KR20100091749A - 토양 메타게놈 유래 신규 에스터라제 유전자 및 이로부터 암호화되는 에스터라제 단백질 - Google Patents

Abstract

본 발명은 토양 메타게놈 유래 신규 에스터라제(esterase) 유전자 및 이로부터 암호화되는 에스터라제 단백질에 관한 것으로, 보다 상세하게는 토양 미생물의 총 유전체인 메타게놈으로부터 분리한 신규 에스터라제가 우수한 에스터라제 활성을 나타내고, 온도, pH 및 유기용매에 대한 효소 활성 안정성을 나타내며, 짧은 사슬(short chain) 지방산을 가지는 지질 및 3-하이드록시팔미트산 메틸 에스테르(3-OH palmitic acid methyl ester; 3-OH PAME)를 분해하여 식물 병원성균에 대한 바이오필름 저해 활성을 나타냄으로써 식물세균병 저항성 작물 또는 식물세균병 제어제 개발에 유용하게 사용될 수 있다.

메타게놈, 에스터라제, 3-OH PAME.

Description

토양 메타게놈 유래 신규 에스터라제 유전자 및 이로부터 암호화되는 에스터라제 단백질{NOVEL GENE ENCODING ESTERASE DERIVED FROM SOIL METAGENOME AND THE ESTERASE}

본 발명은 토양 메타게놈 유래 신규 에스터라제(esterase) 유전자, 이로부터 암호화되는 에스터라제 단백질, 및 상기 에스터라제 단백질의 제조방법에 관한 것이다.

미생물 분자생태적 연구 결과, 순수 배양기술을 통상적인 방법을 통해서 발견되었던 미생물보다 더 많은 미생물이 지구상에 존재한다는 것이 밝혀졌으며, 토양 내에 존재하는 미생물의 99%이상이 배양이 되지 않는 것으로 밝혀졌다. 즉, 대다수의 미생물 자원의 발굴이 미생물 순수배양에 의존해 왔으므로 대다수 다양한 미생물의 자원이 발굴되지 못했던 문제가 있었다.

이러한 문제를 해결하기 위해서 개발된 방법 중의 하나가 바로 메타게놈 연구방법이다. 메타게놈은 미생물이 존재하는 자연환경에 존재하는 모든 미생물 군 집의 총 게놈(genome)을 통칭하는 의미로 1998년 Jo Handelsman에 의해서 처음 사용되었다(Handelsman 등 Chem. Biol. 5:R245-249, 1998; Steele 등 FEMS Microbiol. lett. 247:105-111, 2005). 상기 방법은 특정 환경 시료에서 미생물 군집들의 DNA를 바로 추출하여 커다란 크기의 DNA를 수용할 수 있는 코스미드(cosmid), 포스미드(fosmid) 또는 BAC 벡터(vector)에 클로닝하여 유전자 라이브러리를 제작하는 방법을 포함한다(Schloss 등 Curr. Opin. Biotechnol. 14:303-310, 2003; Streit 등 Curr. Opin. Microbiol. 7:492-498, 2004). 메타게놈으로부터 지난 수년간 다양한 항생제 및 효소들이 발견되었다(Brady 등 Org. Lett. 3:1981-1984, 2001; Rondon 등 Appl. Environ. Microbiol. 66:2541-2547, 2000; Schmeisser 등 Appl. Environ. Microbiol. 69:7298-7309, 2003; Van Lanen 등 Curr. Opin. Microbiol. 9:252-260, 2006).

미생물학자인 Eijkmann에 의해서 다양한 미생물이 지질분해효소를 생산하고 분비한다는 연구결과가 1901년에 발표된 이후 지질분해효소들은 10개 이상의 계열(family)로 분류되고 있다(Jaeger 등., Annu. Rev. Microbiol .53:315-351, 1999; Jaeger 등., Curr. Opin. Biotechnol. 13:390-397, 2002). 지질분해에 관련된 효소인 에스터라제(esterase, E.C. 3.1.1.3)와 리파제(lipase, E.C. 3.1.1.1)는 생명공학 및 산업적으로 널리 응용되고 있으며, 그 예로는 신규 생합성 물질의 생산, 바이오 디젤의 생산 및 우수한 화합물의 합성에 사용되고 있다(Elend 등 Appl. Environ. Microbiol. 72:3637-3645, 2006; Jaeger 등 Annu. Rev. Microbiol. 53:315-351, 1999; Jaeger 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:12809-12813, 2001; Jaeger 등., Curr. Opin. Biotechnol. 13:390-397, 2002).

에스터라제(esterase) 및 리파제(lipase)의 장점은 다음과 같다. 첫째, 많은 유기용매에 대한 안정성과 정교한 이성질 선택성을 가짐으로써 화학합성을 통해서는 생산할 수 없는 유용한 화합물을 얻을 수 있다(Jaeger et al., Curr. Opin. Biotechnol. 13:390-397, 2002). 둘째, 이전 연구에서 발표했던 것처럼 대장균(E. coli)에서 바실러스(Bacillus) 종, 슈도모나스(Pseudomonas) 종, 및 벌콜데리아(Burkholderia) 종 유래의 많은 리파제들을 생산했던 방법인 이형질적인 과발현 시스템을 이용하여 산업적인 가치를 지닐 수 있을 정도로 효소의 양을 많이 얻을 수 있다. 마지막으로 다른 효소들과 비교하여 조효소를 요구하지 않으므로 생명공학적 활용에 비용이 저렴하며 활용이 용이하다(Beisson 등., Eur. J. Lipid. Sci. Technol. 133-153, 2000; Jaeger 등., FEMS. Microbiol. Rev. 15:29-63, 1994; Jaeger 등., Curr. Opin. Biotechnol. 13:390-397, 2002).

이전의 연구들은 식물이 자체적으로 생산하는 지질 분해효소가 병의 저항성에 관련되어 있다고 보고하고 있다(Shah, Annu. Rev. Phytopathol. 43:229-260, 2005). 이러한 점에서 착안하여 미생물 유래의 지질 분해효소도 식물 병의 억제 또는 저해에 사용될 수도 있음이 예상되었다. 실제로 Shinohara 등(J. Appl. Microbiol. 103:152-162, 2006)은 이데오넬라 종(Ideonella sp.) 0-0013 유래의 에스터라제에 의해서 그람 음성 식물병원성 세균인 랄스토니아 솔라나세럼(Ralstonia solanacearum)의 병원성 인자 발현을 조절하는 미생물 밀도감지(quorum sensing) 신호물질인 3-하이드록시팔미트산 메틸 에스테르(3-hydroxypalmitic acid methyl ester; 3-OH PAME)가 분해되는 것을 보고하였다.

랄스토니아 솔라나세럼(R. solanacearum) 균주는 다양한 기주를 공격하여 풋마름병을 유발하는 식물병원성 그람 음성세균으로서 병원성 인자로서 외피다당류(extracellular polysaccharide, EPS)와 식물세포벽을 분해 할 수 있는 가수분해효소들을 분비한다고 보고되어 있다(Clough 등, J. Bacteriol. 179:3639-3648, 1997; Flavier 등., Mol. Microbiol. 26:251-259, 1997; Schell, Annu. Rev. Phytopathol. 38:263-292, 2000). 특히, EPS를 다량 생산하여 기주식물의 물관을 막는 기작은 가지과 작물의 풋마름병을 일으키는 주요 원인이 된다(Saile 등., Phytopathology 87:1264-1271, 1997). 이전 연구들을 통해서 다양한 세균들이 세포와 세포 간의 신호전달 체계 정족수 인식(quorum-sensing) 신호물질로 N-아실호모세린 락톤(N-acylhomoserine lactone; AHL)을 사용하며, AHL이 병원성 인자의 발현을 조절하는 것이 밝혀졌다(Whitehead, 등., Antonie van Leeuwenhoek 81:223-23, 2002; Saara 등., Infect. Immun. 74:910-919, 2006; Diggle, J. Bacteriol. 184:2576-2586, 2002). 이에 반해, 랄스토니아 솔라나세럼(Ralstonia solanacearum)의 경우 3-OH PAME이 미생물 밀도감지 신호물질로 사용되고(Clough 등., J. Bacteriol. 179:3639-3648, 1997; Flavier 등., Mol. Microbiol. 26:251-259, 1997), 3-OH PAME 의해 조절되는 조절단백질인 PhcA에 의해서 랄스토니아 솔라나세럼(Ralstonia solanacearum)의 병원성 인자인 EPS와 가수분해효소의 생산이 결정되는 것이 보고된 바 있다(Clough 등., J. Bacteriol. 179:3639-3648, 1997; Shinohara 등., J. Appl. Microbiol. 103:152-162, 2006).

