CN103975072B

CN103975072B - 蛋白酶缺陷性炭疽芽孢杆菌

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Publication number: CN103975072B
Application number: CN201280048638.1A
Authority: CN
Inventors: A.P.波梅兰茨夫; S.H.莱普拉
Original assignee: United States, Is Represented By Health And Minister Of Mankind Service Department
Current assignee: United States, Is Represented By Health And Minister Of Mankind Service Department
Priority date: 2011-08-02
Filing date: 2012-08-02
Publication date: 2018-05-08
Anticipated expiration: 2032-08-02
Also published as: US20170145525A1; WO2013019946A2; CN103975072A; US10273548B2; US20140314716A1; EP2739746A2; WO2013019946A3; US9555064B2

Abstract

本发明涉及其中通过遗传修饰使超过一种分泌的蛋白酶失活的炭疽芽胞杆菌。这类蛋白酶缺陷性炭疽芽孢杆菌相比于其他细菌，特别是其他芽孢杆菌具有改进的产生重组分泌蛋白质的能力。改进包括经常以高产率产生完整的(即成熟的全长)蛋白质。本公开提供一种炭疽芽孢杆菌，其包含使金属蛋白酶M4家族的蛋白酶失活的遗传修饰和使金属蛋白酶M6家族的蛋白酶失活的遗传修饰。还提供用编码产物的重组分子转化的、包含这类遗传修饰的经修饰炭疽芽孢杆菌，以及制备和使用这类炭疽芽孢杆菌的方法。

Description

蛋白酶缺陷性炭疽芽孢杆菌

发明领域

本发明涉及一种蛋白酶缺陷性炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)及其作为生产微生物产生稳定的(即完整的)蛋白质，包括重组分泌的蛋白质的用途。

发明背景

芽孢杆菌的种如炭疽芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，就其快速生长速率、高产率和将产生的产物直接分泌到培养基中的能力而言是用于重组蛋白质生产的有吸引力的微生物。炭疽芽孢杆菌就其产生炭疽毒素的能力和正确折叠蛋白质的能力而言也是有吸引力的。然而，考虑到该微生物分泌到培养基中的大量胞外蛋白酶(导致蛋白质降解)和它们形成孢子的事实，芽孢杆菌的吸引力下降。

在生长于认为模拟在感染的动物宿主中的那些条件下时，革兰氏阳性细菌病原体炭疽芽孢杆菌(本文中亦称为炭疽芽孢杆菌)分泌高水平的3种蛋白质，其统称为炭疽毒素：保护性抗原(PA)、水肿因子(EF)和致死因子(LF)。PA是受体结合组分，其作用于向真核细胞的胞质溶胶投递LF和EF；EF是钙调蛋白依赖性腺苷酸环化酶，而LF是锌金属蛋白酶，其切割促细胞分裂剂活化的蛋白质激酶激酶家族的大多数成员；参见例如，Leppla SH等,2000,inAnthrax toxin,bacterial protein toxins,445-472,Aktories K等,(编),Springer,Berlin；Moayeri M等,2011,Anthrax toxins,Bacillus anthracis and Anthrax,121-156,Bergman(编),John Wiley&Sons,Inc.,Hoboken,NJ；Moayeri M等,2009,Mol.AspectsMed.30,439-455；Young JA等,2007,Annu.Rev.Biochem.76,243-265。PA、EF和LF在病毒性质粒pXO1上分别由pag、cya和lef编码。病毒性质粒pXO2编码荚膜(capsule)形成和解聚所需的蛋白质。缺少一种或两种病毒性质粒的炭疽芽孢杆菌通常在大多数动物宿主中消弱。单一的PA、EF和LF组分是无毒性的；一种PA与至少两种EF、至少两种LF、或EF和LF的混合物的组合是毒性所需要的。

由于炭疽致病机制高度依赖于炭疽毒素蛋白的作用，因此疫苗和治疗物开发努力聚焦于抵消毒素作用，通常通过生成对PA的抗体。目前在美国许可的且几乎50年前开发的炭疽疫苗(参见例如，Puziss M等,1963,J.Bacteriol.85,230-236)由蛋白酶缺陷性炭疽芽孢杆菌菌株(V770-NP1-R)的部分纯化的培养上清液组成。PA是该疫苗中最丰富的蛋白质和关键的免疫原。通过确立方法的规模扩大从炭疽芽孢杆菌产生重组PA疫苗的努力(参见例如，Farchaus JW等,1998,Appl.Environ.Microbiol.64,982-991)似乎受到终产物不稳定性的妨碍。

