KR101399945B1 - 토양 메타게놈 유래의 ｗｅｓ 유전자 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 토양 메타게놈 유래의 왁스 에스테르 (wax ester) 생성 또는 환경 스트레스 저항성 관련 WES (wax ester synthase) 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포, 상기 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 WES 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 식물의 왁스 에스테르 생성 또는 환경 스트레스 저항성을 증가시키는 방법, 상기 재조합 벡터를 이용한 왁스 에스테르 생성 또는 환경 스트레스 저항성이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 왁스 에스테르 생성 또는 환경 스트레스 저항성이 증가된 형질전환 식물체 및 이의 종자 및 토양 메타게놈 유래의 WES 유전자를 포함하는 왁스 에스테르 생성 또는 환경 스트레스 저항 증가용 조성물에 관한 것이다.

Description

토양 메타게놈 유래의 ＷＥＳ 유전자 및 이의 용도{WES gene from soil metagenome and uses thereof}

본 발명은 토양 메타게놈 유래의 WES 유전자 및 이의 용도에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 토양 메타게놈 유래의 왁스 에스테르 (wax ester) 생성 또는 환경 스트레스 저항성 관련 WES (wax ester synthase) 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포, 상기 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 WES 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 식물의 왁스 에스테르 생성 또는 환경 스트레스 저항성을 증가시키는 방법, 상기 재조합 벡터를 이용한 왁스 에스테르 생성 또는 환경 스트레스 저항성이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 왁스 에스테르 생성 또는 환경 스트레스 저항성이 증가된 형질전환 식물체 및 이의 종자 및 토양 메타게놈 유래의 WES 유전자를 포함하는 왁스 에스테르 생성 또는 환경 스트레스 저항 증가용 조성물에 관한 것이다.

지구상에서 미생물은 생태계의 구성요소의 하나로 토양, 해수 및 담수뿐만 아니라 동물의 장내를 비롯하여 심해저의 열수구, 고온의 온천수, 혹한의 남극, 고염분, 강산 및 강알카리성 환경에 이르기까지 어떤 환경에서도 존재한다. 그러나 다양한 환경에 존재하는 많은 미생물에 비해 대부분의 환경에서는 1% 미만의 미생물 종만이 배양 가능하고 미생물의 99% 이상이 배양이 되지 않는다는 사실이 알려지면서, 기존의 배양에 의존한 미생물 유래의 유전자원에 대한 연구의 한계를 극복하기 위해서 메타게놈이라는 환경유전체 연구가 도입되었다. 메타게놈은 환경 내에 존재하는 모든 미생물 군집의 총 게놈을 뜻하며, 메타게놈이라는 용어는 1998년 Jo Handelsman이 발표한 논문을 통해 가장 최초로 사용되었다 (Steele et al., 2005 FEMS. Microbiol. Lett. 247:105-111). 메타게놈을 연구하는 가장 일반적인 방법은 특정 환경 시료에서 배양이 되지 않는 미생물을 포함한 다양한 미생물 군집들의 DNA를 직접 추출하여 메타게놈 라이브러리를 제작하고 (Lim et al., 2005. Appl. Environ. Microbiol. 71:7768-7777), 제작된 라이브러리를 이용하여 기능적 분석 및 염기서열의 유사성 분석을 기초로 새로운 유전자를 획득한다. 이러한 방법으로 메타게놈 라이브러리로부터 다양한 유용 유전자 탐색이 가능하게 된 것이다.

한편, 왁스 에스테르 (wax ester)는 탄소사슬이 긴 지방산 및 지방 알코올의 에스터 결합으로 구성되어있다. 왁스 에스테르는 자연에서 널리 존재하여 식물, 동물 및 미생물에서 쉽게 찾아볼 수 있고, 생물학적으로 유용한 기능을 가지고 있다. 그 예로 식물의 큐티클층은 왁스 에스테르로 구성되어 수분 손실을 조절하고, UV로부터 식물체를 보호하며, 먼지, 꽃가루 및 병원균의 포자의 퇴적을 최소화시킨다. 또한 식물체와 곤충의 상호작용에 대한 매개뿐만 아니라 세균과 곰팡이 병원균과의 상호작용에 대해 다양한 매개 역할을 한다. 식물체에서 왁스 에스테르의 함량은 종마다 차이를 나타낸다. 예를 들면, 애기장대의 잎 및 줄기의 큐티클층에서의 왁스 에스테르의 함량은 0.1~0.2% 및 0.7~2.9%이지만, 카나우바 야자는 약 85%의 왁스 에스테르를 잎에 축적하고 있다. 호호바 열매 또한 종자에 대략 97%의 왁스 에스테르를 함유하고 있으며, 그 외 향유고래의 향유기름에도 왁스 에스테르가 존재하여 고래의 부력을 조절하거나 음파 전달의 기능을 가지며, 몇몇 미생물에서의 왁스 에스테르는 탄소에너지 저장기능을 담당한다 (Ishige et al., 2003 Curr. Opin. Microbiol. 6:244-250).

현재 왁스 에스테르는 보습 및 세안제에 사용되는 화장품 산업에 중요한 역할을 하며, 페니실린 제조과정 중 발생하는 거품을 제거하는 등 제약정제 과정에서 중요한 역할을 한다. 또한 왁스 에스테르는 윤활유 및 가소제 등의 역할을 하며 상업적으로 경제적 가치가 있다. 왁스 에스테르를 과거에는 고래를 포획하여 얻었지만 국제적으로 고래 포획이 금지되면서 식물을 이용하여 원료를 공급받고 있다. 그러나 식물체에서 추출되는 양이 제한적이고 가격이 비싸기 때문에 이를 극복하기 위해 화학적 및 생물공학적 공정방법을 통해 생산되고 있으나, 생물공학적 공정방법에는 지방 알코올과 같은 기질에 의존하는 단점이 있어 화학적 합성방법에 의해 왁스 에스테르가 생산되고 있는 실정이다. 여러 산업분야에서 사용되고 있는 왁스 에스테르의 원료 공급의 어려움을 보완하기 위해 미생물 및 식물체에서 왁스 에스테르가 대량 생산될 수 있다면 경제적으로 많은 이익이 창출될 것이라고 여겨진다.

한편, 식물 병원균, 한발, 고농도의 염, 저온, 가뭄 및 고온과 같은 다양한 환경 스트레스는 식물의 성장을 저해하는 요소 중 하나로 작용한다. 식물은 환경 스트레스에 노출되게 되면, 식물 병 발생, 세포 내 삼투압 또는 이온 불균형이 발생하게 되어 식물의 생장 및 광합성이 저해되게 된다. 또한, 식물의 성장을 저해하는 환경 스트레스 있어서 가장 가혹한 스트레스는 탈수, 고염, 가뭄 및 추위 등 다양한 외부 조건에 의해서 야기되는 삼투 스트레스 (osmotic stress)이다. 삼투 스트레스에 대한 저항성이 약간만 증가하여도 농업 생산성과 수율에 막대한 영향을 미칠 수 있기 때문에, 삼투 스트레스에 대한 조절 기작과 이에 관련된 조절 인자에 대해 많은 연구가 진행되어 왔다. 최근 연구들은 식물이 삼투 스트레스에 대한 적응 반응의 일부로 정밀한 기작을 가지고 있으며, 이러한 삼투 스트레스에 적응하기 위한 기작을 이해하기 위해 특정한 스트레스에 의해 발현이 유도되는 유전자들이 분리되었고, 그 특성이 광범위하게 연구되고 있다.