이에, 본 발명자들은 식물근권 메타게놈으로부터 지질분해 활성이 있는 신규한 유전자를 선발하기 위해 노력하던 중, 식물 근권 토양 메타게놈 라이브러리를 제작한 후 이로부터 지질 분해 활성을 가지는 클론을 탐색하여 지질분해 활성 관련 부위를 결정하였고 염기서열을 결정하였는 바 기존에 보고된 유전자들과 50% 이하의 낮은 상동성을 보였으며 짧은 사슬(short chain)의 지방산 사슬을 기질로 선호하는 에스터라제를 암호화하는 신규한 유전자임을 확인하였으며, 랄스토니아 솔라나세럼(R. solanacearum) 균주의 미생물 밀도감지 신호물질이고 식물 병원성 인자인 EPS의 발현을 조절한다고 알려진 3-하이드록시팔미트산 메틸 에스테르(3-OH palmitic acid methyl ester; 3-OH PAME)을 분해함을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 토양 미생물 메타게놈에서 유래한 신규 에스터라제(esterase), 이를 암호화하는 유전자, 및 상기 에스테라제의 제조방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 에스터라제(esterase) 활성을 갖는 하기 a 내지 c 중 어느 하나의 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드의 변이체 또는 이의 활성 단편을 제공한다:

a) 서열번호 1로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드;

b) 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건에서 혼성되는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드; 및,

c) 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드.

또한, 본 발명은 상기 폴리펩티드, 이의 변이체 또는 이의 활성 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드가 조절 서열에 작동가능하게 연결된 유전자 컨스트럭트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 발현벡터가 숙주세포에 형질 도입된 형질전환체를 제공한다.

또한, 본 발명은

1) 상기 폴리펩티드, 이의 변이체 또는 이의 활성 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현벡터를 제조하는 단계;

2) 상기 재조합 발현벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 제조하는 단계; 및,

3) 상기 형질전환체를 배양하여 재조합 단백질의 발현을 유도하고 이를 수득하는 단계로 구성되는 재조합 에스터라제의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 발현벡터가 작물에 형질전환된 식물세균병 저항성 작물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 폴리펩티드, 이의 변이체 또는 이의 활성 단편를 유효성분으로 함유하는 식물세균병 제어제를 제공한다.

아울러, 본 발명은 상기 유전자 컨스트럭트를 비병원성 균주에 형질전환시킨 형질전환 균주 또는 상기 균주의 배양액을 함유하는 미생물 농약제제를 제공한다.

본 발명의 신규 에스터라제(esterase)는 짧은 사슬(short chain) 지방산을 가지는 지질 및 3-하이드록시팔미트산 메틸 에스테르(3-OH palmitic acid methyl ester; 3-OH PAME)을 분해하므로 식물병원성 세균에 의한 세균병 저항성 작물 또는 세균병 제어제 생산을 위해 유용하게 이용할 수 있다.

이하, 본 발명에서 사용된 용어를 정의한다.

본 발명에서 사용된 용어 "재조합 발현벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질 또는 목적 RNA을 발현할 수 있는 벡터로서, 발현벡터의 전사에 제공되는 추가단편에 작동가능하게 연결된 관심의 폴리펩티드를 암호화하는 단편으로 구성되는 선형 또는 원형의 DNA 분자이다. 그와 같은 추가단편은 프로모터 및 종료암호 서열을 포함한다. 발현벡터는 하나 이상의 복제 개시점, 하나 이상의 선택마커, 폴리아데닐화 신호 등을 또한 포함한다. 발현벡터는 일반적으로 플라스미드 또는 바이러스 DNA로부터 유도되거나, 또는 둘 다의 요소를 함유한다.

본 발명에서 사용된 용어 "작동가능하게 연결된(operably linked)"이란 일반적인 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 것을 말한다. 예를 들어 프로모터와 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 작동가능하게 연결되어 코딩하는 핵산 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 재조합 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 에스터라제(esterase) 활성을 갖는 하기 a 내지 c 중 어느 하나의 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드의 변이체 또는 이의 활성 단편을 제공한다:

a) 서열번호 1로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드;

b) 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건에서 혼성되는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드; 및,

c) 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드.

여기서, "엄격한 조건하에서 혼성화되는 폴리뉴클레오티드"란 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열의 폴리뉴클레오티드 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 전부 또는 일부를 탐침자로서 사용하여 콜로니 혼성화 기술, 플라크 혼성화 기술, 서던(southern) 혼성화 기술 등에 의해 수득된, DNA 등의 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 상기 혼성화 방법은, 예를 들어, 문헌 [Molecular Cloning 제 3 판, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997] 등에 기재된 방법일 수 있다.

여기서 "엄격한 조건"이라는 용어는 낮은 엄격성 조건, 중간 엄격성 조건 또는 높은 엄격성 조건 중에서 임의로 선택될 수 있다. "낮은 엄격성 조건"은, 예를 들어, 32℃에서의 5 x SSC, 5 x Denhardt 용액, 0.5% SDS, 50% 포름아마이드이다. "중간 엄격성 조건"은, 예를 들어, 42℃ 에서의 5 x SSC, 5 x Denhardt 용액, 0.5% SDS, 50% 포름아마이드이다. "높은 엄격성 조건"은, 예를 들어, 50℃ 에서의 5 x SSC, 5 x Denhardt 용액, 0.5% SDS, 50% 포름아마이드이다. 이들 조건하에서, 상동성이 더 높은, DNA 등의 폴리뉴클레오티드는 더욱 높은 온도에서 효율적으로 수득될 것으로 예상되지만, 혼성화 엄격성에는 온도, 탐침자 농도, 탐침자 길이, 이온세기, 시간, 염 농도 및 기타를 비롯하여 복수의 요인들이 연루되므로, 당업자는 유사한 엄격성을 구현하기 위해 이들 요인들을 적절히 선택할 수 있다.

본 발명의 에스터라제 단백질은 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있으며 이와 같이 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 에스터라제 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 에스터라제 단백질은 토양의 메타게놈으로부터 분리하거나, 공지의 DNA 또는 펩티드 합성 방법에 따라 합성할 수도 있다. 또한, 이렇게 제조된 유전자를 당 분야에 공지된 미생물 발현용 벡터에 삽입하여 발현벡터를 제조한 후 이를 적절한 숙주 세포, 예를 들어, 대장균 또는 효모 세포 등에 도입시킬 수 있다. 이와 같이 형질전환된 숙주를 이용하여 본 발명의 유전자의 DNA를 대량으로 복제하거나 단백질을 대량 생산할 수 있다. 벡터의 제작 시에는, 상기 에스터라제 유전자 또는 단백질을 생산하고자 하는 숙주 세포의 종류에 따라 프로모터(promoter), 종결자(terminator) 등과 같은 발현 조절 서열, 자가-복제 서열, 및 분비 시그날 등을 적절히 선택하고 조합할 수 있다.

본 발명자들은 신규한 에스터라제 유전자를 토양으로부터 동정하기 위하여, 토양 미생물로부터 메타게놈을 분리한 후 포스미드(fosmid)를 이용하여 대장균에 메타게놈 라이브러리를 작성하였다. 상기 작성된 라이브러리로부터 트라이뷰티린 (tributyrin)의 가수분해 여부를 통해 우수한 지질분해 활성을 갖는 메타게놈 클론을 선별하였다. 우수한 지질 활성 관련 유전자를 다시 작게 재분리하여 유전자 부위를 결정하였고 이의 염기서열을 분석하였다. 상기 염기 서열을 분석한 결과, 서열번호 1로 기재되는 1,631 bp의 염기서열로 이루어지는 에스터라제를 발굴하였다. 상기 서열번호 1의 염기서열에서, 뉴클레오티드 번호 237 내지 1430 부위(1428-1430: 종결코돈)에 해당하는 전사 해독 프레임(open reading frame)은 에스터라제 단백질을 암호화하는 부위로서 서열번호 2로 기재되는 397개 아미노산을 암호화하고 있으며, 분자량이 약 40 ~ 45 kDa으로 예측되었다. 상기 에스터라제의 염기 서열을 BLAST 프로그램을 이용하여 GenBank에 있는 아미노산 서열과 비교 분석한 결과, 21 ~ 23% 정도의 낮은 상동성을 보여 지질분해 활성을 암호화하는 신규한 유전자로 확인되었다. 상기 에스터라제의 아미노산 서열을 BLAST 프로그램을 이용하여 GenBank에 있는 아미노산 서열과 비교 분석한 결과, 이전에 보고 되었던 단백질들에 대해 50% 이하의 상동성을 보였으며, 대부분이 기능이 알려지지 않은 단백질들이며, 효소로 기능이 알려진 유전자 중에서 유추된 아미노산 서열이 가장 유사한 단백질은 메타노콜푸스컬럼 라브레아눔 Z(Methanocorpusculum labreanum Z)의 가수 분해효소(ABN07867, 23% 상동성)와 배양되지 않은 박테리아의 에스테라제 Est5S(ABI17943, 21% 상동성)이 발견되었다. 따라서 상기 선발된 지질 분해 활성 효소가 신규 에스터라제인 것을 알 수 있다.

본 발명의 신규 에스테라제는 분자량이 40 ~ 60 kDa인 것이 바람직하고, 40 ~ 45 kDa인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명자들은 서열번호 2로 기재되는 신규 에스터라제의 분자량을 알아보기 위해, 상기 신규 에스터라제를 암호화하는 서열번호 1로 기재되는 유전자를 벡터에 클로닝하고, 상기 벡터를 대장균에 형질전환시킨 후, 상기 형질전환체로부터 생산된 에스터라제를 정제한 다음, SDS-PAGE 방법으로 분자량을 확인하였다. 그 결과, 본 발명의 에스터라제의 분자량은 약 50 kDa ~ 60 kDa을 나타내었으며, 히스티딘 태깅(histidine tagging)에 의해 융합되면서 일어난 크기의 변화를 감안하면 약40 ~ 45 kDa인 것을 알 수 있다(도 1 참조).

