KR101356478B1 - 토양 메타게놈 유래의 에스터라제 ｅｌｐ９６ 유전자 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 토양 메타게놈 유래의 에스터라제 ELP96 유전자 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명에서 분리한 에스터라제 ELP96 유전자로부터 유도된 단백질이 식물 병원성 세균의 외피다당류를 분해하는 것을 확인함으로써, 상기 단백질을 분비하는 미생물을 이용하여 효과적인 식물 병원균 저항성 작물 또는 식물 병원균 방제용 미생물 제제를 개발할 수 있게 하므로 산업적으로 매우 유용하게 이용될 수 있다.

Description

토양 메타게놈 유래의 에스터라제 ＥＬＰ９６ 유전자 및 이의 용도{Esterase ELP96 gene from soil metagenome and uses thereof}

본 발명은 토양 메타게놈 유래의 에스터라제 ELP96 유전자 및 이의 용도에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 토양 메타게놈 유래의 에스터라제(esterase) ELP96 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포, 상기 재조합 벡터를 숙주세포에 형질전환시켜 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는 재조합 에스터라제 단백질을 생산하는 방법, 상기 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계를 포함하는 식물 병원균 저항성이 증진된 형질전환 식물체의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 식물 병원균 저항성이 증진된 형질전환 식물체 및 이의 종자, 상기 에스터라제 ELP96 단백질을 유효성분으로 함유하는 식물 병원균 방제용 조성물 및 상기 재조합 벡터를 비병원성 균주에 형질전환시킨 형질전환체 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 미생물 농약제제에 관한 것이다.

기존의 미생물 분자생태학적 연구 결과, 통상적인 방법인 순수 배양기술을 통해서 발견되었던 미생물보다 더 많은 미생물이 지구상에 존재한다는 것이 밝혀졌고, 토양 내에 존재하는 미생물의 99% 이상이 배양이 되지 않는 것으로 밝혀졌다. 즉, 이전의 미생물 자원의 발굴이 미생물 순수배양에 의존해 왔으므로 지구상에 존재하는 대다수 다양한 미생물 자원이 발굴되지 못했던 문제가 있었다. 상기 문제를 해결하기 위해서 개발된 미생물 분자생태학적 방법 중의 하나가 메타게놈(metagenome) 연구방법이다. 메타게놈은 미생물이 존재하는 자연환경에서의 모든 미생물 군집의 총 게놈(genome)을 통칭하는 의미로 1998년 Jo Handelsman에 의해서 처음 사용되었다(Handelsman et al., 1998 Chem. Biol. 5, R245-249). 상기 방법은 특정 환경 시료에서 미생물 군집의 총 DNA를 바로 추출하여 커다란 크기의 DNA를 수용할 수 있는 코스미드(cosmid), 포스미드(fosmid) 또는 BAC 벡터(vector)에 클로닝하여 유전자 라이브러리를 제작하는 방법을 포함한다. 상기 방법을 통해 메타게놈으로부터 지난 수년간 다양한 항생제 및 효소들이 발견되었다.

미생물학자인 Eijkmann에 의해서 다양한 미생물이 지질분해효소를 생산하고 분비한다는 연구결과가 1901년에 발표된 이후 지질분해 효소들은 10개 이상의 계열(family)로 분류되고 있다(Eijkmann, 1901 Centralbl. Bakteriol. 29, 841-848). 지질분해에 관련된 효소인 에스터라제(esterase, E.C. 3.1.1.3) 및 리파아제(lipase, E.C. 3.1.1.1)는 생명공학 및 산업적으로 널리 응용되고 있으며, 그 예로는 신규 생합성 물질의 생산, 바이오 디젤의 생산 및 우수한 화합물의 합성에 사용되고 있다.

에스터라제(esterase) 및 리파아제(lipase)의 장점은 다음과 같다. 첫째, 많은 유기용매에 대한 안정성과 정교한 이성질 선택성을 가짐으로써 화학합성을 통해서는 생산할 수 없는 유용한 화합물을 얻을 수 있다. 둘째, 대장균(E. coli)에서 바실러스(Bacillus) 종, 슈도모나스(Pseudomonas) 종 및 벌크홀데리아(Burkholderia) 종 유래의 많은 리파아제들을 생산했던 방법인 이형질적인 과발현 시스템을 이용하여 산업적인 가치를 지닐 수 있을 정도로 효소의 양을 많이 얻을 수 있다. 마지막으로 다른 효소들과 비교하여 조효소를 요구하지 않으므로 생명공학적 활용에 드는 비용이 저렴하며 활용이 용이하다. 또한, 이전의 연구에서 식물이 자체적으로 생산하는 지질 분해효소가 병의 저항성에 관련되어 있다고 보고된 바 있다(Shah, 2005 Annu . Rev . Phytopathol. 43, 229-260).

랄스토니아 솔라나세럼(Ralstonia solanacearum) 균주는 다양한 기주를 공격하여 풋마름병(청고병)을 유발하는 식물 병원성 그람 음성 병원성 인자로서, 외피 다당류(extracellular polysaccharide, EPS) 및 식물세포벽을 분해할 수 있는 가수분해 효소들을 분비한다고 보고되어 있다(Schell, 2000 Annu . Rev . Phytopathol. 38, 263-292). 특히, EPS를 다량 생산하여 기주식물의 물관을 막는 기작은 가지과 작물의 풋마름병을 일으키는 주요 원인이 된다. 이전 연구들을 통해서 다양한 세균들이 세포와 세포 간의 신호전달 체계 정족수 인식(quorum-sensing) 신호물질로 N-아실호모세린 락톤(N-acylhomoserine lactone; AHL)을 사용하며, AHL이 병원성 인자의 발현을 조절하는 것이 밝혀졌다. 이에 반해, 랄스토니아 솔라나세럼(Ralstonia solanacearum)의 경우 3-하이드록시팔미트산 메틸 에스테르(3-hydroxypalmitic acid methyl ester, 3-OH PAME)이 미생물 밀도감지 신호물질로 사용되고, 3-OH PAME에 의해 조절되는 조절 단백질인 PhcA에 의해 랄스토니아 솔라나세럼의 병원성 인자인 EPS 및 가수분해 효소의 생산이 결정되는 것이 보고된 바 있다.