尽管可将毒素组分作为重组蛋白从炭疽芽孢杆菌培养上清液纯化(参见例如，Farchaus JW等，同上；Varughese M等,1999,Infect.Immun.67,1860-1865；Singh Y等,1991,J.Biol.Chem.266,15493-15497；Park S等,2000,Protein Expr.Purif.18,293-302)，但完整性和产率均受到共分泌的炭疽芽孢杆菌蛋白水解酶的限制。

报告了两种胞外蛋白酶富含在炭疽芽孢杆菌分泌组(secretome)中：NprB(GBAA_0599)，中性蛋白酶B，一种与来自其他芽孢杆菌菌种的bacillolysin(芽孢杆菌溶素)高度同源的嗜热菌蛋白酶(thermolysin)样酶；和InhA1(GBAA_1295)，免疫抑制剂A1，是来自蜡样芽孢杆菌组其他成员的免疫抑制剂A的同源物(参见例如，Antelmann H等,2005,Proteomics 5,3684-3695；Chitlaru T等,2006,J.Bacteriol 188,3551-3571；Chung MC等,2006,J.Biol.Chem.281,31408-31418)。这两种蛋白酶含有金属肽酶zincin族典型的锌结合基序(His-Glu-Xxx-Xxx-His(SEQ ID NO:31))且分别属于依照MEROPS数据库，Wellcome Trust Sanger Institute的金属蛋白酶的M4和M6家族(参见例如，WellcomeTrust Sanger Institute的网站)。

第三种金属蛋白酶camelysin(GBAA_1290)属于M73家族，其在几种炭疽芽孢杆菌菌株的分泌组中发现。该蛋白酶类似于蜡样芽孢杆菌的camelysin，一种新的表面金属蛋白酶；参见例如，Grass G等,2004,Infect.Immun.219-228。

炭疽芽孢杆菌还含有编码InhA2金属蛋白酶(GBAA_0672，M6家族)的基因，尽管不知晓该蛋白酶是否表达和分泌。该基因是上文描述的InhA1的直系同源物(68％氨基酸同一性)。类似地，炭疽芽孢杆菌的基因组还含有编码TasA(GBAA_1288，M73超家族)和MmpZ(GBAA_3159，ZnMc超家族)的基因，TasA是camelysin的直系同源物(60％氨基酸同一性)，MmpZ是一种推定的胞外锌依赖性基质金属蛋白酶，是金属肽酶metzincin族的一个成员。该族特征是延长的锌结合基序(His-Glu-Xxx-Xxx-His-Xxx-Xxx-Gly/Asn-Xxx-Xxx-His/Asp(SEQ ID NO:32))(参见例如，Gomis-Ruth,FX,2009,J.Biol.Chem.284,15353-15357)。

已产生并分析了具有超过一种蛋白酶失活的枯草芽孢杆菌菌株。例如，Wu XC等,1991,J.Bacteriol.173,4952-4958产生了在6种胞外蛋白酶，即中性蛋白酶A、枯草杆菌蛋白酶、胞外蛋白酶、金属蛋白酶、杆菌肽酶F(bacillopeptidase F)和中性蛋白酶B中缺陷性的枯草芽孢杆菌菌株(WB600)。WB600显示仅0.32％的野生型枯草芽孢杆菌菌株的胞外蛋白酶活性。Kurashima K等,2002,J.Bacteriol.184,76-81，在有8种蛋白酶缺陷性的枯草芽孢杆菌菌株(WB800)中表达表观完整的食纤维梭菌(Clostridium cellulovorans)EngB纤维素酶。WB800经由VpR蛋白酶和细胞壁蛋白酶WprA的失活源自WB600。WB700经由VpR的失活源自WB600(参见例如，Wu等,2002,Appl.Environ.Microbiol.68,3261-3269)。

已有关于将某些分别的炭疽芽孢杆菌蛋白酶失活的报告：炭疽芽孢杆菌NprB的失活导致降低的酪蛋白的蛋白水解(参见例如，Pomerantsev AP等,2006,Infect.Immun.74,682-693)。InhA1的失活指示炭疽芽孢杆菌将人血液凝结需要InhA1用于凝血酶原和因子X的蛋白水解性活化(参见例如，Kastrup CJ等,2008,Nat.Chem.Biol.4,742-750)。然而，炭疽毒素蛋白在这两种菌株中的产生导致随时间的蛋白质降解，尽管时间比在炭疽芽孢杆菌A35中的产生要晚。

