gtcaacaccg 1260
cctggattat gtctattatc gttgccttgt tcggtttaat tattactatt aagatgaagg 1320
gtggtccatt atacatcttc ggttactgtt tcggtatctt cggtggtatc gtctactccg 1380
ttccaccttt cagatggaag caaaacccat ccaccgcttt cttgttgaac ttcttagccc 1440
acatcattac taactttacc ttctactatg cctctagagc cgctttaggt ttaccatttg 1500
aattgcgtcc atctttcact ttcttgttgg ctttcatgaa gtctatgggt tccgccttgg 1560
ctttaattaa ggatgcctct gatgttgagg gtgatactaa gttcggtatt tctaccttag 1620
cttccaaata cggttccaga aacttgactt tgttctgttc cggtattgtt ttattgtctt 1680
acgtcgctgc tatcttggct ggtatcattt ggcctcaagc tttcaactct aacgttatgt 1740
tgttatccca tgctatcttg gctttctggt tgatcttgca aaccagagac ttcgctttga 1800
ctaactacga tccagaagct ggtagaagat tctacgaatt tatgtggaaa ttatattacg 1860
ccgaatactt ggtttacgtt ttcatcggct gaggcgccgc tggctccgct gctggttctg 1920
gcgaattcat gagtaaagga gaagaacttt tcactggagt tgtcccaatt cttgttgaat 1980
tagatggtga tgttaatggg cacaaatttt ctgtcagtgg agagggtgaa ggtgatgcaa 2040
catacggaaa acttaccctt aaatttattt gcactactgg aaaactacct gttccatggc 2100
caacacttgt cactactttc acttatggtg ttcaatgcat ttcaagatac ccagatcata 2160
tgaaacggca tgactttttc aagagtgcca tgcccgaagg ttatgtacag gaaagaacta 2220
tatttttcaa agatgacggg aactacaaga cacgtgctga agtcaagttt gaaggtgata 2280
cccttgttaa tagaatcgag ttaaaaggta ttgattttaa agaagatgga aacattcttg 2340
gacacaaatt ggaatacaac tataactcac acaatgtata catcatggca gacaaacaaa 2400
agaatggaat caaagttaac ttcaaaatta gacacaacat tgaagatgga agcgttcaac 2460
tagcagacca ttatcaacaa aatactccaa ttggcgatgg ccctgtcctt ttaccagaca 2520
accattacct gtccacacaa tctgcccttt cgaaagatcc caacgaaaag agagaccaca 2580
tggtccttct tgagtttgta acagctgctg ggattacaca tggcatggat gaactataca 2640
aataaggcgc ctaatcatgt aattagttat gtcacgctta cattcacgcc ctccccccac 2700
atccgctcta accgaaaagg aaggagttag acaacctgaa gtctaggtcc ctatttattt 2760
ttttatagtt atgttagtat taagaacgtt atttatattt caaatttttc ttttttttct 2820
gtacaaacgc gtgtacgcat gtaacattat actgaaaacc ttgcttgaga aggttttggg 2880
acgctcgaag gctttaattt gccctcttta tattacatca aaataagaaa ataattataa 2940
ca 2942
<210> 43
<211> 2678
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有AltPT-绿色荧光蛋白融合蛋白编码序列、调节序列和整合序列的盒
<220>
<221> LV3
<222> (1)..(40)
<220>
<221> TDH3
<222> (41)..(692)
<220>
<221> Alt PT
<222> (702)..(1628)
<220>
<221> GFP_接头
<222> (1629)..(1664)
<220>
<221> GFP
<222> (1665)..(2381)
<220>
<221> LV5
<222> (2639)..(2678)
<400> 43
aggaatactc tgaataaaac aacttatata ataaaaatgc tcgagtttat cattatcaat 60
actgccattt caaagaatac gtaaataatt aatagtagtg attttcctaa ctttatttag 120
tcaaaaaatt agccttttaa ttctgctgta acccgtacat gcccaaaata gggggcgggt 180
tacacagaat atataacatc gtaggtgtct gggtgaacag tttattcctg gcatccacta 240
aatataatgg agcccgcttt ttaagctggc atccagaaaa aaaaagaatc ccagcaccaa 300
aatattgttt tcttcaccaa ccatcagttc ataggtccat tctcttagcg caactacaga 360
gaacaggggc acaaacaggc aaaaaacggg cacaacctca atggagtgat gcaacctgcc 420
tggagtaaat gatgacacaa ggcaattgac ccacgcatgt atctatctca ttttcttaca 480
ccttctatta ccttctgctc tctctgattt ggaaaaagct gaaaaaaaag gttgaaacca 540
gttccctgaa attattcccc tacttgacta ataagtatat aaagacggta ggtattgatt 600
gtaattctgt aaatctattt cttaaacttc ttaaattcta cttttatagt tagtcttttt 660
tttagtttta aaacaccaag aacttagttt cgaaaacaat gatgtctgaa gccgctgatg 720
tcgaaagagt ttacgccgct atggaagagg ccgctggttt gttgggtgtt gcctgtgcta 780
gagacaagat ttacccattg ttatccacct tccaagatac tttggttgaa ggtggttctg 840
ttgtcgtttt ctctatggcc tccggtagac actccaccga attggacttc tctatttctg 900
ttccaacttc tcatggtgat ccatacgcca ctgtcgttga aaagggttta tttcctgcta 960
ctggtcaccc agttgacgat ttgttagctg acactcaaaa gcacttacct gtttctatgt 1020
tcgctattga cggtgaagtt accggtggtt tcaaaaagac ttacgccttc ttcccaactg 1080
acaatatgcc aggtgttgct gaattgtctg ctatcccatc catgccacca gccgttgccg 1140
agaatgctga attgttcgct cgttatggtt tggacaaggt ccaaatgacc tccatggact 1200
acaagaaaag acaagtcaac ttgtatttct ccgaattgtc tgctcaaact ttagaagccg 1260
aatctgtttt ggctttggtt agagaattag gtttgcacgt tccaaacgaa ttgggtttga 1320
agttttgtaa acgttctttc tctgtttatc caactttgaa ctgggaaacc ggtaaaatcg 1380
acagattgtg cttcgctgtc atctctaacg acccaacctt ggtcccatcc tccgatgaag 1440
gtgatatcga aaagttccac aactacgcca ctaaggctcc ttacgcttac gtcggtgaga 1500
aacgtacctt ggtctatggt ttgactttat ccccaaagga ggaatactac aagttgggtg 1560
cttactacca cattaccgac gtccaaagag gtttgttaaa ggccttcgac tctttagaag 1620
acggctgagg cgccgctggc tccgctgctg gttctggcga attcatgagt aaaggagaag 1680
aacttttcac tggagttgtc ccaattcttg ttgaattaga tggtgatgtt aatgggcaca 1740
aattttctgt cagtggagag ggtgaaggtg atgcaacata cggaaaactt acccttaaat 1800
ttatttgcac tactggaaaa ctacctgttc catggccaac acttgtcact actttcactt 1860
atggtgttca atgcatttca agatacccag atcatatgaa acggcatgac tttttcaaga 1920
gtgccatgcc cgaaggttat gtacaggaaa gaactatatt tttcaaagat gacgggaact 1980
acaagacacg tgctgaagtc aagtttgaag gtgataccct tgttaataga atcgagttaa 2040
aaggtattga ttttaaagaa gatggaaaca ttcttggaca caaattggaa tacaactata 2100
actcacacaa tgtatacatc atggcagaca aacaaaagaa tggaatcaaa gttaacttca 2160
aaattagaca caacattgaa gatggaagcg ttcaactagc agaccattat caacaaaata 2220
ctccaattgg cgatggccct gtccttttac cagacaacca ttacctgtcc acacaatctg 2280
ccctttcgaa agatcccaac gaaaagagag accacatggt ccttcttgag tttgtaacag 2340
ctgctgggat tacacatggc atggatgaac tatacaaata aggcgcctaa tcatgtaatt 2400
agttatgtca cgcttacatt cacgccctcc ccccacatcc gctctaaccg aaaaggaagg 2460
agttagacaa cctgaagtct aggtccctat ttattttttt atagttatgt tagtattaag 2520