한국특허등록 제10-1077938호에는 식물 세포벽의 큐티클 왁스의 적재량을 조절하는 방법 및 그에 따른 식물체가 개시되어 있으며, 한국특허등록 제10-0796164호에는 고추의 세포막 수용체 유사 단백질을 코딩하는 씨에이엠알피１ (CaMRP1) 유전자 및 이를 이용한 환경 스트레스 저항성 형질전환 식물체가 개시되어 있으나, 본 발명의 토양 메타게놈 유래의 WES 유전자 및 이의 용도에 대해서는 밝혀진 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서, 본 발명자들은 토양 메타게놈 유래의 WES ( wax ester synthase ) 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 담배 및 애기장대 식물체에서 왁스 에스테르 생성이 증가되었고, 환경 스트레스 저항성이 증진되는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 토양 메타게놈 유래의 왁스 에스테르 (wax ester) 생성 또는 환경 스트레스 저항성 관련 WES (wax ester synthase) 단백질을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 WES 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 식물의 왁스 에스테르 생성을 증가시키는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계 및 상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 왁스 에스테르 생성이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 왁스 에스테르 생성이 증가된 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진, 토양 메타게놈 유래의 WES 유전자를 포함하는 왁스 에스테르 생성 증가용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 WES 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 식물의 환경 스트레스 저항성을 증진시키는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계 및 상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 환경 스트레스 저항성이 증진된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 환경 스트레스 저항성이 증진된 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진, 토양 메타게놈 유래의 WES 유전자를 포함하는 식물의 환경 스트레스 저항 증진용 조성물을 제공한다.

본 발명의 토양 메타게놈 유래의 WES 유전자를 과발현시킨 형질전환체를 이용하면 왁스 에스테르 대량생산이 가능하므로 화장품 산업뿐만 아니라 식품산업 및 제약산업 등에서 상업적으로 경제적 이익이 창출될 수 있고, 또한 WES 유전자를 과발현시킨 형질전환 식물체는 환경 스트레스 저항성을 증가시키는 효과가 있으므로 척박한 자연 환경에서도 재배환경을 극복하고, 수확량을 크게 증대시킬 수 있어 농업 및 식물종자산업의 발전에 유용하게 이용될 수 있을 것이다.

도 1은 임의로 선발한 메타게놈 클론을 BamHI를 사용하여 반응시킨 후, 0.7% 아가로스 겔에 전기영동한 결과이다 (M: λ DNA/HindⅢ, 1 ~ 12 : 메타게놈 클론).
도 2는 본 발명의 메타게놈 유래의 WES 유전자가 삽입된 벡터의 도식을 나타낸다. (A) WES 유전자가 삽입된 벡터 pULP120W의 제한효소 지도를 나타낸다. (B) WES 유전자가 삽입된 벡터 pET-WES의 제한효소 지도를 나타낸다. (C) WES 유전자가 클로닝된 식물발현벡터 pCAMBIA-WS의 지도를 나타낸다.
도 3은 아시네토박터 배일리(Acinetobacter baylyi)의 ADP1, 애기장대의 WES 및 본원 발명의 토양 메타게놈 유래의 WES의 아미노산 서열을 정렬한 결과를 나타낸다. 박스로 표시된 부분은 보존된 HHXXXDG인 아실-트랜스페라제 (Acyl-transferase) 촉매 도메인에 해당한다.
도 4는 대장균 BL21 (DE3) pLysS에서 IPTG (isopropyl β-D-1-thiogalactopyrano side)로 유도 발현된 WES-His 융합 단백질의 SDS-PAGE 분석을 나타낸다. (A) WES의 과발현을 나타낸다 (M : 단백질 크기 스탠다드, 1 : 유도되지 않은 WES 단백질, 2 : 시간별로 유도된 WES 단백질). (B) WES의 His-taq 친화성으로 정제된 것을 나타낸다 (M : 단백질 크기 스탠다드, 1 ~ 5 : 분리된 융합 단백질). 작은 크기의 단백질은 정제과정 중에 C-말단이 잘려진 WES 단백질이다.
도 5는 대장균에서 벡터 pULP120W를 발현시켜 GC (Gas chromatography) 분석을 수행한 결과를 나타낸다. (A) 양성 대조구, 팔미틸 팔미테이트 (palmityl palmitate) ; (B) 음성 대조구, pUC119 ; (C) pULP120W 형질전환 대장균의 추출물.
도 6은 GC-MS를 이용한 왁스 에스테르 동정을 나타낸다. (A) 양성 대조구, 팔미틸 팔미테이트 (palmityl palmitate) ; (B) 음성 대조구, pUC119 ; (C) pULP120W 형질전환 대장균의 추출물 (1 ~ 5 : MS (Mass spectroscopy)로 분석한 선택된 피크).
도 7은 GC-MS를 이용하여 다양한 탄소사슬을 갖는 왁스 에스테르 동정을 나타낸다 (1 : 팔미틸 라우레이트 (palmityl laurate, C₂₈H₅₆O₂), 2 : 팔미틸 미리스테이트 (palmityl myristate, C₃₀H₆₀O₂), 3 : 팔미틸 팔미테이트 (palmityl palmitate, C₃₂H₈₄O₂), 4 : 팔미틸 시스-10-햅타데세노에이트 (palmityl cis-10-heptadecenoate, C₃₃H₃₃O₂), 5 : 팔미틸 올레이트 (palmityl oleate, C₃₄H₅₅O₂)).
도 8은 C-말단 제거 WES 유전자가 삽입된 pUCWES 형질전환 대장균 추출물 GC 분석을 나타낸다. (A) 스탠다드 팔미틸 팔미테이트, (B) WES 유전자가 삽입된 pULP120W로 형질전환된 대장균의 추출물의 GC 분석은 팔미틸 팔미테이트에 대한 비슷한 보유 시간(retention time)을 나타낸다 (33.5분, 37.3분, 39.1분 및 40.8분). (C) C-말단 제거 WES 유전자가 삽입된 pUCWES의 GC 분석은 (B)와 비슷한 보유시간을 나타내지만, 긴 보유시간을 갖는 피크가 나타나지 않았다.
도 9는 담배에서 (A) GFP 및 (B) WES-GFP 융합 단백질 발현의 세포내 위치를 나타낸다. 표피세포는 공초점 레이저 주사 형광 현미경 (Carl Zeiss LSM510 laser confocal)으로 관찰하였다.
도 10은 RT-PCR 결과, 5개의 담배 형질전환 식물체 (TW5, TW8, TW13, TW29-2 및 TW40)에서 WES 유전자의 발현을 나타낸다.
도 11은 GC 분석을 통해 형질전환 담배(T₁) 종자에서 왁스 에스테르의 생성을 나타낸다. (A) 대조구는 야생형 담배를 이용하였다. 34분에 피크가 관찰되지 않았다. (B) TW 5 (C) TW 8 및 (D) TW 13은 팔미틸 팔미테이트와 비슷한 37.4분의 보유 시간을 갖는 특정한 화합물이 존재함을 나타낸다.
도 12는 RT-PCR을 이용하여 애기장대 형질전환 식물체에서 WES 유전자의 발현을 나타낸다. 2개의 식물체 라인 11 및 50은 T₂ 식물체이고, WT는 야생형 애기장대 (Columbia)이다. 대조구로 액틴 프라이머가 PCR에 사용되었다. 6개의 형질전환 식물체에서 WES 유전자가 발현됨을 나타낸다.
도 13은 형질전환 애기장대 식물체에서 왁스 에스테르의 GC 분석을 나타낸다. WT는 야생형 애기장대 (Columbia)이다. 형질전환 식물 라인 11-13, 11-14, 50-6 및 50-7은 왁스 에스테르와 비슷한 보유 시간을 갖는 특정한 화합물이 존재함을 나타내며, WT에는 존재하지 않았다.
도 14는 WES 과발현 형질전환 애기장대 식물체에서 가뭄 스트레스 저항성을 검정한 결과를 나타낸다. 2주 동안 물을 주지 않은 야생형 애기장대 (Columbia) 식물체는 생존하지 못했다. 반면에, 4개의 WES 과발현 형질전환 애기장대 식물체 라인은 심한 건조에도 불구하고 생존했다. (A) 및 (B)는 다른 형질전환 식물체 라인으로 2번의 독립적인 실험을 하였다.
도 15는 WES 과발현 형질전환 애기장대 식물체의 잎에서 수분 함량의 변화를 나타낸다. WT는 야생형 애기장대 (Columbia)이다. 4개의 형질전환 식물체 라인 11-4, 13-4, 13-5 및 50-6이 조사되었다.
도 16은 WES 과발현 형질전환 애기장대 식물체에서 삼투 스트레스 저항성을 검정한 결과를 나타낸다. (A) MS 고체 배지 (대조구) 및 만니톨 200mM 첨가된 MS 고체 배지에서 야생형 애기장대 (Columbia) 및 형질전환 애기장대 종자 발아의 뿌리 형태를 나타낸다. (B) 식물체의 총 뿌리 길이 (㎝) 및 무게 (g)를 나타낸다. 야생형 및 형질전환 애기장대 종자 발아는 (A)에서 보여주는 MS 고체 배지 및 만니톨 200mM 첨가된 MS 고체 배지에서 형성된 것이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 토양 메타게놈 유래의 왁스 에스테르 (wax ester) 생성 또는 환경 스트레스 저항성을 증진시키는 WES (wax ester synthase) 단백질을 제공한다.