본 발명의 신규 에스테라제는 짧은 사슬(short chain) 지방산을 가지는 지질에 대한 분해 활성을 갖는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명자들은 서열번호 2로 기재되는 신규 에스터라제의 기질 특이성을 알아보기 위해, 상기 정제된 에스터라제를 다양한 기질을 포함한 용액에 첨가한 후 분광광도계(spectrophotometer)를 사용하여 각 기질에 대한 효소 활성을 측정하였다. 그 결과, 상기 에스터라제는 짧은 사슬 p-나이트로페닐 아실에스테르(p-nitrophenyl acylester)인 p-나이트로페닐 뷰티레이트(p-nitrophenyl butyrate)와 p-나이트로페닐 발러레이트(p-nitrophenyl valerate)에 대해 85% 이상의 높은 활성 을 나타내었지만, 긴 사슬 p-나이트로페닐 아실에스테르인 p-나이트로페닐 옥타노에이트(p-nitrophenyl octanoate), p-나이트로페닐 데카노에이트(p-nitrophenyl decanoate) 및 p-나이트로페닐 팔미테이트(p-nitrophenyl palmitate)에 대해서는 약 50% 이하의 낮은 활성을 나타내었다(도 2 참조).

본 발명의 신규 에스테라제는 최적 효소 활성 조건은 온도가 10 ~ 50℃ 및 pH가 7.0 ~ 9.0인 것이 바람직하고, 온도가 30 ~ 40℃ 및 pH가 7.5 ~ 8.5 조건인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명자들은 서열번호 2로 기재되는 신규 에스터라제의 최적의 효소 활성 반응 조건을 알아보기 위해, 상기 정제된 에스터라제의 다양한 온도 및 pH 조건에서 기질에 대한 효소 활성을 측정하였다. 그 결과, 상기 에스터라제는 35℃의 조건에서 100%의 활성을 나타내었고, 10 ~ 50℃의 조건에서도 50% 이상의 활성을 나타내었으며(도 3 참조), pH 8.0의 조건에서 100%의 활성을 나타내었고, pH 7.0 ~ 9.0 사이에서도 50% 이상의 활성을 나타내었다(도 4 참조).

본 발명의 신규 에스테라제는 유기용매에 대한 효소 활성 안정성을 갖는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명자들은 서열번호 2로 기재되는 신규 에스터라제의 효소 활성 안정성을 알아보기 위해, 상기 정제된 에스터라제의 다양한 종류 및 농도의 유기용매를 첨가한 용액에서의 기질에 대한 효소 활성을 측정하였다. 그 결과, 상기 에스터라제는 15%의 부탄올 및 15%의 메탄올에서는 대조군에 비하여 활성이 증가하였고, 10 mM의 EDTA, 15% 및 30%의 DMSO, 30%의 메탄올, 및 15%의 이소프로파놀 조건의 반응 액에서도 50% 이상의 활성을 나타내었다. 또한, 1%의 SDS가 첨가된 조건 및 30%의 헥산이 첨가된 조건에서는 활성이 전혀 나타나지 않았다(도 5 참조).

본 발명의 신규 에스테라제는 3-하이드록시팔미트산 메틸 에스테르(3-OH palmitic acid methyl ester; 3-OH PAME) 분해 활성을 갖는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명자들은 서열번호 2로 기재되는 신규 에스터라제의 3-OH PAME 분해 활성을 알아보기 위해, 서열번호 1로 기재되는 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환한 대장균을 제조하여 상기 균주와 함께 배양한 랄스토니아 솔라나세럼(Ralstonia solanacearum; R. solanacearum) 균주의 외피다당류(EPS) 생산 정도를 확인하였다. 그 결과, 본 발명의 에스터라제를 생산하는 균주에 의해서 랄스토니아 솔라나세럼 SL2029의 EPS 생산이 현저히 줄어들었다. 따라서, 상기 에스터라제가 3-OH PAME을 분해하는 것을 알 수 있었다(도 6 참조). 또한, 본 발명의 에스터라제에 의한 3-OH PAME 분해를 효소반응 후 기체 크로마토그래피(Gas Chromatography; GC) 분석을 통해 확인하였다. 그 결과, 본 발명의 에스터라제를 생산하는 균주의 경우 대조군 균주에 비해서 3-OH PAME의 양이 현저히 줄어든 것을 관찰할 수가 있었다. 따라서 본 발명의 에스터라제가 3-OH PAME을 직접 분해함을 알 수 있었다(도 7 참조).

또한, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드, 이의 변이체 또는 이의 활성 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드가 적당한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 유전자 컨스트럭트를 제공한다.

상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 갖는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여 또는 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 암호화 영역으로부터 발현되는 본 발명의 에스터라제 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 암호화 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 암호화 영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 서열번호 1의 에스터라제 유전자와 실질적으로 동일한 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

또한, 본 발명은 상기 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다.

본 발명의 재조합 발현벡터의 제작 시에는, 상기 에스터라제 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편을 생산하고자 하는 숙주세포의 종류에 따라 프로모터(promoter), 종결자(terminator) 또는 인핸서(enhancer)와 같은 발현조절 서열, 막 표적화 또는 분비를 위한 서열을 적절히 선택하고 목적에 따라 다양하게 조합할 수 있다.

상기 발현벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파이지 벡터 및 바이러스 벡터로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 적합한 발현벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 발현벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 상기 시그널 서열에는 숙주가 에쉐리키아속(Escherichia sp.)균인 경우에는 PhoA 시그널 서열, OmpA 시그널 서열 등이, 숙주가 바실러스속(Bacillus sp.)균인 경우에는 α-아밀라아제 시그널 서열, 서브틸리신 시그널 서열 등이, 숙주가 효모(yeast)인 경우에는 MFα 시그널 서열, SUC2 시그널 서열 등이, 숙주가 동물 세포인 경우에는 인슐린 시그널 서열, α-인터페론 시그널 서열, 항체 분자 시그널 서열 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 발현벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택 마커를 포함할 수 있고, 복제 가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함한다.

본 발명의 발현 벡터는 관심 단백질인 에스터라제가 숙주세포에서 발현하면 그 활성을 나타내게 되므로, 숙주세포의 배양 배지에 트리뷰티린 등의 에스터라제 기질을 첨가함으로써, 별도의 선택마커 없이도 형질전환된 숙주세포의 선별이 가능하도록 할 수 있다.

상기 재조합 발현벡터는 발현물의 정제를 용이하게 하기 위한 서열을 포함할 수 있으며, 구체적으로 본 발명의 에스터라제 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편을 암호화하는 유전자에 작동 가능하도록 분리정제용 태그를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 연결될 수 있다. 이때, 상기 분리정제용 태그는 GST, poly-Arg, FLAG, 히스티딘-택(His-tag) 및 c-myc로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나를 단독으로 또는 두 개 이상을 순차적으로 연결하여 사용할 수 있다.

본 발명의 재조합 발현벡터의 에스터라제 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편을 암호화하는 유전자와 분리정제용 태그를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 단백질 절단효소 인식부위를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 연결될 수 있다. 본 발명의 에스터라제 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편은 생물의학과 정밀화학 분야에서 생체 촉매로 유용하게 활용되는 단백질로써, 정제용 태그에 의해 기능이 저하될 수 있으므로 제거되는 것이 바람직하다. 이때, 상기 단백질 절단효소 인식부위는 Xa 인자 인식부위, 엔테로키나제 인식부위, 제네나제(Genenase) I 인식부위 및 퓨린(Furin) 인식부위로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나를 단독으로 또는 두 개 이상을 순차적으로 연결하여 사용할 수 있다.

본 발명의 에스터라제 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편을 암호화하는 유전자는 제한효소 부위를 통해 클로닝될 수 있고, 단백질 절단효소 인식부위를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 사용된 경우에는 상기 폴리뉴클레오티드와 틀이 맞도록(in frame) 연결되어, 상기 에스터라제 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편 분비 후 단백질 절단효소로 절단시, 원래 형태의 에스터라제 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편이 생산될 수 있도록 할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 본 발명의 재조합 발현벡터가 숙주세포에 형질 도입된 형질전환체를 제공한다.

본 발명에 따른 상기 재조합 발현벡터를 적절한 숙주 세포, 예를 들어, 대장균 또는 효모 세포 등에 형질전환시킨 후, 형질전환된 숙주세포를 배양함으로써 본 발명에 따른 신규 에스터라제를 대량 생산할 수 있다. 숙주세포의 종류에 따른 적절한 배양 방법 및 배지 조건 등은 당해 분야의 통상의 기술자에게 알려진 공지 기술로부터 당업자가 용이하게 선택할 수 있다.

본 발명자들은 신규 에스터라제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현벡터를 제작한 후 대장균에 형질전환시켜 제조한 형질전환체로부터 본 발명의 에스터라제 생산을 확인하였다.

또한, 본 발명은

1) 본 발명의 폴리펩티드, 이의 변이체 또는 이의 활성 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현벡터를 제조하는 단계;

2) 상기 재조합 발현벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 제조하는 단계; 및,

3) 상기 형질전환체를 배양하여 재조합 단백질의 발현을 유도하고 이를 수득하는 단계로 구성되는 재조합 에스터라제의 제조방법을 제공한다.