한편, 한국등록특허 제1166038호에는 '신규한 에스터라제 유전자'가 개시되어 있고, 한국공개특허 제2012-0036635호에는 '메타게놈 유래 신규 저온성 에스터라제'가 개시되어 있으나, 본 발명의 토양 메타게놈 유래의 에스터라제 ELP96 유전자 및 이의 용도에 대해서는 기재된 바가 전혀 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명에서는 토양 메타게놈에서 에스터라제(esterase) ELP96 유전자를 분리하였고, 상기 유전자로부터 유도된 단백질을 분리하여 이의 효소 활성을 조사한 결과, 우수한 지질분해 활성을 나타내고, 특정 온도 및 pH에 대한 효소 활성 안정성을 나타내며, 짧은 사슬(short chain) 지방산을 가지는 지질 및 3-하이드록시팔미트산 메틸 에스테르(3-hydroxypalmitic acid methyl ester, 3-OH PAME)를 분해하는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 토양 메타게놈 유래의 에스터라제(esterase) ELP96 단백질을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 에스터라제 ELP96 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터를 숙주세포에 형질전환시켜 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는 재조합 에스터라제(esterase) 단백질을 생산하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계를 포함하는 식물 병원균 저항성이 증진된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 식물 병원균 저항성이 증진된 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 에스터라제 ELP96 단백질을 유효성분으로 함유하는 식물 병원균 방제용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터를 비병원성 균주에 형질전환시킨 형질전환체 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 미생물 농약제제를 제공한다.

본 발명의 토양 메타게놈 유래의 에스터라제(esterase) ELP96 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환시켜 대장균에서 발현시킨 결과, 에스터라제 ELP96 단백질이 짧은 사슬(short chain) 지방산을 가지는 지질 및 3-하이드록시팔미트산 메틸 에스테르(3-hydroxypalmitic acid methyl ester, 3-OH PAME)를 분해하는 것을 확인하였다. 또한, 본 발명에서 분리한 에스터라제 ELP96 유전자로부터 유도된 단백질이 식물 병원성 세균의 외피다당류를 분해하는 것을 확인함으로써, 상기 단백질을 분비하는 미생물을 이용하여 효과적인 식물 병원균 저항성 작물 또는 식물 병원균 방제용 미생물 제제를 개발할 수 있게 하므로 산업적으로 매우 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 서브클론 pULP96 배양 여액의 3-OH PAME(3-hydroxypalmitic acid methyl ester)에 대한 분해 활성을 가스 크로마토그래피(Gas chromatography)로 측정한 결과를 나타낸다.
도 2는 토양 메타게놈에서 분리한 에스터라제(esterase) ELP96을 융합 단백질로 순수분리하여 SDS-PAGE 분석한 결과를 나타낸다. S는 단백질 사이즈 마커, 레인 1은 EPL96 융합 단백질이 과발현되지 않은 균체의 총 단백질 양상, 레인 2는 EPL96 융합 단백질이 과발현된 균체의 총 단백질 양상, 레인 3은 히스티딘 친화성 컬럼(Histrap affinity column)을 이용하여 순수분리한 ELP96 및 레인 4는 음이온교환 컬럼(anion exchange column)을 이용하여 순수분리한 ELP96을 나타낸다.
도 3은 순수분리한 에스터라제 ELP96의 여러 가지 기질들에 대한 효소 활성을 측정한 결과 그래프를 나타낸다. p-나이트로페닐 뷰티레이트(p-nitrophenyl butyrate)에 대한 효소 활성을 기준으로 하여 백분율로 나타내었다. p-NP는 p-나이트로페닐(p-nitrophenyl)을 의미한다.
도 4는 순수분리한 에스터라제 ELP96의 최적 활성을 나타내는 온도 확인을 위해, 다양한 온도 조건에서 p-나이트로페닐 뷰티레이트에 대한 효소 활성을 측정한 그래프를 나타낸다.
도 5는 순수분리한 에스터라제 ELP96의 최적 활성을 나타내는 pH 확인을 위해, 다양한 pH 조건에서 p-나이트로페닐 뷰티레이트에 대한 효소 활성을 측정한 그래프를 나타낸다.
도 6은 순수분리한 에스터라제 ELP96의 3-OH PAME에 대한 분해 활성을 가스 크로마토그래피로 측정한 결과 그래프를 나타낸다.
도 7은 ELP96을 생산할 수 있는 유전자인 ELP96이 형질전환된 랄스토니아 솔라나세럼(Ralstonia solanacearum) GMI1000 균주에서 외피다당류(extracellular polysaccharide, EPS) 생산의 감소 양상을 확인한 결과를 나타낸다. (1) 제공자(donor) 균주인 랄스토니아 솔라나세럼(Ralstonia solanacearum) GMI1000 균주, (2) 도움자(helper) 균주인 랄스토니아 솔라나세럼 GMI1000 pRK415 균주 및 (3) 수령자(recipient) 균주인 랄스토니아 솔라나세럼 GMI1000 pRKELP96 균주를 나타낸다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 토양 메타게놈 유래의 에스터라제(esterase) ELP96(Esterase-Lipase96) 단백질을 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 단백질에서, 상기 단백질의 최적 온도는 48~52℃이고, 최적 pH는 9.5~10.5일 수 있고, 가장 바람직하게는 최적 온도는 50℃일 수 있고, 최적 pH는 10.0일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 단백질에서, 상기 단백질은 3-하이드록시팔미트산 메틸 에스테르(3-hydroxypalmitic acid methyl ester, 3-OH PAME)를 분해할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 에스터라제(esterase) ELP96 단백질의 범위는 토양 메타게놈으로부터 분리된 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다.

본 발명은 또한, 상기 에스터라제(esterase) ELP96 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다.

본 발명에 따른 에스터라제(esterase) ELP96 유전자의 범위는 토양 메타게놈으로부터 분리된 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 유전자 및 상기 염기 서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩타이드, 이종의 펩타이드 또는 이종의 핵산에 의해 암호화된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

본 발명에서, 상기 에스터라제(esterase) ELP96 유전자 서열은 재조합 발현 벡터 내로 삽입될 수 있다. 용어 "재조합 발현 벡터"는 세균 플라스미드, 파아지, 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 포유동물 세포 바이러스 또는 다른 벡터를 의미한다. 대체로, 임의의 플라스미드 및 벡터는 숙주 내에서 복제 및 안정화할 수 있다면 사용될 수 있다. 상기 발현 벡터의 중요한 특성은 복제 원점, 프로모터, 마커 유전자 및 번역 조절 요소(translation control element)를 가지는 것이다.

