CN114729386A - 用于大麻素合成的酶及其制备和使用方法 - Google Patents
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Abstract
提供了用于大麻素合成的多种酶及其制备和使用方法。还提供了具有异戊二烯基转移酶活性和/或香叶基焦磷酸酯:橄榄醇酸酯香叶基转移酶(GOT)活性的重组多肽,和用于生产CBGA的工程化的重组微生物,以及生产大麻萜酚酸(CBGA)或其类似物的方法,所述方法包括以下步骤:使异源表达的异戊二烯基转移酶与香叶基二磷酸酯(GPP)和酸如橄榄醇酸(OA)反应。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2019年10月1日提交的美国临时专利申请序列号62/909,227、2019年11月27日提交的美国临时专利申请序列号62/941,689和2019年12月1日提交的美国临时专利申请序列号62/942,198的权益和优先权,将其通过援引并入本文。
序列表的引用
本申请含有计算机可读形式的序列表,将其通过援引以其全文并入本文。
技术领域
本申请涉及分子生物学,并且更特别地涉及用于大麻素合成的酶。
背景技术
大麻素化合物作用于大麻素受体的其他靶标,并显著影响大脑中神经递质的释放。大麻素化合物(如用于医疗目的的大麻二酚)的使用已在全球扩大,并且其立法也越来越被接受。因此,大麻素类化合物正在成为一类新型药物。然而,在生产大麻素化合物方面仍然存在许多挑战,所述大麻素化合物传统上是从植物中提取和纯化的。此外,很难使用目前已知的方法来生产多种大麻素类似物。因此,需要合成和生产大麻素化合物的新途径。
发明内容
根据一些方面,本申请涉及可用于在微生物宿主或酵母宿主中生产大麻素或大麻素中间体的酶,以及制备和使用此类酶的方法。
在某些实施例中,要求保护的生产大麻素的方法是对目前已知方法(如植物提取)的改进。从植物中提取大麻素涉及种植并收获天然含有大麻素的植物,并且然后使用本领域已知的多种提取方法提取化合物。由于大麻素在植物中天然混合,因此通常很难针对每个提取样本再现相同的提取和纯化特征。每种植物独特的遗传来源和生长条件使其进一步复杂。所得的不同大麻素特征导致样品各自具有不同的药物特征-从安全或监管角度来看是一个问题。最后,由于具有相似结构和大小的化合物混合的性质,纯化高纯度单一产物的能力非常具有挑战性。
因此,在某些实施例中,本申请提供了可用于在微生物或酵母宿主中生产大麻素的酶。示例实施例包括新型异戊二烯基转移酶以及在由异戊二烯基基团供体和酸生产大麻萜酚酸(CBGA)或其类似物中制备和使用此类酶的方法。
在某些实施例中,本申请还提供了使用此类酶的方法,所述方法通过使用植物和微生物基因在微生物宿主或酵母宿主中的异源表达,来生产大麻素途径中的化合物,例如由异戊二烯基基团供体和酸生产的大麻萜酚酸(CBGA)或其类似物。
在某些实施例中,本申请提供了生产大麻萜酚酸(CBGA)或其类似物的方法,所述方法包括以下步骤:使异戊二烯基转移酶与异戊二烯基基团供体和酸反应。
在一个实施例中,异戊二烯基转移酶具有大麻萜酚酸合酶(CBGAS)活性。
在一个实施例中,异戊二烯基转移酶从完整的、纯化的细胞提取物或其组合中获得。
在一个实施例中,异戊二烯基基团供体选自由以下组成的组:衍生自烯丙基异戊二烯基二磷酸酯(allylic isoprenyl diphosphate)(包括但不限于二甲基烯丙基二磷酸酯(DMAPP;C5)、香叶基二磷酸酯(GPP;C10)和法呢基二磷酸酯(FPP;C15))的异戊二烯基部分。
在一个实施例中,异戊二烯基基团供体是GPP。
在一个实施例中,所述酸选自由以下组成的组:苔色酸(OSA)、丙基雷锁辛酸(divarinolic,DVA)和橄榄醇酸(OLA)、芹菜素、黄豆苷元、染料木素、柚皮素、橄榄醇、OA和白藜芦醇。
在一个实施例中,所述酸是橄榄醇酸。
在一个实施例中,异戊二烯基转移酶具有与天然CBGAS的活性相比合成能力提高并且副产物形成减少的活性。
在一个实施例中,异戊二烯基转移酶具有大于12μg/mL CBGA的反应速率。
在一个实施例中,异戊二烯基转移酶与天然nphB蛋白的序列具有小于约50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%的序列同一性。
在一个实施例中,异戊二烯基转移酶与SEQ ID NO:1-56的全部或片段具有至少约80%、85%、90%或95%序列同一性。
在一个实施例中,CBGA是特定的异构体形式,其中所述异构体形式是特定的结构异构体或立体异构体。
在一个实施例中,异戊二烯基基团供体、酸(或脂肪酸)和CBGA类似物,如下表所示:
异戊二烯基基团供体 | 脂肪酸 | CBGA类似物 |
GPP | 橄榄醇酸 | CBGA |
GPP | 丙基雷锁辛酸 | CBGAVA |
在某些实施例中,提供了生产大麻素的方法,所述方法包括以下步骤:
(1)使异戊二烯基转移酶与异戊二烯基基团供体和酸反应以生产大麻萜酚酸(CBGA)或其类似物;和(2)使CBGA或其类似物与大麻素合酶反应以形成大麻素的酸性形式。
在一个实施例中,大麻素合酶是两种氧化还原酶四氢大麻酚酸合酶(THCAS)或大麻二酚酸合酶(CBDAS),并且大麻素是THC或CBD。
在某些实施例中,提供了工程化以生产CBGA的重组微生物,其中所述微生物过表达与SEQ ID NO:1-56的全部或片段具有至少约80%、85%、90%或95%序列同一性的异戊二烯基转移酶。
在某些实施例中,提供了具有大麻萜酚酸合酶(CBGAS)活性的分离的多肽,所述多肽包含与SEQ ID NO:1-56的全部或片段具有至少约80%、85%、90%或95%序列同一性的氨基酸序列。
在一个实施例中,所述多肽在微生物宿主或植物宿主中表达,其中所述微生物宿主包括但不限于大肠杆菌、解脂耶氏酵母(Y.lipolytica)和酿酒酵母,并且所述植物宿主包括但不限于大麻(种和属)。
在一个实施例中,所述方法是体外方法。
在一个实施例中,所述方法是基于体内细胞的测定。
根据一些方面,本申请涉及可用于在微生物宿主中生产大麻素或大麻素中间体的酶,以及制备和使用此类酶的方法。在一些实施例中,微生物宿主是酵母,例如酿酒酵母和解脂耶氏酵母。
在某些实施例中,要求保护的生产大麻素的方法是对目前已知方法(如植物提取)的改进。从植物中提取大麻素涉及种植并收获天然含有大麻素的植物,并且然后使用本领域已知的多种提取方法提取化合物。由于大麻素在植物中天然混合,因此通常很难针对每个提取样本再现相同的提取和纯化特征。每种植物独特的遗传来源和生长条件使其进一步复杂。所得的不同大麻素特征导致样品各自具有不同的药物特征-从安全或监管角度来看是一个问题。最后,由于具有相似结构和大小的化合物混合的性质,纯化高纯度单一产物的能力非常具有挑战性。
因此,在某些实施例中,本申请提供了可用于在微生物宿主中生产大麻素的酶。在一些实施例中,微生物宿主是酵母,例如酿酒酵母和解脂耶氏酵母。示例实施例包括具有大麻萜酚酸合酶(CBGAS)活性的新型酶以及在生产大麻萜酚酸(CBGA)或其类似物中制备和使用此类酶的方法。在一些示例实施例中,所述酶是异戊二烯基转移酶。在一些示例实施例中,所述酶是香叶基焦磷酸酯:橄榄醇酸酯香叶基转移酶(geranylpyrophosphate:olivatolate geranyltransferase)(GOT)或其类似物。
在某些实施例中,本申请还提供了使用此类酶的方法,所述方法通过在微生物宿主中使用编码此类酶的基因的异源表达,来生产大麻素途径中的化合物,例如由异戊二烯基基团供体和酸生产的大麻萜酚酸(CBGA)或其类似物。
在某些实施例中,提供了生产大麻萜酚酸(CBGA)或其类似物的方法,所述方法包括使用具有大麻萜酚酸合酶(CBGAS)活性的酶的步骤。
在一个实施例中,所述酶是与异戊二烯基基团供体和酸反应的异戊二烯基转移酶。
在一个实施例中,异戊二烯基转移酶具有香叶基焦磷酸酯:橄榄醇酸酯香叶基转移酶(GOT)活性。
在一个实施例中,异戊二烯基转移酶从完整的、纯化的细胞提取物或其组合中获得。
在一个实施例中,异戊二烯基基团供体选自由以下组成的组:衍生自烯丙基异戊二烯基二磷酸酯(包括但不限于二甲基烯丙基二磷酸酯(DMAPP;C5)、香叶基二磷酸酯(GPP;C10)和法呢基二磷酸酯(FPP;C15))的异戊二烯基部分。
在一个实施例中,异戊二烯基基团供体是GPP。
在一个实施例中,所述酸选自由以下组成的组:苔色酸(OSA)、丙基雷锁辛酸(DVA)和橄榄醇酸(OLA)、芹菜素、黄豆苷元、染料木素、柚皮素、橄榄醇、OA和白藜芦醇。
在一个实施例中,所述酸是橄榄醇酸。
在一个实施例中,异戊二烯基基团供体是GPP,脂肪酸选自由以下组成的组:橄榄醇酸、丙基雷锁辛酸、丁酸、戊酸、己酸和庚酸,并且CBGA类似物选自由CBGA和CBGAVA组成的组。
在某些实施例中,提供了生产大麻萜酚酸(CBGA)或其类似物的方法,所述方法包括以下步骤:使异源表达的、具有香叶基焦磷酸酯:橄榄醇酸酯香叶基转移酶(GOT)活性的异戊二烯基转移酶与GPP和OA反应。
在一个实施例中,异戊二烯基转移酶具有与天然CBGAS的活性相比合成能力提高并且副产物形成减少的活性。
在一个实施例中,异戊二烯基转移酶在酵母中异源表达。
在一个实施例中,与NphB野生型相比,异戊二烯基转移酶具有改善的用于形成CBGA的反应速率。
在一个实施例中,异戊二烯基转移酶与SEQ ID NO:57-103的全部或片段具有至少约80%、85%、90%或95%序列同一性。