본 발명에 따른 WES 단백질의 범위는 토양 메타게놈으로부터 분리된 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 왁스 에스테르 (wax ester) 생성 또는 환경 스트레스 저항성을 의미한다.

본 발명은 또한 WES 단백질의 단편, 유도체 및 유사체 (analogues)를 포함한다. 본원에 사용된, 용어 "단편", "유도체" 및 "유사체"는 본 발명의 WES 폴리펩티드와 실질적으로 같은 생물학적 기능 또는 활성을 보유하는 폴리펩티드를 말한다. 본 발명의 단편, 유도체 및 유사체는 (i) 하나 이상의 보존적(conservative) 또는 비보존적 아미노산 잔기(바람직하게는 보존적 아미노산 잔기)가 치환된 폴리펩티드(상기 치환된 아미노산 잔기는 유전암호에 의해 암호화될 수도, 되지 않을 수도 있다) 또는 (ii) 하나 이상의 아미노산 잔기에서 치환기(들)를 가지는 폴리펩티드, 또는 (iii) 또 다른 화합물(폴리펩티드의 반감기를 연장할 수 있는 화합물, 예를 들면 폴리에틸렌 글리콜)과 결합된 성숙 폴리펩티드로부터 유래된 폴리펩티드, 또는 (iv) 부가적인 아미노산 서열(예를 들면, 선도 서열, 분비 서열, 상기 폴리펩티드를 정제하는데 사용된 서열, 프로테이노젠(proteinogen) 서열 또는 융합 단백질)과 결합된 상기 폴리펩티드로부터 유래된 폴리펩티드일 수 있다. 본원에 정의된 상기 단편, 유도체 및 유사체는 당업자에 잘 알려져 있다.

서열번호 2로 표시되는 성숙(mature) 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 오직 성숙 폴리펩티드만을 암호화하는 코딩 서열; 성숙 폴리펩티드 및 다양한 부가적인 코딩 서열을 암호화하는 서열; 성숙 폴리펩티드(및 임의의 부가적인 코딩 서열) 및 넌코딩 서열을 암호화하는 서열을 포함한다.

용어 "폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드"는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 또는 부가적인 코딩 및/또는 넌코딩 서열을 더 포함하는 폴리뉴클레오티드를 말한다.

또한, 본 발명은 본원에 기재된 것과 동일한 아미노산 서열, 또는 이의 단편, 유사체, 및 유도체를 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 상기 폴리뉴클레오티드의 변이체에 관한 것이다. 폴리뉴클레오티드 변이체는 자연적으로 발생하는 대립유전자 변이체 또는 비자연적으로 발생하는 변이체일 수 있다. 상기 뉴클레오티드 변이체는 치환 변이체, 결실 변이체, 및 삽입 변이체를 포함한다. 당업계에 공지된 바와 같이, 대립유전자 변이체는 폴리뉴클레오티드의 대안(alternative)이며, 이는 하나 이상의 치환, 결실 또는 삽입된 뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 변이체에 의해 암호화된 폴리펩티드에서 실질적인 기능 변화를 초래하지는 않는다.

또한, 본 발명은 상기 WES 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다. 본 발명의 유전자는 WES 단백질을 코딩하는 DNA 또는 RNA 일 수 있다. DNA는 cDNA, 게놈 DNA 또는 인위적인 합성 DNA를 포함한다. DNA는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. DNA는 코딩 (coding) 가닥 또는 넌코딩 (non-coding) 가닥일 수 있다.

바람직하게는, 본 발명의 상기 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 염기 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 기재된 서열번호 1의 염기서열과 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 70%, 더욱 바람직하게는 적어도 80%의 동일성을 가지는 서열과 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 발명은 특히, 스트린전트 조건하에 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 발명에서, "스트린전트 조건"은 (1) 0.2 × SSC, 0.1% SDS, 60℃와 같은 더 낮은 이온강도 및 더 높은 온도하에서의 혼성화 및 세척; 또는 (2) 50%(v/v) 포름아미드, 0.1% 소혈청/0.1% Ficoll 및 42℃ 등과 같은 변성제의 존재하에 혼성화; 또는 (3) 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 동일성을 가지는 단지 2개의 서열 사이에서 발생하는 혼성화를 말한다. 게다가, 혼성화가 가능한 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드의 생물학적 기능 및 활성은 서열번호 2 표시되는 성숙 폴리펩티드의 생물학적 기능 및 활성과 동일하다.

본 발명의 구현예에 따라, WES 유전자는 바람직하게는 토양 메타게놈 유래라는 것을 이해해야 한다. 그러나, 본 발명의 구현예는 토양 메타게놈 유래의 WES 유전자와 높은 상동성(예를 들면, 60% 이상, 즉 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 심지어 98%의 서열 동일성)을 갖고 다른 식물로부터 유래한 다른 유전자를 또한 포함한다. 서열정렬 방법, 및 서열 동일성 또는 상동성을 결정하기 위한 수단(예를 들면, BLAST)은 당업계에 주지되어 있다.

본 발명은 또한, 상기 WES 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로써 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

본 발명의 재조합 식물 발현 벡터는 외래 유전자를 도입한 식물체 내에서 일시적으로 발현시킬 수 있는 일시적 (transient) 발현 벡터 및 외래 유전자를 도입된 식물체에서 영구적으로 발현시킬 수 있는 식물 발현 벡터로 사용할 수 있다.

본 발명에 이용될 수 있는 바이너리 벡터는 A. tumefaciens의 Ti 플라스미드와 함께 존재 시 식물체를 형질전환시킬 수 있는 T-DNA의 RB (right border)과 LB (left border)을 함유하는 어떤 바이너리 벡터도 될 수 있으나, 바람직하게는 당업계에서 자주 사용되는 pBI101(Cat#: 6018-1, Clontech, 미국), pBIN19(Genbank 수탁번호 U09365), pBI121, pCAMBIA 벡터 등을 사용하는 것이 좋다.

용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.

식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리 벡터이다. 본 발명에 따른 유전자를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환 하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.

발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함한다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신, 엠피실린(Ampicillin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 식물 발현 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 식물 발현 벡터에서, 터미네이터는 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 상기 WES 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 WES 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 식물의 왁스 에스테르 생성을 증가시키는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및 상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 왁스 에스테르 생성이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 방법은 본 발명에 따른 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계를 포함하는데, 상기 형질전환은 예를 들면, 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefiaciens)에 의해 매개될 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함한다. 형질전환 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.