에스터라제(esterase) ELP96 유전자 서열 및 적당한 전사/번역 조절 신호를 포함하는 발현 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관 내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 발현 벡터는 번역 개시 영역으로서 리보좀 결합 영역 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.

본 발명은 또한, 본 발명의 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.

본 발명의 벡터를 원핵세포에 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 튜린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.

또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 곰팡이, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 사람세포(예컨대, CHO 세포주(Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl₂ 방법, 하나한 방법(Hanahan, D., 1983 J. Mol. Biol. 166, 557-580) 및 전기천공 방법 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법, 및 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 재조합 벡터를 숙주세포에 형질전환시켜 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는 재조합 에스터라제(esterase) 단백질을 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 생산된 재조합 에스터라제(esterase) 단백질을 제공한다.

본 발명은 또한,

서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 토양 메타게놈 유래 에스터라제(esterase) ELP96 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및

상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 식물 병원균 저항성이 증진된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 제조 방법에서, 상기 식물 병원균은 랄스토니아 솔라나세럼(Ralstonia solanacearum)일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 외피다당류(extracellular polysaccharide, EPS)를 다량 생산하는 균은 모두 포함될 수 있다. 상기 랄스토니아 솔라나세럼(Ralstonia solanacearum) 균에 의해 유도되는 식물 세균병은 풋마름병(청고병)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

형질전환 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.

형질전환된 식물세포는 전식물로 재분화되어야 한다. 캘러스 또는 원형질체 배양으로부터 성숙한 식물의 재분화를 위한 기술은 수많은 여러 가지 종에 대해서 당업계에 주지되어 있다(Handbook of Plant Cell Culture, 1-5권, 1983-1989 Momillan, N.Y.).

본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 제조된 식물 병원균 저항성이 증진된 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다.

본 발명은 또한, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 토양 메타게놈 유래 에스터라제(esterase) ELP96 단백질 또는 상기 재조합 에스터라제 단백질을 유효성분으로 함유하는 식물 병원균 방제용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 병원균 방제용 조성물은 예를 들어 직접 분사가능한 용액, 분말 및 현탁액의 형태 또는 고농축 수성, 유성 또는 다른 현탁액, 분산액, 에멀젼, 유성 분산액, 페이스트, 분진, 흩뿌림 물질 또는 과립제로 제조할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 상기 병원균 방제용 조성물은 분사, 분무, 살포, 흩뿌림 또는 붓기에 의해 사용될 수 있다. 사용 형태는 의도한 목적에 의존하는데, 모든 경우에 본 발명에 따른 조성물의 분포가 가능한 한 미세하고 균일하도록 해야 한다.

본 발명의 병원균 방제용 조성물은 다양한 형태로 제제화할 수 있다. 상기 조성물은 예를 들어 용매 및/또는 담체를 첨가함으로서 제조될 수 있다. 종종, 비활성 첨가제 및 표면-활성 물질, 예를 들어 유화제 또는 분산제를 제제에 혼합한다. 적합한 표면-활성 물질은 방향족 술폰산(예를 들어 리그노술폰산, 페놀-술폰산, 나프탈렌- 및 디부틸나프탈렌술폰산), 지방산, 알킬- 및 알킬아릴술포네이트, 알킬 라우릴 에테르, 지방 알코올 술페이트의 알칼리 금속, 알카라인 토금속, 암모늄염, 술페이트화 헥사-, 헵타- 및 옥타데칸올, 지방 알코올 글리콜 에테르의 염, 술포네이트 나프탈렌 및 이의 유도체, 포름알데히드의 축합물, 나프탈렌 또는 나프탈렌술폰산, 페놀 및 포름알데히드의 축합물, 폴리옥시에틸렌옥틸 페놀 에테르, 에톡실화 이소옥틸-, 옥틸- 또는 노닐페놀, 알킬페닐 또는 트리부틸페닐 폴리글리콜 에테르, 알킬아릴폴리에테르 알코올, 이소트리데실 알코올, 지방 알코올/에틸렌 옥사이드 축합물, 에톡실화 피마자유, 폴리옥시에틸렌 알킬에테르 또는 폴리옥시프로필렌, 라우릴 알코올 폴리글리콜 에테르 아세테이트, 소르비톨 에스테르, 리그닌-술파이트 폐액 또는 메틸셀룰로오스일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명은 또한,

(a) 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 토양 메타게놈 유래 에스터라제(esterase) ELP96 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제조하는 단계;

(b) 상기 (a) 단계의 재조합 벡터로 숙주세포를 형질전환하는 단계; 및

(c) 상기 형질전환된 숙주세포를 배양하여 배양액을 얻는 단계를 포함하는 식물 병원균 방제용 조성물의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 (c) 단계의 형질전환된 숙주세포를 배양하는 방법은 당업계에 공지된 일반적인 방법을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 식물 병원균은 랄스토니아 솔라나세럼(Ralstonia solanacearum)일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 외피다당류(extracellular polysaccharide, EPS)를 다량 생산하는 균은 모두 포함될 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 재조합 벡터를 비병원성 균주에 형질전환시킨 형질전환체 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 미생물 농약제제를 제공한다. 본 발명의 신규 에스터라제는 우수한 에스터라제 활성을 나타내고, 기질 특이성을 가지며, 3-OH PAME을 분해하므로 식물 병원성균에 대한 세균병 제어 활성을 나타내므로, 상기 신규 에스터라제를 생산하는 비병원성 균주 및 이를 배양한 배양액을 미생물 농약제제의 유효성분으로 유용하게 사용할 수 있음을 알 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

1) 토양 메타게놈 DNA 의 분리

부산광역시 사상구 학장동의 감전수로 인근에 위치한 공단으로부터 산업적으로 오염된 토양을 2008년 및 2009년에 채취하여 토양 메타게놈 라이브러리 작성에 사용하였다. 상기 채취한 토양을 각 구멍의 직경이 2mm인 체로 걸러서 1.5mm 이상의 입자 및 식물 잔재물 등을 제거하고, 메타게놈 추출을 위하여 5g씩 사용하였다. 메타게놈 추출은 토양에 SDS 및 프로테이나제 K(proteinase K)를 처리하여 DNA를 추출하였다.

