WO2013009018A1 - 퇴비 메타게놈 유래 신규 에스터라제 및 이의 제조방법 - Google Patents

퇴비 메타게놈 유래 신규 에스터라제 및 이의 제조방법 Download PDF

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WO2013009018A1
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윤정훈
강철형
이미화
오기훈
오태광
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한국생명공학연구원
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    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins

Definitions

  • the present invention relates to a novel esterase, and more particularly, the present invention relates to a novel esterase isolated from a compost metagenomic library, a gene encoding the same, a recombinant vector comprising the genes and the recombinant vector.
  • the present invention relates to a method for producing a transformed microorganism.
  • Esterase is an enzyme that hydrolyzes the ester bonds of triglycerides, which mainly hydrolyzes the ester bonds during catabolism, at pH 5-8 and 30-37 ° C. It has the best activity in the acid, and the degradation products include acids (including inorganic acids) and alcohols (alcohols) or phenols (-0H compounds) and thiols (thiol). Esterases are known as tetrahydroisoquinoline and azabicyclononane in the decomposition or synthesis of ester bonds.
  • bioactive substances such as azabicyclononane and indolemycine.
  • it is a major enzyme widely used due to its unique properties such as high substrate specificity and optical activity specificity.
  • Metagenome is defined as the genome of all microorganisms existing in nature.
  • metagenome research is carried out to isolate Escherichia coli without culturing microorganisms from natural samples. It consists of introducing stages. This is a method for securing useful products from microorganisms that were impossible to cultivate. It is difficult to obtain information on the microorganisms from which the genes are derived, but there is an advantage of simultaneously obtaining the products and genes of the microorganisms.
  • the Institute for Genomic Research (TIGR) team is also building a total microbial metagenomic library of marine microorganisms in a BAC vector to explore the genetic resources of microorganisms that are not cultured from marine ecosystems.
  • the present inventors have tried to select novel esterases having lipid-degrading activity from metagenomes in an environment in which various microorganisms exist.
  • the novel esterases having excellent tributyrin degrading ability from the composting metagenome library Article was completed by preparing a vector containing the gene by separating the former, transforming the vector into Escherichia coli, and confirming that the protein produced from the transformant exhibited excellent esterase activity.
  • An object of the present invention is a novel esterase derived from the composting metagenome, a gene encoding the same, a recombinant vector comprising the genes, a transformant transduced with the expression vector and a method for producing the esterase To provide.
  • the present invention provides a polypeptide of any one of the following a to c having an esterase activity and a polynucleotide encoding the same:
  • the present invention provides a recombinant expression vector comprising the polynucleotide.
  • the present invention also provides a transformant in which the recombinant expression vector is transfected into a host cell.
  • the term “recombinant expression vector” is a vector capable of expressing a target protein or RNA of interest in a suitable host cell, and encodes a polypeptide of interest operably linked to an additional fragment provided for transcription of the expression vector.
  • a linear or circular DNA molecule consisting of fragments, such additional fragments comprising promoter and termination sequence sequences, the expression vector comprising one or more replication initiation points, one or more selection markers, polyadenylation signals, or the like.
  • Expression vectors are also generally derived from plasmid or viral DNA, or contain elements of both.
  • operably linked means that the nucleic acid expression control sequence and the nucleic acid sequence encoding the desired protein or RNA are functionally linked to perform a general function.
  • promoters and nucleic acid sequences encoding proteins or RNAs may be operably linked to affect expression of the coding nucleic acid sequences.Operative linkages with recombinant vectors are well known in the art. It can be prepared using genetic recombination techniques, site-specific DNA cleavage and ligation using enzymes generally known in the art, etc.
  • the present invention will be described in detail.
  • the present invention has the following a to having esterase activity .
  • the esterase has an activity temperature of 10 to 6 (rc and preferably 5 (rc), but is not limited thereto.
  • rc activity temperature
  • the genome library produced by extracting DNA from compost samples containing microorganisms that cannot be cultured was searched for colonies that exhibited excellent esterase activity that effectively degrades tributyrin.
  • an ORF open reading frame of esterase consisting of 310 amino acids (930 bases; SEQ ID NO: 1) as set forth in SEQ ID NO: 2 and whose molecular weight is estimated to be about 34 kDa)
  • the amino acid sequence of the esterase was found in Bank by using the BLAST program. Comparison with the amino acid sequence showed the highest similarity with the uncultured bacter ium (AY496581.8), with a low homology of 40 to 46% with previously reported esterase gene populations.
  • the esterases of the present invention were identified in the consensus sequence of glycine-X-serine-X-glycine (Gly-X- Ser-X-Gly).
  • the esterase gene of SEQ ID NO: 1 encoding the novel esterase is cloned into the vector (see FIG. 2). ), The vector was transformed into Escherichia coli, and the esterase produced from the transformant was purified. By confirming the purified esterase of the present invention by the SDS-PAGE method, it can be seen that the molecular weight was effectively produced at about 34 kDa, the esterase of the present invention was confirmed that the expression in water-soluble form. (See Figure 3).
  • esterase of the present invention exhibits the following properties: stable in the pH 5.0 to 10.0 range, showing optimal activity at pH 8.0 (see FIG. 4); Active to 60 ° C. and optimal activity at 50 ° C. (see FIG. 5); In most cases, it was confirmed that activity was similar or increased by divalent metal ions (see Table 2). In addition, among the several para-nitrophenyl esters, the activity against p-nitrophenyl propionate C3 and para-nitrophenyl caproate (p6) was the highest. The protein of the present invention, which was high and better degrades substrates with relatively short acyl chains, was able to recognize esterasebeam (see FIG. 6).
  • the esterase of the present invention has the ability to remove the hindered ester of tertiary alcohol It was confirmed (see FIG. 7).
  • a polynucleotide that is localized under strict conditions refers to a polynucleotide of the nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO. 1 or a part or all of a polynucleotide encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO.
  • colony shaker technology plaque shaker technology
  • Southern Nucleotide sequences, such as DNA, obtained by the hybridization technique and the like.
  • the method of homogenization may be, for example, the method described in Molecular Cloning 3rd Edition, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997.
  • the term “strict conditions” may be arbitrarily selected from low stringency conditions, medium stringency conditions or high stringency conditions.
  • Low stringency conditions are, for example, 5 X SSC, 5 X Denhardt solution, 0.5% SDS , 50% formamide at 321 :.
  • Medium stringency conditions are, for example, 5 X SSC, 5 X Denhardt solution, 0.5% SDS, 50% formamide at 42 ° C.
  • High stringency conditions are, for example, 5 X SSC, 5 X Denhardt solution, 0.5% SDS, 50% formamide at 50 ° C.
  • polynucleotides such as DNA, which have higher homology, are expected to be efficiently obtained at higher temperatures, but the stringency of the hybridization includes temperature, probe concentration, probe length, temperature, time, and salt. Since a number of factors are involved, including concentration and others, those skilled in the art can appropriately select these factors to implement similar stringency.
  • Polypeptides having an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 2 of the present invention may be used to identify variants or fragments of amino acids having different sequences by deletion, insertion, substitution, or combination of amino acid residues within a range that does not affect the function of protein quality. It is included in the scope of the present invention.
  • Amino acid exchanges in proteins and peptides that do not alter the activity of the molecule as a whole are known in the art. In some cases, it may be modified by phosphorylation, sul fat ion, acrylation, glycosylation, methylat ion, farnesylat ion, or the like.
  • the present invention includes a polypeptide having an amino acid sequence substantially identical to a polypeptide having an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 2, and a variant or active fragment thereof, wherein the substantially identical polypeptide is at least 80%, Preferably at least 90%, most preferably at least 95% amino By those having homology to the acid sequence.
  • the present invention is not limited thereto.
  • the polynucleotide of the present invention is preferably characterized in that the polynucleotide described in SEQ ID NO: 1.
  • a polynucleotide encoding an esterase of the present invention and a variant thereof or an active fragment thereof is due to the degeneracy of the codon or an organism which is intended to express the esterase and the variant thereof or an active fragment thereof.
  • various modifications can be made to the coding region within the range of not changing the amino acid sequence of the esterase and its variants or the active fragments thereof expressed from the coding region.
  • the present invention includes polynucleotides having a base sequence substantially identical to the gene of SEQ ID NO: 1 and fragments of the gene.
  • Polynucleotides having substantially the same nucleotide sequence mean those having sequence homology of at least 80%, preferably at least 90%, most preferably at least 95%.
  • the present invention is not limited thereto and is included in the present invention as long as it has 70% or more of sequence homology and the same biochemical activity of the encoded protein.
  • nucleic acid bases may be mutated by substitution, deletion, insertion, or a combination thereof as long as the polynucleotide of the present invention encodes a protein having equivalent activity.