형질전환된 식물세포는 전식물로 재분화되어야 한다. 캘러스 또는 원형질체 배양으로부터 성숙한 식물의 재분화를 위한 기술은 수많은 여러 가지 종에 대해서 당업계에 주지되어 있다 (Handbook of Plant Cell Culture, 1-5권, 1983-1989 Momillan, N.Y.).

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 왁스 에스테르 생성이 증가된 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다.

본 발명에 따른 방법이 적용될 수 있는 식물체로는 단자엽 식물 또는 쌍자엽 식물이 포함된다. 상기 단자엽 식물의 예로는 벼, 밀, 보리, 죽순, 옥수수, 토란, 아스파라거스, 양파, 마늘, 파, 부추, 달래, 마 및 생강이 있으나, 이에 제한되지 않는다. 쌍자엽 식물의 예로는 애기장대, 담배, 가지, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갯무, 수박, 참외, 오이 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩 및 완두가 있고, 바람직하게는 애기장대 또는 담배이나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진, WES 유전자를 포함하는 왁스 에스테르 생성 증가용 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 유효성분으로 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 WES 유전자를 포함하며, 상기 유전자를 식물체에 형질전환시킴으로써 식물체의 왁스 에스테르를 증가시킬 수 있는 것이다.

또한, 본 발명은 상기 WES 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 WES 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 식물의 환경 스트레스 저항성을 증진시키는 방법을 제공한다.

본 발명에서 "환경 스트레스"란 식물체의 성장 또는 생산성을 저하시키는 외부적인 요인을 말하며 크게 생물학적 스트레스 (biotic stress)와 비생물학적 스트레스 (abiotic stress)로 대별된다. 생물학적 스트레스로는 대표적으로 병원균을 들 수 있으며, 비생물학적 스트레스로는 고농도의 염, 가뭄, 저온, 고온 및 산화 스트레스 등이 포함된다. "환경 스트레스 저항성"이란 상기와 같은 환경 스트레스에 의한 식물체의 성장 저하 또는 생산성의 저하가 억제되거나 지연되는 형질을 말한다.

본 발명의 일 구현예에 따른 방법에서, 상기 환경 스트레스는 가뭄 또는 삼투 스트레스일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및 상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 환경 스트레스 저항성이 증진된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 따른 방법에서, 상기 환경 스트레스는 가뭄 또는 삼투 스트레스일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 환경 스트레스 저항성이 증진된 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다. 본 발명에 따른 방법이 적용될 수 있는 식물체로는 단자엽 식물 또는 쌍자엽 식물이 포함된다. 바람직한 단자엽 식물 또는 쌍자엽 식물의 예는 상기 기술한 바와 같고, 가장 바람직하게는 애기장대이나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진, WES 유전자를 포함하는 식물의 환경 스트레스 저항 증진용 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 유효성분으로 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 WES 유전자를 포함하며, 상기 유전자를 식물체에 형질전환시킴으로써 식물체의 환경 스트레스 저항성을 증가시킬 수 있는 것이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 토양 메타게놈 DNA 분리

메타게놈 라이브러리 구축을 위한 토양 시료는 부산시 사하구 을숙도의 쓰레기 매립토양 및 부산시 사하구 엄궁동 사상공단 감천수로에서 각각 2007년 4월 및 2008년 12월에 채취하여 사용하였다. 채취한 토양은 메타게놈 DNA를 추출하기 위해서 사용하였고, 남은 토양은 추가적인 실험을 위해서 -80℃에 보관하였다. 상기 채취한 토양은 구멍의 직경이 2㎜인 채로 걸러서 큰 크기의 식물 잔재 및 돌을 제거하여 사용하였고, 걸러진 토양들은 SDS 및 프로티나아제 K (proteinase K)를 이용한 화학적인 미생물 용균방법을 사용하여 DNA를 추출하였다. 추출된 DNA 크기의 분석은 0.5% 아가로스 겔에 전기영동 (Mupid-EX, 50V, 35분)을 통해서 수행하였다.

실시예 2 : 메타게놈 라이브러리의 제작

상기 실시예 1에서 추출된 토양 메타게놈 DNA 라이브러리(1㎍)는 1% 저융점 아가로스 겔 (low melting point agarose gel)에서 전기영동 (Mupid-EX, 50V, 60분)한 후, GeLase (Epicentre, USA)를 이용하여 겔에서 25kb 이상의 DNA를 분리하였고, 양 말단 보수를 통해서 블런트 (blunt) 말단을 갖도록 하였다. 말단이 보수된 메타게놈 DNA를 사용하여 pCC1FOS 벡터에 라이게이션 (ligation)을 실시한 후, MaxPlax lambda packaging extracts (Epicentre, Madison, WI, USA)를 이용하여 대장균 EPI-300에 도입하였고 형질전환체를 선발하였다. 메타게놈 라이브러리 클론은 튜브에 500 ~ 1,000 클론을 풀 (pool) 단위로 -80℃ 냉동고에 저장하였다. 각 라이브러리 풀에서 임의로 40개의 클론을 선발하여 제한 효소 BamHI으로 반응시킨 후, 제작된 메타게놈 라이브러리의 다형성 및 삽입 DNA 크기를 확인하였다. 그 결과, 라이브러리 클론이 서로 다른 크기의 삽입 DNA를 가지는 것을 확인하였고 평균적인 크기는 약 35kb 이상으로 나타났다. 이 결과를 통해 삽입된 DNA로 라이브러리의 작성이 성공적임을 확인하였다 (도 1).

실시예 3 : WES ( wax ester synthase ) 유전자 동정

왁스 에스테르 합성 효소의 탐색을 위하여, 이미 제작된 라이브러리를 희석 완충용액 (diluent buffer)으로 10^-5까지 희석하였고, 1%의 트리뷰티린 (tributyrin)이 첨가된 LB 고체배지에 클론의 수가 500 ~ 1,000개 정도 자라도록 도말하였다. 3 ~ 4일간 37℃에 배양하며 트리뷰티린을 분해하여 투명환 (clear zone)이 보이는 대장균 클론을 선발하였다.

선발된 클론 중 트리뷰티린 분해 능력이 좋은 클론인 pELP120의 WES ( wax ester synthase ) 유전자 서브클로닝을 위하여 포스미드 (fosmid) 클론을 분리하고, 2차 라이브러리를 작성하였다. 먼저, pELP120 클론의 플라스미드 DNA를 PstI으로 무작위 절단하였고, 동일한 제한효소로 자른 pUC119 벡터에 라이게이션 (ligation) 하여 2차 라이브러리를 작성하였다. 이를 다시 대장균 DH5a에 형질전환하여 트리뷰트린 및 엠피실린 (ampicillin)이 포함된 LB 고체배지에서 다시 투명환을 형성하는 형질전환체를 선발하였다. 선발된 형질전환 클론을 ULP120P로 명명하였고 삽입된 DNA의 염기서열을 분석하였다. 상기 염기서열 분석을 통해 DNA 지도를 제작하였고 그 결과, 리파제 (lipase)의 업스트림 (upstream)에 존재하는 WES 유전자의 ORF (open reading flame)를 확인하였다. WES 유전자만 삽입된 클론을 제작하기 위해 WES 유전자 내의 염기서열을 자르지 않는 제한효소인 HindⅢ를 사용하여 pULP120P에서 WES의 ORF를 획득하였고, 동일한 제한효소로 pUC119를 자른 후에 라이게이션 (ligation)하였다. 이후 무작위로 클론을 선발하였고, 유전자 지도를 통하여 특정 제한효소를 처리하였을 때 보이는 DNA 절단양상으로 WES 유전자의 존재 여부를 판단하였다. WES 유전자가 pUC119에 클로닝된 플라스미드를 pULP120W로 명명하였다 (도 2A).