구체적으로, 채취한 토양 5g을 완충용액 15㎖에 넣어 섞어주었다. 상기 완충용액의 조성은, 100mM Tris-HCl(pH 8.0), 100mM EDTA(pH 8.0), 100mM 인산나트륨(sodium phosphate)(pH 8.0), 1.5M NaCl 및 1% CTAB(cetyltrimethylammonium bromide)로 구성되었다. 상기 완충용액으로 현탁시킨 토양에 100mg/㎖ 농도의 프로테이나제 K 100㎕를 첨가하고, 37℃ 진탕 배양기에서 90rpm의 속도로 30분간 진탕 배양하였다. 이후에 20% SDS 1.5㎖을 첨가하고 잘 흔들어 섞어주었다. 이를 65℃ 항온 수조에서 30분마다 한번씩 섞어주면서 2시간 동안 유지하였다. 이후에 7,000rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액을 분리하고, 같은 부피의 클로로포름/아이소아밀 알코올(24:1)을 첨가하여 섞어준 후, 8,000rpm에서 5분간 원심분리하여 DNA가 포함된 상등액을 새 튜브로 옮겨주었다. 상등액 부피의 0.6배에 해당하는 이소프로판올(isopropanol)을 첨가하고 섞어준 후, 11,000rpm에서 5분간 원심분리하여 DNA 펠렛을 얻었다. 상기 펠렛에 70% 에탄올을 첨가하여 재 원심분리하고, 펠렛을 건조시킨 후 0.5㎖의 TE 완충액(10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 8.0)에 재현탁하여 4℃에 보관하였다. 그 결과, 해당 토양 시료로부터 메타게놈을 분리하여 토양 1g 당 약 1~1.5㎍의 DNA를 회수하였고, DNA의 크기는 약 20~100kb로 분리가 가능하였다.

2) 메타게놈 라이브러리의 작성

토양으로부터 추출한 메타게놈의 라이브러리를 구축하였다. 이때, DNA 전기영동, 플라스미드(plasmid) 분리 및 DNA 절단은 기준이 되는 분자생물학적 방법(Sambrook et al., 1989 Molecular cloning: a laboratory manual, 3rd ed.)으로 수행하였다.

구체적으로, 추출한 메타게놈을 저융점 아가로스 겔(low melting point agarose gel)에서 전기영동한 후, 25kb 이상의 DNA를 포함하는 아가로스 블락(agarose block)만을 회수하였다. 상기 회수한 아가로스 블락에 GeLase(Epicentre, 미국)를 처리하여 DNA를 순화시켰다. 상기 과정을 통하여 부식산(humic acid)을 제거할 수 있었다. 순화된 DNA 조각의 양끝 말단을 DNA 말단 회복(DNA end-repair) 효소를 이용하여 수선(repair)하였다. 그 후, 25kb 이상의 메타게놈을 제한효소 Eco72I로 처리한 포스미드(fosmid) 벡터인 pEpi-FOS5 및 pCC1FOS(Epicentre, 미국)에 라이게이션(ligation)하였고, packagening extract(Epicentre. 미국)를 이용하여 대장균(E. coli)에 도입한 후, 형질전환체들을 선별하였다. 형질전환체들의 재조합 효율을 검정하기 위하여 전통적인 SDS-알칼리 용해(SDS-alkali lysis) 방법으로 플라스미드를 분리한 후, 제한효소로 절단하여 전기영동하였다.

그 결과, 검정한 30여 개의 형질전환체들이 모두 재조합 플라스미드로 확인되었고, 라이브러리가 잘 작성됨을 확인하였다. 토양 메타게놈 DNA 1㎍당 5,600~90,200 클론을 확보하였다. 작성된 라이브러리는 400~1,000 클론씩 풀(pool)로 -80℃에서 보관하였다. 작성된 라이브러리는 총 125,300 클론이었다. 삽입된 메타게놈 DNA에서 무작위로 메타게놈 라이브러리 클론 플라스미드를 추출하여 BamHI 효소로 절단한 후 전기영동하여 확인한 결과, 평균 크기는 35kb 이상인 것으로 나타났다.

3) 메타게놈 라이브러리의 지질분해 활성 클론 선별

토양으로부터 추출하여 구축한 메타게놈 라이브러리에서 지질분해 활성을 갖는 클론을 선별하였다.

구체적으로, 저장된 각 라이브러리 풀(library pool)을 희석 평판법을 사용하여 알맞은 희석배수를 구하고, 정해진 희석배수에서 한 개의 풀(pool)당 저장된 클론수의 3배 정도가 되도록 플레이트에 배양하여 활성 클론의 탐색을 위해 사용하였다. 라이브러리 클론의 희석을 위해 희석 완충용액(diluent buffer, 8.5g NaCl, 0.3g KH₂PO₄, 0.6g Na₂HPO₄, 0.1g 젤라틴(gelatin))을 사용하였다. 작성된 메타게놈 라이브러리에서 지질 분해 효소를 생산하는 클론을 선별하기 위해, 1% 트리뷰티린(tributyrin, TBN)이 첨가된 LB 아가(agar) 배지 위에 적정 희석 배수를 정해서 라이브러리 클론들을 도말하였다. 그 후, 3~4일간 37℃에서 배양하여 트리뷰티린이 분해되어 대장균 주위에 투명환(clear zone)이 보이는 클론들을 선별하였다. 활성을 나타내는 클론은 동일한 배지에 순수 배양하여 2차적으로 활성을 검정하였다. 선별된 지질분해 효소 생산 클론들의 플라스미드 DNA를 분리하고, 제한효소 BamHI을 사용하여 삽입 DNA를 분석하였고, 동일한 클론들은 제외시켰다. 상기 과정으로 선별된 활성 클론의 플라스미드를 재분리하고, 대장균 EPI-100 및 EPI-300에 형질전환하여 지질분해 활성을 재검정한 후, -80℃에 보관하였다. 그 결과, 총 125,300 클론을 탐색하여 지질분해 활성을 가지는 142개의 클론을 선별하였다. 선별된 클론의 플라스미드를 분리하여 제한효소 BamHI으로 반응시키고, 아가로스 겔 전기영동을 통해 확인한 후에 중복되는 클론을 제거하였다.