在一个实施例中,CBGA是特定的异构体形式,其中所述异构体形式是特定的结构异构体或立体异构体。
在某些实施例中,提供了生产大麻素的方法,所述方法包括以下步骤:
(1)使异源表达的异戊二烯基转移酶与异戊二烯基基团供体和酸反应以生产大麻萜酚酸(CBGA)或其类似物;和(2)使CBGA或其类似物与大麻素合酶反应以形成大麻素的酸性形式。
在一个实施例中,异戊二烯基转移酶与SEQ ID NO:57-103的全部或片段具有至少约80%、85%、90%或95%序列同一性。
在一个实施例中,大麻素合酶是两种氧化还原酶四氢大麻酚酸合酶(THCAS)或大麻二酚酸合酶(CBDAS),并且大麻素是THC或CBD。
在一个实施例中,所述方法是体外方法。
在一个实施例中,所述方法是基于体内细胞的测定。
在某些实施例中,提供了工程化以生产CBGA的重组微生物,其中所述微生物过表达与SEQ ID NO:57-103的全部或片段具有至少约80%、85%、90%或95%序列同一性的异戊二烯基转移酶。
在某些实施例中,提供了包含至少一种异源核苷酸序列或其密码子简并核苷酸序列的重组微生物,所述异源核苷酸序列与SEQ ID NO:104-197具有至少约80%、85%、90%或95%序列同一性。
在某些实施例中,提供了具有大麻萜酚酸合酶(CBGAS)活性的分离的多肽,所述多肽包含与SEQ ID NO:57-103的全部或片段具有至少约80%、85%、90%或95%序列同一性的氨基酸序列。
在一个实施例中,所述多肽在微生物宿主中表达,其中所述微生物宿主包括但不限于酵母。
在一个实施例中,所述多肽在解脂耶氏酵母或酿酒酵母中表达。
根据一些方面,本申请涉及可用于在微生物宿主或酵母宿主中生产大麻素或大麻素中间体的酶,以及制备和使用此类酶的方法。
在某些实施例中,要求保护的生产大麻素的方法是对目前已知方法(如植物提取)的改进。从植物中提取大麻素涉及种植并收获天然含有大麻素的植物,并且然后使用本领域已知的多种提取方法提取化合物。由于大麻素在植物中天然混合,因此通常很难针对每个提取样本再现相同的提取和纯化特征。每种植物独特的遗传来源和生长条件使其进一步复杂。所得的不同大麻素特征导致样品各自具有不同的药物特征-从安全或监管角度来看是一个问题。最后,由于具有相似结构和大小的化合物混合的性质,纯化高纯度单一产物的能力非常具有挑战性。
因此,在某些实施例中,本申请提供了可用于在微生物宿主中生产大麻素的酶。示例实施例包括新型异戊二烯基转移酶以及在由异戊二烯基基团供体和酸生产大麻萜酚酸(CBGA)或其类似物中制备和使用此类酶的方法。
在某些实施例中,本申请还提供了使用此类酶的方法,所述方法通过使用植物和微生物基因在微生物宿主中的异源表达,来生产大麻素途径中的化合物,例如由异戊二烯基基团供体和酸生产的大麻萜酚酸(CBGA)或其类似物。各种实施例提供了用于在大麻素途径中生产化合物的具有改善特点的工程化酶。此类改善的特点包括但不限于更好的动力学(例如kM和kCAT)、对溶剂更高的耐受性、在更高的温度下发挥功能的能力和使用不同底物和基团供体的改善的能力。
在某些实施例中,提供了生产大麻萜酚酸(CBGA)或其类似物的方法,所述方法包括以下步骤:使异戊二烯基转移酶与异戊二烯基基团供体和酸反应。
在一个实施例中,异戊二烯基转移酶具有大麻萜酚酸合酶(CBGAS)活性。
在一个实施例中,异戊二烯基转移酶从完整的、纯化的细胞提取物或其组合中获得。
在一个实施例中,异戊二烯基基团供体选自由以下组成的组:衍生自烯丙基异戊二烯基二磷酸酯(allylic isoprenyl diphosphate)(包括但不限于二甲基烯丙基二磷酸酯(DMAPP;C5)、香叶基二磷酸酯(GPP;C10)和法呢基二磷酸酯(FPP;C15))的异戊二烯基部分。
在一个实施例中,异戊二烯基基团供体是GPP。
在一个实施例中,所述酸选自由以下组成的组:苔色酸(OSA)、丙基雷锁辛酸(DVA)和橄榄醇酸(OLA)、芹菜素、黄豆苷元、染料木素、柚皮素、橄榄醇、OA和白藜芦醇。
在一个实施例中,所述酸是橄榄醇酸。
在一个实施例中,异戊二烯基转移酶具有合成能力显著和/或副产物形成减少的活性。
在一个实施例中,异戊二烯基转移酶与天然nphB蛋白的序列具有小于约50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%的序列同一性。
在一个实施例中,异戊二烯基转移酶与SEQ ID NO:198-253的全部或片段具有至少约80%、85%、90%或95%序列同一性。
在一个实施例中,CBGA是特定的异构体形式,其中所述异构体形式是特定的结构异构体或立体异构体。
在一个实施例中,异戊二烯基基团供体是GPP,脂肪酸选自由以下组成的组:橄榄醇酸、丙基雷锁辛酸、丁酸、戊酸、己酸和庚酸,并且CBGA类似物选自由CBGA和CBGAVA组成的组。
在某些实施例中,提供了生产大麻素的方法,所述方法包括以下步骤:
(1)使异戊二烯基转移酶与异戊二烯基基团供体和酸反应以生产大麻萜酚酸(CBGA)或其类似物;和(2)使CBGA或其类似物与大麻素合酶反应以形成大麻素的酸性形式。
在一个实施例中,大麻素合酶是两种氧化还原酶四氢大麻酚酸合酶(THCAS)或大麻二酚酸合酶(CBDAS),并且大麻素是THC或CBD。
在某些实施例中,提供了工程化以生产CBGA的重组微生物,其中所述微生物过表达与SEQ ID NO:198-335的全部或片段具有至少约80%、85%、90%或95%序列同一性的异戊二烯基转移酶。
在某些实施例中,提供了具有大麻萜酚酸合酶(CBGAS)活性的分离的多肽,所述多肽包含与SEQ ID NO:198-335的全部或片段具有至少约80%、85%、90%或95%序列同一性的氨基酸序列。
在一个实施例中,所述多肽在微生物宿主或植物宿主中表达,其中所述微生物宿主包括但不限于大肠杆菌、解脂耶氏酵母和酿酒酵母,并且所述植物宿主包括但不限于大麻(种和属)。
在一个实施例中,所述方法是体外方法。
在一个实施例中,所述方法是基于体内细胞的测定。
在某些实施例中,提供了包含与SEQ ID NO:246或SEQ ID NO:232具有至少95%同一性的氨基酸序列的重组多肽,其中所述氨基酸序列包含对SEQ ID NO:246和SEQ ID NO:232之间的保守氨基酸的至少一个氨基酸取代。
在一个实施例中,将保守氨基酸用与保守氨基酸具有相似的化学性质的氨基酸替代。
在某些实施例中,提供了重组多肽,所述重组多肽包含与SEQ ID NO:246具有至少95%同一性的氨基酸序列,其中所述氨基酸序列包含至少一个氨基酸取代ID No:246。
在一个实施例中,至少一个氨基酸取代选自由以下组成的组:Y46W、Y46A、Y46L、Y46C、Y46D、Y46E、Y46F、Y46G、Y46H、Y46I、Y46K、Y46P、Y46M、Y46N、Y46Q、Y46R、Y46S、Y46T、Y46V、Q51G、Q51A、Q51C、Q51D、Q51E、Q51F、Q51G、Q51H、Q51I、Q51K、Q51L、Q51M、Q51N、Q51P、Q51R、Q51S、Q51T、Q51V、Q51W、Q51Y、L55V、L55F、L55A、L55Q、L55W、L66V、L66F、L66A、L66Q、L66W、G67L、G67M、G67E、R100E、R100Q、D115E、K186N、K186Q、K186A、K186D、Y188W、Y188A、Y188L、Y188C、Y188、Y188E、Y188F、Y188G、Y188H、Y188I、Y188K、Y188P、Y188M、Y188N、Y188Q、Y188R、Y188S、Y188T、Y188V、D256E、R264E、R264Q、V265L、V265S、V265E、V265A、V265F、V265N、Y268W、Y268A、Y268L、Y268C、Y268D、Y268E、Y268F、Y268G、Y268H、Y268I、Y268K、Y268P、Y268M、Y268N、Y268Q、Y268R、Y268S、Y268T、Y268V、L269V、L269F、L269A、L269Q、L269W、L285V、L285F、L285A、L285Q、L285W、G286L、G286M、G286E、G287L、G287M、G287E、R288E、R288Q、G313L、G313M、G313E、Y352W、Y352A、Y352L、Y352C、Y352D、Y352E、Y352F、Y352G、Y352H、Y352I、Y352K、Y352P、Y352M、Y352N、Y352Q、Y352R、Y352S、Y352T、Y352V、Y383W、Y383A、Y383L、Y383C、Y383D、Y383E、Y383F、Y383G、Y383H、Y383I、Y383K、Y383P、Y383M、Y383N、Y383Q、Y383R、Y383S、Y383T、Y383V、S407W、S407A、S407L、S407C、S407D、S407E、S407F、S407G、S407H、S407I、S407K、S407P、S407M、S407N、S407Q、S407R、S407S、S407T、S407V、Y420W、Y420A、Y420L、Y420C、Y420D、Y420E、Y420F、Y420G、Y420H、Y420I、Y420K、Y420P、Y420M、Y420N、Y420Q、Y420R、Y420S、Y420T和Y420V。
在某些实施例中,提供了重组多肽,所述重组多肽包含与SEQ ID NO:232具有至少95%同一性的氨基酸序列,其中所述氨基酸序列包含至少一个氨基酸取代。