仍然需要能产生大量稳定的(即完整的)蛋白质如炭疽毒素蛋白PA、EF和LF的炭疽芽孢杆菌。

发明概述

本发明涉及其中通过遗传修饰使超过一种分泌的蛋白酶失活的炭疽芽胞杆菌。这类蛋白酶缺陷性炭疽芽孢杆菌相比于其他细菌，特别是其他芽孢杆菌具有改进的产生重组分泌蛋白质的能力。改进包括经常以高产率产生完整的(即成熟的全长)蛋白质。

本公开提供一种炭疽芽孢杆菌，其包含使金属蛋白酶M4家族的蛋白酶失活的遗传修饰和使金属蛋白酶M6家族的蛋白酶失活的遗传修饰。一个实施方案是包含使金属蛋白酶M4家族的蛋白酶失活的遗传修饰和使金属蛋白酶M6家族的蛋白酶失活的遗传修饰的炭疽芽孢杆菌。一个实施方案是包含使金属蛋白酶M4家族的蛋白酶失活的遗传修饰、使金属蛋白酶M6家族的蛋白酶失活的遗传修饰、和使金属蛋白酶M73家族的蛋白酶失活的遗传修饰的炭疽芽孢杆菌。一个实施方案是包含使金属蛋白酶M4家族的蛋白酶失活的遗传修饰、使金属蛋白酶M6家族的蛋白酶失活的遗传修饰、使金属蛋白酶M73家族的蛋白酶失活的遗传修饰、和使锌依赖性金属蛋白酶ZnMc超家族的炭疽芽孢杆菌蛋白酶失活的遗传修饰的炭疽芽孢杆菌。M4蛋白酶的一个例子是NprB。M6蛋白酶的例子包括InhA1和InhA2。M73蛋白酶的例子是camelysin和TasA。ZnMc蛋白酶的一个例子是MmpZ。

一个实施方案是包含使NprB蛋白酶失活的遗传修饰和使InhA1蛋白酶失活的遗传修饰的炭疽芽孢杆菌。一个实施方案是包含使NprB蛋白酶失活的遗传修饰、使camelysin蛋白酶失活的遗传修饰和使InhA1蛋白酶失活的遗传修饰的炭疽芽孢杆菌。一个实施方案是包含使NprB蛋白酶失活的遗传修饰、使TasA蛋白酶失活的遗传修饰、使camelysin蛋白酶失活的遗传修饰和使InhA1蛋白酶失活的遗传修饰的炭疽芽孢杆菌。一个实施方案是包含使NprB蛋白酶失活的遗传修饰、使InhA2蛋白酶失活的遗传修饰、使TasA蛋白酶失活的遗传修饰、使camelysin蛋白酶失活的遗传修饰和使InhA1蛋白酶失活的遗传修饰的炭疽芽孢杆菌。一个实施方案是包含使NprB蛋白酶失活的遗传修饰、使InhA2蛋白酶失活的遗传修饰、使TasA蛋白酶失活的遗传修饰、使camelysin蛋白酶失活的遗传修饰和使InhA1蛋白酶失活的遗传修饰的炭疽芽孢杆菌。一个实施方案是包含使NprB蛋白酶失活的遗传修饰、使InhA2蛋白酶失活的遗传修饰、使TasA蛋白酶失活的遗传修饰、使camelysin蛋白酶失活的遗传修饰、使InhA1蛋白酶失活的遗传修饰和使MmpZ蛋白酶失活的遗传修饰的炭疽芽孢杆菌。

本公开提供这些蛋白酶缺陷性炭疽芽孢杆菌中的任一种还可包含选自下组的遗传修饰：使BA1995蛋白酶失活的遗传修饰、使VpR蛋白酶失活的遗传修饰、使BA5414蛋白酶失活的遗传修饰及其组合。