4) 지질분해 활성 유전자 부위 결정

토양으로부터 분리된 메타게놈에서 선별한 클론의 지질분해 활성 유전자 부위를 결정하였다. 구체적으로, 지질분해 활성이 우수한 22개의 클론으로부터 플라스미드 DNA를 대량으로 분리하였고, 플라스미드 DNA를 제한효소 Sau3AI으로 부분 절단하여 DNA 크기를 2 내지 5kb로 제작하였다. 상기 DNA 절편들을 BamHI으로 절단한 pUC119 벡터에 라이게이션하여 2차 숏건 라이브러리(shortgun library)를 작성하였다. 작성된 라이브러리를 암피실린(ampicillin) 및 트리뷰티린이 첨가된 LB 배지에 도말하고, 37℃에서 2일간 배양하여 지질분해 활성 서브클론들을 분리하였다. 상기 과정으로 분리된 활성 서브클론 중, 삽입 DNA가 가장 적은 22개의 서브클론들을 최종 선별하였다.

5) 3- OH PAME 을 분해하는 서브클론 선별

토양 메타게놈으로부터 선별한 지질분해 활성을 지닌 22개의 서브클론들이 3-하이드록시팔미트산 메틸 에스테르(3-hydroxypalmitic acid methyl ester, 3-OH PAME)에 대하여 분해 활성을 나타내는지를 검정하였다. 구체적으로, 22개의 서브클론들을 하루 동안 37℃에서 밤새워 배양하고, 그 다음날 4℃에서 하루 동안 배양한 후 원심분리를 실시하여 배양 여액을 각각 취하였다. 3-OH PAME 분해활성을 측정하기 위해 기질인 3-OH PAME을 DMSO(Dimethyl sulfoxide)에 용해시켜 140mM 용액을 제조하였다. 10mM 인산 완충액(pH 7.0)에 1.7mM의 농도로 3-OH PAME을 첨가한 후, 배양 여액 300㎕를 넣고 37℃에서 7시간 동안 반응시켰다. 그 후에 마지막으로 디클로로메탄(dichloromethane)을 이용하여 700㎕씩 두 번 반응시켜 반응물에 존재하는 3-OH PAME을 추출하였다. 대조구는 모든 반응 조건을 동일하게 준비하고, 배양 여액 대신 버퍼만을 첨가하여 동일 조건에서 반응을 수행하였다. 추출된 시료 내의 3-OH PAME은 가스 크로마토그래피(Gas Chromatography) 전용 유리 바이알(vial)에 보관하였다.

추출 후 유리 바이알(vial)에 보관된 시료의 3-OH PAME 분해 활성을 측정하기 위하여 불꽃 이온화 검출기(flame ionization detector) 및 길이 30m, 직경 0.25㎛ HP-5 컬럼(column)이 장착된 Agilent Technologies 7890A Gas Chromatography system(미국)을 사용하였다. 인젝터(injector) 온도는 300℃로 설정하고, 컬럼 온도는 150℃에서 5분간 유지 후에 1분당 12℃씩 280℃까지 온도가 증가하도록 하고, 마지막으로 280℃에서 5분간 유지하며 분석을 실시하였다. 검출된 3-OH PAME의 양을 분석하여 3-OH PAME 분해 활성을 가지는 서브클론을 선별하였고, 그 중 분해 활성이 우수한 pULP96을 최종 선별하였다(도 1).

6) 지질분해 활성 유전자 부위를 포함하는 형질전환체의 제조

지질분해 활성 유전자 부위를 포함하는 pULP96을 대량으로 생산할 수 있는 형질전환체를 제조하였다. 구체적으로, 플라스미드 pULP96을 대장균 수용 세포(competent cell) DH5a 50㎕와 혼합한 후, 얼음에서 20분간 정치시켰다. 그 후, 42℃에서 45초간 열처리하여 pULP96을 수용 세포 내로 도입시킨 후, LB 배지 400㎕를 첨가하여 37℃에서 45분 동안 배양하였다. 수용 세포에 도입된 형질전환체를 선별하기 위하여 1% 트리뷰티린 및 암피실린 100㎍/㎖이 함유된 LB 플레이트에 도말하고, 37℃에서 16시간 동안 배양하였다. 배양된 플레이트로부터 트리뷰티린을 가수분해하여 강한 활성을 보이는 콜로니들을 선별하였다. 선별된 콜로니의 pULP96 도입 여부를 확인하기 위하여 플라스미드 DNA를 분리하고, 적절한 제한효소로 절단한 후 절단 양상을 판별하여 pULP96 도입 여부를 확인하였다. 그 결과, 강한 지질분해 활성을 유지하는 pULP96을 함유한 대장균 DH5a 형질전환체가 제작됨을 확인하였고, 상기 균주에 글리세롤 스톡을 첨가하여 -80℃에 보관하였다.

7) 지질분해 활성 유전자 과발현 및 단백질 분리

플라스미드 pULP96에 존재하는 지질분해 활성 유전자를 효소활성 단백질로 순수분리하였다. 구체적으로, 히스티딘 태킹(histidine tagging)하는 과발현 벡터인 pET-30b(+)(NOVAGEN, 독일)에 클로닝하기 위해 종결코돈이 그대로 위치하면서 양쪽 말단에 각각의 유전자에 맞는 제한효소 영역을 가질 수 있도록 해주는 프라이머를 제작하여 pULP96 유전자를 주형으로 PCR을 수행하였다. 사용한 프라이머의 서열은 하기와 같다; pULP96f; 5'-ACCTGCAGAATTCGATGACTATGG-3'(서열번호 3) <EcoRI 포함>, pULP96r; 5'-AAGGTGAATTCATCAGGCAGG-3'(서열번호 4) <EcoRI 포함>

PCR 반응물은 50㎕ 용액에 10X Taq DNA 버퍼, dNTPs, Taq DNA 폴리머라제, 2mM MgSO₄ 및 약 1~5ng의 주형(template) DNA를 첨가하여 조합하였다. PCR 반응은 95℃에서 3분의 최초 변성; 95℃에서 30초 변성, 60℃에서 30초 어닐링 및 72℃에서 1분 30초 중합의 30회 반응을 수행하고, 마지막으로 72℃에서 5분간 확장 반응을 수행하였다.