在一个实施例中,至少一个氨基酸取代选自由以下组成的组:Y24W、Y24A、Y24L、Y24C、Y24D、Y24E、Y24F、Y24G、Y24H、Y24I、Y24K、Y24P、Y24M、Y24N、Y24Q、Y24R、Y24S、Y24T、Y24V、Q29G、Q29A、Q29C、Q29D、Q29E、Q29F、Q29G、Q29H、Q29I、Q29K、Q29L、Q29M、Q29N、Q29P、Q29R、Q29S、Q29T、Q29V、Q29W、Q29Y、L33V、L33F、L33A、L33Q、L33W、L44V、L44F、L44A、L44Q、L44W、G45L、G45M、G45E、R81E、R81Q、D96E、K165N、K165Q、K165A、K165D、Y167W、Y167A、Y167L、Y167C、Y167D、Y167E、Y167F、Y167G、Y167H、Y167I、Y167K、Y167P、Y167M、Y167N、Y167Q、Y167R、Y167S、Y167T、Y167V、D255E、R236E、R236Q、V237L、V237S、V237E、V237A、V237F、V237N、Y239W、Y239A、Y239L、Y239C、Y239D、Y239E、Y239F、Y239G、Y239H、Y239I、Y239K、Y239P、Y239M、Y239N、Y239Q、Y239R、Y239S、Y239T、Y239V、L241V、L241F、L241A、L241Q、L241W、L254V、L254F、L254A、L254Q、L254W、G258L、G258M、G258E、G259L、G259M、G259E、R260E、R260Q、G286L、G286M、G286E、Y330W、Y330A、Y330L、Y330C、Y330D、Y330E、Y330F、Y330G、Y330H、Y330I、Y330K、Y330P、Y330M、Y330N、Y330Q、Y330R、Y330S、Y330T、Y330V、Y364W、Y364A、Y364L、Y364C、Y364D、Y364E、Y364F、Y364G、Y364H、Y364I、Y364K、Y364P、Y364M、Y364N、Y364Q、Y364R、Y364S、Y364T、Y364V、S384W、S384A、S384L、S384C、S384D、S384E、S384F、S384G、S384H、S384I、S384K、S384P、S384M、S384N、S384Q、S384R、S384S、S384T、S384V、Y398W、Y398A、Y398L、Y398C、Y398D、Y398E、Y398F、Y398G、Y398H、Y398I、Y398K、Y398P、Y398M、Y398N、Y398Q、Y398R、Y398S、Y398T和Y398V。
在某些实施例中,提供了重组多肽,所述重组多肽包含与SEQ ID NO:198具有至少95%同一性的氨基酸序列,其中所述氨基酸序列包含至少一个氨基酸取代。
在一个实施例中,所述至少一个氨基酸取代选自由以下组成的组:A17T_Q159W_A230S;A51T_M104E_Q159S;A51Q_S175W_L217F;L217F_V292N_Q235A;A51T_D164E_Q293W;V47A_Q159S_I292A;和A51Q_S175Y_Y286H。
在某些实施例中,提供了生产大麻萜酚酸(CBGA)或其类似物的方法,所述方法包括以下步骤:使异源表达的异戊二烯基转移酶与香叶基二磷酸酯(GPP)和酸反应。
在一个实施例中,异戊二烯基转移酶具有异戊二烯基转移酶活性和/或香叶基焦磷酸酯:橄榄醇酸酯香叶基转移酶(GOT)活性。
在一个实施例中,异戊二烯基转移酶具有与天然CBGAS的活性相比合成能力提高并且副产物形成减少的活性;或具有与NphB野生型相比改善的用于形成CBGA的反应速率。
在一个实施例中,异戊二烯基转移酶具有大于12μg/mL CBGA的反应速率。
在一个实施例中,所述酸选自由以下组成的组:苔色酸(OSA)、丙基雷锁辛酸(DVA)和橄榄醇酸(OLA)、芹菜素、黄豆苷元、染料木素、柚皮素、橄榄醇、橄榄醇酸(OA)和白藜芦醇。
在某些实施例中,所述异戊二烯基转移酶与选自由SEQ ID No:01-103、198-335组成的组的氨基酸序列的全部或片段具有至少约80%、85%、90%或95%序列同一性,或所述异戊二烯基转移酶由与选自由SEQ ID No:104-197、336-583组成的组的核酸序列的全部或片段具有至少约80%、85%、90%或95%序列同一性的核苷酸序列表达。
在一个实施例中,其中所述氨基酸序列是SEQ ID No:01、02、85或179。
在某些实施例中,提供了生产大麻素的方法,所述方法包括以下步骤:
(1)使异源表达的异戊二烯基转移酶与异戊二烯基基团供体和酸反应以生产大麻萜酚酸(CBGA)或其类似物;和(2)使所述CBGA或其类似物与大麻素合酶反应以形成大麻素的酸性形式。
在一个实施例中,其中所述异戊二烯基转移酶具有与天然CBGAS的活性相比合成能力提高并且副产物形成减少的活性。
在一个实施例中,其中所述异戊二烯基转移酶具有大于12μg/mL CBGA的反应速率。
在一个实施例中,其中所述酸选自由以下组成的组:苔色酸(OSA)、丙基雷锁辛酸(DVA)和橄榄醇酸(OLA)、芹菜素、黄豆苷元、染料木素、柚皮素、橄榄醇、橄榄醇酸(OA)、白藜芦醇、丁酸、戊酸、己酸和庚酸。
在某些实施例中,其中所述酶与选自由SEQ ID NO:01-103、198-335组成的组的序列的全部或片段具有至少约80%、85%、90%或95%序列同一性;或所述酶由核苷酸序列表达,所述核苷酸序列与SEQ ID No:104-197、336-583的全部或片段具有至少约80%、85%、90%或95%序列同一性。
在某些实施例中,提供了工程化以生产CBGA的重组微生物,其中所述微生物过表达与选自由SEQ ID NO:01-103和198-335组成的组的序列的全部或片段具有至少约80%、85%、90%或95%序列同一性的酶。
在某些实施例中,提供了工程化以生产CBGA的重组微生物,其中所述微生物包含至少一种异源核苷酸序列或其密码子简并核苷酸序列,所述异源核苷酸序列与选自由SEQID No:104-197、336-583组成的组的核酸序列的全部或片段具有至少约80%、85%、90%或95%序列同一性。
在某些实施例中,提供了具有大麻萜酚酸合酶(CBGAS)活性的分离的多肽;其中所述多肽包含与选自由SEQ ID NO:01-103、198-335组成的组的氨基酸序列的全部或片段具有至少约80%、85%、90%或95%序列同一性的氨基酸序列;或所述多肽由核苷酸序列表达,所述核苷酸序列与选自由SEQ ID NO:104-197和336-583组成的组的核苷酸序列的全部或片段具有至少约80%、85%、90%或95%序列同一性。
在一个实施例中,其中所述多肽在微生物宿主中表达,所述微生物宿主选自由以下组成的组:大肠杆菌、解脂耶氏酵母和酿酒酵母。
如权利要求15所述的分离的多肽,其中所述多肽在大麻属物种(Cannabis sp.)中表达。
在某些实施例中,提供了酶用于生产CBGA的用途,其中所述酶与选自由SEQ IDNO:01-103和198-335组成的组的序列的全部或片段具有至少约80%、85%、90%或95%序列同一性,或所述酶由与选自由SEQ ID No:104-197和336-583组成的组的全部或片段具有至少约80%、85%、90%或95%序列同一性的核苷酸序列表达。
在某些实施例中,提供了重组多肽,所述重组多肽包含与SEQ ID NO:246具有至少95%同一性的氨基酸序列,其中所述氨基酸序列包含对保守氨基酸的至少一个氨基酸取代。
在一个实施例中,其中所述至少一个氨基酸取代选自由以下组成的组:Y46W、Y46A、Y46L、Y46C、Y46D、Y46E、Y46F、Y46G、Y46H、Y46I、Y46K、Y46P、Y46M、Y46N、Y46Q、Y46R、Y46S、Y46T、Y46V、Q51G、Q51A、Q51C、Q51D、Q51E、Q51F、Q51G、Q51H、Q51I、Q51K、Q51L、Q51M、Q51N、Q51P、Q51R、Q51S、Q51T、Q51V、Q51W、Q51Y、L55V、L55F、L55A、L55Q、L55W、L66V、L66F、L66A、L66Q、L66W、G67L、G67M、G67E、R100E、R100Q、D115E、K186N、K186Q、K186A、K186D、Y188W、Y188A、Y188L、Y188C、Y188、Y188E、Y188F、Y188G、Y188H、Y188I、Y188K、Y188P、Y188M、Y188N、Y188Q、Y188R、Y188S、Y188T、Y188V、D256E、R264E、R264Q、V265L、V265S、V265E、V265A、V265F、V265N、Y268W、Y268A、Y268L、Y268C、Y268D、Y268E、Y268F、Y268G、Y268H、Y268I、Y268K、Y268P、Y268M、Y268N、Y268Q、Y268R、Y268S、Y268T、Y268V、L269V、L269F、L269A、L269Q、L269W、L285V、L285F、L285A、L285Q、L285W、G286L、G286M、G286E、G287L、G287M、G287E、R288E、R288Q、G313L、G313M、G313E、Y352W、Y352A、Y352L、Y352C、Y352D、Y352E、Y352F、Y352G、Y352H、Y352I、Y352K、Y352P、Y352M、Y352N、Y352Q、Y352R、Y352S、Y352T、Y352V、Y383W、Y383A、Y383L、Y383C、Y383D、Y383E、Y383F、Y383G、Y383H、Y383I、Y383K、Y383P、Y383M、Y383N、Y383Q、Y383R、Y383S、Y383T、Y383V、S407W、S407A、S407L、S407C、S407D、S407E、S407F、S407G、S407H、S407I、S407K、S407P、S407M、S407N、S407Q、S407R、S407S、S407T、S407V、Y420W、Y420A、Y420L、Y420C、Y420D、Y420E、Y420F、Y420G、Y420H、Y420I、Y420K、Y420P、Y420M、Y420N、Y420Q、Y420R、Y420S、Y420T和Y420V。