aacgttattt atatttcaaa tttttctttt ttttctgtac aaacgcgtgt acgcatgtaa 2580
cattatactg aaaaccttgc ttgagaaggt tttgggacgc tcgaaggctt taatttgccc 2640
tctttatatt acatcaaaat aagaaaataa ttataaca 2678
<210> 44
<211> 2399
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有带有编码序列、调节序列和整合序列的来自链霉菌属CL190的AltPT的盒
<220>
<221> LV3
<222> (1)..(40)
<220>
<221> PMA1p
<222> (47)..(946)
<220>
<221> L1
<222> (947)..(986)
<220>
<221> AltPT
<222> (987)..(1913)
<220>
<221> Eno2t
<222> (1954)..(2353)
<220>
<221> LV5
<222> (2360)..(2399)
<400> 44
aggaatactc tgaataaaac aacttatata ataaaaatgc gtatccacag gcattgctgg 60
gatcacccat acatcactct gttttgcctg accttttccg gtaatttgaa aacaaacccg 120
gtctcgaagc ggagatccgg cgataattac cgcagaaata aacccataca cgagacgtag 180
aaccagccgc acatggccgg agaaactcct gcgagaattt cgtaaactcg cgcgcattgc 240
atctgtattt cctaatgcgg cacttccagg cctcgagacc tctgacatgc ttttgacagg 300
aatagacatt ttcagaatgt tatccatatg cctttcgggt ttttttcctt ccttttccat 360
catgaaaaat ctctcgagac cgtttatcca ttgctttttt gttgtctttt tccctcgttc 420
acagaaagtc tgaagaagct atagtagaac tatgagcttt ttttgtttct gttttccttt 480
tttttttttt tacctctgtg gaaattgtta ctctcacact ctttagttcg tttgtttgtt 540
ttgtttattc caattatgac cggtgacgaa acgtggtcga tggtgggtac cgcttatgct 600
cccctccatt agtttcgatt atataaaaag gccaaatatt gtattatttt caaatgtcct 660
atcattatcg tctaacatct aatttctctt aaattttttc tctttctttc ctataacacc 720
aatagtgaaa atcttttttt cttctatatc tacaaaaact ttttttttct atcaacctcg 780
ttgataaatt ttttctttaa caatcgttaa taattaatta attggaaaat aaccattttt 840
tctctctttt atacacacat tcaaaagaaa gaaaaaaaat ataccccagc tagttaaaga 900
aaatcattga aaagaataag aagataagaa agatttaatt atcaaactag aaaatttatt 960
ataaaaggaa gagaaataat taaacaatgt ctgaagccgc tgatgtcgaa agagtttacg 1020
ccgctatgga agaggccgct ggtttgttgg gtgttgcctg tgctagagac aagatttacc 1080
cattgttatc caccttccaa gatactttgg ttgaaggtgg ttctgttgtc gttttctcta 1140
tggcctccgg tagacactcc accgaattgg acttctctat ttctgttcca acttctcatg 1200
gtgatccata cgccactgtc gttgaaaagg gtttatttcc tgctactggt cacccagttg 1260
acgatttgtt agctgacact caaaagcact tacctgtttc tatgttcgct attgacggtg 1320
aagttaccgg tggtttcaaa aagacttacg ccttcttccc aactgacaat atgccaggtg 1380
ttgctgaatt gtctgctatc ccatccatgc caccagccgt tgccgagaat gctgaattgt 1440
tcgctcgtta tggtttggac aaggtccaaa tgacctccat ggactacaag aaaagacaag 1500
tcaacttgta tttctccgaa ttgtctgctc aaactttaga agccgaatct gttttggctt 1560
tggttagaga attaggtttg cacgttccaa acgaattggg tttgaagttt tgtaaacgtt 1620
ctttctctgt ttatccaact ttgaactggg aaaccggtaa aatcgacaga ttgtgcttcg 1680
ctgtcatctc taacgaccca accttggtcc catcctccga tgaaggtgat atcgaaaagt 1740
tccacaacta cgccactaag gctccttacg cttacgtcgg tgagaaacgt accttggtct 1800
atggtttgac tttatcccca aaggaggaat actacaagtt gggtgcttac taccacatta 1860
ccgacgtcca aagaggtttg ttaaaggcct tcgactcttt agaagacggc tgaagacata 1920
aaactgaaac aacaccaatt aataatagac tttagtgctt ttaactaaga attattagtc 1980
ttttctgctt attttttcat catagtttag aacactttat attaacgaat agtttatgaa 2040
tctatttagg tttaaaaatt gatacagttt tataagttac tttttcaaag actcgtgctg 2100
tctattgcat aatgcactgg aaggggaaaa aaaaggtgca cacgcgtggc tttttcttga 2160
atttgcagtt tgaaaaataa ctacatggat gataagaaaa catggagtac agtcactttg 2220
agaaccttca atcagctggt aacgtcttcg ttaattggat actcaaaaaa gatggatagc 2280
atgaatcaca agatggaagg aaatgcgggc cacgaccaca gtgatatgca tatgggagat 2340
ggagatgata cctggatacc ctctttatat tacatcaaaa taagaaaata attataaca 2399
<210> 45
<211> 5616
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有大麻OAS编码序列、调节序列和整合序列的盒
<220>
<221> LV3
<222> (1)..(40)
<220>
<221> THD3p
<222> (41)..(693)
<220>
<221> L1
<222> (694)..(733)
<220>
<221> Hex1
<222> (734)..(2899)
<220>
<221> T3
<222> (2900)..(3303)
<220>
<221> ADH1终止子
<222> (3071)..(3263)
<220>
<221> P5
<222> (3264)..(3837)
<220>
<221> LTP2
<222> (3264)..(3303)
<220>
<221> Tef1p
<222> (3304)..(3797)
<220>
<221> L3
<222> (3798)..(3837)
<220>
<221> OAS
<222> (3841)..(4995)
<220>
<221> PRM9t
<222> (5039)..(5576)
<220>
<221> LV5
<222> (5577)..(5616)
<400> 45
aggaatactc tgaataaaac aacttatata ataaaaatgc tcgagtttat cattatcaat 60
actgccattt caaagaatac gtaaataatt aatagtagtg attttcctaa ctttatttag 120
tcaaaaaatt agccttttaa ttctgctgta acccgtacat gcccaaaata gggggcgggt 180
tacacagaat atataacatc gtaggtgtct gggtgaacag tttattcctg gcatccacta 240
aatataatgg agcccgcttt ttaagctggc atccagaaaa aaaaagaatc ccagcaccaa 300
aatattgttt tcttcaccaa ccatcagttc ataggtccat tctcttagcg caactacaga 360
gaacaggggc acaaacaggc aaaaaacggg cacaacctca atggagtgat gcaacctgcc 420
tggagtaaat gatgacacaa ggcaattgac ccacgcatgt atctatctca ttttcttaca 480
ccttctatta ccttctgctc tctctgattt ggaaaaagct gaaaaaaaag gttgaaacca 540
gttccctgaa attattcccc tacttgacta ataagtatat aaagacggta ggtattgatt 600
gtaattctgt aaatctattt cttaaacttc ttaaattcta cttttatagt tagtcttttt 660
tttagtttta aaacaccaag aacttagttt cgactagaaa atttattata aaaggaagag 720
aaataattaa acaatgggta aaaactataa gtctttagac tccgttgtcg cctccgactt 780
tattgctttg ggtatcacct ccgaagttgc tgaaacttta cacggtagat tagctgagat 840
tgtttgtaac tacggtgccg ccactccaca aacttggatt aatatcgcta accatatttt 900
gtctccagac ttaccattct ccttgcatca aatgttgttt tacggttgtt ataaagattt 960
tggtccagct cctccagctt ggatcccaga tcctgaaaaa gttaagtcta ctaacttagg 1020
tgctttgtta gaaaaaagag gtaaagaatt cttgggtgtt aagtataaag atccaatctc 1080
ttccttctct cattttcaag aattctccgt tagaaaccca gaagtttatt ggagaaccgt 1140