왁스합성 유전자의 예측된 분자량은 64,800Da였고, ORF가 암호화하는 단백질의 아미노산 수는 552개였다. 이미 왁스 합성 효소를 생산한다고 알려진 아시네토박터 배일리 (Acinetobacter baylyi) ADP1 (WS/DGAT), 마리노박터 히드로카보노클라스티커스 ( Marinobacter hydrocarbonoclasticus)의 WES와는 30%, 아시네토박터 바우만니 (Acinetobacter baumannii)의 WES와는 28%, 그리고 애기장대 (abidopsis thaliana)의 WES와는 22%의 낮은 상동성을 나타냈다. 그 중에서, 아시네토박터 배일리의 ADP1, 애기장대의 WES 및 본원 발명의 토양 메타게놈 유래의 WES의 아미노산 서열을 정렬한 결과, 대부분의 왁스 에스테르 합성 효소들이 공통적으로 가지고 있는 HHXXXDG 영역인 아실-트랜스페라제 (Acyl-transferase) 촉매 도메인을 가지고 있는 것을 확인하였다 (도 3).

실시예 4 : WES ( Wax ester Synthase ) 유전자 과발현 및 단백질 분리

WES 유전자를 히스티딘 태깅 (histidine tagging) 단백질 과발현 벡터인 pET-30b(+) (NOVAGEN, Germany)에 클로닝하기 위해서 플라스미드 pULP120W를 주형 DNA로 사용하여 WESNcoI F 프라이머 (5'-GCCACTGACGCCATGGCCATGGAGCAGC-3' : 서열번호 3) 및 WESHindⅢ R 프라이머 (5'-GGTGATCAAGCTTCTCATCCGCGCCT-3': 서열번호 4)로 WES 유전자를 증폭하였다. PCR에 이용된 프라이머는 (주)코스모진텍 (Seoul, Korea)에서 합성되었다. PCR은 2×GC 완충액, dNTPs (200μM) 및 LA Taq DNA polymerase (Takara Korea Biomedical Inc.)을 이용하였고, 반응 조건은 95℃ 5분; 95℃ 1분, 60℃ 1분, 72℃ 1분 40초의 30 사이클; 마지막 신장단계는 72℃ 7분이다. PCR 산물은 pGEM-T Easy 벡터(pGEM-T Easy vector system, Promega)에 삽입한 후, (주)코스모진텍(Seoul, Korea)에 의뢰하여 삽입 유전자 염기서열을 확인하였다. 확인한 WES 유전자가 삽입된 pGEM-T Easy 벡터 및 pET-30b(+) 벡터를 NcoI/HindⅢ 제한효소로 절단하여 전기영동한 후, 각각 약 1.7kb, 및 5.4kb의 DNA를 겔 추출 (gel extraction)하여 라이게이션하였다. 이렇게 만들어진 재조합 플라스미드를 pET-WES로 명명하고 (도 2B), 호스트 균주인 대장균 BL21(DE3) pLysS에 형질전환시켜 발현되는 단백질을 WES-his로 명명하였다. pET-WES가 형질전환된 대장균을 클로람페니콜 (chloramphenicol, 50㎍/㎖) 및 카나마이신 (kanamycin, 50㎍/㎖)이 첨가된 LB 고체배지에서 배양하여 무작위로 선발하였고, NcoI/HindⅢ 제한 효소를 처리한 후에 전기영동하여 확인하였다. 그 후 (주)코스모진텍 (Seoul, Korea)에 의뢰하여 염기서열이 확인된 형질전환체를 선발하였다.

WES-his 융합단백질을 과발현하기 위해 선발된 상기 형질전환체를 항생제가 포함된 LB 액체 배지에 37℃로 배양한 후에 다음날 새로운 LB 액체 배지에 균을 접종하여 OD₆₀₀값이 0.6이 될 때까지 배양하였다. 또한 단백질 과발현을 유도하기 위해 1mM의 IPTG (isopropyl β-D-1-thiogalactopyrano side)를 첨가한 후, 18℃에서 시간별 (0시간, 1시간, 2시간, 3시간 및 4시간)로 단백질 발현을 확인하였다. 단백질 발현은 12% SDS-PAGE (sodium dode cyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)를 통해 확인하였다. 발현이 확인된 WES 단백질을 순수분리하기 위해 FPLC (fast protein liquid chromatography)를 실시하였고, 단백질 동정 분석은 (주)제노마인 (genomine Corp. pohang, Korea)에 의뢰하였다. 확인 결과, WES 유전자가 형질전환된 대장균에서 약 66kDa의 단백질이 관찰되었다 (도 4A). 그러나 FPLC를 통한 단백질 순수 분리 과정에서 약 66 kDa의 단백질 외에 약 58kDa정도의 단백질이 추가로 관찰되었다 (도 4B). 상기 두 개의 단백질을 제노마인에서 분석 한 결과, 두 개의 단백질은 같은 단백질이나 분자량이 작은 58kDa의 단백질은 C-말단의 일부가 소실된 단백질임을 확인하였다. 염기서열이 확인된 C-말단이 제거된 WES 유전자가 삽입된 벡터에 BamHI/Hind 제한효소 (Takara Korea Biomedical Inc.)를 처리하여 다시 유전자를 pUC119 벡터에 삽입하였고, 획득한 재조합 플라스미드를 pUCWES이라 명명하고, 대장균 DH5a에 형질전환시켜 이후의 실험 및 분석에도 이용하였다.

실시예 5 : 기체 크로마토그래피 ( Gas chromatography , GC ) 분석을 통한 대장균에서의 왁스 에스테르 생성 유무 확인

메타게놈 유래의 WES 유전자가 형질전환된 대장균에서의 왁스 에스테르 생성 유무를 확인하기 위해 대장균이 생성한 물질을 추출하고, 기체 크로마토그래피 (Gas chromatography, GC) 분석을 수행하였다. 먼저 재조합 플라스미드인 pULP120W 및 pUCWES가 형질전환된 대장균을 100㎖의 M9 액체 배지에 엠피실린 (ampicillin, 100㎍/㎖) 및 10mM의 1-헥사데카놀 (1-hexadecanol)을 첨가하여 (Kalscheuer et al., 2003 J. Biol. Chem. 278:8075-8082), 37℃에서 48시간 동안 진탕배양 하였다. 대장균이 접종된 배양액을 취하여 음파처리 (sonication) 40초 작동 및 20초 중지를 번갈아가며 수행하였고, 총 10분간 실시하였다. 그 후 동일한 양의 에틸 아세테이트 (ethyl acetate)로 배양액을 추출하여 감압농축하고 클로로포름 (chloroform) 5㎖에 녹여 막여과 (membrane filtration, 0.2㎛) 한 후, 질소가스로 얼려 냉장보관 하였다.

상기 추출한 추출물을 클로로포름 500㎕로 녹여 그 중 200㎕를 GC 분석에 이용하였다. GC 분석시 주입량은 2㎕이며 GC 분석 조건은 초기에 50℃에서 2분간 유지하고 분당 40℃씩 200℃까지 증가시켜 2분간 유지하였고, 다시 분당 3℃씩 증가시켜 310℃까지 올려 30분간 유지하였다. 300℃에서 시료를 주입하였고 (Kunst, 2008 Plant Physiol. Preview. 148:97-107), 불꽃 이온화 검출기 (flame ionization detector) 및 길이 30m, 직경 0.32㎜의 HP-5 컬럼 (column)이 장착된 GC 시스템 (Agilent Technologies 7890A)을 사용하였다. GC 분석시 왁스 에스테르의 화학적 대조구로 팔미틸 팔미테이트 (palmityl palmitate, Sigma-Aldrich Co.)가 사용되었으며, 시료와 동일한 용매에 희석하여 사용하였다. 또한 대장균의 대조구로는 pUC119 벡터만 삽입되어있는 대장균 DH5a 균주의 추출물을 이용하였다. 그 후에, GC 분석을 통해 왁스 에스테르로 보이는 특정한 피크를 확인한 후, GC-MS를 통해 여러 종류의 왁스 에스테르를 동정하였다. GC-MS (Shimadzu QP5050A)를 사용하여 DB-5 컬럼 (column), 주입 온도 310℃ 및 인터페이스 온도 150℃로 분석하였으며, 초기 컬럼 온도는 40℃로 1분간 유지하고 분당 40℃씩 200℃까지 높여 2분간 유지하였다. 그 후 분당 4℃씩 305℃까지 증가시켜 11분간 반응시켰다. 이후 각 피크들의 질량 분석을 통한 왁스 에스테르의 동정은 한국화학연구원에 의뢰하여 수행되었다.