在某些实施例中,提供了重组多肽,所述重组多肽包含与SEQ ID NO:232具有至少95%同一性的氨基酸序列,其中所述氨基酸序列包含对保守氨基酸的至少一个氨基酸取代。
在一个实施例中,其中所述至少一个氨基酸取代选自由以下组成的组:Y24W、Y24A、Y24L、Y24C、Y24D、Y24E、Y24F、Y24G、Y24H、Y24I、Y24K、Y24P、Y24M、Y24N、Y24Q、Y24R、Y24S、Y24T、Y24V、Q29G、Q29A、Q29C、Q29D、Q29E、Q29F、Q29G、Q29H、Q29I、Q29K、Q29L、Q29M、Q29N、Q29P、Q29R、Q29S、Q29T、Q29V、Q29W、Q29Y、L33V、L33F、L33A、L33Q、L33W、L44V、L44F、L44A、L44Q、L44W、G45L、G45M、G45E、R81E、R81Q、D96E、K165N、K165Q、K165A、K165D、Y167W、Y167A、Y167L、Y167C、Y167D、Y167E、Y167F、Y167G、Y167H、Y167I、Y167K、Y167P、Y167M、Y167N、Y167Q、Y167R、Y167S、Y167T、Y167V、D255E、R236E、R236Q、V237L、V237S、V237E、V237A、V237F、V237N、Y239W、Y239A、Y239L、Y239C、Y239D、Y239E、Y239F、Y239G、Y239H、Y239I、Y239K、Y239P、Y239M、Y239N、Y239Q、Y239R、Y239S、Y239T、Y239V、L241V、L241F、L241A、L241Q、L241W、L254V、L254F、L254A、L254Q、L254W、G258L、G258M、G258E、G259L、G259M、G259E、R260E、R260Q、G286L、G286M、G286E、Y330W、Y330A、Y330L、Y330C、Y330D、Y330E、Y330F、Y330G、Y330H、Y330I、Y330K、Y330P、Y330M、Y330N、Y330Q、Y330R、Y330S、Y330T、Y330V、Y364W、Y364A、Y364L、Y364C、Y364D、Y364E、Y364F、Y364G、Y364H、Y364I、Y364K、Y364P、Y364M、Y364N、Y364Q、Y364R、Y364S、Y364T、Y364V、S384W、S384A、S384L、S384C、S384D、S384E、S384F、S384G、S384H、S384I、S384K、S384P、S384M、S384N、S384Q、S384R、S384S、S384T、S384V、Y398W、Y398A、Y398L、Y398C、Y398D、Y398E、Y398F、Y398G、Y398H、Y398I、Y398K、Y398P、Y398M、Y398N、Y398Q、Y398R、Y398S、Y398T和Y398V。
在某些实施例中,提供了重组多肽,所述重组多肽包含与SEQ ID NO:198具有至少95%同一性的氨基酸序列,其中所述氨基酸序列包含至少一个氨基酸取代。
在一个实施例中,其中所述至少一个氨基酸取代选自由以下组成的组:A17T_Q159W_A230S;A51T_M104E_Q159S;A51Q_S175W_L217F;L217F_V292N_Q235A;A51T_D164E_Q293W;V47A_Q159S_I292A;和A51Q_S175Y_Y286H。
附图说明
图1显示根据示例实施例,在四种不同浓度下滴定CBGA的结果。
图2根据示例实施例,使用LC-MS比较了四种对照样品(nphB基因)和本发明的两种酶在它们形成CBGA的能力方面的CBGAS活性。
图3根据示例实施例,详述了大麻素生产的生物途径。
图4根据另一个示例实施例,详述了大麻素生产的生物途径。
图5根据示例实施例,使用LC-MS比较了对照样品(nphB基因)和本发明的两种酶(eCAN20005和eCAN20006)在它们形成CBGA的能力方面的GOT活性和CBGA/CBGA-异构体比率。
图6A根据示例实施例,使用LC-MS比较了在大肠杆菌中表达的本发明的各种酶(yCAN30003至yCAN30049)在它们形成CBGA的能力方面的GOT活性。图6B根据示例实施例,使用LC-MS比较了在酵母中表达的本发明的各种酶(yCAN30003至yCAN30049)在它们形成CBGA的能力方面的GOT活性。
具体实施方式
定义
如本文和权利要求中所使用的,“包含”意指包括以下要素但是不排除其他要素。
如本文和权利要求中所使用的,单数形式“一个/一种(a/an)”和“所述”包括复数指代物,除非上下文另外明确指出。例如,如以上所使用的,“一个”基因意指一个或多个基因,其可以相同或者不同。
“异戊二烯基转移酶(Prenyl transferase enzymes或prenyl transferase)”是指芳香族异戊二烯基转移酶(PTase),其催化例如衍生自相应的异戊二烯基二磷酸酯代谢物的C5(二甲基烯丙基)、C10(香叶基)或C15(法呢基)异戊二烯基基团转移至多种富含电子的芳香族受体上。
“异戊二烯基基团”是指出现在多种微生物来源和植物来源的生物活性天然产物(包括氨基酸、芪、生物碱、聚酮化合物和苯丙素(如类黄酮))中的一种官能团,其生产具有改变的或增强的生物活性的天然产物杂合体。
“异戊二烯化”是指异戊二烯基基团转移到富含电子的芳香族受体上。与非异戊二烯化的前体相比,异戊二烯化在许多情况下似乎提供了更高水平的生物活性,如通过增加生物膜的亲和力和与细胞靶标的相互作用。
“GPP途径”是指通过MVA或MEP途径生产香叶基二磷酸酯(GPP)的途径。微生物分别通过酵母和细菌中的MVA或MEP途径天然生产GPP。
“OA途径”或“橄榄醇酸途径”是指合成OA的途径,其中己酸(酵母中天然生产的简单脂肪酸)通过己酰-CoA合酶转化为己酰-CoA。OA的合成是己酰-CoA和3丙二酰-CoA的两步融合,负责这些反应的酶是橄榄醇合酶(OLS)和橄榄醇酸环化酶(OAC)。这些编码序列的来源来自大麻(C.sativa)。通过在生长培养基中添加来补料己酸已显示OA产量提高。
“大麻萜酚酸”或“CBGA”是指通过香叶基焦磷酸酯:橄榄醇酸酯香叶基转移酶(GOT)由橄榄醇酸和甲羟戊酸酯途径中间体香叶基焦磷酸酯(GPP)生产的分子。CBGA也是Δ-四氢大麻酚酸(THCA)、大麻二酚酸(CBDA)和许多其他大麻素的前体。
“CBGA途径”是指通过由大麻香叶基焦磷酸酯:橄榄醇酸酯香叶基转移酶活性(GOT)和nphB酶的异戊二烯基转移酶活性显示的大麻萜酚酸合酶(CBGAS)活性,GPP和橄榄醇酸融合来形成大麻萜酚酸(CBGA)。
“nphB”或“nphB酶”是指催化10-碳香叶基基团与芳香族底物(如CBGA)的连接的芳香族异戊二烯基转移酶。此酶类别驱动大麻素途径的第一个生化步骤以形成CBGA。
“香叶基焦磷酸酯:橄榄醇酸酯香叶基转移酶”或“GOT”是指一种异戊二烯基转移酶,所述异戊二烯基转移酶是植物大麻的大麻素生物合成途径的一部分,催化香叶基二磷酸酯和2,4-二羟基-6-戊基苯甲酸酯之间的反应以形成大麻萜酚酸酯和二磷酸酯。
“密码子简并核苷酸序列”是指在多肽序列中与具有不同密码子的另一个核苷酸序列编码相同的一组氨基酸的核苷酸序列。例如,包含GAA(编码谷氨酸)的序列的密码子简并核苷酸序列将与GAA被GAG(也编码谷氨酸)替代的序列相同。
图3描述了大麻中大麻素的生物合成途径。将前体GPP和OA转化为大麻素途径CBGA的中心中间体。CBGA通过两种氧化还原酶四氢大麻酚酸合酶(THCAS)和大麻二酚酸合酶(CBDAS)转化为THC和CBD的酸性形式。异源表达的酶以绿色显示。初级代谢的中间体以灰色显示(Zirpel等人,2017)。
图4描述了大麻中大麻素的生物合成途径。将前体GPP和OA转化为大麻素途径CBGA的中心中间体。CBGA通过两种氧化还原酶四氢大麻酚酸合酶(THCAS)和大麻二酚酸合酶(CBDAS)转化为THC和CBD的酸性形式。
本文提供了以比NphB令人惊讶地更高的反应速率催化相同反应的酶。
在某些实施例中,本文提供了以令人惊讶地更高的反应速率催化相同反应的酶、表达此类酶的工程化生物体、使用此类工程化生物体以制备此类酶的方法以及使用此类酶以制备大麻素或制备用于制备大麻素的中间体的方法。
在一些实施例中,与NphB野生型(wt)相比,所述酶具有改善的用于形成CBGA的反应速率。在一些实施例中,所述酶选自在本文表1中列出的那些。
实例
克隆、表达和纯化异戊二烯基转移酶