증폭된 PCR 산물은 pET-30b(+) 벡터로의 클로닝 효율을 높이기 위해서 pGEM-T Easy 벡터에 1차적으로 라이게이션을 실시한 후에 각각의 유전자에 알맞은 제한효소로 절단하고, 동일한 제한 효소로 잘려진 pET-30b(+) 벡터에 클로닝하였다. 재조합된 플라스미드는 'pELP96'으로 명명하였다. 그리고 숙주(host) 균주인 대장균(E. coli ) BL21(DE3) 또는 대장균 BL21(DE3) pLysS에 형질전환시킨 후에, 카나마이신(kanamycin) 및 1mM 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노사이드(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside, IPTG)가 첨가된 LB 트리뷰티린 아가 배지에서 활성을 나타내는 형질전환체를 선별하였다. 최종 선별된 E. coli BL21(DE3) pELP96은 지질 분해 효소를 분리하기 위해 사용되었다.

ELP96 융합 단백질을 분리하기 위해, 항생제가 포함된 LB 액체 배지에 접종하여 37℃에서 종균 배양을 한 후, 다음날 새로운 LB 액체 배지 500㎖에 신선한 균을 접종하여 O.D.₆₀₀값이 0.6이 될 때까지 배양하였다. ELP96 융합 단백질의 발현을 유도하기 위해, 1mM의 IPTG를 첨가한 후에 25℃로 옮겨서 4시간 동안 추가 배양하고, 원심분리하여 세포를 회수하였다.

융합 단백질을 분리하는 방법은 다음과 같다; 회수된 세포에 용리 완충용액(20mM Tris-Cl, pH 8.0)을 첨가하고, 호모믹서(sonic dismembrator Model 500, Fisher Scientific)를 사용하여 Pulse ON 10초 및 Pulse OFF 10초의 조건으로 총 2 분 동안 세포를 파괴하였다. 반응이 끝난 후에 용해물(lysate)을 4℃ 조건에서 10,000g로 10분간 원심분리시킨 후에, 세포 잔해(cell debris)를 제거한 상등액을 ELP96 융합 단백질을 분리하기 위해 사용하였다. 세포 용해물의 상등액 1㎖을 HisTrap^TM HP affinity column(GE Healthcare)이 설치된 prime liquid chromatography system(GE Healthcare)을 이용하여 히스티딘이 태깅된 융합 단백질을 순수분리하였다.

분리된 융합 단백질은 12% SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)를 통하여 확인하였다. SDS-PAGE 전기영동 후 단백질 검출은 쿠마시블루(coomassie blue) 염색 방법으로 확인하였다. 상기 방법으로, 가용성 분획(soluble fraction)으로 축적되는 ELP96이 순수분리된 융합 단백질임이 확인되었다. 그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 예상했던 크기보다 6kDa 정도 큰 크기를 가지는 분리된 단백질 밴드(band)를 확인할 수 있었다. 이는 ELP96 융합 단백질이 히스티딘 태깅(histidine tagging)에 의해 융합되면서 일어난 크기의 변화와 일치하였다. 이후 실험부터 ELP96은 순수분리된 융합 단백질을 사용하였다.

8) 순수분리한 ELP96 단백질의 기질특이성 분석

순수분리된 ELP96 융합 단백질의 기질특이성을 측정하였다. 구체적으로, p-나이트로페닐(p-nitrophenyl; pNP) 아실에스테르(acylester)인 p-나이트로페닐 뷰티레이트(butyrate), 발러레이트(valerate), 옥타노에이트(octanoate), 데카노에이트(decanoate) 및 팔미테이트(palmitate)를 0.1M NaCl 및 0.3%의 트리톤(Triton) X-100이 포함된 100mM 인산(sodium phosphate) 완충액(pH 7.25)에 2mM의 농도로 희석하여 총 700㎕로 혼합액을 제조하였다. 상기 혼합액에 분리된 ELP96 융합 단백질(4.55㎎/㎖) 용액 50㎕를 첨가하고, UV/VIS 분광광도계(spectrophotometer) DU730(Beckman Coulter)을 사용하여 400nm에서 각 기질에 대한 효소 활성을 측정하였다. 효소활성 분석을 위하여, ELP96 융합 단백질의 1 유닛(unit)은 p-나이트로페닐 아실에스테르(p-nirophenyl acylester)와 반응하여 분당 1μmol의 p-나이트로페놀(p-nitrophenol)을 만들어내는 효소의 양으로 정의하였다. 효소 활성은 p-나이트로페닐 뷰티레이트에 대하여 가장 높은 활성을 나타내었다. 따라서 p-나이트로페닐 뷰티레이트에 대한 활성을 기준으로 하여 다른 기질에 대한 활성을 백분율로 환산하여 분석하였다.

9) 최적 온도 및 pH 분석

ELP96 융합 단백질의 반응 최적 온도를 알아보기 위해, p-나이트로페닐 뷰티레이트를 사용하여 15~55℃의 범위 내 다양한 온도의 0.1M NaCl 및 0.3%의 트리톤X-100이 포함된 100mM 인산 완충액(pH 8.0) 혼합액을 사용하여 각 온도 조건에서의 효소 활성을 측정하였다.

또한, ELP96 융합 단백질의 반응 최적 pH를 알아보기 위해, pH 3.0~11.0의 범위에서 활성 측정을 실시하였다. 최적 pH 확인을 위한 pH별 완충액으로는 pH 3.0~6.0은 시트레이트(sodium citrate) 완충액, pH 6.0~8.0은 인산칼륨(potssiumium phosphate) 완충액, pH 8.0~10.0은 붕산나트륨(sodium borate) 완충액 및 pH 10.0~11.0은 탄산나트륨(sodium carbonate) 완충액을 사용하였다. 각 기질에 대한 효소 활성은 UV/VIS 분광광도계(spectrophotometer) DU730(Beckman Coulter)를 사용하여 348nm 파장으로 40℃에서 측정하였다.