상기 제조방법에 있어서, 단계 1)의 폴리뉴클레오티드는 N-말단에 분리정제 용 태그를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 단백질 절단효소 인식부위가 추가로 연결될 수 있고, 이로 인해 재조합 에스터라제의 정제 또는 원래 형태의 에스터라제의 수득이 가능할 수 있다. 즉, 재조합 에스터라제를 분리정제용 태그를 이용하여 정제한 후, 상기 단백질 절단효소 인식부위를 절단할 수 있는 단백질 절단효소를 처리하는 단계를 추가로 포함함으로써 원래 형태의 에스터라제를 수득할 수 있다.

또한, 본 발명은 본발명의 재조합 발현벡터가 작물에 형질전환된 식물세균병 저항성 작물을 제공한다.

본 발명의 유전자 컨스트럭트를 식물 형질전환 벡터에 삽입하여 아그로박테리움 형질전환 방법에 따라 작물에 형질전환시킴으로써 식물세균병 저항성 작물을 제조할 수 있다.

상기 작물은 토마토, 고추, 감자, 가지, 담배 및 파프리카로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 식물인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 식물세균병은 병원성 세균은 랄스토니아 솔라나세럼(Ralstonia solanacearum)에 의해 유도되는 세균병인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않으며, 외피다당류(EPS)를 다량 생산하는 균에 의해 유도되는 세균병은 모두 포함된다.

상기 식물세균병은 풋마름병(청고병)인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 신규 에스터라제를 발현하는 작물은 랄스토니아 솔라나세룸이 생산하는 3-OH PAME을 효과적으로 제어하여 풋마름병 발생을 억제함으로써 저항성 식 물로 육종할 수 있음을 알 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드, 이의 변이체 또는 이의 활성 단편를 유효성분으로 함유하는 식물세균병 제어제를 제공한다.

본 발명의 신규 에스터라제는 우수한 에스터라제 활성을 나타내고, 기질 특이성을 가지며, 다양한 범위의 온도, pH 및 유기용매에 대한 효소 활성 안정성을 나타내며, 짧은 사슬(short chain) 지방산을 가지는 지질 분해 활성을 가지며, 3-OH PAME을 분해하므로 식물 병원성균에 대한 항진균 및 항세균 활성을 나타내므로, 신규 에스테라제 및 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 유전자 컨스트럭트를 식물 항생제의 유효성분으로 유용하게 사용할 수 있음을 알 수 있다.

본 발명의 세균병 제어제는 특히 등장 멸균 용액 또는 건조 특히 멸균수 또는 적절한 생리 식염수의 첨가에 따라 주사 가능한 용액의 조성을 가능케 하는 동결건조 조성물을 포함할 수 있다.

본 발명의 세균병 제어제는 상기 에스테라제 또는 이를 암호화하는 폴리펩티드를 포함하는 유전자 컨스트럭트에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.

상기 식물세균병은 병원성 세균은 랄스토니아 솔라나세럼(Ralstonia solanacearum)에 의해 유도되는 세균병인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않으며, 외피다당류(EPS)를 다량 생산하는 균에 의해 유도되는 세균병은 모두 포함된다.

상기 식물세균병은 풋마름병(청고병)인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는 다.

아울러, 본 발명은 본 발명의 유전자 컨스트럭트를 비병원성 균주에 형질전환시킨 형질전환 균주 또는 상기 균주의 배양액을 함유하는 미생물 농약제제를 제공한다.

본 발명의 신규 에스터라제는 우수한 에스터라제 활성을 나타내고, 기질 특이성을 가지며, 다양한 범위의 온도, pH 및 유기용매에 대한 효소 활성 안정성을 나타내며, 짧은 사슬(short chain) 지방산을 가지는 지질 분해 활성을 가지며, 3-OH PAME을 분해하므로 식물 병원성균에 대한 세균병 제어 활성을 나타내므로, 상기 신규 에스테라제를 생산하는 비병원성 균주 및 이를 배양한 배양액을 미생물농약제제의 유효성분으로 유용하게 사용할 수 있음을 알 수 있다.

이하, 실시예에 의하여 본 발명을 상세히 설명하고자 한다.

단, 하기 실시예들은 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 내용이 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 토양 메타게놈 DNA의 분리

본 발명자들은 경상남도 김해시 대동면과 경상북도 청송군, 영양군 일대의 고추 및 딸기 근권 토양을 2005년과 2006년에 채취하여 메타게놈 라이브러리 작성 에 사용하였다. 상기 채취한 토양은 각 구멍이 2 mm 직경인 체에 쳐서 1.5 mm 이상의 입자와 식물 잔재물 등을 제거하고 메타게놈 추출을 위하여 5 g씩 사용하였다. 메타게놈 추출은 토양에 SDS와 프로테이나제 K(proteinase K)를 처리하여 DNA를 추출하였다.

구체적으로, 채취한 토양 5 g을 완충용액 15 ml에 넣어 섞어주었다. 상기 완충용액의 조성은, 100 mM의 Tris-HCl(pH 8.0), 100 mM의 EDTA(pH 8.0), 100 mM의 인산나트륨(sodium phosphate)(pH 8.0), 1.5 M의 NaCl, 및 1%의 CTAB로 구성하였다. 상기 완충용액에 현탁이 된 토양에 100 mg/ml 농도의 프로테이나제 K를 100 ㎕ 첨가하고 37℃ 진탕배양기에서 150 rpm의 속도로 30분간 진탕하였다. 이후에 20%의 SDS를 1.5 ml 첨가하고 잘 흔들어 섞어주었다. 이를 65℃ 항온수조에서 30분마다 한번씩 섞어주면서 2시간 동안 유지하였다. 이후에 7,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액을 분리하고 같은 부피의 클로로포름/아이소 아밀 알코올(24 : 1)을 첨가하여 섞어준 후 8,000 rpm에서 5분간 원심분리하여 DNA가 포함된 상등액을 새 튜브로 옮겼다. 상등액의 부피의 0.6배에 해당하는 아이소프로파놀(isopropanol)을 첨가하고 섞은 후, 11,000 rpm에서 5분간 원심분리하여 DNA 침전물을 얻은 다음, 이를 70% 에탄올을 첨가하여 재원심분리하고 침전물을 말려서 0.5 ml의 TE 완충액(10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0)에 녹여서 4℃에 보관하였다.

그 결과, 해당 토양 시료로부터 메타게놈을 분리하여 토양 1 g 당 약 1 ~ 1.5 ㎍의 DNA를 회수하였고 분리된 DNA 크기는 약 20 ~ 100 kb로 분리가 가능하였 다.

<실시예 2> 메타게놈 라이브러리의 작성

본 발명자들은 상기 <실시예 1>에서 추출해낸 메타게놈으로부터 라이브러리를 구축하였다. 이때, DNA의 전기영동, 플라스미드(plasmid) 분리, 및 DNA의 절단은 기준이 되는 분자생물학적 방법(Sambrook 등 1989, Molecular cloning: a laboratory manual, 3rd ed. Cold Spring Habor Laboratory., Cold Spring Habor, NY.)으로 수행하였다.

구체적으로, 추출해낸 메타게놈을 저융점 아가로즈겔(low melting point agarose gel)에서 전기영동한 후, 25 kb 이상의 DNA를 포함하는 아가로즈 블락(agarose block)만을 회수하였고, 이를 GeLase(Epicentre, USA)를 처리하여 DNA를 순화하였다. 상기 과정을 통하여 부식산(humic acid)을 제거할 수 있었다. 순화된 DNA 조각의 양끝 말단을 DNA 말단 회복(DNA end-repair) 효소를 이용하여 수리하고, 25-kb 이상의 메타게놈을 제한효소 Eco72I로 처리한 포스미드 벡터 pEpiFOS-5(Epicentre, USA)에 라이게이션(ligation)한 후 packagene extract(Epicentre. USA)를 이용하여 대장균(E. coli)에 도입하여 형질 전환체들을 선발하였다. 형질 전환체들로부터 재조합 효율을 검정하기 위하여 전통적인 SDS-알칼리 용해(SDS-alkali lysis) 방법으로 플라스미드를 분리한 후 제한효소로 절단하여 전기영동하였다.

그 결과, 검정한 60여개의 모든 형질전환체들은 모두 재조합 플라스미드로 확인되어 라이브러리가 잘 작성됨을 알 수 있었다. 토양 메타게놈 DNA 1 ㎍당 20,000 ~ 40,000 클론을 확보하였다. 작성된 라이브러리는 500 ~ 1,000 클론씩 풀(pool)로 -80℃에서 보관하였다. 작성된 라이브러리는 총 142,900 클론이었다. 삽입된 메타게놈 DNA의 평균 크기는 무작위로 메타게놈 라이브러리 클론 플라스미드를 추출하여 BamHI으로 절단한 후 전기영동하여 확인한 결과 35 kb 이상으로 나타났다.

<실시예 3> 메타게놈 라이브러리의 지질분해 활성 클론 선발

본 발명자들은 상기 <실시예 2>에서 구축한 메타게놈 라이브러리로부터 지질분해 활성을 갖는 클론을 선발하였다.