本公开还提供这些蛋白酶缺陷性炭疽芽孢杆菌中的任一种可缺少SinR和SinI调节蛋白。本公开还提供这些蛋白酶缺陷性炭疽芽孢杆菌中的任一种可以是孢子形成缺陷性的。本公开还提供这些蛋白酶缺陷性炭疽芽孢杆菌中的任一种可缺少一种或多种病毒性质粒。对这些蛋白酶缺陷性炭疽芽孢杆菌中任一种的遗传修饰可选自下组：缺失、插入、倒置、取代、衍生化及其组合，其中这类遗传修饰影响编码蛋白质的基因中的一个或多个核苷酸。在一个实施方案中，遗传修饰包括编码蛋白质的基因中一个或多个核苷酸的缺失、编码蛋白质的基因中一个或多个核苷酸的插入或其组合。

本公开提供包含以下的炭疽芽孢杆菌：一种使NprB蛋白酶失活的遗传修饰，其中所述失活的NprB蛋白酶由在炭疽芽孢杆菌的基因座GBAA_0599处经遗传修饰的nprB基因编码；一种使InhA2蛋白酶失活的遗传修饰，其中所述失活的InhA2蛋白酶由在炭疽芽孢杆菌的基因座GBAA_0672处经遗传修饰的inhA2基因编码；一种使TasA蛋白酶失活的遗传修饰，其中所述失活的TasA蛋白酶由在炭疽芽孢杆菌的基因座GBAA_1288处经遗传修饰的tasA基因编码；一种使camelysin失活的遗传修饰，其中所述失活的camelysin由在炭疽芽孢杆菌的基因座GBAA_1290处经遗传修饰的calY基因编码；一种使InhA1蛋白酶失活的遗传修饰，其中所述失活的InhA1蛋白酶由在炭疽芽孢杆菌的基因座GBAA_1295处经遗传修饰的inhA1基因编码；一种使MmpZ蛋白酶失活的遗传修饰，其中所述失活的MmpZ蛋白酶由在炭疽芽孢杆菌的基因座GBAA_3159处经遗传修饰的mmpZ基因编码；和一种使Spo0A蛋白失活的遗传修饰，其中所述失活的Spo0A蛋白由在炭疽芽孢杆菌的基因座GBAA_4394处经遗传修饰的spo0A基因编码，其中所述炭疽芽孢杆菌缺少病毒性质粒pXO1和pXO2。一个实施方案是具有保藏在ATCC登录号PTA-12024下的BH460的鉴别特征的炭疽芽孢杆菌。一个实施方案是炭疽芽孢杆菌BH460，其以ATCC登录号PTA-12024保藏。

本公开提供这些蛋白酶缺陷性炭疽芽孢杆菌中的任一种还可包含使选自下组的蛋白酶失活的遗传修饰：转谷氨酰胺酶样超家族的蛋白酶、肽酶家族S8的蛋白酶及其组合。一个实施方案是包含使金属蛋白酶M4家族的蛋白酶失活的遗传修饰、使金属蛋白酶M6家族的蛋白酶失活的遗传修饰、使金属蛋白酶M73家族的蛋白酶失活的遗传修饰、使锌依赖性金属蛋白酶ZnMc超家族的炭疽芽孢杆菌蛋白酶失活的遗传修饰、使转谷氨酰胺酶样超家族的蛋白酶失活的遗传修饰、和使肽酶家族S8的蛋白酶失活的遗传修饰的炭疽芽孢杆菌。转谷氨酰胺酶样超家族蛋白酶的一个例子是CysP1蛋白酶。肽酶家族S8蛋白酶的一个例子是VpR蛋白酶。在一个实施方案中，转谷氨酰胺酶样超家族的蛋白酶是CysP1蛋白酶。在一个实施方案中，肽酶家族S8的蛋白酶是VpR蛋白酶。在一个实施方案中，转谷氨酰胺酶样超家族的蛋白酶是CysP1蛋白酶，而肽酶家族S8的蛋白酶是VpR蛋白酶。如本文中使用的，CysP1蛋白酶亦称为BA1995蛋白酶。