10) 융합 단백질을 이용한 3- OH PAME 분해 활성 측정

순수분리된 ELP96 융합 단백질이 3-OH PAME에 대하여 분해 활성을 나타내는지를 검정하였다. ELP96 단백질의 3-OH PAME 분해 활성을 측정하기 위해 기질인 3-OH PAME을 DMSO에 용해시켜 140mM 용액을 제조하였다. 10mM 인산 완충액(pH 7.0)에 1.0mM의 농도로 3-OH PAME을 첨가한 후, 융합 단백질 용액 300㎕를 넣고 37℃에서 12시간 동안 반응시켰다. 그 후에 마지막으로 디클로로메탄(dichloromethane)을 700㎕씩 두 번 반응시켜 반응물에 존재하는 3-OH PAME을 추출하였다. 대조구는 모든 반응 조건을 동일하게 준비하고, 배양 여액 대신 버퍼만을 첨가하여 동일 조건에서 반응을 수행하였다. 추출된 시료 내의 3-OH PAME은 가스 크로마토그래피(Gas Chromatography) 전용 유리 바이알(vial)에 보관하였다. 추출 후 유리 바이알(vial)에 보관된 시료의 3-OH PAME 분해 활성을 측정하기 위하여 불꽃 이온화 검출기(flame ionization detector) 및 길이 30m, 직경 0.25㎛ HP-5 컬럼(column)이 장착된 Agilent Technologies 7890A Gas Chromatography system(미국)을 사용하였다. 인젝터(injector) 온도는 300℃로 설정하고, 컬럼 온도는 150℃에서 5분간 유지 후에 1분당 12℃씩 280℃까지 온도가 증가하도록 하고, 마지막으로 280℃에서 5분간 유지하며 분석을 실시하였다. 검출된 3-OH PAME의 양을 분석하여 3-OH PAME 분해 여부를 판단하였다.

11) 3- OH PAME 을 분해하는 유전자 부위를 포함하는 식물 병원성 세균 형질전환체의 제조

ELP96 융합 단백질이 식물 병원성 세균의 외피다당류(extracellular polysaccharide, EPS)를 분해하는지 확인하기 위하여, 3-OH PAME을 분해하는 단백질을 생산하는 유전자 부위를 포함하여 ELP96을 생산하는 랄스토니아 솔라나세럼(Ralstonia solanacearum) 균주 형질전환체를 제조하였다.

구체적으로, 플라스미드 pULP96을 포함하는 활성 유전자 부위를 광역 숙주 범위(broad host range) 벡터인 pRK415 벡터에 클로닝하기 위해, 리보솜 결합 부위가 포함되고, 개시 코돈 및 종결 코돈이 그대로 위치하면서 양쪽 말단에 각각의 유전자에 맞는 제한효소 영역을 가질 수 있도록 해주는 프라이머를 제작하여 pULP96 유전자를 주형으로 PCR을 실시하였다. 사용된 프라이머의 서열은 하기와 같다: pRKELP96f; 5'-AGGGATCCTCTAGAGGATCCCACC-3' (서열번호 5) <BamHI 포함>, pRKELP96r; 5'-TCCGAAGGTGGTACCATCAGGCAG-3' (서열번호 6) <KpnI 포함>

PCR 반응물은 50㎕ 용액에 10X Taq DNA 버퍼, dNTPs, Taq DNA 폴리머라제, 2mM MgSO₄ 및 약 1~5ng의 주형(template) DNA를 첨가하여 조합하였다. PCR 반응은 95℃에서 3분의 최초 변성; 95℃에서 30초 변성, 60℃에서 30초 어닐링 및 72℃에서 1분 30초 중합의 30회 반응을 수행하고, 마지막으로 72℃에서 5분간 확장 반응을 수행하였다. 증폭된 PCR 산물은 pRK415 벡터로의 클로닝 효율을 높이기 위해서 pGEM-T Easy 벡터에 1차적으로 라이게이션을 실시한 후에 각각의 유전자에 알맞은 제한효소로 절단하고, 동일한 제한 효소로 잘려진 pRK415 벡터에 클로닝하였다. 재조합된 플라스미드는 'pRKELP96'으로 명명하였다.

또한, 숙주(host) 균주인 대장균(E. coli) DH5a 에 형질전환시킨 후에 테트라싸이클린(tetracycline)이 첨가된 LB 트리뷰티린 아가 배지에서 활성을 나타내는 형질전환체를 선별하였다. 최종 선별된 형질전환체 및 랄스토니아 솔라나세럼(R. solanacearum) GMI1000 균주를 이용하여 삼친 교배(Triparental mating)를 통한 3-OH PAME을 분해하는 유전자를 가지는 식물병원성 세균 형질전환체를 제작하였다. 구체적으로, 제공자(donor) 균주로는 앞서 제작된 형질전환체를 사용하고, 도움자(helper) 균주로는 E. coli HB101 pRK2013 균주, 수령자(recipient) 균주로는 랄스토니아 솔라나세럼(R. solanacearum) GMI1000 균주를 사용하였다.

실시예 1. 토양 메타게놈으로부터 분리된 3- OH PAME 분해 활성을 가지는 유전자 및 아미노산 서열 분석

토양에서 분리한 신규한 에스터라제 유전자를 동정하기 위하여, 토양 미생물로부터 메타게놈을 분리한 후, 포스미드(fosmid)를 이용하여 대장균에 메타게놈 라이브러리를 작성하였다. 상기 작성된 라이브러리로부터 트리뷰티린(tributyrin)의 가수분해 여부를 통해 우수한 지질분해 활성을 갖는 메타게놈 클론을 선별하였다. 우수한 지질 활성 관련 유전자를 다시 작게 재분리하여 3-하이드록시팔미트산 메틸 에스테르(3-OH palmitic acid methyl ester; 3-OH PAME) 가수분해 여부를 통해 활성 유전자 부위를 결정하였고, 이의 염기서열을 분석하였다. 선별된 서브클론의 DNA 염기서열 결정은 코스모진텍(서울, 한국)에 분석을 의뢰하였다. 밝혀진 DNA 염기서열은 NCBI(National Center for Biotechnology Information)에서 제공하는 BLAST 프로그램을 사용하여 분석하였다. 염기서열 분석결과, 지질분해 활성을 나타내는 유전자는 999bp의 염기서열로 구성되어 있었고, 상기 염기서열을 포함하는 서브클론을 pULP96으로 명명하였다. 서열번호 1의 염기서열을 갖는 지질분해 활성 유전자를 기존에 보고된 에스터라제 효소들과 비교한 결과, 35~38% 정도의 낮은 상동성을 보였고, 지질분해 활성을 암호화하는 신규한 유전자인 것으로 확인되었다.

pULP96의 염기서열을 이용하여 이로부터 암호화되는 아미노산 서열을 분석하였는데 구체적으로, 서열번호 1로 기재되는 염기서열로부터 암호화되는 단백질은 278개 아미노산 서열(서열번호 2)로 구성된 것을 확인하였고, 상기 지질분해 효소 단백질을 'ELP96'으로 명명하였다. 단백질의 분자량이 30,980Da으로 유추된 아미노산 서열을 NCBI에서 제공하는 BLAST 프로그램을 사용하여 분석하였다.