tttgatggac gaaatgaaga tctccttctc taaggatcct gaatgtattt tgagacgtga 1200
cgatatcaac aatccaggtg gttctgaatg gttaccaggt ggttatttga actctgctaa 1260
aaattgtttg aacgtcaatt ccaacaaaaa attgaacgac accatgattg tttggagaga 1320
cgaaggtaac gatgacttac cattaaacaa gttgaccttg gaccaattga gaaagcgtgt 1380
ctggttggtc ggttacgcct tggaggaaat gggtttggaa aaaggttgtg ccatcgctat 1440
cgatatgcca atgcacgtcg acgccgtcgt tatctatttg gccatcgttt tagctggtta 1500
cgtcgtcgtc tccatcgctg actctttctc cgctccagaa atttccacta gattgagatt 1560
atccaaggcc aaggctattt tcactcaaga tcacattatt agaggtaaga agcgtattcc 1620
attgtactcc agagtcgtcg aagccaagtc tcctatggcc attgttatcc catgttctgg 1680
ttctaacatt ggtgctgaat tgagagatgg tgacatttcc tgggactatt tcttggaaag 1740
agctaaggaa tttaagaact gcgaatttac cgccagagaa caacctgttg atgcctacac 1800
taacattttg ttctcttctg gtacaactgg tgagccaaag gctatccctt ggactcaagc 1860
taccccatta aaggccgccg ctgatggttg gtcccacttg gacattcgta agggtgacgt 1920
catcgtctgg ccaactaact tgggttggat gatgggtcca tggttagttt acgcctcttt 1980
gttaaacggt gcttccattg ccttgtacaa cggttctcca ttggtttctg gtttcgctaa 2040
gtttgtccaa gacgccaagg ttaccatgtt aggtgttgtt ccatctatcg tcagatcttg 2100
gaagtctact aactgtgtct ctggttacga ttggtctact atcagatgct tctcttcctc 2160
tggtgaagcc tctaacgttg atgaatattt gtggttgatg ggtcgtgcca actacaagcc 2220
agttatcgaa atgtgtggtg gtacagagat cggtggtgct ttttccgctg gttccttttt 2280
gcaagctcaa tctttgtctt ctttctcttc tcaatgtatg ggttgtactt tgtatatttt 2340
ggataagaac ggttacccaa tgcctaagaa caaaccaggt atcggtgaat tagctttggg 2400
tccagttatg ttcggtgctt ccaagacctt gttgaacggt aatcaccatg atgtctattt 2460
caaaggtatg ccaactttaa acggtgaagt cttgagacgt cacggtgaca tctttgaatt 2520
gacttctaac ggttactacc atgctcacgg tagagctgat gatactatga acattggtgg 2580
tattaagatt tcttctatcg aaatcgaaag agtttgtaat gaagttgacg acagagtctt 2640
tgaaaccact gctattggtg tcccaccatt gggtggtggt ccagaacaat tagtcatttt 2700
cttcgttttg aaggattcta acgacactac catcgactta aaccaattga gattgtcttt 2760
caacttgggt ttgcaaaaga agttgaaccc attatttaaa gtcactagag ttgttccatt 2820
gtcttctttg ccaagaaccg ccaccaacaa gattatgaga agagttttga gacaacaatt 2880
ttctcatttc gaaggctgaa gacataaaac tgaaacaaca ccaattaata atagactttt 2940
ggacttcttc gccagaggtt tggtcaagtc tccaatcaag gttgtcggct tgtctacctt 3000
gccagaaatt tacgaaaaga tggaaaaggg tcaaatcgtt ggtagatacg ttgttgacac 3060
ttctaaataa gcgaatttct tatgatttat gatttttatt attaaataag ttataaaaaa 3120
aataagtgta tacaaatttt aaagtgactc ttaggtttta aaacgaaaat tcttattctt 3180
gagtaactct ttcctgtagg tcaggttgct ttctcaggta tagcatgagg tcgctcttat 3240
tgaccacacc tctaccggca tgccttaaat aacatactca tcactaaaca ttcttaacaa 3300
tcaaagcaac aggcgcgttg gacttttaat tttcgaggac cgcgaatcct tacatcacac 3360
ccaatccccc acaagtgatc ccccacacac catagcttca aaatgtttct actccttttt 3420
tactcttcca gattttctcg gactccgcgc atcgccgtac cacttcaaaa cacccaagca 3480
cagcatacta aatttcccct ctttcttcct ctagggtgtc gttaattacc cgtactaaag 3540
gtttggaaaa gaaaaaagag accgcctcgt ttctttttct tcgtcgaaaa aggcaataaa 3600
aatttttatc acgtttcttt ttcttgaaaa tttttttttt tgattttttt ctctttcgat 3660
gacctcccat tgatatttaa gttaataaac ggtcttcaat ttctcaagtt tcagtttcat 3720
ttttcttgtt ctattacaac tttttttact tcttgctcat tagaaagaaa gcatagcaat 3780
ctaatctaag ttttaataca tctaccagtc aacagccaac aattaactaa ttaaacaatg 3840
aaccacttga gagctgaagg tccagcttcc gttttggcta tcggtacagc taaccctgaa 3900
aacatcttgt tgcaagatga attcccagac tattacttca gagttaccaa gtctgaacat 3960
atgactcaat tgaaggaaaa gtttagaaag atttgtgata agtctatgat cagaaagcgt 4020
aattgttttt tgaacgaaga acatttaaaa caaaatccaa gattggttga gcacgaaatg 4080
caaactttgg atgctagaca agatatgtta gtcgtcgaag tcccaaagtt gggtaaggat 4140
gcttgtgcta aggctattaa ggagtggggt caaccaaagt ccaaaatcac ccacttgatt 4200
ttcacttccg cttctactac cgacatgcca ggtgctgatt accactgtgc taagttgttg 4260
ggtttatccc cttctgttaa aagagttatg atgtaccaat tgggttgcta cggtggtggt 4320
actgttttga gaattgccaa ggacatcgct gagaataaca agggtgctag agttttggcc 4380
gtctgttgtg acatcatggc ttgtttattc agaggtccat ctgaatccga cttggaattg 4440
ttagtcggtc aagccatctt tggtgatggt gctgccgccg ttattgttgg tgctgaacca 4500
gatgaatccg tcggtgaaag accaatcttt gagttggtct ctactggtca aaccattttg 4560
ccaaactccg aaggtactat tggtggtcac atccgtgaag ctggtttgat ttttgattta 4620
cacaaggatg tcccaatgtt gatctctaac aacatcgaga agtgtttaat tgaagccttc 4680
accccaattg gtatttccga ctggaactct attttctgga ttactcatcc aggtggtaag 4740
gctattttag ataaggttga agaaaagttg cacttgaagt ctgataaatt cgttgactct 4800
agacacgttt tgtctgaaca tggtaatatg tcttcttcca ctgttttgtt cgttatggat 4860
gaattgagaa agagatcttt ggaagaaggt aagtccacta ctggtgacgg tttcgaatgg 4920
ggtgttttgt tcggtttcgg tccaggtttg actgttgaaa gagtcgttgt ccgttctgtt 4980
ccaatcaagt acggctaata ataattaaat actattttca aaattctact taaaaataac 5040
agaagacggg agacactagc acacaacttt accaggcaag gtatttgacg ctagcatgtg 5100
tccaattcag tgtcatttat gattttttgt agtaggatat aaatatatac agcgctccaa 5160
atagtgcggt tgccccaaaa acaccacgga acctcatctg ttctcgtact ttgttgtgac 5220
aaagtagctc actgccttat tatcacattt tcattatgca acgcttcgga aaatacgatg 5280
ttgaaaatgc ctctagagat gaaaaacaat cgtaaaaggg tcctgcgtaa ttgaaacatt 5340
tgatcagtat gcagtggcac agaaacaacc aggaatacta tagtcatagg caatacaagg 5400
tatatattgg ctatgcagac ccctccagaa agtaccgacg tcaagttaga tacacttaac 5460
gaacctagtg cacatttaat tgagaaaaat gtggctcttc ctaaggacat attccgttcg 5520
tacttgagtt attggatcta tgaaatcgct cgctatacac cagtcatgat tttgtccctc 5580