本公开提供包含使NprB蛋白酶失活的遗传修饰、使InhA2蛋白酶失活的遗传修饰、使TasA蛋白酶失活的遗传修饰、使camelysin蛋白酶失活的遗传修饰、使InhA1蛋白酶失活的遗传修饰、使MmpZ蛋白酶失活的遗传修饰、使CysP1蛋白酶失活的遗传修饰和使VpR蛋白酶失活的遗传修饰的炭疽芽孢杆菌。在一个实施方案中，所述失活的NprB蛋白酶由在炭疽芽孢杆菌的基因座GBAA_0599处经遗传修饰的nprB基因编码；所述失活的InhA2蛋白酶由在炭疽芽孢杆菌的基因座GBAA_0672处经遗传修饰的inhA2基因编码；所述失活的TasA蛋白酶由在炭疽芽孢杆菌的基因座GBAA_1288处经遗传修饰的tasA基因编码；所述失活的camelysin由在炭疽芽孢杆菌的基因座GBAA_1290处经遗传修饰的calY基因编码；所述失活的InhA1蛋白酶由在炭疽芽孢杆菌的基因座GBAA_1295处经遗传修饰的inhA1基因编码；所述失活的MmpZ蛋白酶由在炭疽芽孢杆菌的基因座GBAA_3159处经遗传修饰的mmpZ基因编码；所述失活的CysP1蛋白酶由在炭疽芽孢杆菌的基因座GBAA_1995处经遗传修饰的cysP1基因编码；且所述失活的VpR蛋白酶由在炭疽芽孢杆菌的基因座GBAA_4584处经遗传修饰的vpR基因编码。

本公开提供任一种所述蛋白酶缺陷性炭疽芽孢杆菌还可包含选自下组的遗传修饰：使NprC蛋白酶失活的遗传修饰、使SprA蛋白酶失活的遗传修饰、使HtrA蛋白酶失活的遗传修饰、使HsIV蛋白酶失活的遗传修饰及其组合。如本文中使用的，SprA蛋白酶亦称为BA5414蛋白酶。

本公开提供一种炭疽芽孢杆菌，其包含使NprB蛋白酶失活的遗传修饰、使InhA2蛋白酶失活的遗传修饰、使TasA蛋白酶失活的遗传修饰、使camelysin蛋白酶失活的遗传修饰、使InhA1蛋白酶失活的遗传修饰、使MmpZ蛋白酶失活的遗传修饰、使CysP1蛋白酶失活的遗传修饰、使VpR蛋白酶失活的遗传修饰、和选自下组的遗传修饰：使NprC蛋白酶失活的遗传修饰、使SprA蛋白酶失活的遗传修饰、使HtrA蛋白酶失活的遗传修饰、使HsIV蛋白酶失活的遗传修饰及其组合。

本公开还提供这些蛋白酶缺陷性炭疽芽孢杆菌中的任一种可缺少SinR和SinI调节蛋白。本公开还提供这些蛋白酶缺陷性炭疽芽孢杆菌中的任一种可以是孢子形成缺陷性的。本公开还提供这些蛋白酶缺陷性炭疽芽孢杆菌中的任一种可以缺少一种或多种病毒性质粒。对这些蛋白酶缺陷性炭疽芽孢杆菌中的任一种的遗传修饰可选自下组：缺失、插入、倒置、取代、衍生化及其组合，其中这类遗传修饰影响编码蛋白质的基因中的一个或多个核苷酸。

本公开提供一种炭疽芽孢杆菌，其包含：一种使NprB蛋白酶失活的遗传修饰，其中所述失活的NprB蛋白酶由在炭疽芽孢杆菌的基因座GBAA_0599处经遗传修饰的nprB基因编码；一种使InhA2蛋白酶失活的遗传修饰，其中所述失活的InhA2蛋白酶由在炭疽芽孢杆菌的基因座GBAA_0672处经遗传修饰的inhA2基因编码；一种使TasA蛋白酶失活的遗传修饰，其中所述失活的TasA蛋白酶由在炭疽芽孢杆菌的基因座GBAA_1288处经遗传修饰的tasA基因编码；一种使camelysin失活的遗传修饰，其中所述失活的camelysin由在炭疽芽孢杆菌的基因座GBAA_1290处经遗传修饰的calY基因编码；一种使InhA1蛋白酶失活的遗传修饰，其中所述失活的InhA1蛋白酶由在炭疽芽孢杆菌的基因座GBAA_1295处经遗传修饰的inhA1基因编码；一种使MmpZ蛋白酶失活的遗传修饰，其中所述失活的MmpZ蛋白酶由在炭疽芽孢杆菌的基因座GBAA_3159处经遗传修饰的mmpZ基因编码；一种使CysP1蛋白酶失活的遗传修饰，其中所述失活的CysP1蛋白酶由在炭疽芽孢杆菌的基因座GBAA_1995处经遗传修饰的cysP1基因编码；一种使VpR蛋白酶失活的遗传修饰，其中所述失活的VpR蛋白酶由在炭疽芽孢杆菌的基因座GBAA_4584处经遗传修饰的vpR基因编码；和一种使Spo0A蛋白失活的遗传修饰，其中所述失活的Spo0A蛋白由在炭疽芽孢杆菌的基因座GBAA_4394处经遗传修饰的spo0A基因编码，其中所述炭疽芽孢杆菌缺少病毒性质粒pXO1和pXO2。一个实施方案是具有以ATCC登录号_________保藏的BH480的鉴别特征的炭疽芽孢杆菌。一个实施方案是以ATCC登录号____保藏的炭疽芽孢杆菌BH480。