  • Polypeptides having an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 are preferably encoded by a nucleic acid molecule having a pulley nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1, but the present invention is not limited thereto and has the same amino acid sequence.
  • the nucleotide sequence has another nucleotide sequence that is substantially the same as the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1. It may also be encoded by a nucleic acid molecule.
  • the sequence of such nucleic acid molecules may be single or double chained, and may be DNA molecules or RNA (mRNA) molecules.
  • the present invention also provides a recombinant expression vector comprising an esterase of the present invention and a variant thereof or an active fragment thereof and a polynucleotide encoding the same.
  • expression control such as a promoter, terminator, enhancer, etc., depending on the type of host cell to produce the esterase and its variants or active fragments thereof.
  • Sequences, sequences for membrane targeting or secretion, and the like can be selected appropriately and combined in various ways depending on the purpose.
  • Expression vectors of the present invention include, but are not limited to, plasmid vectors, cosmid vectors, bacteriophage vectors, and viral vectors.
  • Suitable expression vectors include signal sequences or leader sequences for membrane targeting or secretion in addition to expression control elements such as promoters, operators, initiation codons, termination codons, polyadenylation signals, and enhancers, and can be prepared in various ways depending on the purpose. have.
  • the promoter of the expression vector may be constitutive or inducible.
  • the signal sequence includes a PhoA signal sequence and an OmpA signal sequence when the host is Escherichia sp., And an ⁇ -amylase signal sequence and a subtilisin signal when the host is Bacillus sp.
  • the MFa signal sequence and the SUC2 signal sequence may be used when the host is a yeast, or the insulin signal sequence, the a-interferon signal sequence, or the antibody molecule signal sequence when the host is an animal cell. It is not limited to this.
  • the expression vector may include a selection marker for selecting a host cell containing the vector, and, in the case of a replicable expression vector, includes a replication origin. Since the expression vector of the present invention expresses its activity when the esterase, a protein of interest, is expressed in the host cell, it is transformed without adding a selective marker by adding an esterase substrate such as tributyrin to the culture medium of the host cell. Selection of host cells can be enabled.
  • the recombinant expression vector is for may include a sequence that facilitates the expression of purified water, the atmospheres S of the present invention in detail first, and variants or derivatives bow thereof ⁇ separation operably in a gene coding for a sex fragment purified Polynucleotides encoding tags may be linked.
  • the separation and purification tag may be used alone, or GST, poly-Arg, FLAG, histidine-tag (Hi ' s-tag) and c-myc snout alone or connected two or more in sequence.
  • the histidine-tag was placed at the C-terminus to purify the expressed esterase using a nickel-antiei (Ni-NTA, Ni-nitriloteiacetic acid, Qiagen, Germany) column. .
  • a polynucleotide encoding a protein cleavage enzyme recognition site may be linked to a gene encoding an esterase and a variant thereof or an active fragment thereof of the recombinant expression vector of the present invention and a polynucleotide encoding a tag for separation and purification.
  • Esterases and variants or active fragments thereof of the present invention are preferably removed because the function may be degraded by the proteinrose purification tag which is usefully used as a biocatalyst in biomedical and fine chemistry.
  • the protein cleavage enzyme recognition site may be a Xa factor recognition site, an enterokinase recognition site, a Genenase I recognition site, or a Furin recognition site, or a combination of two or more of them in sequence. Can be.
  • the gene encoding the esterase and its variants or active fragments thereof can be cloned via restriction enzyme sites, and if a polynucleotide encoding a protein cleavage enzyme recognition site is used, Linked to a polynucleotide in frame, upon secretion of the esterase and its variants or active fragments thereof and cleaved with protein cleavage enzymes, the original form of the esterase and its variants or active fragments thereof Can be produced.
  • the present invention also provides esterases of the present invention and variants thereof or active groups thereof.
  • a recombinant expression vector comprising a fragment and a polynucleotide encoding the same provides a transformant transformed into a host cell. '
  • the recombinant expression vector according to the present invention may be transformed into an appropriate host cell, for example, E. coli or yeast cell, and then cultured in the transformed host cell, thereby producing a large amount of the novel esterase according to the present invention.
  • Suitable culture methods, media conditions, and the like according to the type of host cell can be easily selected by those skilled in the art from known techniques known to those skilled in the art.
  • the host cell is Escherichia coli, and in a specific embodiment of the present invention, a recombinant expression vector comprising a polynucleotide encoding a novel esterase is prepared (see FIG. 2) and transformed into Escherichia coli. It was exchanged. The esterase expressed from the transformant was confirmed to exhibit excellent esterase activity by effectively decomposing tributyrin.
  • the N-terminus of the polynucleotide encoding the esterase and its variants or the active fragments of the present invention may be further linked to the polynucleotide encoding the separation and purification tag and the protein cleavage enzyme recognition site, thereby It may be possible to purify the recombinant esterase or to obtain the esterase in its original form. That is, after the recombination esterase is purified using a tag for separation and purification, the method further comprises a step of treating the protein cleavage enzyme capable of cleaving the protein cleavage site, thereby preparing the esterase in its original form. Can be obtained.
  • novel esterases of the present invention exhibit excellent esterase activity, have substrate specificities, exhibit enzymatic stability to a wide range of temperatures, pH and organic solvents, and in particular hydrolytic capacity to tertiary alcohol esters. It can be usefully used as a biological synthesis catalyst for pharmaceuticals and chemical products.
  • novel esterase isolated from the compost metagenome library of the present invention is expressed in water-soluble form, which allows mass production, and shows excellent activity at pH 5 to 10 and preferably at pH 8, 0 ° C. Maintaining excellent esterase activity up to 60 ° C, high resistance to various organic solvents, and hydrolytic ability to tertiary alcohol esters, it is useful for various industries such as biological synthesis catalyst of pharmaceuticals and chemicals Can be used.
  • 1 is a diagram showing a result of comparing homology between the amino acid sequence of EstCSl and the amino acid sequence of a similar esterase.
  • FIG. 2 is a diagram showing a schematic diagram of recombinant vector P ET22b (+)-EstCSl containing a novel esterase gene derived from compost metagenome.
  • FIG. 2 is a diagram showing a schematic diagram of recombinant vector P ET22b (+)-EstCSl containing a novel esterase gene derived from compost metagenome.
  • Figure 3 shows the purified EstCSl via SDS-PAGE.
  • 4 is a diagram showing the activity and stability of the esterase of the present invention according to pH.
  • 5 is a diagram showing the activity ' and stability of the esterase of the present invention with temperature.
  • FIG. 6 is a decomposition of a substrate having various carbon lengths of the esterase of the present invention. Figure showing activity.
  • FIG. 7 is a diagram confirming the hydrolysis effect of the tertiary alcohol of the esterase of the present invention by thin layer chromatography (Thin Layer Chromatography):
  • Lane 1 linallyl acetate
  • Lane 2 linalool
  • Lane 3 Esterase EstCSl of the present invention and reacted linalyl acetic acid.
  • the metagenome library may be a TBN emulsion [l3 ⁇ 4 (v / v) TBN, sigma, USA; 1 mM calcium chloride (CaC12), junsei, Japan; 20 mM sodium chloride (NaCl), junsei, Sun ' Bon; Nutritional solid medium [5% (v / v) trypton, difco, USA, added with 5% (v / v) gum arabic, sigma, USA; 0.5% (w / v) yeast extract, difco, USA; 0.5% (w / v) sodium chloride (NaCl), junsei, Japan; 1.5% (w / v) agar (agar), junsei, Japan] was incubated at 37 ° C.
  • the plasmid pFos-CSl was digested with Sau3AI restriction enzymes, and then inserted into a pUC19 vector (Novagen, USA) treated with phosphatase (calf intestinal phosphatase; TaKaRa, Japan). Switched.
  • the transformed strain was TBN solid medium (1% tryptone, 0.5% yeast extract, 0.5% NaCl, 1% TBN, 1 mM CaC12, 20 mM NaCl, 0.5% Arabian rubber, 1.5) with ampicillin. % Agar), and incubated for 24 hours at 37 ° C to decompose TBN was selected to form a clear ring.
  • the base sequence of pUC-CSl obtained in Example 3-1 was analyzed using a Big Dye DNA Sequencing kit (Appl ied Biosystems, USA) by shot-gun sequencing.
  • the nucleotide sequence is 0RF f inder (// w w.ncbi .nlm.nih.gov / gorf / gorf .html) 3 ⁇ 4 ⁇ transferring decrypted frames (open reading frame, 0RF) using the (National Center for Biotechnology Information) NCBI Was identified and BlastX (BlastX; w ⁇ . ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi) was used to predict the function of the transcription decoding frame.