구체적으로, 저장된 각 라이브러리 풀(library pool)을 희석 평판법을 사용하여 알맞은 희석배수를 밝히고, 정해진 희석 배수에서 한 개의 풀(pool)당 저장된 클론수의 3배수 정도가 되도록 플레이트(plate)에 배양하여 활성 클론의 탐색을 위해서 사용하였다. 라이브러리 클론의 희석을 위해서는 희석 완충용액(diluent buffer)[NaCl: 8.5 g; KH₂PO₄: 0.3 g; Na₂HPO₄: 0.6 g; 젤라틴(gelatin): 0.1 g]를 사용하였다. 작성된 메타게놈 라이브러리로부터 지질 분해 효소 생산 클론의 탐색을 위해 1%의 트리뷰티린(tributyrin; TBN)이 첨가된 LB 아가(agar) 배지 위에 적정 희석배수를 정해서 라이브러리 클론들을 도말한 후에 3 ~ 4일간 37℃에 배양하여 트리뷰티린이 분해되어 투명환(clear zone)이 대장균 주위에 보이는 클론들을 선발하였다. 활성을 나타내는 클론은 동일한 배지에 순수 배양하여 2차적으로 활성을 검정하였다. 선발된 지질 분해 효소 생산 클론들은 플라스미드 DNA를 분리하고 제한효소 BamHI을 사용해 삽입 DNA를 분석하고 동일한 클론들은 제외시켰다. 선발된 활성 클론은 플라스미드를 재분리하고 대장균 EPI-100에 형질전환하여 지질분해 활성을 재검정하고 -80℃에 보관하였다.

그 결과, 총 142,900 클론을 탐색하여 지질 분해 활성을 가지는 14 클론을 선발하였다. 선발된 클론의 플라스미드를 분리하여 제한효소 BamHI으로 반응시키고 아가로즈겔 전기영동을 통해 확인한 후에 중복되는 클론을 제거하였다. 지질 분해 활성을 가지는 클론 중에서 가장 활성이 좋은 클론을 선발하여 'pFlp-2'라고 명명하였다.

<실시예 4> 지질분해 활성 유전자 부위 결정 및 염기서열 결정

<4-1> 지질분해 활성 유전자 부위 결정

본 발명자들은 토양으로부터 분리된 메타게놈에서 지질분해 활성 유전자 부위를 결정하였다.

구체적으로, 지질 분해 활성이 가장 우수한 pFlp-2으로부터 플라스미드 DNA를 대량으로 분리하였고, 플라스미드 DNA를 제한효소 BfuCI으로 부분 절단하여 DNA 크기를 2 내지 5 kb로 만들었다. 상기 DNA 절편들을 BamHI으로 절단한 pUC119(Vieira 및 Messing, Methods Enzymol. 153: 3-11, 1987)에 라이게이션하여 2차 숏건 라이브러리(shot gun library)를 작성하였다. 작성된 라이브러리를 암피 실린(ampicillin)과 트라이뷰티린이 첨가된 LB 배지에 도말하고 37℃에서 2일간 배양하여 지질분해 활성 서브클론을 분리하였다.

그 결과, 분리한 활성 서브클론중 삽입 DNA가 가장 작은 서브클론을 선발하여 'pElp-2'로 명명하였다.

<4-2> 염기서열 분석

상기 실시예 <4-1>에서 결정한 지질분해 활성 유전자 부위의 염기서열을 분석하였다.

구체적으로, pElp-2의 DNA 염기서열 결정은 제노텍(Daejeon, Korea)에 분석을 의뢰하였다. 밝혀진 DNA 염기서열은 NCBI(the National Center for Biotechnology Information)에서 제공하는 BLAST 프로그램을 사용하여서 분석하였다.

그 결과, 지질분해 활성을 가지는 서브클론이 서열번호 1으로 기재되는 1,631 bp의 염기서열을 가짐을 확인하였고, 상기 염기서열을 포함하는 서브클론을 pElp-2로 명명하였다. 서열번호 1의 염기서열을 갖는 지질분해 활성 유전자를 기존에 보고된 효소들과 비교한 결과, 21 ~ 23% 정도의 낮은 상동성을 보여 지질분해 활성을 암호화하는 신규한 유전자로서 확인되었다.

<4-3> 아미노산 서열 분석

상기 실시예 <4-1>에서 결정한 염기서열을 이용하여 이로부터 암호화되는 아 미노산 서열을 분석하였다.

구체적으로, 상기 서열번호: 1로 기재되는 염기서열로부터 암호화되는 서열번호 2의 397개 아미노산 서열로 구성된 에스터라제 단백질을 에스터라제 'ELP2-1'로 명명하였다. 단백질의 분자량이 42,398 Da으로 유추된 아미노산 서열을 NCBI에서 제공하는 BLAST 프로그램을 사용하여서 분석하였다.

그 결과, 지질분해 효소들이 공통적으로 가지고 있는 Gly-Xaa-Ser-Xaa-Gly(서열번호: 3) 영역(여기서, 'Xaa'는 임의의 아미노산일 수 있다)을 가지고 있는 것을 확인하였다. 이전에 보고 되었던 단백질들에 대해 50% 이하의 상동성을 보였으며, 대부분이 기능이 알려지지 않은 단백질들이며, 효소로 기능이 알려진 유전자 중에서 유추된 아미노산 서열이 가장 유사한 단백질은 메타노콜푸스컬럼 라브레아눔 Z(Methanocorpusculum labreanum Z)의 잠재적 가수분해효소(putative hydrolase)(ABN07867, 23% identity)와 배양되지 않은 박테리아의 에스테라제(esterase) Est5S(ABI17943, 21%)만이 발견되었다. 따라서 상기 선발된 지질 분해 활성 효소가 신규 에스터라제(esterase) 또는 리파제(lipase) 계열 중 하나인 것을 알 수 있었다.

<실시예 5> 지질분해 활성 유전자 부위를 포함하는 형질전환체의 제조

본 발명자들은 pFlp-2를 대량으로 생산할 수 있는 형질전환체를 제조하였다.

구체적으로, 서브클론 pElp-2를 콤피턴트 대장균 세포 DH5a 50와 혼합한 후 얼음에서 20분간 정치시킨 다음, 42℃에서 45초간 열처리하여 서브클론을 콤피턴트 세포내로 도입한 후, LB 배지 400 ㎕를 가하여 37℃에서 45분 동안 배양하였다. 이로부터 형질전환체를 선별하기 위하여 1%의 트라이뷰티린과 암피실린이 100 ㎍/㎖ 함유된 LB 플레이트에 도말하여 37℃에서 16시간 배양하였다. 배양된 플레이트로부터 트라이뷰티린을 가수분해하여 강한 후광을 보이는 콜로니들을 선별하고 pFlp-2 도입여부를 플라스미드 DNA를 분리하고 제한효소 BamHI, EcoRI, HindIII, XhoI 및 SacI의 절단양상을 판별하여 확인하였다.

그 결과, 강한 지질분해 활성을 유지하는 pFlp-2를 함유한 대장균 DH5a 세포를 제조하였고, 상기 균주를 글리세롤 스톡으로 -80℃에 보관하였다.

<실시예 6> 지질분해 활성 유전자 과발현과 ELP2-1 단백질 분리

본 발명자들은 플라스미드 pElp-2에 존재하는 지질분해 활성 유전자를 효소활성 단백질로 순수분리하였다.

구체적으로, 히스티딘 태킹(histidine tagging)하는 과발현 벡터인 pET-30b(+)(NOVAGEN, Germany)에 클로닝(cloning)하기 위해서 종결코돈이 그대로 위치하면서 양쪽 말단에 EcoRI과 NotI 영역을 가질 수 있도록 해주는 프라이머(primer)를 제작하여 pElp-2 유전자를 원판으로 PCR을 실시하였다. 사용된 프라이머의 서열은 하기와 같다:

elp2f : 5'-AGGCGAATTCGATGCTCCGCAGAGGC-3'(서열번호: 4) <EcoRI 포함>

elp2r : 5'-TCACGCGGCCGCTTTACTTGTTTTT-3'(서열번호: 5) <NotI 포함>

PCR 반응물은 50 ㎕ 용액에 10X Taq DNA buffer, dNTPs, Taq DNA polymerase, 2 mM MgSO₄, 약 1 ~ 5 ng의 주형(template) DNA를 조합하였다. PCR 조건은 95℃에서 3분의 초기 변성을 실시하고, 총 30 사이클(cycle)의 95℃에서 30초간 변성, 65℃에서 30초간 어닐링(annealing), 및 72℃에서 1분 30초간 확장반응을 실시하였으며, 마지막으로 72℃에서 5분간 확장반응을 실시하였다.

증폭된 PCR 산물은 pET-30b(+) 벡터로의 클로닝 효율을 높이기 위해서 pGEM-Teasy vector에 1차적으로 라이게이션을 실시한 후에 EcoRI과 Not I으로 절단하고 동일한 제한 효소로 잘려진 pET-30b(+) 벡터에 클로닝하였다. 재조합된 플라즈미드는 'pELP2-1'이라고 명명하였다. 그리고 숙주(host) 균주인 E. coli BL21(DE3) pLysS에 형질전환해서 클로람페니콜(chloramphenicol), 카나마이신(kanamycin) 및 1 mM 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노사이드(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside; IPTG)가 첨가된 LB 트라이뷰티린 아가 배지에서 활성을 나타내는 형질전환체를 선발하였다. 최종 선발된 E. coli BL21 (DE3) pLysS pELP2-1는 지질 분해 효소를 분리하기 위해 사용되었다.