在某些实施例中,将基因候选物在大肠杆菌中表达,制备蛋白质提取物,使用HIS标签通过亲和力的酶纯化递送用于测试的纯化酶以形成CBGA。在又其他示例实施例中,将基因候选物在酵母中表达。将表达的蛋白提取物纯化,并用于测试。在本文的实例中描述了展示克隆、表达和纯化本披露的酶的具体方法的示例实施例。
制备大麻素的方法
可以使用微生物或酵母中的异源表达来制备大麻素。可以将微生物基因工程化以表达大麻素或大麻素前体分子。异源表达大麻素化合物的方法是本领域已知的,并且如例如在Carvalho等人,2017中所述的,将其通过援引并入本文。
图3显示详述大麻素生产的生物途径的图,所述生物途径包括前体,如通过异戊二烯基转移酶NphB由橄榄醇酸(OA)和香叶基二磷酸酯(GPP)形成的CBGA。OA与NphB的异戊二烯化是非特异性的,并且生成了2-O-香叶基橄榄醇酸酯(作为副产物)(Valliere等人,2019)。异戊二烯化可以通过本领域技术人员已知的方法进行,并且包括但不限于Valliere等人,2019和Luo等人,2019,将其通过援引并入本文。
图4显示详述大麻素生产的生物途径的图,所述生物途径包括前体,如通过CBGA类酶(特别是异戊二烯基转移酶NphB家族代表的)由橄榄醇酸(OA)和香叶基二磷酸酯(GPP)形成的CBGA。OA与NphB的异戊二烯化是非特异性的,并且生成了2-O-香叶基橄榄醇酸酯(作为副产物)(Valliere等人,2019)。异戊二烯化可以通过本领域技术人员已知的方法进行,并且包括但不限于Valliere等人,2019和Luo等人,2019,将其通过援引并入本文。
实例1:酶的克隆、表达和纯化
候选基因作为基因块购自通用生物系统(中国安徽)有限公司(GeneralBiosystems(Anhui,China)Corporation Limited),并在表达N末端His标签酶的pET28a(+)的限制性内切酶位点NdeI(CATATG)和XhoI(C TCGAG)之间克隆。将所有质粒转化至BL21(DE3),并命名为eCAN20005至eCAN20060(参见表1)。
将具有50μg/mL卡那霉素的LB培养基中的0.5mL饱和培养物接种在具有50μg/mL卡那霉素的50mL TB培养基中。使培养物在37℃下生长至OD600为0.5-0.8,并用0.5mM IPTG诱导,并且然后在25℃下在220rpm下表达18小时。
将细胞通过离心在2500×g下收获,并用裂解缓冲液(50mM Tris-HCl,500mMNaCl,[pH 8.0],10%(v/v)甘油)洗涤,并在10ml裂解缓冲液中重悬至OD550约为100。在4℃下,使用超声细胞破碎机将细胞裂解10min。通过在4℃下在12,000×g下离心30分钟来澄清裂解物。将含有可溶性蛋白级分的上清液回收,并通过0.45μm过滤器过滤,并在25℃下在旋转器(或滚轮器(Roller))中与0.5mL的Ni亲和树脂结合1小时。将树脂转移至重力流柱。将树脂用10个柱体积的洗涤缓冲液(50mM Tris-HCl,500mM NaCl,(pH 8.0),10%(v/v)甘油和20mM咪唑)洗涤,随后用1mL的洗脱缓冲液(50mM Tris-HCl,500mM NaCl,(pH 8.0),10%(v/v)甘油和250mM咪唑)洗脱。通过Amicon过滤柱(10K截留)来用反应缓冲液(50mM HEPES(pH 7.5),5mM Mg)替代洗脱缓冲液并浓缩蛋白质样品。最初将蛋白质样品浓缩至200μL。
实例2:体外酶测定
用于酶测定的反应条件由以下组成:具有5mM MgCl2的50mM HEPES(pH=7.5)、2mMGPP、2mM橄榄醇酸和1mg/ml的纯化候选酶,最终体积为200uL。在室温下孵育18小时后,将反应混合物用200μL的乙酸乙酯/甲酸(0.05%(v/v))萃取2次。将每个反应的有机提取物合并,并使用块式加热器去除溶剂。在LC-MS分析前,将样品溶解于100μL重悬液(乙腈/H2O/甲酸(80%/20%/0.05%(v/v/v))),并用0.22μm PVDF膜过滤。
图1通过显示在四种不同浓度下滴定CBGA的结果验证了酶测定。CBGA滴定曲线浓度:(A)10ng/mL,(B)100ng/mL,(C)1ug/mL,(D)10ug/mL。表2还显示在m/z 359.5下CBGA的LC-MS色谱图,保留时间为5.43分钟。
实例3:大麻萜酚酸(CBGA)的LC-MS分析
配备RP-C18柱(BEH130,1.7μm,2.1mm x 50mm,沃特斯(Waters))的UPLC-MS(具有SQ检测器2的沃特斯H级)。流动相A是含有0.1%甲酸的水,并且流动相B是含有0.1%甲酸的乙腈。梯度洗脱从50%B维持1min开始,然后在10min内增加至90%B,在1min内降低至50%B,并在50%B下维持1min。流速为0.4ml/min,运行时间为13min。样品注射体积为2μl,并且分别将样品盘和柱温箱设置为10℃和30℃。在负离子模式下通过电喷雾电离来检测大麻萜酚酸,并且MS扫描模式为SIR 359.5m/z,毛细管电压和锥孔电压分别为3,800V和30V。去溶剂化气体和温度分别设置为1000l/h和500℃。
实例4
结果
根据实例1所述的方法制备表1(以下)的蛋白质样品,根据实例2的测定和实例3的LC-MS方法测试蛋白质样品的CBGAS酶活性。
表1提供了异戊二烯基转移酶的蛋白质序列的列表,与NphB wt相比,所述异戊二烯基转移酶可具有改善的用于形成CBGA的反应速率。注意,以下序列在N末端包括以下多组氨酸标签:MGSSHHHHHHSSGLVPRGSH。
表1
表2
样品 | 组 | 基因 |
RCAN-0001 | 组A | nphB wt |
RCAN-0002 | 组B | nphB M23 |
RCAN-0003 | 组C | nphB M30 |
RCAN-0004 | 组D | nphB-G286S |
RCAN-0006 | 组E | SActPT06 |
表2与图2一起使用LC-MS比较了四个对照样品组A、B、C和D(nphB基因、野生型和突变体)和新型酶(组E:SActPT06)在它们形成CBGA的能力方面的CBGAS活性。LC-MS色谱图显示天然nphB的活性,并证实了M23、M30和G286S突变体的活性增强。它显示SActPT06也形成CBGA。m/z 359.5下样品的LC-MS色谱图结果,CBGA保留时间为5.43分钟,在我们的样品中观察到几个异构体的R.T.为3.47、5.94、6.30和8.70min。R.T.5.4对应于CBGA。
表3提供了CBGAS活性,以由本发明的新酶形成的CBGA的计算产量的形式显示。令人惊讶的是,结果显示出在大肠杆菌中表达的几种原核酶具有CBGAS活性(或GOT活性),并且一些酶(eCAN2005和eCAN2006)甚至具有比野生型NphB酶(eCAN20001)和一些突变体NphB酶(eCAN20002和eCAN20004)更高的CGGAS/GOT活性。
图5显示使用LC-MS的对照样品(nphB,野生型)和两种新型酶(eCAN2005和eCAN2006)在它们形成CBGA能力方面的GOT活性。LC-MS色谱图显示了天然nphB的活性,并证实了样品eCAN20005和eCAN2006的活性。它显示SaPT05和SActPT06也形成CBGA。LC-MS色谱图结果显示在m/z 359.5下,CBGA保留时间为5.43分钟,在对照和样品中观察到几个异构体的R.T.为3.47和5.90min。结果还显示样品eCAN20005和eCAN2006的CBGA/CBGA-异构体比率比NpHB的高,这表明两种酶均显示比对照更高的特异性,并且因此生产更多所需的异构体形式。总之,样品eCAN20005(即,抗生链霉菌SaPT05)(SEQ ID NO:01)和eCAN20006(即,链霉菌属物种SActPT06)(SEQ ID NO:02)在生产CBGA或类似物方面令人惊讶的有用。
表3:CBGA产量
实例4:nphB与其他酶和突变体相比的蛋白质同一性
表4显示使用UniProt的CLUSTAL W和Expasy程序的LALAIGN将本发明的酶与nphB相比的蛋白质同一性。表4表明本发明的酶的蛋白质序列与nphB非常不同,显示总体百分比同一性远低于50%。因此,尽管本文披露的酶与nphB的结构不同,但具有令人惊讶的高CBGAS活性。此外,一些本发明的酶在催化CBGA的形成中令人惊奇地更有效。
表4:显示蛋白质同一性水平的序列比对
实例5:克隆和酵母转化
克隆
候选基因作为基因块购自通用生物系统(中国安徽)有限公司,并在pESC-TRP(含有TRP1酵母-选择性标记)的限制性内切酶位点EcoRI(GAATTC)和SpeI(ACTAGT)之间克隆。将所有质粒转化至至少一个酵母菌株中,并命名为yCAN20003至yCAN20053(参见下表5)。
表5提供了本披露的异戊二烯基转移酶的蛋白质序列的列表。
根据实例5和6所述的方法制备表5的蛋白质样品,根据实例7(A)、7(B)的测定和实例8的LC-MS方法测试蛋白质样品的CBGAS酶活性。
表6提供了本披露的异戊二烯基转移酶的基因序列的列表。注意,SEQ ID No.151至SEQ ID No.197是经优化以在酵母中表达的基因序列,所述序列分别对应于它们的天然对应物SEQ ID No.104至SEQ ID No.150。
表5本披露的异戊二烯基转移酶的蛋白质序列的列表。
表6本披露的异戊二烯基转移酶的基因序列的列表。
酵母转化
用于酵母转化的试剂
YPD培养基:
1%(w/v)细菌用(Bacto)酵母提取物,2%(w/v)细菌用蛋白胨,2%(w/v)葡萄糖。对于YPD琼脂平板,需要额外的18g/L细菌用琼脂。