  • esterase EstCSl (FIG. 1).
  • amino acid sequence of the novel esterase as set forth in SEQ ID NO: 2 was compared with the amino acid sequence in GenBank using the BLAST program.
  • esterase EstCSl of the present invention showed the highest similarity with the uncultured bacterium, ( ⁇ 496581 ⁇ ), and showed low homology of 40-46% with the previously reported esterase gene population. It was identified as a novel gene that encodes (Table 1).
  • esterase of the present invention and the 155th serine residue (Ser) in the consensus sequence of glycine X-serine-X-glycine (Gly-X— Ser-X-Gly) and Histidine-glycine ⁇ glycine-alanine with specific catalytic triads conserved in esterases consisting of 255th glutamic acid (Glu) and 285th histidine (His) It was confirmed that the (HGGG (A)) motif was located about 75 amino acids before the 155th serine residue (FIG. 1).
  • Reverse primer 5'-GCGCTCGAGTGATTnTGGGGATCT-3 '(including Xhol restriction enzyme end) (SEQ ID NO: 4).
  • the PCR product was purified and digested with restriction enzymes of Ndel and Xhol, followed by expression vector pET-22b (+) containing a strong T7 promoter and a readout signal treated with the same restriction enzyme and calf intestinal phosphatase.
  • E. coli BL21 (DE3) / pET22b (+)-EstCSl obtained in Example 4 was absorbed at 600 ran in a liquid nutrient medium containing ampicillin (100 g / m «). After incubation at 37 ° C until the final concentration of 0.5 mM IPTG isopropyl- ⁇ - thiogalactopyranoside) was added to the culture medium and further incubated at 21 ° C for 18 hours.
  • E. coli BL21 (DE3) / pET22b (+)-EstCSl was recovered by centrifugation and suspended in binding lysate [50 mM Trisma complete layer (Tris-HCl, H 8.0), 300 mM NaCl]. It was crushed by ultrasonic grinding. The supernatant recovered by centrifugation again was added to a Ni-NTA (nitriloteiacetic acid; Qiagen, Germany) column, and the esterase was eluted using an imidazole concentration gradient.
  • Example ⁇ 5x1> The protein concentration purified in Example ⁇ 5x1> was measured by absorbance at 280 nm using a NanoDrop Spectrophotometer (nanodrop, USA), 5XSDS (0.156 M Tris-HCl, pH 6.8, 2.5% SDS, 37.5% (v / v) glycerol, 37.5 mM DTT) and 1: 4 was mixed and boiled at 100 ° C for 5 minutes. Boiled samples were loaded into wells of a 12% SDS-PAGE gel, the samples were developed at 130v for 2 hours, and the gels were stained by Coomassie staining and then decolorized to confirm the expression level of each recombinant protein.
  • the reaction solution for measuring enzyme activity is 10 ⁇ of 10 mM p-nitrophenyl ester substrate, 40 ⁇ of ethanol, 50 mM Trisma complete solution (Tris-HC1, pH 8.0) 940 and the above.
  • Para-nitrophenol (P-nitrophenol) which is decomposed from the substrate, was reacted for 5 or 60 minutes with the addition of the esterase enzyme 5 ⁇ purified in Example ⁇ 5-1>, at an absorbance increase rate of 405 ran. Measured.
  • 1 unit (U) was defined as the amount of enzyme that can be produced by hydrolyzing 1 ⁇ of para-nitrophenol per minute.
  • the activity was measured for 5 minutes in a reaction solution at various temperatures of 10 to 80 ° C.
  • FIG. 5 showed the optimum activity at 50 ° C (FIG. 5a), and the remaining enzyme activity after 60 minutes at each temperature in order to investigate the stability to heat, the temperature up to 60 ° C Its activity was maintained in the range and appeared to be stable (FIG. 5B).
  • the para-nitrophenyl esters of the semi-quilts were converted to C2 to C18 [para-nitrophenyl acetate (C2), para-nitrophenyl propionate p. -nitrophenyl propionate (C3), para-nitrophenyl butyrate (C4), para-nitrophenyl caproate (C6), para-nitrophenyl caprylate (p-nitrophenyl caprylate, Esterase activity was compared in the same way by substituting substrates of C8), para-nitrophenyl caprate (p10) and para-nitrophenyl laurate (p12).
  • EstCSl In order to determine the ester hydrolytic ability of EstCSl, it was analyzed by thin layer chromatography using linalil acetate as a substrate).
  • EstCSl has the ability to eliminate sterically hindered esters of tertiary alcohols (FIG. 7).

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Abstract

【요약서】 본 발명은 퇴비 메타게놈 라이브러리에서 분리한 신규 에스터라제(esterase), 이를 암호화하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 발현벡터가 형질 도입된 형질전환체 및 상기 에스터라제의 제조방법에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명의 에스터라제는 pH 5 내지 10, 바람직하게는 pH 8에서 우수한 활성을 나타내며, 0℃ 내지 60℃까지 우수한 에스터라제 활성을 유지하고, 다양한 유기용매에 대한 높은 내성을 가지며, 삼차 알콜 에스테르에 대한 가수분해 능력을 가지므로 의약품 및 화학제품의 생물학적 합성 촉매 등의 다양한 산업에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
퇴비 메타게놈 유래 신규 에스터라제 및 이의 제조방법
【기술분야】
본 발명은 신규 에스터라제 (esterase)에 관한 것으로， 보다 구체적으로 본 발명은 퇴비 메타게놈 라이브러리에서 분리한 신규 에스터라제, 이를 코딩하는 유 전자， 상기 유전자들은 포함하는 재조합 백터 및 상기 재조합 백터로 형질 전환된 미생물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
【배경기술】
에스터라제 (esterase)는 트리글리세라이드 (triglyceride)의 에스터 (ester) 결합을 가수분해하는 효소로， 주로 이화과정에서 에스터 결합을 가수분해하게 되는 ， pH 5 ~ 8 및 30 ~ 37°C의 온도 조건에서 가장 우수한 활성을 가지며， 그 분해 산물로는 산 (무기산도 포함)과 알콜 (alcohol)류 또는 페놀 (phenol)류 (-0H 화합물) 및 티올 (thiol)류 등이 있다. 에스터라제는 에스터 결합의 분해나 합^ 반응에서 테트라하이드로이소퀴놀린 (tetrahydroisoquinoline), 아자비싸이클로노난
(azabicyclononane), 인돌마이신 ( indolemycine)과 같은 생리활성물질의 광학 합성 에 유용하게 이용될 수 있다. 특히， 높은 기질 특이성 및 광학활성 특이성 등의 고 유한 특성에 의해 폭넓게 이용되는 주요한 효소이다.
상기 에스터라제를 포함한 신규 효소를 발굴하고자 하는 노력은 주로 배양 이 가능한 미생물을 대상으로 이루어졌고， 이로부터 밝혀진 다양한 미생물 효소들 이 산업적으로 이용되고 있다. 그러나 최근 많은 분자미생물 생태학의 연구들은 자 연계에 존재하는 99% 이상의 미생물들이 실험실에서 행해지는 전통적인 배양기법올 통해서는 분리 동정되지 않는다는 사실을 증명하였다 (Amarm et al . , Microbiol. Rev. 59： 143-169, 1995； Hugenholtz and Pace, Trends Biotechnol. 14： 190-197, 1996； Ward et al . , Nature 345： 63-65, 1990). 따라서 , 실제로 배양되어 동정된 적이 없는 대다수 미생물의 효소를 찾으려는 노력이 필요하몌 이는 분자생물학적 인 유전자 재조합 발현을 통하여 가능하리라 여겨진다. 이러한 접근방법의 하나로 메타게놈 (tnetagenome)에 관한 연구가 시도되고 있다. 메타게놈은 자연계에 존재하는 모든 미생물의 유전체를 통칭하는 것으로 정 의된다ᅳ 일반적으로, 메타게놈 연구는 자연계 시료로부터 미생물을 배양하지 않고 메타게놈을 분리한 후, 이들을 라이브러리로 작성하여 배양 가능한 대장균에 도입 하는 단계로 구성된다. 이는 배양이 불가능했던 미생물로부터 유용 산물을 확보하 기 위한 방법으로， 유전자의 유래가 되는 미생물에 대한 정보는 얻기가 어려우나 미생물의 산물과 유전자를 동시에 확보할 수 있는 장점이 있다. 미국 위스콘신 대학 연구.팀은 처음으로 대형의 메타게놈을 성공적으로 분리 하여 BAC bacterial artificial chromosome) 백터에 클로닝하여 메타게놈 라이브러 리를 구축하였고， 이로부터 광범위한 항생물질 및 그의 생합성에 관련된 유전자들 을 분리하였다 (Gillespie et al. , Appl. Environ. Microbiol. 68： 4301-4306, 2002； Rondon et al. , Appl. Environ. Microbiol. 66: 2541-2547, 2000) . TIGR(The Institute for Genomic Research) 연구팀에서도 해양 미생물의 총 미생물 메타게놈 라이브러리를 BAC 백터에 구축하여 해양 생태계로부터 배양되지 않는 미생물의 유 전자원 탐색을 시도하고 있다. 이에 본 발명자들은 다양한 미생물이 존재하는 환경의 메타게놈으로부터 지 질분해 활성이 있는 신규한 에스터라제를 선별하기 위해 노력한 결과， 퇴비 메타게 놈 라이브러리로부터 트리뷰티린 (tributyrin) 분해능이 우수한 신규 에스터라제 유 전자를 분리하여 상기 유전자를 포함하는 백터를 제작하고， 상기 백터를 대장균에 형질전환한후, 상기 형질전환체로부터 생산된 단백질이 우수한 에스터라제 활성을 나타냄을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
【발명의 상세한 설명】
【기술적 과제】
본 발명의 목적은 퇴비 메타게놈에서 유래한 신규 에스터라제 (esterase), 이를 암호화하는 유전자, 상기 유전자들을 포함하는 재조합 백터， 상기 발현백터가 형질 도입된 형질전환체 및 상기 에스터라제의 제조방법을 제공하는 것이다.