ELP2-1 융합단백질을 분리하기 위해, 항생제가 포함된 LB 액체배지에 접종하여 37℃에서 종균 배양을 한 후에 다음날 새로운 LB 액체배지 500 ㎖에 신선한 균을 접종하여 A₆₀₀값이 0.6이 될 때까지 배양을 했다. ELP2-1 융합단백질의 발현을 유도하기 위해, 1 mM의 IPTG를 첨가한 후에 25℃로 옮겨서 추가적으로 4시간을 배양하고 세포를 원심분리하여 회수하였다. 상기 방법으로 과발현된 융합단백질인 ELP2-1이 불용성 분획(insoluble fraction)으로 축적되었으므로 융합단백질을 변 성(denaturation) 상태에서 분리하였다. 변성 상태에서 ELP2-1 융합단백질을 분리하는 방법은 다음과 같다: 회수된 세포에 용해완충용액 B(lysis buffer B)(100 mM NaH₂PO₄, 10 mM Tris-Cl, 8 M Urea, pH 8.0)를 첨가하여 얼음에서 15분간 반응시키고 상온에서 1시간 동안 약하게 교반하였다. 반응이 끝난 후에 용해물(lysate)은 상온조건에서 10,000 g로 30분간 원심분리를 실시하고 세포 잔해(cell debris)를 제거한 상등액을 ELP2-1 융합단백질을 분리하기 위해서 사용하였다. 세포용해물의 상등액 4 ㎖ 당 1 ㎖의 50% Ni-NTA 아가로즈(QIAGEN, Germany)를 첨가하여 회전식 진탕기(rotary shaker)에서 200 rpm으로 1시간 동안 실온에서 반응시켰다. 반응이 끝나면 용해물(lysate)과 레진(resin)의 혼합물을 컬럼(column)에 로딩(loading)한 후, Ni-NTA 레진에 결합되지 않은 단백질 용액은 따로 수집하였다. 레진을 세척 완충용액 C(wash buffer C)(100 mM NaH₂PO₄, 10 mM Tris-Cl, 8 M Urea, pH 6.3) 4 ㎖로 두 번 세척하고, 용리 완충용액 D(elution buffer D)(100 mM NaH₂PO₄, 10 mM Tris-Cl, 8 M Urea, pH 5.9) 0.5 ㎖로 4번 용리시킨 후, 마지막으로 용리 완충용액 E(elution buffer E)(100 mM NaH₂PO₄, 10 mM Tris-Cl, 8 M Urea, pH 4.5) 0.5 ㎖로 4번 용리시켰다. 상기 용리 단계를 제외한 각 단계에서는 1 ㎖씩 시료를 회수하였다.

분리된 ELP2-1 융합단백질과 각 단계의 시료들은 12% SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)를 통해서 확인하였다. SDS-PAGE 전기영동 후 단백질의 검출은 쿠마시블루(coomassie blue) 염색 방법을 통해서 확인하였다. 분리한 융합단백질의 지질 분해 활성 측정을 위해서 변성 상태로 분리된 ELP2-1 융합단백질은 단계적 투석을 통해서 요소(urea)를 제거하였고 최종적으로 100 mM 인산나트륨 완충용액(sodium phosphate buffer)(pH 7.0)에 녹였다. 투석을 마친 ELP2-1 융합단백질은 다시 SDS-PAGE를 통해서 확인하였다.

그 결과, 도 1에서 보는 바와 같이 예상했던 크기인 약 43 KDa보다 큰 50 KDa 이상의 크기를 가지는 분리된 단백질 밴드(band)를 확인할 수 있었다. 이는 ELP2-1 융합단백질이 히스티딘 태깅(histidine tagging)에 의해 융합되면서 일어난 크기의 변화와 일치하였다(도 1).

<실시예 7> 순수분리한 ELP2-1 단백질의 효소활성 측정

<7-1> 기질특이성 분석

본 발명자들은 재생(Renaturation)되어 활성이 확인된 순화된 ELP2-1 융합단백질의 기질특이성을 측정하였다.

구체적으로, 2 mM의 p-나이트로페닐(p-nitrophenyl; pNP) 아실에스테르(acylester)[p-나이트로페닐 뷰티레이트(butyrate), 발러레이트(valerate), 옥타노에이트(octanoate), 데카노에이트(decanoate), 팔미테이트(palmitate)]를 0.1 M NaCl과 0.3%의 Triton X-100이 포함된 100 mM 인산 완충액(pH 7.0)에 0.1 mM의 농도로 희석하여 총 700 ㎕로 혼합액을 만들고 분리된 ELP2-1 융합단백질(8 ㎎/㎖) 용액을 100 ㎕ 첨가하여 UV/VIS 분광광도계(spectrophotometer) DU730(Beckman Coulter)를 사용하여 400 nm에서 각 기질에 대한 효소 활성을 측정하였다. 효소활 성 분석을 위하여 ELP2-1 융합단백질의 1 유닛(unit)은 p-나이트로페닐 아실에스테르(p-nirophenyl acylester)와 반응하여 분당 1 umol의 p-나이트로페놀(p-nitrophenol)을 만들어내는 효소의 양으로 정의하였다. p-나이트로페닐 뷰티레이트에 대하여 가장 높은 활성을 나타내었다. 따라서 p-나이트로페닐 뷰티레이트에 대한 활성을 기준으로 하여 다른 기질에 대한 활성을 백분율로 환산하여 분석하였다.

그 결과, 도 2에서 보는 바와 같이 활성 측정에 사용한 여러 기질 중 짧은 사슬 p-나이트로페닐 아실에스테르인 p-나이트로페닐 뷰티레이트와 p-나이트로페닐 발러레이트에 대해 각각 100%와 85%의 높은 활성을 나타내었지만, 긴 사슬 p-나이트로페닐 아실에스테르인 p-나이트로페닐 옥타노에이트, p-나이트로페닐 데카노에이트 및 p-나이트로페닐 팔미테이트에 대해서는 각각 40.27%, 51.92% 및 14.95%의 낮은 활성을 나타냈다(도 2). 이러한 결과를 바탕으로 지질 분해 효소 ELP2-1이 에스터라제임을 확인하였다.

<7-2> 최적 온도 및 pH 분석

ELP2-1 융합단백질의 반응 최적 온도를 알아보기 위해, p-나이트로페닐 뷰티레이트를 사용하여 15 ~ 70℃의 범위내 다양한 온도의 0.1 M NaCl과 0.3%의 Triton X-100이 포함된 100 mM 인산 완충액(pH 7.0) 혼합액을 사용하여 각 온도 조건에서의 효소활성을 측정하였다.

그 결과, 도 3에서 보는 바와 같이 최적 온도는 35℃였으며, 50℃ 이하의 조 건에서도 50% 이상의 활성을 나타내었다(도 3).

또한, ELP2-1 융합단백질의 반응 최적 pH를 알아보기 위해, pH 3.0 ~ 11.0의 범위에서 실시하였으며, pH별 완충액은 pH 3.0 ~ 4.0은 글라이신(glycine)-HCl 완충액, pH 5.0 ~ 7.0은 인산나트륨(sodium phosphate) 완충액, pH 8.0 ~ 9.0은 Tris-HCl 완충액, pH 10.0 ~ 11.0은 글라이신-NaOH 완충액을 사용하여 35℃에서 효소활성을 측정하였다.

그 결과, 도 4에서 보는 바와 같이 효소반응의 최적 pH는 pH 8.0이었고, pH 7.0 ~ 9.0 사이에서도 50% 이상의 활성을 보였다(도 4).

이상의 최적 반응조건에서 p-나이트로페닐 뷰티레이트를 기질로 이용하여 효소활성을 분석한 결과, ELP2-1 융합단백질의 V_max값은 71.733 U/㎖ 이었고 K_m값은 37 mM이었다.

<7-3> 효소 활성 안정성 분석

많은 지질 분해 효소들은 유기용매에서 안정성이 뛰어나 유기 화학 반응에 이용될 수 있다(Jaeger 등., Curr. Opin. Biotechnol. 13:390-397, 2002). 이에, 본 발명에서 순수 분리한 ELP2-1 융합단백질의 효소 활성 안정성을 측정하기 위해 여러 가지 유기용매 조건에서 효소 반응을 실시하여 분석하였다.

우선, ELP2-1 융합단백질의 효소 활성 안정성 측정을 위해서 아세톤, 아세토니트릴(acetonitrile), 부탄올, 디메틸 술폭시드(dimethyl sulfoxide; DMSO), 디메 틸 포름아마이드(dimethyl formamide; DMF), 헥산 및 이소프로판올와 메탄올을 각각 15%(vol/vol)와 30%(vol/vol)의 농도로 사용하였다. 그리고 EDTA는 최종 10 mM이 되게 하였고 SDS의 경우 1%(wt/vol)가 되게 첨가하여 활성을 측정하였다. 각 실험에서는 대조구로써 동량의 BSA 용액(8 ㎎/㎖)을 사용하였다. 각 조건에서 효소 활성 안정성의 측정은 0.1 M 인산 완충용액(pH 8.0)에 기질로 p-나이트로페닐 뷰티레이트를 사용하여 35℃ 조건에서 실시하였고 각 조건에서의 효소활성을 대조군과 비교하여 백분율로 환산하여 평가하였다.