选择培养基合成的完全色氨酸缺陷型培养基(SC/-Trp):
SC/-Trp肉汤购自酷来博有限公司(Coolaber Co.,Ltd)(中国北京)。将8g培养基与900mL蒸馏水混合,并且然后用1.0N氢氧化钠(NaOH)调节至pH 5.8,并高压灭菌。对于琼脂平板,需要额外的18g/L细菌用琼脂。
醋酸锂(1.0M),溶解:
将102g的醋酸锂二水合物溶解于100ml水中(在瓶中),高压灭菌15min。可替代地,可以使用过滤器单元(乐基因公司(Nalgene))和真空泵来过滤灭菌溶液。将溶液在室温下(约20℃)储存。
PEG MW 3350(50%w/v):
将50g PEG 3350添加至约30ml的蒸馏或去离子水中(在150ml烧杯中)。将混合物搅拌直至它溶解。如有必要,用加热板轻轻地加热溶液以帮助溶解。在100ml量筒中,将溶液的体积补充至100ml,并将溶液充分混合。将溶液转移至玻璃储存瓶,并高压灭菌15min。可替代地,可以使用过滤器单元(乐基因公司)和真空泵来过滤灭菌溶液。可以将溶液密封,并且在室温下储存几个月。
单链载体DNA(2.0mg/ml)
使用磁力搅拌板,在4℃下将200mg的鲑鱼精子DNA完全溶解在100ml无菌TE缓冲液(10mM Tris-HCl,1mM Na2EDTA,pH 8.0)中几小时。将1.0ml的溶液等分至1.5ml微量离心管中,并且可以将剩余溶液等分至15ml螺旋盖塑料离心管中并在-20℃下储存。将载体DNA在沸水浴中变性5min,并在使用前立即在冰水浴中冷却。
酵母转化程序
将从新鲜YPD平板上生长的酵母菌株单菌落用无菌接种环接种至5mL的YPD培养基,并用旋转振荡器在200rpm下、在30℃下孵育过夜,约12-16小时。
确定酵母培养物的细胞密度。将约2.5x108个细胞用50ml的YPD稀释,以获得最终密度为约5x106个细胞/ml的细胞悬浮液。
将烧瓶中的细胞悬浮液在振荡培养箱中、在200rpm下、在30℃下孵育约4小时,直至细胞密度达到至少2x107个细胞/ml。
将1.0ml载体DNA在沸水浴中变性5min,并立即在冰水浴中冷却。可替代地,可以使用在-20℃下储存的预变性载体DNA,将其解冻并保持在冰上直至使用。
通过以3,000g离心5min收获酵母细胞,并将细胞沉淀重悬在25ml无菌水中。在20℃下,将悬浮液以3,000g离心5min以沉淀细胞。通过重悬细胞并再次通过离心来沉淀它们来用另外的25ml无菌水重复此洗涤。将细胞重悬在1.0ml的无菌水中。
将细胞悬浮液转移至1.5ml微量离心管,并以13,000g离心30秒,并弃去上清液。
将细胞重悬于1.0ml的无菌水中,并将含有约108个细胞的100μl悬浮液用移液管等分至1.5ml微量离心管中。将每个等分用于每种转化。将含有悬浮液的微量离心管在微型离心机中以13,000g离心30秒,以去除上清液。将含有沉淀的微量离心管命名为“转化管”。
如表7所示,为每个转化反应混合以下组分。
表7.用于酵母转化的转化混合组分。
转化混合组分 | 体积(ul) |
PEG MW 3350(50%(w/v)) | 240 |
醋酸锂,1.0M | 36 |
单链载体DNA(2.0mg/ml) | 50 |
无菌水中的质粒DNA(30ng/μl) | 34 |
总体积 | 360 |
将360ml的转化混合物添加至每个转化管中,并将细胞通过剧烈涡旋重悬。可以包括无质粒DNA的阴性对照。
将转化管置于42℃下的水浴中,并孵育40min。
将转化管在微量离心机中以13,000g离心30秒,并将上清液用微量移液器去除。将1.0ml的无菌水移液至每个转化管中。将沉淀用无菌微量移液器吸头搅拌,以破坏细胞沉淀,并且然后涡旋以均匀地重悬细胞沉淀。
将200ml的细胞悬浮液铺板至适当的培养基上,如SC/-TRP选择培养基。
将琼脂平板在30℃下孵育3-4天,并计算菌落(转化子)数量。
实例6:制备酵母细胞培养物并表达酶
试剂
YPD培养基:
1%(w/v)细菌用酵母提取物,2%(w/v)细菌用蛋白胨,2%(w/v)葡萄糖。对于YPD琼脂平板,需要额外的18g/L细菌用琼脂。
选择培养基合成的完全色氨酸缺陷型培养基(SC/-Trp):
SC/-Trp肉汤购自酷来博有限公司(中国北京)。将8g培养基与900mL蒸馏水混合,并且然后用1.0N氢氧化钠(NaOH)调节至pH 5.8,并高压灭菌。对于琼脂平板,需要额外的18g/L细菌用琼脂。
裂解缓冲液:
50mM Tris-HCl(pH 7.4),含有0.1M KCl、1mM DTT、10mM PMSF和1x蛋白酶抑制剂混合物(PIC),不含EDTA
从含有2%(w/v)葡萄糖板的SC/-Trp培养基中分离目的单菌落(即,转化体),并将其接种在10ml的含有2%(w/v)葡萄糖的SC/-Trp培养基中过夜。然后通过以3,000g离心10min来收获细胞培养物,并将细胞用SC/-Trp培养基和2%半乳糖洗涤两次。将细胞沉淀添加至250-ml带挡板的烧瓶(含有50ml SC/-Trp培养基和2%半乳糖)中,其中最初光密度(OD600nm)为0.1。然后将培养物在定轨振荡器中、在28℃下以200rpm孵育过夜持续约12-14小时,直至OD达到约3-4。
然后在4℃下,通过以8,000rpm离心10min来收获细胞。弃去上清液,并将细胞沉淀用冰冷裂解缓冲液重悬。将细胞沉淀再洗涤一次,并测量生物质。
细胞裂解
在4℃下进行以下用于制备微粒体的步骤。
将来自前述步骤的细胞沉淀用比率1:3(w:v)的冰冷裂解缓冲液重悬,并将细胞悬浮液转移至新管中。将等量的玻璃珠添加至细胞悬浮液中,并以最高速涡旋1min,并将其在冰上冷却1min。将此步骤重复10-12次。然后在显微镜下检查细胞以获取破坏效率。
将裂解或破碎的细胞悬浮液转移到新试管中,避免转移任何玻璃珠。将玻璃珠用裂解缓冲液洗涤,直至大多数裂解或破碎的细胞从玻璃珠上去除。收集所有样品,并进行下一离心步骤。
微粒体酶制备
试剂:
反应缓冲液:
10mM Tris-HCl,10mM MgCl2,pH 8.0,10%甘油
在4℃下进行以下用于制备微粒体的步骤。
将样品以17,000g离心10min以去除细胞碎片和未破碎的细胞。然后,将上清液倒入超速离心管,并在4℃下以160,000g离心1h。弃去上清液,并将含有微粒体的沉淀与反应缓冲液(50mM Tris-HCl,10mM MgCl2,pH 8.5)混合。
以1:10(w:v)的比率添加含有5%甘油的1x磷酸盐缓冲盐水(PBS)。首先添加1-2ml的缓冲液,并将沉淀用移液管重悬直至将沉淀破碎成小片段。将微粒体悬浮液转移至预冷的杜恩斯(Douncer或Dounce)匀浆器中,并添加剩余的缓冲液。将混合物用10-12冲程的杜恩斯匀浆器轻轻匀浆化。测量280nm下的吸光度。
实例7:体外酶测定
试剂:
底物溶液缓冲液:
50mM Tris-HCl,10mM MgCl2,(pH 8.5),含有2mM橄榄醇酸和2mM GPP。
将100ul微粒体制剂与100ul底物溶液缓冲液(50mM Tris-HCl,10mM MgCl2,(pH8.5),含有2mM橄榄醇酸和2mM GPP)混合,以补充总体积为200ul。将样品在室温下孵育。在室温下孵育18小时后,将反应混合物用200μL的乙酸乙酯/甲酸(0.05%(v/v))萃取2次。将每个反应的有机提取物合并,并使用块式加热器去除溶剂。在LC-MS分析前,将样品溶解于100μL重悬液(乙腈/H2O/甲酸(80%/20%/0.05%(v/v/v))),并用0.22μm PVDF膜过滤。
实例8:大麻萜酚酸(CBGA)的LC-MS分析
配备RP-C18柱(BEH130,1.7μm,2.1mm x 50mm,沃特斯(Waters))的UPLC-MS(具有SQ检测器2的沃特斯H级)。流动相A是含有0.1%甲酸的水,并且流动相B是含有0.1%甲酸的乙腈。梯度洗脱从50%B维持1min开始,然后在10min内增加至90%B,在1min内降低至50%B,并在50%B下维持1min。流速为0.4ml/min,运行时间为13min。样品注射体积为2μl,并且分别将样品盘和柱温箱设置为10℃和30℃。在负离子模式下通过电喷雾电离来检测大麻萜酚酸,并且MS扫描模式为SIR 359.5m/z,毛细管电压和锥孔电压分别为3,800V和30V。去溶剂化气体和温度分别设置为1000l/h和500℃。
结果
图6A显示使用实例1-3中所述的方法来在大肠杆菌中表达的各种样品(yCAN30003至yCAN30049)(其中酶源自各种植物)的GOT活性。结果显示出,一些样品(eCAN30003、eCAN30005、eCAN30006、eCAN30007、eCAN30008、eCAN30009、eCAN30010、eCAN30011、eCAN30013、eCAN30017、eCAN30018、eCAN30028、eCAN30029、eCAN30030、eCAN30033、eCAN30034、eCAN30035、eCAN30037、eCAN30041、eCAN30045、eCAN30046、eCAN30047、eCAN30048)确实具有不同水平的阳性GOT活性。在测试的样品中,样品yCAN30035(即,黄瓜CPHPT2)显示最高的GOT活性(约2.8mg/L)。图6B显示使用实例5-8中所述的方法来在酵母中表达的各种样品(yCAN30003至yCAN30049)(其中酶源自各种植物)的GOT活性。令人惊讶的是,当测试这些样品的体内GOT活性时,仅样品yCAN30035(即,黄瓜CPHPT2)显示阳性GOT活性(约40mg/L)。其他样品显示无GOT活性。总之,样品yCAN30035(即,黄瓜CPHPT2)(SEQ IDNO:85)在生产CBGA或类似物方面令人惊讶的有用。具有用于酵母表达的优化的基因序列设计、基于黄瓜CPHPT2(SEQ ID NO:85)的人工序列SEQ ID NO:179特别适用于通过在酵母中异源表达来生产CBGA或类似物。