분석 결과, WES 유전자가 형질전환된 대장균에서 pUC119 벡터만 가지고 있는 대장균과 달리 보유시간 (retention time) 30분 및 40분대에서 독특한 물질이 합성됨을 확인하였다. 이는 화학적 대조구인 팔미틸 팔미테이트와 동일한 보유시간에서 피크가 보였으므로 WES 유전자를 가진 대장균에서 왁스 에스테르가 생성됨을 확인할 수 있었다 (도 5). 또한 GC 분석을 통해 왁스 에스테르 생성이 확인된 형질전환 대장균의 추출물의 왁스 에스테르의 동정을 위해 GC/MS 분석을 한 결과, 팔미틸 라우레이트 (C₂₈), 팔미틸 미리스테이트 (C₃₀), 팔미틸 팔미테이트 (C₃₂), 팔미틸 시스-10-햅타데세노에이트 (C₃₃), 팔미틸 올레이트 (C₃₄)의 다양한 길이를 갖는 5가지의 왁스 에스테르가 동정되었다. 또한 보유 시간이 늦어지는 피크일수록 탄소사슬이 긴 왁스 에스테르임을 확인하였다 (도 6 및 도 7).

또한 C-말단이 제거된 WES 유전자의 발현을 통한 왁스 에스테르 생성을 비교하기 위해 C-말단이 제거된 WES 유전자로 형질전환된 대장균의 배양액으로부터 왁스 에스테르를 추출하였다. GC 분석을 통해 합성을 분석한 결과, 정상적인 WES 유전자에 비해 C-말단이 제거된 WES 유전자로 형질전환된 대장균에서는 탄소 사슬이 긴 왁스 에스테르를 생성하지 못한다는 것을 확인할 수 있었다 (도 8).

실시예 6 : WES - GFP 융합 단백질 발현을 이용한 WES 의 식물 세포내 위치 분석

식물체에서 WES 단백질의 발현 및 발현 위치를 확인하기 위해 WES-GFP의 융합 단백질을 제작하였고, 융합된 단백질 유전자를 담배 식물체에 일시적인 형질전환하였다. 먼저, WES-GFP 형질전환 아그로박테리움 튜메파시엔스 C58C1을 4 ~ 5주 생장한 담배의 잎에 접종하여, 36시간 후에 단백질 발현을 확인하였다. WES-GFP 융합단백질의 세포내 분배 패턴은 공초점 레이저 주사 형광 현미경 (Carl Zeiss LSM510 laser confocal)으로 관찰하여 확인하였다. 관찰 결과, 대조구인 GFP 형질전환 식물체에서는 GFP 단백질이 세포 전체적으로 타겟팅되어 형광이 나타나는 반면 WES-GFP 융합 단백질은 핵 주변으로 타겟팅되는 것으로 확인하였다 (도 9). 이러한 결과는 WES 단백질이 식물에서 발현되어 핵으로 이동되는 것을 나타낸다.

실시예 7 : WES 과발현 형질전환 담배 식물체의 제작 및 형질전환 여부 확인

식물에 형질전환할 플라스미드를 제작하기 위해서 WES 유전자를 XbaI-WS 프라이머 (5'-TCTAGAATGGAGCAGCTATCCGGC-3' : 서열번호 5) 및 KpnI-WS 프라이머 (5'-GGTACCTCATCCGCGCCTCTTCTT-3' : 서열번호 6)로 증폭하여 pGEM-Teasy 벡터에 클로닝하였다. 그 후 XbaⅠ 및 KpnⅠ으로 절단하고, 동일한 제한효소로 절단한 pCAMBIA 1301에 클로닝하였다. 이와 같이 제작된 재조합 플라스미드를 pCAMBIA-WS로 명명하였다 (도 2C). 만들어진 플라스미드를 아그로박테리움 튜메파시엔스 C58C1균주에 형질전환 하였고 이 균주를 PC-WS로 명명하였다.

담배 (Nicitiana tabacum Samsun NN) 잎을 채취하여 10% 차아염소산나트륨 및 트윈 20 (Tween 20, 1~2방울)이 첨가된 플라스크에 넣고 5분 동안 흔들면서 살균하였다. 5분 후에 살균수로 담배 잎을 여러번 헹구어 차아염소산나트륨을 씻어냈다. 살균된 여과지를 깔아 놓은 페트리디쉬에 잎을 넣고 1 ~ 1.5㎝ (가로×세로) 크기로 살균된 메스를 이용하여 잘랐다. 자른 잎 40 ~ 50개 정도를 페트리디쉬에 넣고 미리 준비해둔 PC-WS 현탁액을 부어 10분 동안 공동배양하였다. 상기 PC-WS 현탁액은 카나마이신 (kanamycin) 및 리팜피신 (rifampicin)이 첨가된 LB 액체 배지에 접종하여 28℃에서 밤새 진탕배양하고, 이를 원심분리하여 세포를 모으고 MS에 3%의 수크로스 (sucrose)가 첨가된 액체 배지로 현탁하여 OD₆₀₀ 값을 0.5로 조정하여 사용했다. 살균된 여과지 위에 잎을 올려 물기를 제거하고, 초기배양 배지에 10 ~ 15개 잎을 2일 동안 25℃에서 암조건으로 배양했다. 2일 후, 캘러스 유도 배지로 계대하고 25℃에서 장일조건 (광조건 16시간, 암조건 8시간)으로 2 ~ 3주 배양하였다. 잎의 유도를 위해, 2 ~ 3주 후에 유도된 건전한 캘러스 조각을 신초 유도 배지로 옮겨주었다. 4 ~ 5주 후에 잎이 유도되면, 뿌리 유도 배지로 옮겨 배양하고 뿌리가 나오면 원예용 상토로 옮겨 심어 생육상에서 생육시켰다.

그 결과 약 70개의 담배 식물체를 획득하였고, 그 중에서 WES 유전자 형질전환 식물체의 여부를 확인하기 위해서 PCR을 수행하였다. 적당히 자란 형질전환 식물체 잎에서 SDS 및 페놀을 사용하여 게놈 DNA를 추출하였고, 하이그로마이신 (hygromycin) 프라이머 hygro 1 (5'-AGCCTGACCTATTGCATCTCC-3' : 서열번호 7) 및 hygro 2 (5'-TCGGTTTCCACTATCGGCGAT-3' : 서열번호 8)을 사용하였고, WES 프라이머 3ws (5'-CATTCCGCGCCTCTTCTTCG-3' : 서열번호 9) 및 35s (5'-ATGACGCACAATCCCACTAT-3' : 서열번호 10)를 사용하여 PCR을 수행하였다. LA Taq DNA polymerase (Takara Korea) 및 GC 완충액 I (Takara Korea)을 사용하였고 반응 조건은 95℃ 5분; 95℃ 1분, 57℃ 1분, 72℃ 1분 40초의 30 사이클; 마지막 신장단계는 72℃ 7분이고, 반응이 끝나고 4℃에 보관하였다.