그 결과, 도 5에서 보는 바와 같이 ELP2-1 융합단백질은 15%의 부탄올과 15%의 메탄올에서는 대조구에 비하여 활성이 증가하였고, 10 mM의 EDTA, 15% 및 30%의 DMSO, 30%의 메탄올과 15%의 이소프로판올 조건의 반응액에서도 50% 이상의 활성을 나타내었다. 그리고 1%의 SDS가 첨가된 조건과 30%의 헥산이 첨가된 조건에서는 활성이 전혀 나타나지 않았다(도 5).

<실시예 8> ELP2-1 단백질의 3-OH PAME 분해 활성 측정

<8-1> E. coli EPI-100 pFlp2-1의 제작

본 발명자들은 제작된 플라스미드 pELP2-1에 EcoRI과 NotI 두개의 제한효소를 처리하여 지질 분해 활성 유전자만 잘라내고 클레나우(Klenow; klenow fragment) 효소를 처리하여 블런트 엔드(blunt end)로 Eco72I로 절단한 pEpiFOS-5 플라스미드에 서브클로닝(subcloning)하였다. 이렇게 만들어진 재조합 플라스미드를 E. coli EPI-100에 형질전환하여 'E. coli EPI-100 pFlp2-1'를 제작하였다.

<8-2> 외피다당류 생산 균주를 이용한 3-OH PAME 분해 활성 분석

E. coli EPI-100 pFlp2-1 균주를 실험구로, 및 라이브러리 제작에 사용된 플라스미드를 가지는 E. coli EPI-100 pEpiFOS-5를 대조구로 사용하여, 상기 실시예에서 선발된 지질 분해 활성 유전자의 3-OH PAME 분해 활성 측정을 위한 선행 실험을 실시하였다.

구체적으로, 3-OH PAME의 분해 활성은 실험 대상 균주인 랄스토니아 솔라나세럼(Ralstonia solanacearum; R. solanacearum) SL2029 균주가 외피다당류(EPS)를 생산하는지 여부를 교차배양하여 확인하였다. 이는 랄스토니아 솔라나세럼(R. solanacearum)에서 EPS의 생산이 3-OH PAME에 의해 양성적으로 조절되는 것을 이용하였다. 실험 방법은 다음과 같다: 우선, 대조구인 E. coli EPI-100 pEpiFOS-5와 실험구인 E. coli EPI-100 pFlp2-1 균주를 각각 TZC 아가(agar) 배지에 세로 방향으로 스트리크(streak)하여 2일간 37℃에서 배양하였다. 이렇게 E. coli 균주가 배양된 위치와 직각 방향으로 랄스토니아 솔라나세럼 SL2029 균주를 교차 스트리크하여서 이틀간 배양하며 두개의 실험군 사이의 교차 이후 자란 랄스토니아 솔라나세럼 SL2029 균주에서 EPS 생산량 차이를 비교하였다.

그 결과, 도 6에서 보느 바와 같이 ELP2-1 융합단백질을 생산하는 E. coli EPI-100 pFlp2-1 균주에 의해서 랄스토니아 솔라나세럼 SL2029의 EPS 생산이 현저히 줄어들었다(도 6). 이를 통해, 본 발명의 ELP2-1 에스터라제가 3-OH PAME을 분해하므로 랄스토니아 솔라나세럼에서 EPS 생산을 억제시킬 수 있음을 알 수 있었 다.

<8-3> 기체 크로마토그래피를 이용한 3-OH PAME 분해 활성 분석

본 발명의 에스터라제에 의한 3-OH PAME 분해를 효소반응 후 기체 크로마토그래피(Gas Chromatography; GC) 분석을 통해 확인하였다.

구체적으로, 기질인 3-OH PAME 0.5 ㎎을 20 ㎕의 DMSO에 녹이고 10 mM 인산 완충액(pH 7.0) 380 ㎕에 혼합하였다. 반응물에 ELP2-1 융합단백질 용액(8 ㎎/㎖)을 4 ㎕에 넣고 1 시간 동안 37℃에서 반응시켰고, 35% HCl 20 ㎕를 첨가하여 반응을 중지시켰다. 마지막으로 디클로로메탄(dichloromethane) 400 ㎕를 첨가하여 반응물에 존재하는 3-OH PAME을 추출하였다. 반응의 대조구로서 모든 반응 조건을 동일하게 준비하고 ELP2-1 융합단백질 대신 8 ㎎/㎖의 우태혈청(Bovine Serum Albumin; BSA)을 첨가하여 동일조건에서 반응을 수행하였다. 추출된 시료 내의 3-OH PAME은 불꽃 이온화 검출기(flame ionization detector)가 장착된 길이 30 m, 직경 0.32 ㎜의 HP-INNOWAX 컬럼(column)이 장착된 Shimadzu GC 크로마토그래피를 사용하여 분석하였다. 반응 조건은 주입부(injection port)의 온도가 300℃, 컬럼의 온도는 150℃로 6분간 반응시키고 220℃에 도달할 때까지 분당 10℃씩 온도를 올렸다. 반응 시간은 총 45분이었다. GC 분석에는 추출된 시료 1 ㎕을 사용하였다.

먼저, GC를 이용하여 3-OH PAME의 검출에 대한 표준시간을 결정하기 위해 3-OH PAME와 디클로로메탄(dichloromethane)만으로 GC 분석을 실시한 결과, 유지시 간(retention time)이 분석 시작 후 21분임을 확인하였다. 이 결과를 바탕으로 상기의 반응액의 GC 분석을 실시한 결과, 도 7에서 보는 바와 같이 ELP2-1 융합단백질 실험군(뒤쪽 그래프)의 경우 대조군(앞쪽 그래프)에 비해서 3-OH PAME의 양이 현저히 줄어든 것을 관찰할 수가 있었다(도 7). 따라서 본 발명의 ELP2-1 에스터라제가 3-OH PAME을 직접 분해함을 알 수 있었다.

본 발명의 에스터라제는 기질 특이성 및 효소 활성 특이성이 있어서 식물병원성 세균에 대한 저항성 작물 개발, 및 식물병원성 세균에 의한 세균병 제어제 개발에 이용될 수 있으며, 이때 상기 효소의 활성을 증가시키기 위해 효소의 화학적 변형, 효소정제, 유기용매 처리, 반응조건 선택 및 반응 용매 설계 등의 다양한 기술을 응용할 수 있다.

도 1은 토양 메타게놈에서 분리한 에스터라제 ELP2을 융합단백질로 순수분리한 결과 SDS-PAGE 분석한 결과를 나타낸 그림이다:

S는 단백질 크키를 표시하는 마커이고; 및

ELP2-1은 순수분리한 단백질이다.

도 2는 순수분리한 에스터라제 ELP2-1에 의해 여러 가지 기질들에 대한 에스터라제 활성을 p-나이트로페닐 뷰티레이트(p-nitrophenyl butyrate)에 대한 효소 활성을 기준으로 하여 백분율로 나타낸 그래프이다:

p-NP는 p-나이트로페닐(p-nitrophenyl)을 의미한다.

도 3은 순수분리한 에스터라제 ELP2-1의 최적 활성을 위한 다양한 온도 조건에서의 p-나이트로페닐 뷰티레이트에 대한 효소 활성을 나타낸 그래프이다.

도 4는 순수분리한 에스터라제 ELP2-1의 최적 활성을 위한 다양한 pH 조건에서의 p-나이트로페닐 뷰티레이트에 대한 효소 활성을 나타낸 그래프이다.

도 5는 순수분리한 에스터라제 ELP2-1의 반응액에 여러 가지 유기용매가 첨가되었을 때 상기 용매가 p-나이트로페닐 뷰티레이트에 대한 효소 활성에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.

도 6은 순수분리한 에스터라제 ELP2-1의 랄스토니아 솔라나세럼(Ralstonia solanacearum; R. solanacearum) SL2029 균주의 외피다당류(EPS) 생산에 미치는 영향을 나타낸 그림이다.

도 7은 순수분리한 에스터라제 ELP2-1의 3-OH PAME에 대한 분해 활성을 GC를 통해 검출한 결과를 나타낸 그림이다:

21분의 유지 시간(retention time)에 보이는 피크(peak)가 3-OH PAME을 나타내며, 대조군(control)은 BSA를 이용한 것이다.