tttatattac atcaaaataa gaaaataatt ataaca 5616
<210> 46
<211> 10584
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有盘基网柄菌DiPKS编码序列、调节序列和整合序列的盒
<220>
<221> LV3
<222> (1)..(40)
<220>
<221> 酿酒酵母GAL1启动子
<222> (41)..(482)
<220>
<221> L1
<222> (483)..(522)
<220>
<221> DiPKS
<222> (523)..(9966)
<220>
<221> 基序1
<222> (5050)..(5076)
<220>
<221> C-甲基转移酶结构域
<222> (5050)..(5412)
<220>
<221> 基序2
<222> (5309)..(5331)
<220>
<221> 基序3
<222> (5389)..(5421)
<220>
<221> L2
<222> (9967)..(10006)
<220>
<221> PRM9t
<222> (10007)..(10544)
<220>
<221> LV5
<222> (10545)..(10584)
<400> 46
aggaatactc tgaataaaac aacttatata ataaaaatgc cggattagaa gccgccgagc 60
gggtgacagc cctccgaagg aagactctcc tccgtgcgtc ctcgtcttca ccggtcgcgt 120
tcctgaaacg cagatgtgcc tcgcgccgca ctgctccgaa caataaagat tctacaatac 180
tagcttttat ggttatgaag aggaaaaatt ggcagtaacc tggccccaca aaccttcaaa 240
tgaacgaatc aaattaacaa ccataggatg ataatgcgat tagtttttta gccttatttc 300
tggggtaatt aatcagcgaa gcgatgattt ttgatctatt aacagatata taaatgcaaa 360
aactgcataa ccactttaac taatactttc aacattttcg gtttgtatta cttcttattc 420
aaatgtaata aaagtatcaa caaaaaattg ttaatatacc tctatacttt aacgtcaagg 480
agctagaaaa tttattataa aaggaagaga aataattaaa caatgaacaa gaactccaaa 540
atccagtccc caaactcttc tgatgttgct gttattggtg ttggttttag attcccaggt 600
aactctaatg acccagaatc tttgtggaac aacttgttgg atggtttcga tgctattacc 660
caagtcccaa aagaaagatg ggctacttct tttagagaga tgggtttgat caagaacaag 720
ttcggtggtt tcttgaagga ttctgaatgg aagaatttcg accctttgtt ctttggtatc 780
ggtccaaaag aagctccatt cattgatcca caacaaaggt tgttgttgtc catcgtttgg 840
gaatctttgg aagatgctta catcagacca gatgaattga gaggttctaa cactggtgtt 900
ttcatcggtg tttctaacaa cgattacacc aagttgggtt tccaagacaa ctactctatt 960
tctccataca ctatgaccgg ctctaactct tcattgaact ccaacagaat ttcctactgc 1020
ttcgatttta gaggtccatc cattactgtt gataccgctt gttcttcttc cttggtttct 1080
gttaatttgg gtgtccaatc catccaaatg ggtgaatgta agattgctat ttgcggtggt 1140
gttaacgctt tgtttgatcc atctacatct gttgcctttt ccaagttggg tgttttgtct 1200
gaaaatggca gatgcaactc ttttagtgat caagcctctg gttacgttag atctgaaggt 1260
gctggtgttg ttgttttgaa gtctttggaa caagctaagt tggatggtga tagaatctac 1320
ggtgttatca agggtgtttc ctctaatgaa gatggtgctt ctaatggtga caagaactct 1380
ttgactactc catcttgtga agcccaatcc attaacattt ctaaggctat ggaaaaggcc 1440
tccttgtctc catctgatat ctattacatt gaagcccatg gtactggtac tccagttggt 1500
gatccaattg aagttaaggc cttgtccaag atcttctcca actctaacaa caaccagttg 1560
aacaacttct ctaccgatgg taatgataac gatgatgatg atgacgataa cacctctcca 1620
gaaccattat tgattggctc attcaagtcc aacatcggtc atttggaatc tgctgctggt 1680
attgcttctt tgattaagtg ttgcttgatg ttgaagaaca ggatgttggt tccatccatt 1740
aactgctcta atttgaaccc atccattcca ttcgatcagt acaacatctc cgttatcaga 1800
gaaatcagac aattcccaac cgataagttg gttaacatcg gtatcaattc tttcggtttc 1860
ggtggttcta actgccattt gattattcaa gagtacaaca acaacttcaa gaacaactct 1920
accatctgca ataacaacaa caacaacaat aacaacatcg actacttgat cccaatctcc 1980
tctaagacta agaagtcctt ggataagtac ttgattttga tcaagaccaa ctccaactac 2040
cacaaggata tttctttcga tgacttcgtc aagttccaaa tcaagtctaa gcagtacaac 2100
ttgtccaaca gaatgactac cattgctaac gattggaact ccttcattaa gggttctaac 2160
gaattccaca acttgatcga atctaaggat ggtgaaggtg gttcttcatc ttctaacaga 2220
ggtattgatt ccgccaatca aatcaacact actactacct ctaccatcaa cgatatcgaa 2280
cctttgttgg ttttcgtttt ctgtggtcaa ggtccacaat ggaatggtat gattaagacc 2340
ttgtacaact ccgagaacgt tttcaagaac accgttgatc atgttgacag catcttgtac 2400
aagtacttcg gttactccat tttgaacgtc ttgtctaaga tcgatgataa cgacgattcc 2460
atcaaccatc caatagttgc tcaaccatct ttgttcttgt tgcaaattgg tttggtcgag 2520
ttgtttaagt actggggtat ctacccatct atctctgttg gtcattcttt cggtgaagtc 2580
tcttcttatt acttgtccgg tatcatctct ttggaaaccg cttgtaaaat cgtctacgtc 2640
agatcctcta atcagaacaa aactatgggt tccggtaaga tgttggttgt ttctatgggt 2700
tttaagcaat ggaacgatca attctctgct gaatggtccg atattgaaat tgcttgttac 2760
aacgctccag attccatagt tgttactggt aacgaagaaa gattgaaaga attgtccatc 2820
aagttgtccg acgaatccaa tcaaattttc aacaccttct tgaggtcccc atgttctttt 2880
cattcttccc atcaagaagt catcaagggt tctatgttcg aagagttgtc taacttgcaa 2940
tctactggtg aaaccgaaat ccctttgttc tctactgtta ctggtagaca agttttgtct 3000
ggtcatgtta ctgctcaaca catctacgat aatgttagag aaccagtctt gttccaaaag 3060
acgattgaat ccattacctc ctacatcaag tctcactacc catccaatca aaaggttatc 3120
tacgttgaaa ttgctccaca cccaaccttg ttttcattga tcaaaaagtc catcccatcc 3180
tccaacaaga attcctcttc tgttttgtgt ccattgaaca gaaaagaaaa ctccaacaac 3240
tcctacaaga agttcgtttc tcagttgtac ttcaacggtg ttaacgttga cttcaacttc 3300
cagttgaact ccatttgcga taacgttaac aacgatcacc atttgaacaa cgtcaagcaa 3360
aactccttca aagagactac caattccttg ccaagatacc aatgggaaca agatgaatat 3420
tggtccgaac cattgatctc cagaaagaat agattggaag gtccaactac ttccttgttg 3480
ggtcatagaa ttatctacag cttcccagtt ttccaatccg ttttggactt gcaatctgac 3540
aactacaaat acttgttgga ccacttggtt aacggtaagc cagtttttcc aggtgctggt 3600
tatttggata tcatcatcga attcttcgac taccaaaagc agcagttgaa ttcctctgat 3660
tcctctaact cctacatcat caacgttgac aagatccaat tcttgaaccc aattcacttg 3720
accgaaaaca agttgcaaac cttgcaatct tctttcgaac ctatcgttac taagaagtct 3780
gccttctctg ttaacttctt catcaaggat accgtcgagg atcaatctaa ggttaagtct 3840
atgtctgacg aaacttggac taacacttgt aaggctacca tttccttgga acaacaacag 3900
ccatctccat cttctacttt gactttgtct aagaagcaag acttgcagat cttgagaaac 3960
agatgcgata ttagcaagct agacaagttt gagttgtacg acaagatctc taagaatttg 4020