그 결과, 지질분해 효소들이 공통적으로 가지고 있는 Gly-Xaa-Ser-Xaa-Gly 영역('Xaa'는 임의의 아미노산일 수 있다)을 가지고 있는 것을 확인하였다. ELP96은 이전에 보고되었던 효소 단백질들에 대해 40% 이하의 상동성을 나타내었고, 그 중 대부분이 가수분해 효소 단백질이었다. 상동성 분석 결과, 비슷한 효소로서 기능이 알려진 유전자에서 유추된 아미노산 서열이 가장 유사한 단백질로는 배양이 되지 않는 박테리아(uncultured bacterium)의 리파아제/에스터라제(lipase/esterase)(ABQ11270, 35% 상동성)만이 발견되었다. 따라서 상기 선별된 지질분해 활성 효소가 신규 리파아제/에스터라제(lipase/esterase) 계열 중 하나인 것을 확인하였다.

실시예 2. 순수분리한 ELP96 단백질의 기질특이성, 최적 온도 및 pH 분석 결과

순수분리된 ELP96 융합 단백질의 기질특이성을 측정한 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 활성 측정에 사용한 여러 기질 중 짧은 사슬 p-나이트로페닐 아실에스테르인 p-나이트로페닐 뷰티레이트, p-나이트로페닐 발러레이트 및 긴 사슬 p-나이트로페닐 아실에스테르인 p-나이트로페닐 옥타노에이트에 대해 각각 100%, 90.95% 및 72.57%의 높은 활성을 나타내었지만, 긴 사슬 p-나이트로페닐 아실에스테르인 p-나이트로페닐 데카노에이트 및 p-나이트로페닐 팔미테이트에 대해서는 각각 42.45% 및 10.72%의 낮은 활성을 나타내었다. 상기 결과를 바탕으로 지질 분해 효소 ELP96이 에스터라제임을 확인하였다(도 3).

ELP96 융합 단백질의 반응 최적 온도를 알아보기 위해, p-나이트로페닐 뷰티레이트를 사용하여, 각 온도 조건에서의 효소 활성을 측정한 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 최적 온도는 50℃로 나타났고, 35~55℃ 범위의 온도 조건에서도 50% 이상의 활성을 나타내는 것을 확인하였다(도 4).

또한, ELP96 융합 단백질의 반응 최적 pH를 알아보기 위해, pH 3.0~11.0의 범위에서 활성 측정을 실시한 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 효소반응의 최적 pH는 pH 10.0을 나타내었고, pH 7.0~11.0 사이에서도 50% 이상의 활성을 나타내는 것을 확인하였다(도 5).

실시예 3. 융합 단백질을 이용한 3- OH PAME 분해 활성 측정

순수분리된 ELP96 융합 단백질이 3-OH PAME에 대하여 분해 활성을 나타내는지를 검정하였다. 그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 실험에 사용한 3-OH PAME의 양이 1.76% 정도만이 잔존하고 모두 분해된 것을 확인하였고, 상기 결과를 바탕으로 ELP96 융합 단백질이 3-OH PAME을 분해하는 효과적인 3-OH PAME 하이드롤라제(hydrolase)인 것을 확인하였다(도 6).

실시예 4. 3- OH PAME 을 분해하는 유전자 부위를 포함하는 식물 병원성 세균 형질전환체의 제조

3-OH PAME을 분해하는 단백질을 생산하는 유전자 부위를 포함하여 ELP96을 생산하는 랄스토니아 솔라나세럼(Ralstonia solanacearum) 균주 형질전환체를 제조하여 ELP96 융합 단백질이 식물 병원성 세균의 외피다당류(extracellular polysaccharide, EPS)를 분해하는지 확인하였다(도 7). 그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 에스터라제(esterase) 유전자가 형질전환된 랄스토니아 솔라나세럼(R. solanacearum) 형질전환 균주에서 외피다당류(EPS)가 현저히 감소한 것을 확인할 수 있었다. 상기 결과로서, 식물의 풋마름병(청고병)을 일으키는 주요 원인이 되는 랄스토니아 솔라나세럼(R. solanacearum) 균주의 외피다당류(EPS)를 억제시킴으로써 식물 병원균 제어 및 병원균에 대한 저항성을 지닌 작물 생산이 가능할 것으로 예측된다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims (11)

1. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 토양 메타게놈 유래의 에스터라제(esterase) ELP96 단백질.
2. 제1항에 있어서, 최적 온도는 48~52℃이고, 최적 pH는 9.5~10.5인 것을 특징으로 하는 단백질.
3. 제1항에 있어서, 3-하이드록시팔미트산 메틸 에스테르(3-hydroxypalmitic acid methyl ester, 3-OH PAME)를 분해하는 것을 특징으로 하는 단백질.
4. 제1항의 에스터라제(esterase) ELP96 단백질을 코딩하는 유전자.
5. 제4항의 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
6. 제5항의 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포.
7. 제5항의 재조합 벡터를 숙주세포에 형질전환시켜 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는 재조합 에스터라제(esterase) 단백질을 생산하는 방법.
8. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 토양 메타게놈 유래 에스터라제(esterase) ELP96 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및
   상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 식물 병원균 저항성이 증진된 형질전환 식물체의 제조 방법.
9. 제8항에 있어서, 상기 식물 병원균은 랄스토니아 솔라나세럼(Ralstonia solanacearum)인 것을 특징으로 하는 방법.
10. 제1항의 에스터라제(esterase) ELP96 단백질 또는 제7항의 방법에 의해 생산된 재조합 에스터라제(esterase) 단백질을 유효성분으로 함유하는 식물 병원균 방제용 조성물.
11. 제5항의 재조합 벡터를 비병원성 균주에 형질전환시킨 형질전환체 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 미생물 농약제제.

Images