<110> KOREA RESEARCH INSTITUTE OF CHEMICAL TECHNOLOGY <120> NOVEL GENE ENCODING ESTERASE DERIVED FROM SOIL METAGENOME AND THE ESTERASE <130> 9p-01-30 <160> 5 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1631 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid sequence of novel gene encoding esterase <400> 1 gatcttattc acagcttcca cccggttggt actgaccggg ttgacgaccg gtttgccctg 60 aaccaacccc tgcccgactc ccggcagcct gatcaacacg agcctggacg aggcctgcca 120 tggcctactc gtcaatccag aattctcagg attgcagcgt ttctgttata gttcggctgc 180 acccgtagaa acaaccgact tcgcaagtta tcaaccaacc actggaggca acgaagatgc 240 tccgcagagg cacctctttt ctgaccctcg cgtttgccgt tttcctaact ggcgcggcac 300 tcgcacagac aacaccacag acggcacaac ctgcgcagcc ccgtaacgac tacagcaaac 360 ccgattcgtg gctctgtcgg cccggccggc aggatccatg caccgtcgac ctcaccacca 420 ctgtcgtcgc ggcgaatggc aagctttcac gcgaagagtt taagtcaaat acaaatgcgc 480 cgattgattg tttctacgtc tacccgaccg tgtcgctcga caccaccccg aatagcgata 540 tgacagcagg cgctgaggaa gccgcggtag ttcgcggaca gcttgcacga tttggggcgc 600 attgccgaat ctacgcgcca ctctatcgtc agatcacact gacagcgctt cgatccgtga 660 tggggggccg tcccgcggcc ggtatggatc gagctctcgc gtacaacgat gtacacgatg 720 cgtggaagca ctaccttcaa aacgacaatc agggtcgcgg tgtcgttctc atcggtcatt 780 ctcagggctc catggtgctg acccagctca tcacgaatga gatcgatggg aagcctgttc 840 aggagcgcat cgtgtccgca ctactactcg gatctaacgt tgcagttcca cgtggcaaag 900 atgttggtgg ctcattcaag catatgccgc tctgccgctc agccaaacaa acggggtgtg 960 tcatcactta tgcttctttc cgatcgacag tgcctccgcc caccgcttcc cttttcggac 1020 gcgtgcagga caaggagatg gttgcagcct gtaccaaccc ggcagcgctc gctggtggca 1080 agggcagtct gcacgcttat ctttcagcgg cggctcgtgt gacaagtgcc gcagctgaac 1140 ccaggccctg ggtgacaccg gcacagaaga tcgacacgcc gtttgtgagt gtgccgggcc 1200 tgctgaccgg cgaatgcgtc tctaaggatg gcgcctcata cctcgaggtg accgtcaatg 1260 cagatccagc cgacccccga acagatgaca tttcgggaga cgttctcacc aacggtcagg 1320 tgcaggcatc gtggggtctt catctgattg atgtccatgt cgcgatggga aatctagtcg 1380 aaatcgtcgg gcagcagtcg agcgcatttc gcgcaagcaa aaacaagtaa accagaagag 1440 tgaggcagtt ccatgcgaat gcaacaacgt ctcgggctga tagtcgtcgc catttttgcc 1500 acgtttgcca cgtttggtgg attggagctc tcgtcctcga gggcatcgca gtcaacgccg 1560 gaagagcgtg gtctaagaaa cctaaaaggg gcaatgccta tggctttccg actctgaacg 1620 agaagctgat c 1631 <210> 2 <211> 397 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of novel esterase <400> 2 Met Leu Arg Arg Gly Thr Ser Phe Leu Thr Leu Ala Phe Ala Val Phe 1 5 10 15 Leu Thr Gly Ala Ala Leu Ala Gln Thr Thr Pro Gln Thr Ala Gln Pro 20 25 30 Ala Gln Pro Arg Asn Asp Tyr Ser Lys Pro Asp Ser Trp Leu Cys Arg 35 40 45 Pro Gly Arg Gln Asp Pro Cys Thr Val Asp Leu Thr Thr Thr Val Val 50 55 60 Ala Ala Asn Gly Lys Leu Ser Arg Glu Glu Phe Lys Ser Asn Thr Asn 65 70 75 80 Ala Pro Ile Asp Cys Phe Tyr Val Tyr Pro Thr Val Ser Leu Asp Thr 85 90 95 Thr Pro Asn Ser Asp Met Thr Ala Gly Ala Glu Glu Ala Ala Val Val 100 105 110 Arg Gly Gln Leu Ala Arg Phe Gly Ala His Cys Arg Ile Tyr Ala Pro 115 120 125 Leu Tyr Arg Gln Ile Thr Leu Thr Ala Leu Arg Ser Val Met Gly Gly 130 135 140 Arg Pro Ala Ala Gly Met Asp Arg Ala Leu Ala Tyr Asn Asp Val His 145 150 155 160 Asp Ala Trp Lys His Tyr Leu Gln Asn Asp Asn Gln Gly Arg Gly Val 165 170 175 Val Leu Ile Gly His Ser Gln Gly Ser Met Val Leu Thr Gln Leu Ile 180 185 190 Thr Asn Glu Ile Asp Gly Lys Pro Val Gln Glu Arg Ile Val Ser Ala 195 200 205 Leu Leu Leu Gly Ser Asn Val Ala Val Pro Arg Gly Lys Asp Val Gly 210 215 220 Gly Ser Phe Lys His Met Pro Leu Cys Arg Ser Ala Lys Gln Thr Gly 225 230 235 240 Cys Val Ile Thr Tyr Ala Ser Phe Arg Ser Thr Val Pro Pro Pro Thr 245 250 255 Ala Ser Leu Phe Gly Arg Val Gln Asp Lys Glu Met Val Ala Ala Cys 260 265 270 Thr Asn Pro Ala Ala Leu Ala Gly Gly Lys Gly Ser Leu His Ala Tyr 275 280 285 Leu Ser Ala Ala Ala Arg Val Thr Ser Ala Ala Ala Glu Pro Arg Pro 290 295 300 Trp Val Thr Pro Ala Gln Lys Ile Asp Thr Pro Phe Val Ser Val Pro 305 310 315 320 Gly Leu Leu Thr Gly Glu Cys Val Ser Lys Asp Gly Ala Ser Tyr Leu 325 330 335 Glu Val Thr Val Asn Ala Asp Pro Ala Asp Pro Arg Thr Asp Asp Ile 340 345 350 Ser Gly Asp Val Leu Thr Asn Gly Gln Val Gln Ala Ser Trp Gly Leu 355 360 365 His Leu Ile Asp Val His Val Ala Met Gly Asn Leu Val Glu Ile Val 370 375 380 Gly Gln Gln Ser Ser Ala Phe Arg Ala Ser Lys Asn Lys 385 390 395 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> common sequence of amino acid <400> 3 Gly Xaa Ser Xaa Gly 1 5 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> elp2f primer <400> 4 aggcgaattc gatgctccgc agaggc 26 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> elp2r primer <400> 5 tcacgcggcc gctttacttg ttttt 25

Claims (18)

1. 에스터라제(esterase) 활성을 갖는 하기 a 내지 c 중 어느 하나의 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드의 변이체 또는 이의 활성 단편:

   a) 서열번호 1로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드;

   b) 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건에서 혼성되는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드; 및,

   c) 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드.
2. 제 1항에 있어서, 최적온도가 10 ~ 50℃, 및 최적 pH가 7.0 ~ 9.0인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드, 이의 변이체 또는 이의 활성 단편.
3. 제 1항에 있어서, 3-하이드록시팔미트산 메틸 에스테르(3-hydroxypalmitic acid methyl ester; 3-OH PAME)를 분해시키는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드, 이의 변이체 또는 이의 활성 단편.
4. 제 1항의 폴리펩티드, 이의 변이체 또는 이의 활성 단편을 암호화하는 폴리 뉴클레오티드.
5. 제 4항에 있어서, 서열번호 1로 기재되는 염기 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
6. 제 4항의 폴리뉴클레오티드가 조절 서열에 작동가능하게 연결된 유전자 컨스트럭트.
7. 제 6항의 유전자 컨스트럭트를 포함하는 재조합 발현벡터.
8. 제 7항의 재조합 발현벡터가 숙주세포에 형질 도입된 형질전환체.
9. 1) 제 4항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현벡터를 제조하는 단계;

   2) 상기 재조합 발현벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 제조하는 단 계; 및,

   3) 상기 형질전환체를 배양하여 재조합 단백질의 발현을 유도하고 이를 수득하는 단계로 구성되는 재조합 에스터라제의 제조방법.
10. 제 9항에 있어서, 단계 1)의 폴리뉴클레오티드는 N-말단에 분리정제용 태그를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 단백질 절단효소 인식부위가 추가로 연결되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
11. 제 9항에 있어서, 재조합 에스터라제에 제 10항의 단백질 절단효소 인식부위를 절단할 수 있는 단백질 분해효소를 처리하여 원래 형태의 에스터라제를 수득하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
12. 제 7항의 재조합 발현벡터가 작물에 형질전환된 식물세균병 저항성 작물.
13. 제 12항에 있어서, 상기 식물세균은 랄스토니아 솔라나세럼(Ralstonia solanacearum)인 것을 특징으로 하는 식물세균병 저항성 작물.
14. 제 12항에 있어서, 상기 식물세균병은 풋마름병(청고병)인 것을 특징으로 하는 식물세균병 저항성 작물.
15. 제 1항의 폴리펩티드, 이의 변이체 또는 이의 활성 단편를 유효성분으로 함유하는 식물세균병 제어제.
16. 제 15항에 있어서, 상기 식물세균은 랄스토니아 솔라나세럼(Ralstonia solanacearum)인 것을 특징으로 하는 식물세균병 제어제.
17. 제 15항에 있어서, 상기 식물세균병은 풋마름병(청고병)인 것을 특징으로 하는 식물세균병 제어제.
18. 제 6항의 유전자 컨스트럭트를 비병원성 균주에 형질전환시킨 형질전환체 또는 상기 형질전환체의 배양액을 함유하는 미생물 농약제제.

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