'
【기술적 해결방법】
상기와 같은 목적을 달성하기 위해， 본 발명은 에스터라제 (esterase) 활성 을 갖는 하기 a 내지 c 중 어느 하나의 폴리펩티드 및 이를 암호화하는 폴리뉴클레 오티드를 제공한다:
a) 서열번호 1로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티 b) 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건에서 흔성되는 폴리뉴클레 오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드; 및，
c) 서열번호 2로 기재되는 아미.노산 서열을 갖는 폴리펩티드.
또한， 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현백터를 제 공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 발현백터가 숙주세포에 형질 도입된 형질전환 체를 제공한다.
아울러， 1) 상기 에스터라제 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편을 암호화 하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현백터를 제조하는 단계; 2) 상기 재조합 발현백터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 제조하는 단 계; 및，
3) 상기 형질전환체를 배양하여 재조합 단백질의 발현을 유도하고 이를 수 득하는 단계로 구성되는 재조합 에스터라제의 제조방법을 제공한다. 이하ᅳ 본 발명에서 사용된 용어를 정의한다. 본 발명에서 사용된 용어 "재조합 발현백터' '란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질 또는 목적 RNA을 발현할 수 있는 백터로서， 발현백터의 전사에 제공되는 추 가단편에 작동 가능하게 연결된 관심의 폴리펩티드를 암호화하는 단편으로 구성되 는 선형 또는 원형의 DNA 분자이다. 그와 같은 추가단편은 프로모터 및 종료암호 서열을 포함한다. 발현백터는 하나 이상의 복제 개시점, 하나 이상의 선택마커， 폴 리아데닐화 신호 등을 또한 포함한다. 발현백터는 일반적으로 플라스미드 또는 바 이러스 DNA로부터 유도되거나, 또는 둘 다의 요소를 함유한다.
본 발명에서 사용된 용어' "작동 가능하게 연결된 (operably linked)' '이란 일 반적인 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질 또는 RNA를 코딩 하는 핵산서열이 기능적으로 연결 (functional linkage)되어 있는 것을 말한다. 예 를 들어 프로모터와 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 작동 가능하게 연결 되어 코딩하는 핵산 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 재조합 백터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있 으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효 소 등을 사용한다. 이하， 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명은 에스터라제 (esterase) 활성을 갖는 하기 a 내지. c 중 어느 하나 의 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드의 변이체 또는 이의 활성 단편 및 이를.암호 화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다:
a) 서열번호 1로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티 드;
b) 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건에서 흔성되는 폴리뉴클레 오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드; 및
c) 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드.
상기 에스터라제는 활성온도가 10내지 6(rc인 것이 바람직하고 5(rc인 것 이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 우수한 활성을 나타내는 신규 에스터라제 의 발굴을 위해， 배양이 불가능한 미생물을 포함하는 퇴비 샘플로부터 DNA를 추출 하여 제작한 메타게놈 라이브러리를 대상으로 트리뷰티린 (tributyrin)을 효과적으 로 분해하는 우수한 에스터라제 활성을 나타내는 콜로니를 탐색하였다. 상기 콜로 니의 재조합 플라스미드를 분리하여 염기서열 분석한 결과， 서열번호 2로 기재되는 310개 아미노산 (930개의 염기; 서열번호 1)으로 이루어지며 분자량이 약 34 kDa으 로 예측되는 에스터라제의 ORF open reading frame)를 찾을 수 있었다 (도 1 참조). 상기 에스터라제의 아미노산 서열을 BLAST프로그램을 이용하여 진뱅크 (Bank)에 있 는 아미노산 서열과 비교 분석한 결과， uncultured bacter ium(AY496581.8)과 가장 높은 유사성을 나타내었으몌 이전에 보고된 에스터라제 유전자 집단과 40 내지 46% 정도의 낮은 상동성을 보여 에스터라제를 암호화하는 신규한 유전자로서 확인 되었다 (표 1 참조). 또한， 본 발명의 에스터라제는 글리신 -X-세린 -X-글리신 (Gly-X- Ser-X-Gly)의 공통서열 (consensus sequence) 내의 155번째 세린잔기 (Ser)와 255번 째 글루탐산 (Glu), 285번째 히스티딘 (His)으로 이루어진 에스터라제에 보존되는 특 이적 세작용기 촉매 (catalytic triad)를 갖고 있었으며， 삼차알콜에 대한 활성과 관련이 있는 히스티틴 -글리신-글리신-알라닌 (HGGG(A)) 모티브도 155번째 세린 잔기 로부터 약 75개 아미노산 앞에 위치하고 있었다 (도 1 참조).
본 발명의 구체적인 실시예에서는 상기 서열번호 2로 기재되는 신규 에스터 라제의 활성을 측정하고자， 우선, 상기 신규 에스터라제를 암호화하는 서열번호 1 의 에스터라제 유전자를 백터에 클로닝하고 (도 2 참조), 상기 백터를 대장균에 형 질전환시킨 후, 상기 형질전환체로부터 생산된 에스터라제를 정제하였다. 상기 정 제된 본 발명의 에스터라제를 SDS-PAGE 방법으로 확인함으로써 분자량이 약 34 kDa 으로 효과적으로 생산되었음을 알、수 있었으며， 본 발명의 에스터라제는 수용성 형 태로 발현이 이루어지고 있음을 확인할 수 있었다 (도 3 참조).
또한， 본 발명의 에스터라제는 다음과 같은 특성을 나타낸다: pH 5.0 내지 10.0 범위에서 안정하며， pH 8.0에서 최적 활성을 나타내고 (도 4 참조); 60°C까지 활성올 나타내고 50°C에서 최적활성을 나타내며 (도 5 참조); 대부분 2가 금속 이온 에 의해 활성이 비슷하거나 증가되는 것을 확인하였다 (표 2 참조). 또한， 여러 파 라 -니트로페닐 에스터 (p— nitrophenyl ester) 중에서 파라 -니트로페닐 프로피오네이 트 (p-nitrophenyl propionate C3) 및 파라 -니트로페닐 카프로에이트 (p-nitrophenyl caproate, C6)에 대한 활성이 가장 높았으며 , 상대적으로 짧은 아실 사슬을 가진 기질을 더 잘 분해하는 본 발명의 단백질은 에스터라제빔을 알 수 있었다 (도 6 참 조). 아을러， 본 발명의 에스터라제의 에스테르 가수분해 능력을 알아보기 위해 박 층크로마토그래피 (Thin Layer Chromatography)로 분석한 결과, 본 발명의 에스터라 제는 삼차 알콜의 입체 장애 에스테르를 제거하는 능력이 있음을 확인하였다 (도 7 참조).