ggcttgcagt acaactcctt gtttcaagtt gttgatacca tcgaaactgg taaggattgc 4080
tcttttgcta ctttgtcttt gccagaagat actttgttca ccaccatttt gaacccatgc 4140
ttgttggata actgtttcca tggtttgttg accttgatca acgaaaaggg ttctttcgtt 4200
gtcgagtcca tttcttctgt ttctatctac ttggagaaca tcggttcctt caatcaaact 4260
tctgttggta acgtccagtt ctacttgtac accactattt ctaaagccac ctcctttagt 4320
tctgaaggta cttgtaagtt gttcaccaag gatggttcct tgattttgtc tatcggtaag 4380
ttcatcatca agtccaccaa tccaaagtct actaagacca acgaaactat cgaatctcca 4440
ttggacgaaa ccttctctat tgaatggcaa tctaaggatt ctccaattcc aaccccacaa 4500
caaatccaac aacaatctcc attgaactct aacccatcct tcattagatc taccatcttg 4560
aaggacatcc agttcgaaca atactgctcc tccattatcc acaaagaatt gatcaaccac 4620
gaaaagtaca agaaccagca atccttcgat atcaactcct tggaaaacca cttgaacgat 4680
gaccaattga tggaatcctt gtccatctcc aaagaatact tgagattctt caccaggatc 4740
atctccatca ttaagcaata cccaaagatc ttgaacgaaa aagagctaaa agaattgaaa 4800
gaaatcatcg aattgaagta cccatccgaa gttcagttgt tggaattcga agttatcgag 4860
aaggtgtcca tgattatccc aaagttgttg ttcgaaaacg acaagcaatc ttccatgacc 4920
ttgttccaag ataacttgtt gaccaggttc tactccaatt ctaactctac cagattctac 4980
ttggaaaggg tttccgaaat ggtcttggaa tctattagac caatcgtcag agaaaagagg 5040
gtgttcagaa ttttggaaat tggtgctggt acaggctctt tgtctaatgt tgttttgact 5100
aagttgaaca cctacttgtc caccttgaat tctaatggtg gttctggtta caacatcatc 5160
attgagtaca ccttcaccga tatttccgcc aacttcatta ttggtgaaat ccaagaaacc 5220
atgtgcaact tgtacccaaa cgttactttc aagttctccg tcttggactt ggagaaagag 5280
attattaact cctccgattt cttgatgggt gattacgata tagttttgat ggcctacgtt 5340
atccatgccg tttctaacat taagttctcc atcgaacagt tgtacaagtt gttgtctcca 5400
agaggttggt tgttgtgtat tgaacctaag tccaacgttg tgttctccga tttggttttc 5460
ggttgtttta atcagtggtg gaactactac gatgatatta gaactaccca ctgctccttg 5520
tctgaatctc aatggaatca gttgttgttg aaccagtcct tgaacaacga atcctcttct 5580
tcttctaact gttacggtgg tttctccaac gtttctttta ttggtggtga aaaggatgtc 5640
gactcccatt ctttcatatt gcactgccaa aaagaatcca tctcccaaat gaagttagcc 5700
accactatta acaacggttt gtcatctggt tccatcgtta tcgttttgaa ctctcaacaa 5760
ttgaccaaca tgaagtccta cccaaaggtt attgagtata ttcaagaggc tacctctttg 5820
tgcaagacca ttgaaattat cgattccaag gacgtcttga actctaccaa ttcagttttg 5880
gaaaagatcc aaaagtcctt gttggtgttc tgtttgttgg gttatgactt gttggagaac 5940
aactaccaag aacagtcttt cgaatacgtt aagttgttga acttgatctc tactaccgcc 6000
tcttcatcta atgataagaa accaccaaag gtcttgttga tcaccaagca atctgaaaga 6060
atctccaggt ctttctactc cagatccttg attggtattt ccagaacctc tatgaacgag 6120
tacccaaatt tgtccattac ctctatcgat ttggatacca acgactactc attgcagtct 6180
ttgttgaagc caatcttcag caactctaag ttttccgaca acgagttcat cttcaaaaag 6240
ggcttgatgt tcgtgtccag gatctttaag aacaagcagt tgctagaatc ctccaacgct 6300
tttgaaactg actcttctaa cttgtactgt aaggcctctt ctgacttgtc ttacaagtac 6360
gctattaagc agtctatgtt gaccgaaaat cagatcgaaa tcaaggttga atgcgtcggt 6420
attaacttca aggacaacct attctacaag ggcttgttgc cacaagaaat tttcagaatg 6480
ggtgacatct acaatccacc atatggtttg gaatgctctg gtgttattac cagaattggt 6540
tctaacgtca ccgaatactc agttggtcaa aatgtttttg gtttcgccag acattctttg 6600
ggttctcatg ttgttaccaa caaggatttg gttatcttga agccagatac catctcattt 6660
tctgaagctg cttctatccc agttgtttac tgtactgctt ggtactcctt gttcaacatt 6720
ggtcagttgt ctaacgaaga atccatccta attcattctg ctactggtgg tgtaggtttg 6780
gcttctttga atttgttgaa aatgaagaat cagcaacagc aaccattgac caatgtttat 6840
gctactgttg gctctaacga gaagaagaag ttcttgatcg ataacttcaa caacttgttc 6900
aaagaggacg gcgaaaacat tttctctacc agagacaaag aatactccaa ccagttggaa 6960
tccaagatcg atgttatttt gaacaccttg tccggtgaat tcgtcgaatc taatttcaag 7020
tccttgagat ccttcggtag attgattgat ttgtctgcta ctcacgttta cgccaatcaa 7080
caaattggtc taggtaactt caagttcgac cacttgtatt ctgctgttga cttggaaaga 7140
ttgatcgacg aaaaacctaa gttgttgcag tccatcttgc aaagaattac caactctatc 7200
gtcaacggtt ccttggaaaa aattccaatt accatcttcc catccaccga aactaaggat 7260
gctatcgaat tattgtccaa gagatcccat atcggtaaag ttgttgtaga ttgcaccgat 7320
atctctaagt gtaatcctgt tggtgatgtg atcaccaact tctctatgag attgccaaag 7380
ccaaactacc agttgaattt gaactccacc ttgttgatta ctggtcagtc tggtttgtct 7440
atccctttgt tgaattggtt gttgtctaag tctggtggta acgttaagaa cgttgtcatc 7500
atttctaagt ccaccatgaa gtggaagttg cagactatga tttcccattt cgtttccggt 7560
ttcggtatcc attttaacta cgttcaagtc gacatctcca actacgatgc tttgtctgaa 7620
gctattaagc aattgccatc tgatttgcca ccaatcacct ctgtttttca tttggctgct 7680
atctacaacg atgttccaat ggatcaagtt accatgtcta ccgttgaatc tgttcataac 7740
cctaaagttt tgggtgccgt taacttgcat agaatctctg tttcttttgg ttggaagttg 7800
aaccacttcg tcttgttctc ttctattact gctattaccg gttacccaga ccaatctatc 7860
tacaattctg ccaactctat tttggacgct ttgtccaact ttagaaggtt tatgggtttg 7920
ccatccttct ccattaactt gggtccaatg aaggatgaag gtaaggtttc taccaacaag 7980
agcatcaaga agctattcaa gtctagaggt ttgccaagcc tatccttgaa caagttattt 8040
ggtttgttgg aggtcgtcat caacaaccca tctaatcatg ttatcccatc ccaattgatt 8100
tgctccccaa tcgatttcaa gacctacatc gaatctttct caactatgag gccaaagttg 8160
ttacacttgc aacctaccat ttccaagcag caatcttcta tcattaacga ttctaccaag 8220
gcttcctcca acatttcatt gcaagataag atcacctcca aggtgtctga tttgttgtcc 8280
attccaatct ccaagatcaa cttcgatcat ccattgaaac actacggctt ggattctttg 8340
ttgaccgttc aattcaaatc ctggatcgac aaagaattcg aaaagaactt gttcacccat 8400
atccaattgg ccaccatctc tattaactca ttcttggaaa aggtgaacgg cttgtctaca 8460