实例9:酶的克隆、表达和纯化
候选基因作为基因块购自通用生物系统(中国安徽)有限公司,并在表达N末端His标签酶的pET28a(+)的限制性内切酶位点NdeI(CATATG)和XhoI(C TCGAG)之间克隆。将所有质粒转化至BL21(DE3),并命名为eCAN20005至eCAN20060(参见表9)。
表8提供了本披露的异戊二烯基转移酶的蛋白质序列的列表。注意,以下蛋白质序列可以包括在N末端具有或不具有以下多组氨酸标签的序列:MGSSHHHHHHSSGLVPRGSH。还要注意,SEQ ID No.310至SEQ ID.335是具有由相应的天然蛋白质序列截短2个氨基酸的蛋白质序列。
根据实例9所述的方法制备蛋白质样品,根据实例10的测定和实例11的LC-MS方法测试蛋白质样品的CBGAS酶活性。
表9提供了本披露的异戊二烯基转移酶的基因序列的列表。注意,以下基因序列可以包括在5’端具有或不具有多组氨酸标签的基因序列的序列。注意,SEQ ID No.472至SEQID No.583是经优化以在大肠杆菌中表达的基因序列。还要注意,SEQ ID No.446至SEQ IDNo.471是具有由对应于表8中截短2个氨基酸的各自原始基因序列(SEQ ID No.310-335)截短6个碱基的蛋白质序列。
表8列出了本披露的异戊二烯基转移酶的蛋白质序列。
表9列出了本披露的异戊二烯基转移酶的基因序列。
将具有50μg/mL卡那霉素的LB培养基中的0.5mL饱和培养物接种在具有50μg/mL卡那霉素的50mL TB培养基中。使培养物在37℃下生长至OD600为0.5-0.8,并用0.5mM IPTG诱导,并且然后在25℃下在220rpm下表达18小时。
将细胞通过离心在2500×g下收获,并用裂解缓冲液(50mM Tris-HCl,500mMNaCl,[pH 8.0],10%(v/v)甘油)洗涤,并在10ml裂解缓冲液中重悬至OD550约为100。在4℃下,使用超声细胞破碎机将细胞裂解10min。通过在4℃下在12,000×g下离心30分钟来澄清裂解物。将含有可溶性蛋白级分的上清液回收,并通过0.45μm过滤器过滤,并在25℃下在旋转器(或滚轮器(Roller))中与0.5mL的Ni亲和树脂结合1小时。将树脂转移至重力流柱。将树脂用10个柱体积的洗涤缓冲液(50mM Tris-HCl,500mM NaCl,(pH 8.0),10%(v/v)甘油和20mM咪唑)洗涤,随后用1mL的洗脱缓冲液(50mM Tris-HCl,500mM NaCl,(pH 8.0),10%(v/v)甘油和250mM咪唑)洗脱。通过Amicon过滤柱(10K截留)来用反应缓冲液(50mM HEPES(pH 7.5),5mM Mg)替代洗脱缓冲液并浓缩蛋白质样品。最初将蛋白质样品浓缩至200μL。
实例10:体外酶测定
用于酶测定的反应条件由以下组成:具有5mM MgCl2的50mM HEPES(pH=7.5)、2mMGPP、2mM橄榄醇酸和1mg/ml的纯化候选酶,最终体积为200uL。在室温下孵育18小时后,将反应混合物用200μL的乙酸乙酯/甲酸(0.05%(v/v))萃取2次。将每个反应的有机提取物合并,并使用块式加热器去除溶剂。在LC-MS分析前,将样品溶解于100μL重悬液(乙腈/H2O/甲酸(80%/20%/0.05%(v/v/v))),并用0.22μm PVDF膜过滤。
实例11:大麻萜酚酸(CBGA)的LC-MS分析
配备RP-C18柱(BEH130,1.7μm,2.1mm x 50mm,沃特斯(Waters))的UPLC-MS(具有SQ检测器2的沃特斯H级)。流动相A是含有0.1%甲酸的水,并且流动相B是含有0.1%甲酸的乙腈。梯度洗脱从50%B维持1min开始,然后在10min内增加至90%B,在1min内降低至50%B,并在50%B下维持1min。流速为0.4ml/min,运行时间为13min。样品注射体积为2μl,并且分别将样品盘和柱温箱设置为10℃和30℃。在负离子模式下通过电喷雾电离(ESI)来检测大麻萜酚酸,并且MS扫描模式为SIR 359.5m/z,毛细管电压和锥孔电压分别为3,800V和30V。去溶剂化气体和温度分别设置为1000l/h和500℃。
实例12:序列比对
分别使用UniProt的CLUSTAL W和Expasy程序的LALAGN来比较nphB与其他酶的蛋白质同一性。
结果
实例13:通过LC-MS对CBGA的验证结果
图1使用实例3中所述的方法,通过显示在四种不同浓度下滴定CBGA的结果验证了酶测定。CBGA滴定曲线浓度:(A)10ng/mL,(B)100ng/mL,(C)1ug/mL,(D)10ug/mL。图2还显示在m/z 359.5下CBGA的LC-MS色谱图,保留时间为5.43分钟。
表10和图2一起使用LC-MS比较了四个对照样品组A、B、C和D(nphB基因、野生型和突变体)在它们形成CBGA的能力方面的CBGA活性。LC-MS色谱图显示天然nphB的活性,并证实了M23、M30和G286S突变体的活性增强。m/z 359.5下样品的LC-MS色谱图结果,CBGA保留时间(R.T.)为约5.43分钟,还观察到几个异构体的R.T.为约3.47、5.94、6.30和8.70min。R.T.5.4对应于CBGA。
表10列出了组和相应的基因
实例14:CBGA产量
表3提供了CBGAS活性,以由本发明的新酶形成的CBGA的计算产量的形式显示。表3列出了具有CBGA活性的异戊二烯基转移酶。表11也显示了与eCAN20001(NphB-wt)相比,eCAN20003(nphB-m30)、eCAN20006(SActPT06)、eCAN20005(SaPT05)、eCAN20002(nphB-m23)和eCAN20004(nphB-G286S)具有显著较高的CBGA产量。
表11:CBGA产量
实例15:nphB与其他酶相比的蛋白质同一性
表12显示使用UniProt的CLUSTAL W和Expasy程序的LALIGN将本发明的酶与nphB相比的蛋白质同一性。表12表明本发明的酶的蛋白质序列与nphB非常不同,显示总体百分比同一性远低于50%。因此,尽管本文披露的酶与nphB的结构不同,但具有显著的CBGAS活性。此外,一些本发明的酶在催化CBGA的形成中令人惊奇地更有效。
表12:显示蛋白质同一性水平的序列比对
实例16:在大麻素途径中生产化合物的突变体的生成
使用UNIPROT Clustal Omega进行eCAN20053(其具有植物来源)的蛋白质序列与eCAN200039(其具有真菌来源)的蛋白质序列之间的成对序列比对,以找到保守氨基酸或保守结构域。
表13提供了突变体酶,其中以上所述的保守氨基酸被具有相似化学性质(如极性、非极性、带电荷、不带电荷等)的其他氨基酸替代。
表13 eCAN200053和eCAN200039的突变体的氨基酸突变位点。
表14中列出了eCAN20005的蛋白质序列上的突变。
表14 eCAN20005的突变体的蛋白质序列上的突变
克隆编号 | 基于eCAN20005的突变体 |
1 | A17T_Q159W_A230S |
2 | A51T_M104E_Q159S |
3 | A51Q_S175W_L217F |
4 | L217F_V292N_Q235A |
5 | A51T_D164E_Q293W |
6 | V47A_Q159S_I292A |
7 | A51Q_S175Y_Y286H |
尽管描述涉及特定的实施例,但是本领域的技术人员将会清楚,本发明可以利用这些具体细节的变型来实践。因此,本发明不应被解释为限于以下阐述的权利要求或本文阐述的实施例。
Claims (24)
1.一种生产大麻萜酚酸(CBGA)或其类似物的方法,所述方法包括以下步骤:使异源表达的异戊二烯基转移酶与香叶基二磷酸酯(GPP)和酸反应。
2.如权利要求1所述的方法,其中所述异戊二烯基转移酶具有异戊二烯基转移酶活性和/或香叶基焦磷酸酯:橄榄醇酸酯香叶基转移酶(GOT)活性。
3.如权利要求1所述的方法,其中所述异戊二烯基转移酶具有与天然CBGAS的活性相比合成能力提高并且副产物形成减少的活性;或具有与NphB野生型相比改善的用于形成CBGA的反应速率。
4.如权利要求1所述的方法,其中所述异戊二烯基转移酶具有大于12μg/mL的CBGA的反应速率。
5.如权利要求1所述的方法,其中所述酸选自由以下组成的组:苔色酸(OSA)、丙基雷锁辛酸(DVA)和橄榄醇酸(OLA)、芹菜素、黄豆苷元、染料木素、柚皮素、橄榄醇、橄榄醇酸(OA)和白藜芦醇。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法,其中所述异戊二烯基转移酶与选自由SEQ IDNo:01-103、198-335组成的组的氨基酸序列的全部或片段具有至少约80%、85%、90%或95%序列同一性,或所述异戊二烯基转移酶由与选自由SEQ ID No:104-197、336-583组成的组的核酸序列的全部或片段具有至少约80%、85%、90%或95%序列同一性的核苷酸序列表达。
7.如权利要求6所述的方法,其中所述氨基酸序列是SEQ ID No:01、02、85或179。