여기서， "엄격한 조건하에서 흔성화되는 폴리뉴클레오티드"란 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열의 폴리뉴클레오티드 또는 서열번 호 2의 아미노산 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전부 또는 일부를 탐침자 로서 사용하여 콜로니 흔성화 기술， 플라크 흔성화 기술， 서던 (southern).흔성화 기술 등에 의해 수득된， DNA 등의 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 상기 흔성화 방 법은, 예를 들어， 문헌 [Molecular Cloning 제 3 판， Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997] 등에 기재된 방법일 수 있다. 본원에 사용된 "엄격한 조건"아라는 용어는 낮은 엄격성 조건, 중간 엄격성 조건 또는 높은 엄격성 조건 중에서 임의로 선택될 수 있다. "낮은 엄격성 조건"은 예를 들어 , 321：에서의 5 X SSC, 5 X Denhardt 용액， 0.5% SDS,, 50% 포름아마이드 이다. "중간 엄격성 조건"은， 예를 들어， 42°C에서의 5 X SSC, 5 X Denhardt 용액， 0.5% SDS, 50%포름아마이드이다. "높은 엄격성 조건"은, 예를 들어， 50°C에서의 5 X SSC, 5 X Denhardt 용액， 0.5% SDS, 50%포름아마이드이다. 이들 조건하에서, 상 동성이 더 높은， DNA 등의 폴리뉴클레오티드는 더욱 높은 온도에서 효율적으로 수 득될 것으로 예상되지만， 흔성화 엄격성에는 온도, 탐침자 농도, 탐침자 길이， 이 온세기， 시간， 염 농도 및 기타를 비롯하여 복수의 요인들이 연루되므로, 당업자는 유사한 엄격성을 구현하기 위해 이들 요인들을 적절히 선택할 수 있다..
본 발명의 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드는 단백 질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 아미노산 잔기의 결실, 삽입, 치환 또는 이들의 조합에 의해서 상이한 서열을 가지는 아미노산의 변이체 또는 단편을 본 발명의 범위에 포함한다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩티드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다. 경우에 따라서는 인산 화 (phosphorylation)， 황화 (sul fat ion) , 아크릴화 (acrylat ion)， 당화 (glycosylation), 메틸화 (methylat ion) , 파네실화 (farnesylat ion) 등으로 수식 (modification)될 수도 있다. 따라서， 본 발명은 상기 서열번호 2로 기재되는 아미 노산 서열을 갖는 폴리펩티드와 실질적으로 동일한 아미노산서열을 갖는 폴리펩티 드 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편을 포함하며， 실질적으로 동일한 폴리펩티 드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상， 가장 바람직하게는 95% 이상의 아미노 산 서열의 상동성을 갖는 것들을 의미한다. 그러나 이에 한정되는 것은 아니며,
70% 이상의 아미노산서열의 상동성을 가지며 동일한 생화학적 활성을 가진다면 본 원 발명에 포함된다.
또한， 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 서열번호 1로 기재되는 폴리뉴클레오티드인 것을 특징으로 한다. 그러나 본 발명의 에스터라제 및 이의 변 이체 또는 이의 활성 단편을 암호화하는 ᅳ폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성 (degeneracy)으로 인하여 또는 상기 에스터라제 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단 편을 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여， 코딩영역으로부터 발 현되는 에스터라제 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편의 아미노산서열을 변화시 키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고, 코딩영역올 제의한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며， 그러한 변형 유전자 '역시 본 발명의 범위에 포함 됨을 당업자는 잘 이해할 수 있을 것이다. 따라서， 본 발명은 서열번호 1의 유전자 와 실질적으로 동일한 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편 을 포함한다. 실질적으로 동일한 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드란 80% 이상， 바람직하게는 90% 이상， 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들 을 의미한다. 그러나 이에 한정되는 것은 아니며， 70% 이상의 서열 상동성을 가지 며 암호화된 단백질의 동일한 생화학적 활성을 가진다면 본원 발명에 포함된다. 상 술한 바와 같이， 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 이와 동등한 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 한， 하나 이상의 핵산 염기가 치환., 결실， 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있으며, 이들 또한 본 발명의 범위에 포함된다. 서열번호 2로 기재되는 아미노산서열을 갖는 폴리펩티드는 바람직하게는 서열번호 1로 기재되는 풀리뉴클 레오티드 서열을 갖는 핵산 분자에 의해 코딩 되나, 본 발명은 이에 제한되지 않고 동일 아미노산 서열을 갖는 본 발명의 단백질을 코딩할 수 있는 한， 서열번호 1의 염기서열과 실질적으로 동일한 다른 염기서열을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산 분자에 의해 코딩 될 수도 있다. 이러한 핵산 분자의 서열은 단쇄 또는 이중 쇄일 수 있으며， DNA 분자 또는 RNA(mRNA)분자일 수 있다. 또한， 본 발명은 본 발명의 에스터라제 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단 편 및 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현백터를 제공한다. 상기 재조합 발현백터의 제작 시에는， 상기 에스터라제 및 이의 변이체 또 는 이의 활성 단편을 생산하고자 하는 숙주세포의 종류에 따라 프로모터 (promoter), 종결자 (terminator), 인핸서 (inhancer) 등과 같은 발현조절 서열, 막 표적화 또는 분비를 위한 서열 등을 적절히 선택하고 목적에 따라 다양하게 조합할 수 있다. 본 발명의 발현백터는 플라스미드 백터， 코즈미드 백터， 박테리오파이지 백 터 및 바이러스 백터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 적합한 발현백터는 프 로모터， 오퍼레이터， 개시코돈， 종결코돈， 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발 현 조절 엘리먼트 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열 을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 발현백터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 상기 시그널 서열에는 숙주가 에쉐리키아속 (Escherichia sp.)균인 경우에는 PhoA 시그널 서열， OmpA 시그널 서열 등이， 숙주가 바실러스속 (Bacillus sp.)균인 경우에는 α-아밀라아제 시그널 서열， 서브틸리신 시그널 서열 등이， 숙주가 효모 (yeast)인 경우에는 MFa 시그널 서열， SUC2 시그널 서열 등이, 숙주가 동물세포인 경우에는 인슬린 시그널 서열， a-인터페론 시그널 서열, 항체 분자 시그널 서열 둥을 이용할 수 있으나， 이에 제한되지 않는다. 또한， 발현백터 는 백터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택 마커를 포함할 수 있고, 복제 가능한 발현백터인 경우 복제 기원올 포함한다. 본 발명의 발현 백터는 관심 단백 질인 에스터라제가 숙주세포에서 발현하면 그 활성을 나타내게 되므로, 숙주세포의 배양 배지에 트리뷰티린 등의 에스터라제 기질을 첨가함으로써, 별도의 선택마커 없이도 형질전환된 숙주세포의 선별이 가능하도록 할 수 있다. 또한， 상기 재조합 발현백터는 발현물의 정제를 용이하게 하기 위한 서열을 포함할 수 있으며， 구체적으로 본 발명의 에스터라제 및 이의 변이체 또는 이의 활 ■ 성 단편을 암호화하는 유전자에 작동 가능하도록 분리정제용 태그를 코딩하는 폴리 뉴클레오티드가 연결될 수 있다. 이때， 상기 분리정제용 태그는 GST, poly-Arg, FLAG, 히스티딘-택 (Hi's-tag) 및 c-myc 둥이 단독으로 사용되거나 어느 두 개 이상 을 순차적으로 연결하여 사용할 수 있다. 본 발명의 구체적 실시예에서는 히스티딘 -택을 C—말단에 위치시켜 니켈—엔티에이 (Ni-NTA, Ni-nitriloteiacetic acid, Qiagen, 독일) 컬럼을 이용하여 발현된 에스터라제를 정제하였다. .
더 나아가， 본 발명의 재조합 발현백터의 에스터라제 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편을 암호화하는 유전자와 분리정제용 태그를 코딩하는 폴리뉴클레오 티드에 단백질 절단효소 인식부위를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 연결될 수 있다. 본 발명의 에스터라제 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편은 생물의학과 정밀화학 분야에서 생체 촉매로 유용하게 활용되는 단백질로쎄 정제용 태그에 의해 기능이 저하될 수 있으므로 제거되는 것이 바람직하다. 이때， 상기 단백질 절단효소 인식 부위는 Xa 인자 인식부위， 엔테로키나제 인식부위， 제네나제 (Genenase) I 인식부위 또는 퓨린 (Fur in) 인식부위가 단독으로 사용되거나 어느 두 개 이상을 순차적으로 연결하여 사용할 수 있다.