aacaataaca acaacaacaa ttccaacgtc aagtcctctc catccattgt caaagaagaa 8520
atcgttacct tggacaagga tcaacaacca ttgctattga aagaacacca gcacattatc 8580
atctccccag atattagaat caacaagcca aagagggaat ccttgattag aaccccaatc 8640
ttgaacaaat tcaaccagat caccgaatcc attatcactc catctacacc atctttgtcc 8700
caatccgatg ttttgaaaac tccaccaatc aagtctttga acaacactaa gaactccagc 8760
ttgattaaca ccccaccaat tcaatctgtc caacaacatc aaaagcaaca acaaaaggtc 8820
caagtcatcc aacaacagca acaaccatta tccagattgt cctacaagag caacaacaac 8880
tctttcgttt tgggtatcgg tatttctgtt ccaggtgaac ctatttccca acaatccttg 8940
aaagactcca tctccaatga cttttctgat aaggctgaaa ctaacgagaa ggtcaagaga 9000
atctttgagc aatctcaaat caagaccaga cacttggtta gagattacac taagccagag 9060
aactccatca agttcagaca tttggaaacc attaccgatg tgaacaacca gttcaagaaa 9120
gttgttccag atttggctca acaagcctgt ttgagagctt tgaaagattg gggtggtgat 9180
aagggtgata ttacccatat agtttctgtt acctccaccg gtattatcat cccagatgtt 9240
aatttcaagt tgatcgactt gttgggcttg aacaaggatg ttgaaagagt gtctttgaac 9300
ctaatgggtt gtttggctgg tttgagttct ttgagaactg ctgcttcttt ggctaaggct 9360
tctccaagaa atagaatttt ggttgtctgt accgaagtct gctccttgca tttttctaat 9420
actgatggtg gtgatcaaat ggtcgcctct tctatttttg ctgatggttc tgctgcttac 9480
attattggtt gtaacccaag aattgaagaa accccattat acgaagtcat gtgctccatt 9540
aacagatctt tcccaaatac cgaaaacgcc atggtttggg atttggaaaa agaaggttgg 9600
aacttgggtt tggatgcttc tattccaatt gtcattggtt ctggtattga agccttcgtt 9660
gatactttgt tggataaggc taagttgcaa acttccactg ctatttctgc taaggattgc 9720
gaattcttga ttcatactgg tggcaagtcc atcttgatga acatcgaaaa ttccttgggt 9780
atcgacccaa agcaaactaa gaatacttgg gatgtttacc atgcctacgg caatatgtca 9840
tctgcctctg ttattttcgt tatggatcat gccagaaagt ccaagtcttt gccaacttac 9900
tcaatttctt tggcttttgg tccaggtttg gcttttgaag gttgtttctt gaagaacgtc 9960
gtctaaagac ataaaactga aacaacacca attaataata gactttacag aagacgggag 10020
acactagcac acaactttac caggcaaggt atttgacgct agcatgtgtc caattcagtg 10080
tcatttatga ttttttgtag taggatataa atatatacag cgctccaaat agtgcggttg 10140
ccccaaaaac accacggaac ctcatctgtt ctcgtacttt gttgtgacaa agtagctcac 10200
tgccttatta tcacattttc attatgcaac gcttcggaaa atacgatgtt gaaaatgcct 10260
ctagagatga aaaacaatcg taaaagggtc ctgcgtaatt gaaacatttg atcagtatgc 10320
agtggcacag aaacaaccag gaatactata gtcataggca atacaaggta tatattggct 10380
atgcagaccc ctccagaaag taccgacgtc aagttagata cacttaacga acctagtgca 10440
catttaattg agaaaaatgt ggctcttcct aaggacatat tccgttcgta cttgagttat 10500
tggatctatg aaatcgctcg ctatacacca gtcatgattt tgtccctctt tatattacat 10560
caaaataaga aaataattat aaca 10584
<210> 47
<211> 4909
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有Cas9编码序列、调节序列和整合序列的盒
<220>
<221> LV3
<222> (1)..(40)
<220>
<221> TEF1p
<222> (41)..(446)
<220>
<221> Cas9
<222> (470)..(4609)
<220>
<221> LV5
<222> (4870)..(4909)
<400> 47
aggaatactc tgaataaaac aacttatata ataaaaatgc atagcttcaa aatgtttcta 60
ctcctttttt actcttccag attttctcgg actccgcgca tcgccgtacc acttcaaaac 120
acccaagcac agcatactaa atttcccctc tttcttcctc tagggtgtcg ttaattaccc 180
gtactaaagg tttggaaaag aaaaaagaga ccgcctcgtt tctttttctt cgtcgaaaaa 240
ggcaataaaa atttttatca cgtttctttt tcttgaaaat tttttttttg atttttttct 300
ctttcgatga cctcccattg atatttaagt taataaacgg tcttcaattt ctcaagtttc 360
agtttcattt ttcttgttct attacaactt tttttacttc ttgctcatta gaaagaaagc 420
atagcaatct aatctaagtt ttctagaact agtggatccc ccgggaaaaa tggacaagaa 480
gtactccatt gggctcgata tcggcacaaa cagcgtcggc tgggccgtca ttacggacga 540
gtacaaggtg ccgagcaaaa aattcaaagt tctgggcaat accgatcgcc acagcataaa 600
gaagaacctc attggcgccc tcctgttcga ctccggggag acggccgaag ccacgcggct 660
caaaagaaca gcacggcgca gatatacccg cagaaagaat cggatctgct acctgcagga 720
gatctttagt aatgagatgg ctaaggtgga tgactctttc ttccataggc tggaggagtc 780
ctttttggtg gaggaggata aaaagcacga gcgccaccca atctttggca atatcgtgga 840
cgaggtggcg taccatgaaa agtacccaac catatatcat ctgaggaaga agcttgtaga 900
cagtactgat aaggctgact tgcggttgat ctatctcgcg ctggcgcata tgatcaaatt 960
tcggggacac ttcctcatcg agggggacct gaacccagac aacagcgatg tcgacaaact 1020
ctttatccaa ctggttcaga cttacaatca gcttttcgaa gagaacccga tcaacgcatc 1080
cggagttgac gccaaagcaa tcctgagcgc taggctgtcc aaatcccggc ggctcgaaaa 1140
cctcatcgca cagctccctg gggagaagaa gaacggcctg tttggtaatc ttatcgccct 1200
gtcactcggg ctgaccccca actttaaatc taacttcgac ctggccgaag atgccaagct 1260
tcaactgagc aaagacacct acgatgatga tctcgacaat ctgctggccc agatcggcga 1320
ccagtacgca gacctttttt tggcggcaaa gaacctgtca gacgccattc tgctgagtga 1380
tattctgcga gtgaacacgg agatcaccaa agctccgctg agcgctagta tgatcaagcg 1440
ctatgatgag caccaccaag acttgacttt gctgaaggcc cttgtcagac agcaactgcc 1500
tgagaagtac aaggaaattt tcttcgatca gtctaaaaat ggctacgccg gatacattga 1560
cggcggagca agccaggagg aattttacaa atttattaag cccatcttgg aaaaaatgga 1620
cggcaccgag gagctgctgg taaagcttaa cagagaagat ctgttgcgca aacagcgcac 1680
tttcgacaat ggaagcatcc cccaccagat tcacctgggc gaactgcacg ctatcctcag 1740
gcggcaagag gatttctacc cctttttgaa agataacagg gaaaagattg agaaaatcct 1800
cacatttcgg ataccctact atgtaggccc cctcgcccgg ggaaattcca gattcgcgtg 1860
gatgactcgc aaatcagaag agaccatcac tccctggaac ttcgaggaag tcgtggataa 1920
gggggcctct gcccagtcct tcatcgaaag gatgactaac tttgataaaa atctgcctaa 1980
cgaaaaggtg cttcctaaac actctctgct gtacgagtac ttcacagttt ataacgagct 2040
caccaaggtc aaatacgtca cagaagggat gagaaagcca gcattcctgt ctggagagca 2100