本公开提供一种产生炭疽芽孢杆菌的方法，包括遗传修饰炭疽芽孢杆菌以使金属蛋白酶M4家族的蛋白酶失活并使金属蛋白酶M6家族的蛋白酶失活。本公开提供一种产生炭疽芽孢杆菌的方法，包括遗传修饰炭疽芽孢杆菌以使金属蛋白酶M4家族的蛋白酶失活、使金属蛋白酶M6家族的蛋白酶失活、并使金属蛋白酶M73家族的蛋白酶失活。本公开提供一种产生炭疽芽孢杆菌的方法，包括遗传修饰炭疽芽孢杆菌以使金属蛋白酶M4家族的蛋白酶失活、使金属蛋白酶M6家族的蛋白酶失活、使金属蛋白酶M73家族的蛋白酶失活、并使锌依赖性金属蛋白酶ZnMc超家族的蛋白酶失活。本公开提供一种产生炭疽芽孢杆菌的方法，包括遗传修饰炭疽芽孢杆菌以使金属蛋白酶M4家族的蛋白酶失活、使金属蛋白酶M6家族的蛋白酶失活、使金属蛋白酶M73家族的蛋白酶失活、使锌依赖性金属蛋白酶ZnMc超家族的蛋白酶失活、使转谷氨酰胺酶样超家族的蛋白酶失活、并使肽酶家族S8的蛋白酶失活。

本公开提供一种产生实施方案中任一种炭疽芽孢杆菌的方法。这类方法包括在培养基中培养所述炭疽芽孢杆菌；并回收炭疽芽孢杆菌。

本公开提供一种用编码产物的重组分子转化的经修饰的炭疽芽孢杆菌，其中：所述炭疽芽孢杆菌包含使金属蛋白酶M4家族的蛋白酶失活的遗传修饰和使金属蛋白酶M6家族的蛋白酶失活的遗传修饰；且所述重组分子包含编码所述产物的核酸分子可操作地连接于表达载体。本公开提供一种用编码产物的重组分子转化的经修饰的炭疽芽孢杆菌，其中：所述炭疽芽孢杆菌包含使金属蛋白酶M4家族的蛋白酶失活的遗传修饰、使金属蛋白酶M6家族的蛋白酶失活的遗传修饰、和使金属蛋白酶M73家族的蛋白酶失活的遗传修饰；且所述重组分子包含编码所述产物的核酸分子可操作地连接于表达载体。本公开提供一种用编码产物的重组分子转化的经修饰的炭疽芽孢杆菌，其中：所述炭疽芽孢杆菌包含使金属蛋白酶M4家族的蛋白酶失活的遗传修饰、使金属蛋白酶M6家族的蛋白酶失活的遗传修饰、使金属蛋白酶M73家族的蛋白酶失活的遗传修饰、和使锌依赖性金属蛋白酶ZnMc超家族的蛋白酶失活的遗传修饰；且所述重组分子包含编码所述产物的核酸分子可操作地连接于表达载体。本公开提供一种用编码产物的重组分子转化的经修饰的炭疽芽孢杆菌，其中：所述炭疽芽孢杆菌包含使金属蛋白酶M4家族的蛋白酶失活的遗传修饰、使金属蛋白酶M6家族的蛋白酶失活的遗传修饰、使金属蛋白酶M73家族的蛋白酶失活的遗传修饰、使锌依赖性金属蛋白酶ZnMc超家族的蛋白酶失活的遗传修饰、使转谷氨酰胺酶样超家族的炭疽芽孢杆菌蛋白酶失活的遗传修饰和使肽酶家族S8的炭疽芽孢杆菌蛋白酶失活的遗传修饰；且所述重组分子包含编码所述产物的核酸分子可操作地连接于表达载体。产物的一个实施方案是选自下组的产物：蛋白质、氨基酸、核酸分子、经由重组生物合成途径产生的化合物、小分子、药物、维生素、药物缀合物、和肽核酸缀合物。在一个实施方案中，这类产物是毒素。毒素的例子包括炭疽毒素、霍乱毒素、白喉毒素、溶血素和蓖麻素蛋白。毒素的另外的例子包括假单胞菌(Pseudomonas)毒素、杜克雷嗜血杆菌(Haemophilus ducreyi)毒素、大肠杆菌(Escherichia coli)毒素和核糖体失活蛋白(RIP)毒素。