발명의 실시태양에서， 상기 에스터라제 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단 편을 암호화하는 유전자는 제한효소 부위를 통해 클로닝될 수 있고， 단백질 절단효 소 인식부위를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가사용된 경우에는 상기 폴리뉴클레오티 드와 를이 맞도록 (in frame) 연결되어， 상기 에스터라제 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편 분비 후 단백질 절단효소로 절단 시， 원래 형태의 에스터라제 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편이 생산될 수 있도록 할 수 있다. 또한， 본 발명은 본 발명의 에스터라제 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단 편 및 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현백터가 숙주세포 에 형질 도입된 형질전환체를 제공한다. '
본 발명에 따른 상기 재조합 발현백터를 적절한 숙주 세포， 예를 들어, 대 장균 또는 효모 세포 등에 형질전환시킨 후， 형질전환된 숙주세포를 배양함으로써 본 발명에 따른 신규 에스터라제를 대량 생산할 수 있다. 숙주세포의 종류에 따른 적절한 배양 방법 및 배지 조건 등은 당해 분야의 통상의 기술자에게 알려진 공지 기술로부터 당업자가 용이하게 선택할 수 있다. 바람직하게， 상기 숙주세포는 대장 균이며， 본 발명의 구체적인 실시예에서는 신규 에스터라제를 코딩하는 폴리뉴클레 오티드를 포함하는 재조합 발현백터를 제작하고 (도 2 참조)， 이를 대장균에 형질전 환시켰다. 상기 형질전환체로부터 발현된 에스터라제는 트리뷰티린을 효과적으로 분해하여 우수한 에스터라제 활성을 나타냄올 확인하였다.
아울러， 1) 본 발명의 에스터라제 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현백터를 제조하는 단계;
2) 상기 재조합 발현백터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 제조하는 단 계; 및，
3) 상기 형질전환체를 배양하여 재조합 단백질의 발현을 유도하고 이를 수 득하는 단계로 구성되는 재조합 에스터라제의 제조방법을 제공한다.
상기 본 발명의 에스터라제 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편을 암호화 하는 폴리뉴클레오티드의 N-말단에는 분리정제용 태그를 암호화하는 폴리뉴클레오 티드와 단백질 절단효소 인식부위가 추가로 연결될 수 있고, 이로 인해 재조합 에 스터라제의 정제 또는 원래 형태의 에스터라제의 수득이 가능할수 있다. 즉， 재조 합 에스터라제를 분리정제용 태그를 이용하여 정제한 후， 상기 단백질 절단효소 인 식부위를 절단할 수 있는 단백질 절단효소를 처리하는 단계를 추가로 포함함으로써 원래 형태의 에스터라제를 수득할 수 있다. 본 발명의 신규 에스터라제는 우수한 에스터라제 활성을 나타내고， 기질 특 이성을 가지며， 다양한 범위의 온도， pH 및 유기용매에 대한 효소활성 안정성을 나 타내며, 특히 삼차 알콜 에스테르에 대한 가수분해 능력을 가지므로 의약품 및 화 학제품의 생물학적 합성 촉매로써 유용하게 사용될 수 있다. 【유리한 효과】
본 발명의 퇴비 메타게놈 라이브러리에서 분리한 신규한 에스터라제 (esterase)는 수용성 형태로 발현되므로 대량생산이 가능하고， pH 5내지 10， 바람 직하게는 pH 8에서 우수한 활성을 나타내며, 0°C 내지 60°C까지 우수한 에스터라제 활성을 유지하고， 다양한 유기용매에 대한 높은 내성을 가지며， 삼차 알콜 에스테 르에 대한 가수분해 능력을 가지므로 의약품 및 화학제품의 생물학적 합성 촉매 등 의 다양한산업에 유용하게 이용될 수 있다.
【도면의 간단한 설명】
도 1은 EstCSl의 아미노산 서열과 이와 유사한 에스터라제 (esterase)의 아 미노산 서열 사이에 상동성을 비교한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 퇴비 메타게놈 유래의 신규 에스터라제 유전자를 포함하는 재조합 백터 PET22b(+)-EstCSl의 모식도를 나타낸 도이다.
도 3은 정제된 EstCSl을 SDS-PAGE를 통해 확인한 도이다: .
M: Size marker (kDa)； 및
1： 정제된 EstCSl.
도 4는 pH에 따른 본 발명의 에스터라제의 활성과 안정성을 나타낸 도이다. 도 5는 온도에 따른 본 발명의 에스터라제의 활성'과 안정성을 나타낸 도이 다.
도 6은 본 발명의 에스터라제의 다양한 탄소 길이를 갖는 기질에 대한 분해 활성을 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명의 에스터라제의 삼차알콜에 대한 가수분해 효과를 박층크로 마토그래피 (Thin Layer Chromatography)로 확인한 도이다:
Lane 1:리날릴 아세트산 (linalyl acetate);
Lane 2： 리날올 (linalool)； 및
Lane 3： 본 발명의 에스터라제 EstCSl과 반웅한 리날릴 아세트산.
【발명의 실시를 위한 최선의 형태】
이하, 본 발명은 실시예에 의하여 상세히 설명한다.
단， 하기 실시예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것일 뿐， 본 발명의 내 용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다. '
<실시예 1> 메타게놈 라이브러리 구축
퇴비 (층청남도 청양군 남양면 금정리)에서 채취한 토양 시료 15 g을 50 l 의 프로테이나제 (proteinase) K를 포함하는 동일부피의 DNA 추출용 완충액 [100 mM 트리즈마 완충액 (Tris-HCl, H 8.0, sigma, 미국) ; 100 mM EDTACethylenediaminetetraacetic acid, sigma, 미국); 100 mM 인산 나트륨 완충액 (sodium phosphate, pH 8.0， sigma, 미국) ; 1.5 M 염화나트륨 (NaCl, junsei , 일 본); l%(w/v) CTAB(hexadecyl tr imethyl ammonium bromide, sigma, 미국)]에 현탁 시킨 후， 음이온 계면활성제 (sodium dodecyl sulfate, SDS, sigma, 미국)를 최종 2%(V/v)가 되게 첨가하여 65°C에서 1시간 동안 반웅시켰다. 그 후， 원심분리를 통 해 획득한 상등액에 1.6 M 염화나트륨 (NaCl)을 포함한 30%(v/v) 폴리에틸렌 글리콜 (polyethylene glycol)을 동일 부피만큼 첨가시켜 잘 섞어주었다. 침전된 DNA는 원 심분리를 통해 분리하여 TE완층용액에 현탁하였고， 동일 부피의 페놀 /클로로포름 / 이소아밀 알코올 (phenol/chloroiorm/isoamyl alcohol )(25:24: 1) 흔합액과 클로로포 름 /이소아밀 알코올 (chloroform/isoamyl alcohol )(24： 1) 흔합액을 첨가하여 두 번 추출하였다. 원심분리하여 획득한 상등액에 이소프로판올(1301 0 ^01)을 첨가하여 DNA를 침전회수하였다. DNA 침전물을 완전히 건조시켜 멸균수에 녹인 후 불순물을 완전히 제거하고， 약 23~48 kb 정도의 DNA 단편으로 부분 절단하기 위해 PFGE(pulse-field gel electrophoresis, Bio-Rad, 미국)를 이용하여 전기영동하고 겔아제 (GelaseKEpicentre, 미국)를 사용하여 겔 용출을 수행하였다. 정제된 DNA 단편들은 CopyControlTM fosmid 라이브러리 제작 키트 (Epicentre, 미국)를 사용하 여 메타게놈 라이브러리를 구축하였다. 그런 다음， 라이브러리의 질을 검사하기 위 해， 형질전환체들을 무작위적으로 선택하여 재조합 플라스미드를 추출하여 제한효 소 처리한 후 전기영동으로 확인한 결과， 모두 재조합 폴라스미드가 포함되어 있었 으며， 삽입된 메타게놈의 평균 크기는 35 kb였다.
<실시예 2> 에스터라제 활성을 가진 재조합 플라스미드의 탐색 및 분리
상기 <실시예 1>에서 수득한 메타게놈 라이브러리로부터 에스터라제 (esterase) 유전자를 탐색하기 위해, 에스터라제에 의해 분해되는 트리뷰티린 (tributyrin; 이하, TBN)을 포함하는 배지에서 상기 메타게놈 라이브러리를 배양하 였다.
구체적으로， 상기 메타게놈 라이브러리를 TBN 에멀젼 [l¾(v/v) TBN, sigma, 미국; 1 mM 염화칼슘 (CaC12), junsei, 일본; 20 mM 염화나트륨 (NaCl), junsei, 일 ' 본; 5%(v/v) 아라비아 고무 (Gum arabic), sigma, 미국]이 첨가된 영양 고체배지 [l%( /v) 트립톤 (trypton), difco, 미국; 0.5%(w/v) 이스트 추출물 (yeast extract), difco, 미국; 0.5%(w/v) 염화나트륨 (NaCl), junsei, 일본; 1.5%(w/v) 한천 (agar), junsei, 일본]에 도말하여 37°C에서 배양하였다. 이때， 에스터라제에 의해 트리뷰 티린이 분해되어 투명환을 형성하는 콜로니를 선별한 후， 트리뷰티린 분해능이 가 장 우수한 콜로니로부터 재조합 플라스미드를 분리하여 pFos-CSl로 명명하였다. <실시예 3>신규 에스터라제 유전자의 클로닝 및 염기 서열 분석
상기 <실시예 2>에서 분리한 플라스미드 pFos-CSl로부터 신규 에스터라제의 유전자를 클로닝하고 염기 서열을 분석하였다. <3-1>신규 에스터라제 유전자의 클로닝
상기 <실시예 2>에서 분리한 플라스미드 pFos-CSl로부터 신규 에스터라제의 유전자를 클로닝을 수행하였다.