8.一种生产大麻素的方法,所述方法包括以下步骤:
a)使异源表达的异戊二烯基转移酶与异戊二烯基基团供体和酸反应以生产大麻萜酚酸(CBGA)或其类似物;和
b)使所述CBGA或其类似物与大麻素合酶反应以形成大麻素的酸性形式。
9.如权利要求8所述的方法,其中所述异戊二烯基转移酶具有与天然CBGAS的活性相比合成能力提高并且副产物形成减少的活性。
10.如权利要求8所述的方法,其中所述异戊二烯基转移酶具有大于12μg/mL的CBGA的反应速率。
11.如权利要求8所述的方法,其中所述酸选自由以下组成的组:苔色酸(OSA)、丙基雷锁辛酸(DVA)和橄榄醇酸(OLA)、芹菜素、黄豆苷元、染料木素、柚皮素、橄榄醇、橄榄醇酸(OA)、白藜芦醇、丁酸、戊酸、己酸和庚酸。
12.如权利要求8-11中任一项所述的方法,其中所述酶与选自由SEQ ID NO:01-103、198-335组成的组的序列的全部或片段具有至少约80%、85%、90%或95%序列同一性;或所述酶由与SEQ ID No:104-197、336-583的全部或片段具有至少约80%、85%、90%或95%序列同一性的核苷酸序列表达。
13.一种工程化以生产CBGA的重组微生物,其中所述微生物过表达与选自由SEQ IDNO:01-103和198-335组成的组的序列的全部或片段具有至少约80%、85%、90%或95%序列同一性的酶。
14.一种工程化以生产CBGA的重组微生物,其中所述微生物包含至少一种异源核苷酸序列或其密码子简并核苷酸序列,所述异源核苷酸序列与选自由SEQ ID No:104-197、336-583组成的组的核酸序列的全部或片段具有至少约80%、85%、90%或95%序列同一性。
15.一种具有大麻萜酚酸合酶(CBGAS)活性的分离的多肽;其中所述多肽包含与选自由SEQ ID NO:01-103、198-335组成的组的氨基酸序列的全部或片段具有至少约80%、85%、90%或95%序列同一性的氨基酸序列;或
所述多肽由核苷酸序列表达,所述核苷酸序列与选自由SEQ ID NO:104-197和336-583组成的组的核苷酸序列的全部或片段具有至少约80%、85%、90%或95%序列同一性。
16.如权利要求15所述的分离的多肽,其中所述多肽在微生物宿主中表达,所述微生物宿主选自由以下组成的组:大肠杆菌、解脂耶氏酵母和酿酒酵母。
17.如权利要求15所述的分离的多肽,其中所述多肽在大麻属物种中表达。
18.一种用于生产CBGA的酶的用途,其中所述酶与选自由SEQ ID NO:01-103和198-335组成的组的序列的全部或片段具有至少约80%、85%、90%或95%序列同一性,或所述酶由与选自由SEQ ID No:104-197和336-583组成的组的全部或片段具有至少约80%、85%、90%或95%序列同一性的核苷酸序列表达。
19.一种重组多肽,所述重组多肽包含与SEQ ID NO:246具有至少95%同一性的氨基酸序列,其中所述氨基酸序列包含对保守氨基酸的至少一个氨基酸取代。
20.如权利要求19所述的重组多肽,其中所述至少一个氨基酸取代选自由以下组成的组:Y46W、Y46A、Y46L、Y46C、Y46D、Y46E、Y46F、Y46G、Y46H、Y46I、Y46K、Y46P、Y46M、Y46N、Y46Q、Y46R、Y46S、Y46T、Y46V、Q51G、Q51A、Q51C、Q51D、Q51E、Q51F、Q51G、Q51H、Q51I、Q51K、Q51L、Q51M、Q51N、Q51P、Q51R、Q51S、Q51T、Q51V、Q51W、Q51Y、L55V、L55F、L55A、L55Q、L55W、L66V、L66F、L66A、L66Q、L66W、G67L、G67M、G67E、R100E、R100Q、D115E、K186N、K186Q、K186A、K186D、Y188W、Y188A、Y188L、Y188C、Y188、Y188E、Y188F、Y188G、Y188H、Y188I、Y188K、Y188P、Y188M、Y188N、Y188Q、Y188R、Y188S、Y188T、Y188V、D256E、R264E、R264Q、V265L、V265S、V265E、V265A、V265F、V265N、Y268W、Y268A、Y268L、Y268C、Y268D、Y268E、Y268F、Y268G、Y268H、Y268I、Y268K、Y268P、Y268M、Y268N、Y268Q、Y268R、Y268S、Y268T、Y268V、L269V、L269F、L269A、L269Q、L269W、L285V、L285F、L285A、L285Q、L285W、G286L、G286M、G286E、G287L、G287M、G287E、R288E、R288Q、G313L、G313M、G313E、Y352W、Y352A、Y352L、Y352C、Y352D、Y352E、Y352F、Y352G、Y352H、Y352I、Y352K、Y352P、Y352M、Y352N、Y352Q、Y352R、Y352S、Y352T、Y352V、Y383W、Y383A、Y383L、Y383C、Y383D、Y383E、Y383F、Y383G、Y383H、Y383I、Y383K、Y383P、Y383M、Y383N、Y383Q、Y383R、Y383S、Y383T、Y383V、S407W、S407A、S407L、S407C、S407D、S407E、S407F、S407G、S407H、S407I、S407K、S407P、S407M、S407N、S407Q、S407R、S407S、S407T、S407V、Y420W、Y420A、Y420L、Y420C、Y420D、Y420E、Y420F、Y420G、Y420H、Y420I、Y420K、Y420P、Y420M、Y420N、Y420Q、Y420R、Y420S、Y420T和Y420V。
21.一种重组多肽,所述重组多肽包含与SEQ ID NO:232具有至少95%同一性的氨基酸序列,其中所述氨基酸序列包含对保守氨基酸的至少一个氨基酸取代。
22.如权利要求21所述的重组多肽,其中所述至少一个氨基酸取代选自由以下组成的组:Y24W、Y24A、Y24L、Y24C、Y24D、Y24E、Y24F、Y24G、Y24H、Y24I、Y24K、Y24P、Y24M、Y24N、Y24Q、Y24R、Y24S、Y24T、Y24V、Q29G、Q29A、Q29C、Q29D、Q29E、Q29F、Q29G、Q29H、Q29I、Q29K、Q29L、Q29M、Q29N、Q29P、Q29R、Q29S、Q29T、Q29V、Q29W、Q29Y、L33V、L33F、L33A、L33Q、L33W、L44V、L44F、L44A、L44Q、L44W、G45L、G45M、G45E、R81E、R81Q、D96E、K165N、K165Q、K165A、K165D、Y167W、Y167A、Y167L、Y167C、Y167D、Y167E、Y167F、Y167G、Y167H、Y167I、Y167K、Y167P、Y167M、Y167N、Y167Q、Y167R、Y167S、Y167T、Y167V、D255E、R236E、R236Q、V237L、V237S、V237E、V237A、V237F、V237N、Y239W、Y239A、Y239L、Y239C、Y239D、Y239E、Y239F、Y239G、Y239H、Y239I、Y239K、Y239P、Y239M、Y239N、Y239Q、Y239R、Y239S、Y239T、Y239V、L241V、L241F、L241A、L241Q、L241W、L254V、L254F、L254A、L254Q、L254W、G258L、G258M、G258E、G259L、G259M、G259E、R260E、R260Q、G286L、G286M、G286E、Y330W、Y330A、Y330L、Y330C、Y330D、Y330E、Y330F、Y330G、Y330H、Y330I、Y330K、Y330P、Y330M、Y330N、Y330Q、Y330R、Y330S、Y330T、Y330V、Y364W、Y364A、Y364L、Y364C、Y364D、Y364E、Y364F、Y364G、Y364H、Y364I、Y364K、Y364P、Y364M、Y364N、Y364Q、Y364R、Y364S、Y364T、Y364V、S384W、S384A、S384L、S384C、S384D、S384E、S384F、S384G、S384H、S384I、S384K、S384P、S384M、S384N、S384Q、S384R、S384S、S384T、S384V、Y398W、Y398A、Y398L、Y398C、Y398D、Y398E、Y398F、Y398G、Y398H、Y398I、Y398K、Y398P、Y398M、Y398N、Y398Q、Y398R、Y398S、Y398T和Y398V。
23.一种重组多肽,所述重组多肽包含与SEQ ID NO:198具有至少95%同一性的氨基酸序列,其中所述氨基酸序列包含至少一个氨基酸取代。
24.如权利要求23所述的重组多肽,其中所述至少一个氨基酸取代选自由以下组成的组:A17T_Q159W_A230S;A51T_M104E_Q159S;A51Q_S175W_L217F;L217F_V292N_Q235A;A51T_D164E_Q293W;V47A_Q159S_I292A;和A51Q_S175Y_Y286H。
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