gaagaaagct atcgtggacc tcctcttcaa gacgaaccgg aaagttaccg tgaaacagct 2160
caaagaagac tatttcaaaa agattgaatg tttcgactct gttgaaatca gcggagtgga 2220
ggatcgcttc aacgcatccc tgggaacgta tcacgatctc ctgaaaatca ttaaagacaa 2280
ggacttcctg gacaatgagg agaacgagga cattcttgag gacattgtcc tcacccttac 2340
gttgtttgaa gatagggaga tgattgaaga acgcttgaaa acttacgctc atctcttcga 2400
cgacaaagtc atgaaacagc tcaagaggcg ccgatataca ggatgggggc ggctgtcaag 2460
aaaactgatc aatgggatcc gagacaagca gagtggaaag acaatcctgg attttcttaa 2520
gtccgatgga tttgccaacc ggaacttcat gcagttgatc catgatgact ctctcacctt 2580
taaggaggac atccagaaag cacaagtttc tggccagggg gacagtcttc acgagcacat 2640
cgctaatctt gcaggtagcc cagctatcaa aaagggaata ctgcagaccg ttaaggtcgt 2700
ggatgaactc gtcaaagtaa tgggaaggca taagcccgag aatatcgtta tcgagatggc 2760
ccgagagaac caaactaccc agaagggaca gaagaacagt agggaaagga tgaagaggat 2820
tgaagagggt ataaaagaac tggggtccca aatccttaag gaacacccag ttgaaaacac 2880
ccagcttcag aatgagaagc tctacctgta ctacctgcag aacggcaggg acatgtacgt 2940
ggatcaggaa ctggacatca atcggctctc cgactacgac gtggatcata tcgtgcccca 3000
gtcttttctc aaagatgatt ctattgataa taaagtgttg acaagatccg ataaaaatag 3060
agggaagagt gataacgtcc cctcagaaga agttgtcaag aaaatgaaaa attattggcg 3120
gcagctgctg aacgccaaac tgatcacaca acggaagttc gataatctga ctaaggctga 3180
acgaggtggc ctgtctgagt tggataaagc cggcttcatc aaaaggcagc ttgttgagac 3240
acgccagatc accaagcacg tggcccaaat tctcgattca cgcatgaaca ccaagtacga 3300
tgaaaatgac aaactgattc gagaggtgaa agttattact ctgaagtcta agctggtctc 3360
agatttcaga aaggactttc agttttataa ggtgagagag atcaacaatt accaccatgc 3420
gcatgatgcc tacctgaatg cagtggtagg cactgcactt atcaaaaaat atcccaagct 3480
tgaatctgaa tttgtttacg gagactataa agtgtacgat gttaggaaaa tgatcgcaaa 3540
gtctgagcag gaaataggca aggccaccgc taagtacttc ttttacagca atattatgaa 3600
ttttttcaag accgagatta cactggccaa tggagagatt cggaagcgac cacttatcga 3660
aacaaacgga gaaacaggag aaatcgtgtg ggacaagggt agggatttcg cgacagtccg 3720
gaaggtcctg tccatgccgc aggtgaacat cgttaaaaag accgaagtac agaccggagg 3780
cttctccaag gaaagtatcc tcccgaaaag gaacagcgac aagctgatcg cacgcaaaaa 3840
agattgggac cccaagaaat acggcggatt cgattctcct acagtcgctt acagtgtact 3900
ggttgtggcc aaagtggaga aagggaagtc taaaaaactc aaaagcgtca aggaactgct 3960
gggcatcaca atcatggagc gatcaagctt cgaaaaaaac cccatcgact ttctcgaggc 4020
gaaaggatat aaagaggtca aaaaagacct catcattaag cttcccaagt actctctctt 4080
tgagcttgaa aacggccgga aacgaatgct cgctagtgcg ggcgagctgc agaaaggtaa 4140
cgagctggca ctgccctcta aatacgttaa tttcttgtat ctggccagcc actatgaaaa 4200
gctcaaaggg tctcccgaag ataatgagca gaagcagctg ttcgtggaac aacacaaaca 4260
ctaccttgat gagatcatcg agcaaataag cgaattctcc aaaagagtga tcctcgccga 4320
cgctaacctc gataaggtgc tttctgctta caataagcac agggataagc ccatcaggga 4380
gcaggcagaa aacattatcc acttgtttac tctgaccaac ttgggcgcgc ctgcagcctt 4440
caagtacttc gacaccacca tagacagaaa gcggtacacc tctacaaagg aggtcctgga 4500
cgccacactg attcatcagt caattacggg gctctatgaa acaagaatcg acctctctca 4560
gctcggtgga gacagcaggg ctgaccccaa gaagaagagg aaggtgtgat ctcttctcga 4620
gtcatgtaat tagttatgtc acgcttacat tcacgccctc cccccacatc cgctctaacc 4680
gaaaaggaag gagttagaca acctgaagtc taggtcccta tttatttttt tatagttatg 4740
ttagtattaa gaacgttatt tatatttcaa atttttcttt tttttctgta cagacgcgtg 4800
tacgcatgta acattatact gaaaaccttg cttgagaagg ttttgggacg ctcgaaggct 4860
ttaatttgcc ctctttatat tacatcaaaa taagaaaata attataaca 4909

Claims (66)

1.一种生产植物大麻素或植物大麻素类似物的方法，所述方法包括：
提供酵母细胞，所述酵母细胞包括编码聚酮化合物合成酶的第一多核苷酸和编码胞质异戊烯基转移酶的第二多核苷酸，其中：
所述聚酮化合物合成酶用于由丙二酰基辅酶A生产至少一种前体化学物质，所述前体化学物质具有结构I：
Figure FDA0002234501000000011
其中，在结构I上，R1是链长为1、2、3、4或5个碳的烷基，R2是H、羧基或甲基，并且R3是H、羧基或甲基；并且
所述胞质异戊烯基转移酶用于使所述至少一种前体化学物质异戊烯化，提供至少一个种类的植物大麻素或植物大麻素类似物；和
使所述酵母细胞繁殖，用于提供酵母细胞培养物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中：
所述酵母细胞包括编码己酰基合成酶的第三多核苷酸；
所述聚酮化合物合成酶包括来自大麻的OAS酶；并且
使所述酵母细胞繁殖包括使所述酵母细胞在包括己酸的营养制剂中繁殖。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述酵母细胞不包括大麻聚酮化合物环化酶，并且所述至少一个种类的植物大麻素或植物大麻素类似物包括脱羧的植物大麻素或植物大麻素类似物。
4.根据权利要求2或3中任一项所述的方法，其中所述第一多核苷酸包括用于来自大麻的所述OAS酶的编码序列，所述OAS酶的一级结构与由SEQ ID NO:45的碱基3841至4995限定的阅读框编码的蛋白质具有80％和100％之间的氨基酸残基序列同源性。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述第一多核苷酸与SEQ ID NO:45的碱基3841至4995具有80％和100％之间的碱基序列同源性。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中R1是链长为3个碳的烷基，R2是H，并且R3是H。
7.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中R1是链长为3个碳的烷基，R2是羧基，并且R3是H。
8.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中R1是链长为3个碳的烷基，R2是甲基，并且R3是H。
9.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中R1是链长为3个碳的烷基，R2是羧基，并且R3是甲基。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述聚酮化合物合成酶包括来自盘基网柄菌的DiPKS聚酮化合物合成酶。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述第一多核苷酸包括用于所述DiPKS聚酮化合物合成酶的编码序列，所述DiPKS聚酮化合物合成酶的一级结构与由SEQ ID NO:46的碱基535至9978限定的阅读框编码的蛋白质具有80％和100％之间的氨基酸残基序列同源性。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述第一多核苷酸与SEQ ID NO:46的碱基535至9978具有80％和100％之间的碱基序列同源性。
13.根据权利要求10至12中任一项所述的方法，其中所述至少一种前体化学物质在R2处包括甲基，并且所述至少一个种类的植物大麻素或植物大麻素类似物包括甲基化的植物大麻素类似物。
14.根据权利要求10所述的方法，其中：
所述DiPKS聚酮化合物合成酶包括影响C-Met结构域的活性位点的突变，用于减轻所述至少一种前体化学物质的甲基化，使得所述至少一种前体化学物质包括其中R2是甲基并且R3是H的第一前体化学物质，和其中R2是H并且R3是H的第二前体化学物质；并且
所述至少一个种类的植物大麻素或植物大麻素类似物包括甲基化的植物大麻素类似物和未甲基化的植物大麻素。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述DiPKS聚酮化合物合成酶包括DiPKSG1516D ；G1518A聚酮化合物合成酶。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述第一多核苷酸包括用于所述DiPKSG1516D；G1518A聚酮化合物合成酶的编码序列，所述DiPKSG1516D；G1518A聚酮化合物合成酶的一级结构与由SEQ ID NO:37的碱基523至9966限定的阅读框编码的蛋白质具有80％和100％之间的氨基酸残基序列同源性。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述第一多核苷酸与SEQ ID NO:37的碱基523至9966具有80％和100％之间的碱基序列同源性。