구체적으로， 플라스미드 pFos-CSl를 Sau3AI 제한 효소로 절단한 다음， 포스 파타제 (calf intestinal phosphatase; ， TaKaRa, 일본)를 처리한 pUC19 백터 (Novagen, 미국)에 삽입시킨 후 이를 이용하여 대장균 DH5a를 형질전환시켰다. 상 기 형질전환 균주를 엠피실린 (ampicillin)이 첨가된 TBN고체배지 (1%트립톤， 0.5% 효모추출액， 0.5% NaCl , 1% TBN, 1 mM CaC12, 20 mM NaCl , 0.5% 아라비아 고무， 1.5% 한천)에 도말하고, 37°C에서 24시간 동안 배양하여 TBN을 분해하여 투명환을 형성하는 콜로니를 선별하였다. 선별된 콜로니를 배양하여 폴라스미드를 분리한 결 과 930b 크기의 삽입체 (insert DNA)를 포함한 3.1kb 크기의 플라스미드를 확인하였 고， 이를 pUC-CSl로 명명하였다. 아울러， pUC-CSl을 이를 이용하여 동일한 방법으 로 대장균 DH5a를 재형질전환 시킨 결과 생성된 콜로니들은 모두 에스터라제 활성 을 나타냄을 확인하였다. <3-2>신규 에스터라제 유전자의 염기 서열 분석
상기 실시예 <3ᅳ1>에서 수득한 pUC-CSl의 염기 서열을 샷건 시뭔싱 (shot-gun sequencing) 방법으로 Big Dye DNA Sequencing kit(Appl iedBiosystems , 미국)를 이 용하여 분석하였다. 상기 염기 서열은 NCBI (National Center for Biotechnology Information)의 0RF f inder(//w w.ncbi .nlm.nih.gov/gorf/gorf .html )¾■ 이용하여 전사해독프레임 (open reading frame, 0RF)을 동정하였고， 블라스트엑스 (BlastX; w丽. ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi)를 이용하여 전사해독프레임의 기능을 예측 하였다.
그 결과， 서열번호 2로 기재된 310개 아미노산 (930개의 염기; 서열번호 1) 으로 .이루어지며 분자량이 약 34 kDa으로 예측되는 에스터라제의 ORFCopen reading frame)를 찾을 수 있었다. 상기 0RF는 에스터라제 단백질 코딩 영역으로 예상되며, 상기 유전자를 에스터라제 EstCSl로 명명하였다 (도 1).
<3-3>신규 에스터라제 유전자의 상동성 분석
서열번호 2로 기재되는 신규 에스터라제의 아미노산 서열을 BLAST프로그램 을 이용하여 GenBank에 있는 아미노산 서열과 비교 분석하였다.
그 결과， 본 발명의 에스터라제 EstCSl는 uncultured bacterium, (ΑΥ496581Λ)와 가장 높은 유사성을 나타내었으며， 이전에 보고된 에스터라제 유전 자 집단과 40~46% 정도의 낮은 상동성을 보여 에스터라제를 암호화하는 신규한 유 전자로서 확인되었다 (표 1).
또한， 도 1에 나타낸 바와 같이 본 발명의 에스터라제는 글리신 X-세린 -X- 글리신 (Gly-X— Ser-X-Gly)의 공통서열 (consensus sequence) 내의 155번째 세린잔기 (Ser)와 255번째 글루탐산 (Glu), 285번째 히스티딘 (His)으로 이루어진 에스터라제 에 보존되는 특이적 세작용기 촉매 (catalytic triad)를 갖고 있었으며， 삼차알콜에 대한 활성과 관련이 있는 히스티딘 -글리신ᅳ글리신-알라닌 (HGGG(A)) 모티프도 155번 째 세린 잔기로부터 약 75개 아미노산 앞에 위치하고 있는 것을 확인하였다 (도 1).
【표 1】
EstCSl와 유사한 단백질들
Figure imgf000018_0001
Figure imgf000019_0001
<실시예 4> 형질전환체의 제조
본 발명의 신규 에스터라제를 대량으로 생산할 수 있는 EstCSl유전자를 포 함하는 재조합 플라스미드를 제조하였다.
구체적으로， 상기 <실시예 2〉의 방법으로 분리된 pFosCSl를 주형 DNA로 하 고， 합성된 각각 Ndel과 Xhol의 제한효소 절단부위를 가지는 프라이머쌍을 사용하 여 중합효소 연쇄반웅 (polymerase chain reaction, PCR)올 수행하였다;
정방향 프라이머 ： 5' - GGGCATATGATGCGAGCCGAGHGCᅳ 3' (Ndel 제한효소 절 단부위 포함) (서열번호: 3); 및
역방향 프라이머 ： 5' - GCGCTCGAGTGATTnTGGGGATCT - 3' (Xhol 제한효소 절 단부위 포함) (서열번호: 4).
상기 PCR산물을 정제하여 Ndel과 Xhol의 제한효소로 절단한 후， 동일한 제 한효소와 포스파타제 (calf intestinal phosphatase)를 처리한 강력한 T7프로모터와 판독신호가 내재되어 있는 발현용 백터 pET-22b(+)(Novagen, 미국)의 제한효소 Ndel과 X )I부위에 서열번호 1의 EstCSl 유전자를 클로닝하고 (재조합백터 PET22b(+)-EstCSl), 이를 대장균 BL2KDE3)에 열 층격 유전자전달 (Heat-shock)방법 으로 형질전환시켜 대장균 BL21(DE3)/pET22b(+)-EstCSl를 제조하였다 (도 2).
<실시예 5> 에스터라제의 생산 <5-l> 에스터라제 발현 및 정제
상기 <실시예 4>에서 수득한 대장균 BL21(DE3)/pET22b(+)-EstCSl를 앰피실 린 (ampicillin, 100 g/m«이 포함된 액체 영양 배지에서 600 ran에서의 흡광도가 0.5 내지 0.6이 될 때까지 37°C에서 배양한 후， 최종 농도 0.5 mM의 IPTG isopropyl-β-으 thiogalactopyranoside)를 배양액에 넣어 21°C에서 18시간 동 안 추가로 배양하였다. 원심분리를 통해 대장균 BL21(DE3)/pET22b(+)-EstCSl를 회 수하여， 결합완층액 [50 mM트리즈마 완층액 (Tris-HCl, H 8.0), 300 mM NaCl]에 현 탁시킨 후， 초음파 분쇄법으로 파쇄하였다. 이를 다시 원심분리하여 회수한 상층액 만을 니켈-엔티에이 (Ni-NTA:nitriloteiacetic acid; Qiagen, 독일) 컬럼에 가하여 이미다졸 (imidazole) 농도 구배를 이용해 에스터라제를 용출시킨 후 투석 농축하였 다.
<5-2> 에스터라제의 확인
상기 실시예 <5ᅳ1>에서 정제한 단백질 농도는 나노드롭 스펙트로포토미터 (NanoDrop Spectrophotometer, nanodrop, 미국)를 이용하여 280 nm에서 흡광도를 측정한 후， 5XSDS(0.156 M Tris-HCl, pH 6.8, 2.5% SDS, 37.5%(v/v) 글리세롤， 37.5 mM DTT)와 1:4로 섞어 100°C에서 5분간 끓였다. 끓인 시료를 12% SDS—PAGE 겔 의 웰에 로딩하고 130v에서 2시간 동안 시료를 전개한 다음 겔을 코마시 염색 방법 으로 염색한후 탈색하여 각각의 재조합 단백질의 발현량을 확인하였다.
그 결과， 도 3에 나타낸 바와 같이 ' '본 발명의 에스터라제는 발현 18 시간 후 시료 속 단백질의 분자량이 약 34 kDa으로 효과적으로 생산되었음을 알 수 있었 으며， 이는 에스터라제의 아미노산 배열로부터 추론된 분자량과 상당히 근접하여 이 단백질 밴드가 본 발명의 신규 에스터라제인 것을 확인할 수 있었다. 또한， 본 발명의 에스터라제는 수용성 형태로 발현이 이루어지고 있음을 확인할 수 있었다 (도 3). <실시예 6>퇴비 메타게놈으로부터 분리한 에스터라제의 특성 조사
상기 실시예 <5-1>에서 정제한 에스터라제 EstCSl의 pH 및 온도 변화에 따 른 효소활성， 다양한 탄소길이를 갖는 기질에 대한 특이성 및 다양한 금속이온에 대한 영향을 측정하였다.