상기 PCR 방법으로 선발된 21개의 형질전환 담배 식물체에서 RNA 발현을 분석하기 위해 식물의 잎에서 트라이졸 (Trizol) 방법으로 총 RNA를 추출하였다. 상기 RNA를 RT (reverse transcription) kit (Promega)의 Oligo dT 프라이머 및 AMV RT 효소를 이용하여 cDNA로 합성하였다. 42℃에서 15분, 95℃에서 5분, 4℃에서 5분 반응 후 -20℃에서 보관하거나 바로 PCR에 사용하였다. 식물체에서 WES 유전자의 발현을 정량하기 위해 모든 식물체에서 반드시 발현되는 액틴 (Actin) 유전자의 프라이머 act1 (5'-CCTCCCACATGCTATTCTCC-3' : 서열번호 11) 및 act2 (5'-AGAGCCTCCAATCCAGACAC-3' : 서열번호 12)를 사용하여 PCR을 수행하였다. 반응 조건은 95℃ 5분; 95℃ 1분, 55℃ 1분, 72℃ 40초의 30 사이클; 마지막 신장단계는 72℃ 7분이다. 액틴 프라이머를 이용하여 cDNA를 주형으로 WES 유전자를 증폭하기 위한 PCR할 때, 사용되는 주형의 양을 조정하여 최종 PCR주형의 양으로 결정하였다. WES 유전자의 발현을 알아보기 위해서 합성한 프라이머 WES509F (5'-ATCAACAAGGTCTTTCGC-3' : 서열번호 13) 및 WES509R (5'-ATCTGGTCGATGGTGAGC-3' : 서열번호 14)를 사용하여 PCR을 수행하였다. 반응 조건은 95℃ 5분; 95℃ 1분, 48~63℃ 1분, 72℃ 40초의 35 사이클; 마지막 신장단계는 72℃ 7분이다. 그 결과, 5개의 WES 유전자 형질전환된 담배식물 (TW 5, TW 8, TW 13, TW 29-2 및 TW 40)을 획득하였다 (도 10).

상기 5개의 형질전환된 담배 식물체를 육성하여 종자를 획득하였고, 상기 종자 (T₁)가 왁스 에스테르를 생성하는지 확인하기 위해 각각의 종자를 0.5g씩 튜브에 담아 클로로포름 (chloroform) 1㎖를 첨가하고, 약 15초 동안 볼텍싱하여 왁스 에스테르를 추출하였다. 추출물은 막여과한 후에, 질소가스로 얼려서 냉장보관하였다. 상기 추출물은 클로로포름 500㎕로 녹이고, 그 중 200㎕을 GC 분석에 이용하였다. 대조구로 담배 (Nicitiana tabacum Samsun NN)의 종자 추출물이 사용되었고, GC 분석 조건은 대장균의 추출물을 이용한 GC 분석 조건과 동일하며, 같은 모델의 GC 분석 기기를 사용하였다. 그 결과, 대조구인 담배의 종자 및 형질전환 담배의 종자에서 서로 다른 피크가 나타났다 (도 11). 상기 모든 5개의 형질전환 담배종자 (T₁)에서 독특하게 나타난 피크는 앞서 GC 분석을 통해 WES 유전자가 형질전환된 대장균이 합성하는 왁스 에스테르 피크의 보유 시간과 일치하였다. 따라서 WES 과발현 형질전환 담배의 종자에서 왁스 에스테르 생성됨이 확인되었다.

실시예 8 : WES 과발현 형질전환 애기장대 식물체의 제작 및 형질전환 여부 확인

실시예 7에서 제작되었던 PC-WES 균주를 이용하여 WES 유전자를 애기장대에 형질전환하였다. 형질전환된 애기장대는 하이그로마이신 (hygromycine, 20㎍/㎖)이 첨가된 MS 배지에서 선발되었고, 2번 순화하였다. 50개체의 T₂ 종자를 획득하였으며, 그 중 20개체의 동형접합체를 선발하여 WES 유전자 발현 확인을 위해 사용되었다.

형질전환 여부를 확인하기 위해서 PCR을 수행하였다. 먼저, 적당히 자란 형질전환 애기장대의 잎에서 SDS 및 페놀을 사용하여 게놈 DNA를 추출하였고, 하이그로마이신 (hygromycin) 저항성 유전자를 선발하는 프라이머 hygro 1 (5'-AGCCTGACCTATTGCATCTCC-3' : 서열번호 7) 및 hygro 2 (5'-TCGGTTTCCACTATCGGCGAT-3' : 서열번호 8)을 사용하였고, WES 유전자를 선발하는 프라이머 3ws (5'-CATTCCGCGCCTCTTCTTCG-3' : 서열번호 9) 및 35s (5'-ATGACGCACAATCCCACTAT-3' : 서열번호 10)를 사용하여 PCR을 수행하였다. LA Taq DNA polymerase (Takara Korea Biomedical Inc.) 및 GC 완충용액 (Takara Korea Biomedical Inc.)를 사용하였고, PCR 반응 조건은 95℃ 5분; 95℃ 1분, 60℃ 1분, 72℃ 1분 40초의 30 사이클; 마지막 신장단계는 72℃ 7분이다. PCR 산물은 전기영동을 통해 WES 유전자가 삽입된 형질전환 애기장대를 선발하였다.

위의 PCR 방법으로 선발된 애기장대에서 WES 유전자가 발현을 더욱 정확히 확인하기 위해, 선발된 형질전환 애기장대 20개체 중 라인 50의 6, 7 및 8을 이용하고, 라인 11의 12, 13, 14 및 16을 이용하여 RNA 발현 분석을 하였다. 먼저 애기장대의 잎을 이용하여 트라이졸 (Trizol) 방법으로 총 RNA를 추출하였다. 추출된 RNA는 분광흡광도를 이용하여 정량한 후에, RT (reverse transcription) kit (Promega)의 Oligo dT 프라이머 및 AMV RT 효소를 이용하여 cDNA를 합성하였다. RT 반응시 먼저 3㎍의 총 RNA 및 Oligo dT를 80℃에서 3분간 반응한 후, 얼음에서 식히고 다시 10×RT 완충액, dNTP, RNase inhibitor 및 AMV AMV RT 효소를 첨가하여 42℃에서 90분간 반응시켜 cDNA를 합성시켰다. 상기 cDNA를 주형 DNA로 이용하여 애기장대의 하우스키핑 (housekeeping) 유전자인 액틴 (actin) 유전자의 프라이머 5-액틴 (5'-TGGACTCTGGTGATGGTGTC-3' : 서열번호 11) 및 3-액틴 (5'-CCTCCAATCCAAACACTGTA-3' : 서열번호 12)을 사용하여 PCR을 수행하였다. 액틴 유전자는 RT-PCR의 대조구로 사용되었다. 반응 조건은 95℃ 4분; 95℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 30초의 30 사이클; 마지막 신장단계는 72℃ 7분이고, 실시한 후에 PCR 산물을 전기영동하여 확인하였다. WES 유전자의 발현을 확인하기 위해서 유전자 특이적 프라이머 WES509F (5'-ATCAACAAGGTCTTTCGC-3' : 서열번호 13) 및 WES509R (5'-ATCTGGTCGATGGTGAGC-3' : 서열번호 14)을 이용하여 PCR을 수행하였다. 반응 조건은 95℃ 5분; 95℃ 1분, 60℃ 1분, 72℃ 40초의 30 사이클; 마지막 신장단계는 72℃ 7분이다. PCR 산물은 전기영동하여 확인한 결과, 라인 50-8을 제외하고 나머지 형질전환 애기장대에서 WES 유전자 발현이 확인되었으며 (도 12), 라인 50의 6 및 7이 선발되었고 라인 11의 12, 13, 14 및 16이 형질전환 애기장대로 선발되었다.