18.根据权利要求14所述的方法，其中所述DiPKS聚酮化合物合成酶包括DiPKSG1516R聚酮化合物合成酶。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述第一多核苷酸包括用于所述DiPKSG1516R聚酮化合物合成酶的编码序列，所述DiPKSG1516R聚酮化合物合成酶的一级结构与由SEQ ID NO:38的碱基523至9966限定的阅读框编码的蛋白质具有80％和100％之间的氨基酸残基序列同源性。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述第一多核苷酸与SEQ ID NO:38的碱基523至9966具有80％和100％之间的碱基序列同源性。
21.根据权利要求10所述的方法，其中：
所述DiPKS聚酮化合物合成酶包括降低在所述DiPKS聚酮化合物合成酶的C-Met结构域的活性位点处的活性的突变，用于防止所述至少一种前体化学物质的甲基化，使得所述至少一种前体化学物质具有氢R2基团和氢R3基团；并且
所述至少一个种类的植物大麻素或植物大麻素类似物包括脱羧的植物大麻素或植物大麻素类似物。
22.根据权利要求10至21中任一项所述的方法，其中所述酵母细胞包括编码磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的第三多核苷酸，用于增加DiPKS的活性。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶包括来自构巢曲霉的NpgA磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述第三多核苷酸包括用于来自构巢曲霉的所述NpgA磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的编码序列，所述NpgA磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的一级结构与由SEQ ID NO:10的碱基1170至2201限定的阅读框编码的蛋白质具有80％和100％之间的氨基酸残基序列同源性。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述第三多核苷酸与SEQ ID NO:10的碱基1170至2201具有80％和100％之间的碱基序列同源性。
26.根据权利要求1至25中任一项所述的方法，其中所述聚酮化合物合成酶包括用于由丙二酰基辅酶A合成所述至少一种前体化学物质的活性位点，而不需要较长链的羰游基辅酶A。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述至少一种前体化学物质在R1处包括戊基，并且所述至少一个种类的植物大麻素或植物大麻素类似物包括戊基植物大麻素或甲基化的戊基植物大麻素类似物。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述至少一种前体化学物质包括橄榄醇橄榄醇酸、甲基橄榄醇或甲基橄榄醇酸中的至少一种，并且所述至少一个种类的植物大麻素或植物大麻素类似物包括CBG、CBGa、meCBG或meCBGa中的至少一种。
29.根据权利要求1至28中任一项所述的方法，其中所述胞质异戊烯基转移酶包括来自链霉菌属CL190的NphB异戊烯基转移酶。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述第二多核苷酸包括用于来自链霉菌属CL190的NphB异戊烯基转移酶的编码序列，所述NphB异戊烯基转移酶的一级结构与由SEQ ID NO:44的碱基987至1913限定的阅读框编码的蛋白质具有80％和100％之间的氨基酸残基序列同源性。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述第二多核苷酸与SEQ ID NO:44的碱基987至1913具有80％和100％之间的碱基序列同源性。
32.根据权利要求1至31中任一项所述的方法，其中R1是链长为5个碳的烷基，R2是H，并且R3是H。
33.根据权利要求1至31中任一项所述的方法，其中R1是链长为5个碳的烷基，R2是羧基，并且R3是H。
34.根据权利要求1至31中任一项所述的方法，其中R1是链长为5个碳的烷基，R2是甲基，并且R3是H。
35.根据权利要求1至31中任一项所述的方法，其中R1是链长为5个碳的烷基，R2是羧基，并且R3是甲基。
36.根据权利要求1至35中任一项所述的方法，其中所述酵母细胞包括增加可用的焦磷酸香叶酯的遗传修饰。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述遗传修饰包括Erg20酶的失活。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述酵母细胞包括第三多核苷酸，所述第三多核苷酸包括用于Erg20K197E的编码序列，所述Erg20K197E的一级结构与由SEQ ID NO:3限定的阅读框编码的蛋白质具有80％和100％之间的氨基酸残基序列同源性。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述第三多核苷酸与SEQ ID NO:3具有80％和100％之间的碱基序列同源性。
40.根据权利要求1至39中任一项所述的方法，其中所述酵母细胞包括增加可用的丙二酰基辅酶A的遗传修饰。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述遗传修饰包括Maf1的增加的表达。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述酵母细胞包括第三多核苷酸，所述第三多核苷酸包括用于Maf1的编码序列，所述Maf1的一级结构与由SEQ ID NO:8的碱基936至2123限定的阅读框编码的蛋白质具有80％和100％之间的氨基酸残基序列同源性。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述第三多核苷酸进一步包括启动子序列、终止子序列和整合序列，并且与SEQ ID NO:8具有80％和100％之间的碱基序列同源性。
44.根据权利要求40所述的方法，其中所述遗传修饰包括用于增加醛脱氢酶和乙酰基辅酶A合成酶的胞质表达的修饰。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述酵母细胞包括第三多核苷酸，所述第三多核苷酸包括用于来自肠道沙门氏菌的AcsL641P的编码序列和用于来自酿酒酵母的Ald6的编码序列，所述AcsL641P的一级结构与由SEQ ID NO:4的碱基3938至5893限定的阅读框编码的蛋白质具有80％和100％之间的氨基酸残基序列同源性，并且所述Ald6的一级结构与由SEQID NO:4的碱基1494至2999限定的阅读框编码的蛋白质具有80％和100％之间的氨基酸残基序列同源性。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述第三多核苷酸进一步包括启动子序列、终止子序列和整合序列，并且与SEQ ID NO:4的碱基51至7114具有80％和100％之间的碱基序列同源性。
47.根据权利要求40所述的方法，其中所述遗传修饰包括用于增加丙二酰基辅酶A合成酶活性的修饰。
48.根据权利要求47所述的方法，其中所述酵母细胞包括第三多核苷酸，所述第三多核苷酸包括用于来自酿酒酵母的Acc1S659A；S1167A的编码序列。
49.根据权利要求48所述的方法，其中所述第三多核苷酸包括用于所述Acc1S659A；S1167A酶的编码序列，所述Acc1S659A；S1167A酶的一部分的一级结构与由SEQ ID NO:7Acc1S659A；S1167A的碱基9至1716限定的阅读框编码的蛋白质部分具有80％和100％之间的氨基酸残基序列同源性。
50.根据权利要求49所述的方法，其中所述第三多核苷酸进一步包括启动子序列、终止子序列和整合序列，并且与SEQ ID NO:7具有80％和100％之间的碱基序列同源性。
51.根据权利要求47所述的方法，其中所述酵母细胞包括第三多核苷酸，所述第三多核苷酸包括用于由组成型启动子调节的来自酿酒酵母的Acc1的编码序列。
52.根据权利要求51所述的方法，其中所述组成型启动子包括来自酿酒酵母的PGK1启动子。
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述PGK1启动子与SEQ ID NO:6的碱基7至750具有80％和100％之间的核苷酸同源性。
54.根据权利要求40所述的方法，其中所述遗传修饰包括用于甾醇生物合成的活化剂的增加的表达。
55.根据权利要求54所述的方法，其中所述酵母细胞包括第三多核苷酸，所述第三多核苷酸包括用于来自酿酒酵母的Upc2E888D的编码序列，所述Upc2E888D的一级结构与由SEQ IDNO:9的碱基975至3701限定的阅读框编码的蛋白质具有80％和100％之间的氨基酸残基序列同源性。
56.根据权利要求55所述的方法，其中所述第三多核苷酸进一步包括启动子序列、终止子序列和整合序列，并且与SEQ ID NO:9具有80％和100％之间的碱基序列同源性。
57.根据权利要求1至28或权利要求31至56中任一项所述的方法，其中所述第二多核苷酸包括用于胞质异戊烯基转移酶的编码序列，所述胞质异戊烯基转移酶的一级结构与下述中的任何一个具有80％和100％之间的氨基酸残基序列同源性：SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ IDNO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ IDNO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:36。
58.根据权利要求1至57中任一项所述的方法，进一步包括从所述酵母细胞培养物中提取所述至少一个种类的植物大麻素或植物大麻素类似物。
59.一种用于生产植物大麻素或植物大麻素类似物的酵母细胞，所述酵母细胞包括：
编码聚酮化合物合成酶的第一多核苷酸；和
编码胞质异戊烯基转移酶的第二多核苷酸。
60.根据权利要求59所述的酵母细胞，进一步包括如结合方法权利要求1至57中的任一项提供的所述酵母细胞所请求保护的所述酵母细胞、所述第一多核苷酸或所述第二多核苷酸的一个或多个的特征。
61.一种转化用于生产植物大麻素或植物大麻素类似物的酵母细胞的方法，所述方法包括：
将编码聚酮化合物合成酶的第一多核苷酸引入至酵母细胞系中；和
将编码胞质异戊烯基转移酶的第二多核苷酸引入至酵母中。
62.根据权利要求61所述的方法，进一步包括如结合方法权利要求1至57的任一项中提供的所述酵母细胞所请求保护的所述酵母细胞、所述第一多核苷酸或所述第二多核苷酸的一个或多个特征。
63.一种植物大麻素类似物，所述植物大麻素类似物具有下述结构II：
Figure FDA0002234501000000071
其中，在结构II上，R1是链长为1、2、3、4或5个碳的烷基；
R2是甲基；并且
R3是H、羧基或甲基。
64.根据权利要求63所述的植物大麻素类似物，其中R1具有5个碳的链长，并且R3是H。
65.根据权利要求63所述的植物大麻素类似物，其中所述植物大麻素类似物是通过酵母中的生物合成生产的。
66.一种植物大麻素类似物，所述植物大麻素类似物具有下述结构III：
其中，在结构III上，R1是戊基；
R2是甲基；并且
R3是H。
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