구체적으로, 효소활성 측정을 위한 반웅액은 10 mM 파라 -니트로페닐 에스테 르 (p-nitrophenyl ester) 기질 10 μί, 에탄올 40 μί, 50 mM 트리즈마 완층액 (Tris- HC1, pH 8.0) 940 및 상기 실시예 <5-1>에서 정제한 에스터라제 효소액 5 ^을 첨가하여 5분 또는 60분간 반웅시키면서， 기질에서 분해되어 나오는 파라-니트로페 놀 (p-nitrophenol)을 405 ran에서의 흡광도 증가율로 측정하였다. 이때, 1 유닛 (U) 은 분당 1 μηι 의 파라-니트로페놀을 가수분해하여 생산할 수 있는 효소의 양으로 정의하였다.
<6-1> pH에 대한 에스터라제의 특성
에스터라제 활성에 대한 pH의 영향을 조사하기 위해， pH 4 내지 11의 다양 한 반웅액에서 5분간 활성올 측정하였다.
그 결과， 도 4에 나타낸 바와 같이 pH 8.0에서 최대의 활성을 나타내었고， 상기 다양한 pH에서 60분간 방치한 후 에스터라제의 잔존 활성을 측정한 결과 pH 5.0~L0.0의 넓은 범위에서 안정한 것으로 나타났다 (도 4). <6-2>온도에 대한 에스터라제의 특성
에스터라제 활성에 미치는 온도의 영향을 조사한 결과， 10 내지 80°C의 다 양한 온도의 반웅액에서 5분간 활성을 측정하였다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이 50°C에서 최적 활성을 보였고 (도 5a)， 열에 대한 안정성을 조사하기 위해 각 온도에서 60분간 방치한 후 잔존 효소활성을 측정한 결과 60°C까지의 온도범위에서 그 활성이 유지되어 안정한 것으로 나타났다 (도 5b).
<6-3>다양한 탄소길이에 대한 에스터라제의 특성
다양한 탄소 길이를 갖는 기질에 대한 특이성을 알아보기 위하여, 상기 반 웅액의 파라 -니트로페닐 에스테르를 C2 내지 C18 [파라 -니트로페닐 아세테이트 (P- nitrophenyl acetate, C2), 파라 -니트로페닐 프로피오네이트 p-nitrophenyl propionate, C3), 파라ᅳ니트로페닐 부틸레이트 (p-nitrophenyl butyrate, C4), 파라 -니트로페닐 카프로에이트 (p-nitrophenyl caproate, C6), 파라 -니트로페닐 카프릴 에이트 (p-nitrophenyl caprylate, C8), 파라 -니트로페닐 카프레이트 (p-nitrophenyl caprate, C10), 파라 -니트로페닐 로레이트 (p-nitrophenyl laurate, C12)의 기질로 대체하여 동일한 방법으로 에스터라제 활성을 비교하였다.
그 결과， 도 6에 나타낸 바와 같이 여러 파라 -니트로페닐 에스터 (P- nitrophenyl ester) 중에서 파라 -니트로페닐 프로피오네이트 (p-nitrophenyl propionate, C3)와 파라 -니트로페닐 카프로에이트 (p-nitrophenyl caproate, C6)에 대한 활성이 가장 높았으며， 상대적으로 짧은 아실 사슬을 가진 기질을 더 잘 분해 하는 EstCSl는 에스터라제임을 확인하였다 (도 6).
<6-4>금속이은에 대한 에스터라제의 영향
하기의 표 2에서와 같은 다양한 농도의 다양한 금속이은에 대한 에스터라제 의 활성을 측정하였다.
그 결과, 표 2에 나타낸 바와 같이 대부분 2가 금속이온에 의해 활성이 비 슷하거나， 미비하게 증가하는 것을 확인하였다 (표 2). 【표 2】
속이온에 대한 에스터 라제의 효소활성
Figure imgf000023_0001
<6-5> 유기용매에 대한 에스터라제의 영향
하기 의 표 3과 같은 다양한 농도의 다양한 유기용매에 대한 에스터라제의 활성을 측정하였다 . '
그 결과， 표 3에 나타낸 바와 같이 대부분의 유기용매에 대해 30%까지 활성 을 유지하는 것을 확인하였다.
【표 3】
유기용매에 대한 에스터라제의 효소활성
Figure imgf000023_0002
Figure imgf000024_0001
<6-6>삼차 알콜에 대한 가수분해
EstCSl의 에스테르 가수분해 능력을 알아보기 위해 리나릴 아세트산 (linalyl acetate)를 기질로 사용하여 박층크로마토그래피 (Thin Layer Chromatography)로 분석하였다).
그 결과， 도 7에 나타낸 바와 같이 리나릴 아세트산 (linalyl acetate)은 EstCSl에 의해 리날올 (Linalool)로 가수분해되는 것을 확인하였다. 이는 EstCSl가 삼차 알콜의 입체 장애 에스테르를 제거하는 능력이 있음을 나타낸다 (도 7).

Claims

【청구의 범위】
【청구항 11
에스터라제 (esterase) 활성을 갖는 하기 a 내지 c 중 어느 하나의 폴리펩티 a) 서열번호 1로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티 b) 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건에서 흔성되는 폴리뉴클레 오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드; 및，
c) 서열번호 2로 기재되는 아미노산서열을 갖는 폴리펩티드.
.
【청구항 2]
제 1항에 있어서， 상기 에스터라제는 활성온도가 10 ~ 60°C인 것을 특징으 로 하는 에스터라제 .
【청구항 3】
제 1항의 에스터라제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
【청구항 4]
제 3항에 있어서， 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1로 기재되는 염기서 열을 갖는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
【청구항 5]
제 3항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현백터 .
【청구항 6】 제 5항의 재조합 발현백터가 숙주세포에 형질 도입된 형질전환체.
【청구항 7】
1) 제 3항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현백터를 제조하는 단 계;
2) 상기 재조합 발현백터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 제조하는 단 계; 및，
3) 상기 형질전환체를 배양하여 재조합 단백질의 발현을 유도하고 이를 수 득하는 단계로 구성되는 재조합 에스터라제의 제조방법.
■
【청구항 8】
제 7항에 있어서， 상기 단계 1)의 폴ᅳ리뉴클레오티드의 N-말단에 분리정제용 태그를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 단백질 절단효소 인식부위가 추가로 연결되 는 것을 특징으로 하는 제조방법 .
【청구항 91
제 8항에 있어서 , 상기 분리정제용 태그는 GST, poly-Arg, FLAG, 히스티딘- 택 (His— tag) 및 c-myc으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 제조방법 .
【청구항 10]
제 8항에 있어서， 상기 단백질 절단효소 인식부위를 절단할 수 있는 단백질 분해효소를 처리하여 원래 형태의 에스터라제를 수득하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107189955A (zh) * 2016-11-19 2017-09-22 国家海洋局第二海洋研究所 一种深海新型热稳定性碱性酯酶及应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20090109364A (ko) * 2008-04-15 2009-10-20 한국생명공학연구원 갯벌 메타게놈 유래 신규 에스터라제 및 이의 제조방법
KR20100091749A (ko) * 2009-02-11 2010-08-19 한국화학연구원 토양 메타게놈 유래 신규 에스터라제 유전자 및 이로부터 암호화되는 에스터라제 단백질

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20090109364A (ko) * 2008-04-15 2009-10-20 한국생명공학연구원 갯벌 메타게놈 유래 신규 에스터라제 및 이의 제조방법
KR20100091749A (ko) * 2009-02-11 2010-08-19 한국화학연구원 토양 메타게놈 유래 신규 에스터라제 유전자 및 이로부터 암호화되는 에스터라제 단백질

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
C. ELEND ET AL.: "Isolation and Biochemical Characterization of Two Novel Metagenome Derived Esterases", APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, vol. 72, no. 5, May 2006 (2006-05-01), pages 3637 - 3645 *
CHUL-HYUNG KANG ET AL.: "A novel family VII esterase with industrial potential from compost metagenomic library", MICROBIAL CELL FACTORIES, vol. 10, no. 41, May 2011 (2011-05-01), pages 1 - 8 *
JIN-KYU RHEE ET AL.: "New Thermophilic and Thermostable Esterase with Sequence Similarity to the Hormone-Sensitive Lipase Family, Cloned from a Metagenomic Library", APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, vol. 71, no. 2, February 2005 (2005-02-01), pages 817 - 825 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107189955A (zh) * 2016-11-19 2017-09-22 国家海洋局第二海洋研究所 一种深海新型热稳定性碱性酯酶及应用

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