형질전환 애기장대의 왁스 에스테르 합성을 확인하기 위해, 앞서 RT-PCR 실시하여 WES 유전자 발현이 확인되었던 형질전환 애기장대의 개체 중 라인 50-6, 50-7, 11-13 및 11-14개체의 잎을 이용하여 왁스 에스테르를 추출하였고, GC 분석을 통해 왁스 에스테르의 합성 유무를 확인하였다. 애기장대의 잎을 각 개체별로 1g씩 채취하여 10㎖의 클로로포름 (chloroform)에 약 5초 동안 침수하여 왁스 에스테르를 추출하였다. 이때 애기장대의 잎자루는 클로로포름에 적시지 않게 주의하였다. 왁스 에스테르가 포함되어 추출된 클로로포름을 막여과한 후, 질소가스로 얼려 냉장 보관하였다. 애기장대의 잎에서 추출된 왁스 에스테르를 클로로포름 500㎕에 녹여 그 중 200㎕를 GC 분석에 이용하였으며, GC 분석조건은 이전 GC 분석조건과 동일하며 야생형 애기장대 (Columbia)로부터 추출한 물질을 대조구로 이용하였다.

GC 분석 결과, 대조구와 비교하였을 때 대조구에 존재하지 않거나 약했던 피크들을 형질전환 애기장대에서 관찰할 수 있었다 (도 13). 또한 생성된 피크들은 앞서 대장균에서 동정되었던 왁스 에스테르의 보유 시간과 거의 일치하는 것을 볼 수 있었다. 따라서 형질전환 애기장대에서도 WES 유전자의 발현에 의해 왁스 에스테르 생성되는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 9 : WES 과발현 형질전환 식물체를 이용하여 가뭄 스트레스 저항성 기능 분석

잎 이외에 뿌리에서도 WES 유전자가 발현될 것이라 예상되었고, WES 과발현 형질전환 애기장대가 가뭄 스트레스에 대한 저항성이 있는지를 검정하였다. 애기장대의 가뭄 스트레스에 대한 저항성을 검정하기 위해 대조구인 애기장대 (Columbia) 및 WES 과발현 형질전환 애기장대 라인 11-13, 11-14, 50-6 및 50-7을 선발하여, 총 5개체에 대해 검정하였다. 먼저, 각각의 개체들을 3 포트씩 동일한 양의 상토를 넣어 준비하고, 상토가 충분히 적실만큼 물을 주었다. 그 후에 2주 동안 물을 주지 않았고, 대조구인 애기장대 (Columbia)와 비교하면서 식물생육 및 시들음을 관찰하였다. 2주간 관찰한 결과, WES 과발현 형질전환 애기장대들이 대조구에 비해 위조가 늦거나 위조가 나타나지 않았던 반면, 대조구에서는 위조가 나타나 빨리 고사함을 확인할 수 있었다 (도 14). 이는 형질전환 식물체 잎 또는 뿌리에서 왁스 에스테르 합성으로 인해 수분의 증산을 감소시켜 식물체 내 수분보유를 장기간 할 수 있는 것으로 예상된다. 통상 식물은 잎의 기공을 통해 90% 수분을 배출하고 나머지 수분은 큐티클 층에서 배출한다고 알려져 있는데, 이런 점을 토대로 애기장대 잎에서 수분 증산량을 비교하기 위해 증산량을 측정하였다. 각 개체의 애기장대의 잎을 0.05g씩 채취하여, 저울 접시에 같은 방향으로 잎을 올린 후에 25℃ 생장상에 넣고 20분 간격으로 총 4시간 동안 잎의 무게를 측정하였다. 측정한 무게를 수분 함유량 (%)으로 환산하여 수치화하였다. 수분 함유량 (%) 계산법은 다음과 같다 :

수분함유량 (%) = 측정한 잎의 무게/처음 측정한 잎의 무게 ×100

상기 수분함량 (%)으로 환산하여 그래프로 나타냈다 (도 15). 수분함량을 측정한 결과, 측정 초기에 대조구 및 모든 WES 과발현 형질전환 애기장대 증산량이 거의 비슷하였지만, 시간이 갈수록 대조구의 증산량이 형질전환 애기장대의 증산량보다 더 증가하였다. 따라서, WES 유전자가 가뭄 스트레스 저항성에 관련됨을 알 수 있었다.

실시예 10 : WES 과발현 형질전환 식물체를 이용하여 삼투 스트레스 저항성 기능 분석

삼투 스트레스에 대한 저항성 검정을 위해, 야생형 애기장대 및 WES 과발현 형질전환 애기장대를 만니톨 (mannitol)이 첨가된 MS 식물체 배양 배지에서 배양하여 뿌리 생장 및 식물체 생장을 비교하였다. 형질전환 애기장대 종자 (T₂)를 0.3% 차아염소산나트륨 및 70% 알코올 용액으로 종자 소독을 한 후, MS 배지에서 발아시켰다. 발아 1주일 후에 MS 배지 및 200mM 만니톨이 첨가된 MS 배지에 발아된 애기장대 유묘를 일렬로 세워 옮겨주었다. 이때 모든 작업은 클린벤치 안에서 수행하였고 모든 과정을 멸균상태에서 수행하였으며, 식물체 생장환경은 8시간의 광조건 (22℃) 및 16시간의 암조건 (20℃)이였다. 만니톨이 첨가된 배지에서 식물체 간의 상대적인 생장을 비교해야하기 때문에 애기장대를 옮길 때 뿌리가 잘리지 않도록 주의하였다. 발아된 애기장대의 각 개체는 10개체씩 3 반복하여 만니톨 첨가 배지에서의 생장을 관찰하였다.

그 결과, 만니톨이 첨가되지 않은 MS 배지에서 대조구인 애기장대 (Columbia) 및 WES 과발현 형질전환 애기장대의 생장차이는 크게 없었으나, 만니톨이 첨가된 MS 배지에서는 대조구인 애기장대보다 WES 과발현 형질전환 애기장대의 뿌리털이 더 많이 자라난 것을 확인하였다 (도 16A). 또한 MS 배지 및 만니톨이 첨가된 MS 배지에서 자란 애기장대 식물체들의 무게 및 뿌리 길이를 평균화하였을 때, 만니톨이 첨가된 MS 배지뿐만 아니라 만니톨이 첨가되지 않은 MS 배지에서도 WES 과발현 형질전환 애기장대가 대조구인 애기장대에 비해 무게 및 뿌리 길이에서 더 좋은 생장을 하였다 (도 16B). 따라서 식물체에서 WES 유전자 과발현은 삼투 스트레스 저항성을 부여하는 것이라고 판단된다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims (12)

1. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 토양 메타게놈 유래의 왁스 에스테르 (wax ester) 생성 또는 환경 스트레스 저항성 관련 WES (wax ester synthase) 단백질.
2. 제1항의 단백질을 코딩하는 유전자.
3. 제2항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 유전자.
4. 제2항의 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
5. 제4항의 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포.
6. 제4항의 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 WES 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 식물의 왁스 에스테르 생성을 증가시키는 방법.
7. 제4항의 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및
   상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 왁스 에스테르 생성이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법.
8. 제7항의 방법에 의해 제조된 왁스 에스테르 생성이 증가된 형질전환 식물체.
9. 제4항의 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 WES 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 식물의 환경 스트레스 저항성을 증진시키는 방법.
10. 제4항의 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및
    상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 환경 스트레스 저항성이 증진된 형질전환 식물체의 제조 방법.
11. 제10항에 있어서, 상기 환경 스트레스는 가뭄 또는 삼투 스트레스인 것을 특징으로 하는 방법.
12. 제10항의 방법에 의해 제조된 환경 스트레스 저항성이 증진된 형질전환 식물체.

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