本公开提供一种重组分子，其包含编码产物的核酸分子可操作地连接于表达载体。重组分子的例子包括选自下组的包含核酸序列的重组分子：包含核酸序列SEQ ID NO:62的重组分子、包含核酸序列SEQ ID NO:65的重组分子、包含核酸序列SEQ ID NO:67的重组分子、和包含核酸序列SEQ ID NO:69的重组分子。

一个实施方案是包含pSJ115质粒的重组分子，该质粒编码包含氨基酸序列SEQ IDNO:91的蛋白质。一个实施方案是包含pYS5质粒的重组分子，该质粒编码包含氨基酸序列SEQ ID NO:92的蛋白质。一个实施方案是选自下组的重组分子：重组分子pSJ136EF-His、重组分子pSJ136EF-Cys和重组分子pSJ136EF-NEHY。本公开还提供包含选自下组的氨基酸序列的蛋白质：氨基酸序列SEQ ID NO:93、氨基酸序列SEQ ID NO:94和氨基酸序列SEQ IDNO:95。

本公开提供一种产生产物的方法，包括：在培养基中培养所述实施方案的经修饰的炭疽芽孢杆菌以产生所述产物；并回收所述产物。

附图简述

图1提供截短和失活的炭疽芽孢杆菌蛋白酶的序列。图1A提供截短和失活的炭疽芽孢杆菌NprB和InhA1蛋白酶的序列。图1B提供截短和失活的炭疽芽孢杆菌InhA2、TasA、camelysin和MmpZ蛋白酶的序列，以及用于产生如实施例中描述的跨越tasA部分至inhA1部分的炭疽芽孢杆菌基因组缺失的序列。蛋白酶基因使用导致34个碱基对的loxP序列(在核苷酸序列中划线)插入的规程失活，该序列侧翼是几个内切核酸酶限制性位点(位置未指示)。使用相同规程，将TasA和InhA1基因之间的大片区域用loxP序列替换。对于每种蛋白酶，以粗体在上面部分显示的氨基酸和核苷酸序列鉴别为从原始蛋白酶保留的最后3个氨基酸。在此三聚体之后的氨基酸序列是无义的和/或越出由限制性位点和loxP序列编码的框翻译；翻译终止于由星号所指示的密码子。InhA2、TasA、camelysin和MmpZ蛋白酶各自的下面部分显示对于每种分别的蛋白酶的完整氨基酸序列(包括信号序列)。在每个上面部分显示的3个氨基酸之后发生的移码导致仅相应原始氨基酸序列的划线部分翻译。NprB和InhA1的锌结合活性位点序列在图1A中粗体显示。相同的锌结合活性位点序列以粗体显示在图1B中的InhA2和MmpZ氨基酸序列中。对于较大的TasA-InhA1缺失，TasA蛋白的截短发生在与单TasA缺失相同的位点。缺失的DNA序列延伸至编码InhA1的头402个氨基酸的相应序列(未指示)。剩余DNA开始于将编码InhA1的后393个氨基酸的序列，其开始于序列IMSGGSWAGKIAGTTPTSFS(SEQ ID NO:33)(虚线下划线)。图1C提供截短和失活的炭疽芽孢杆菌CysP1和VpR蛋白酶的序列。使用Flp重组酶，利用导致基因的至少一部分被48-bp FRT位点替换(在核苷酸序列中下划线)的规程使这些蛋白酶基因失活。

图2提供某些炭疽芽孢杆菌菌株的生长曲线和对这些菌株的水肿因子(EF)、anthrolysin O(ALO)、保护性抗原(PA)、致死因子(LF)和camelysin的产生分析。对于10种炭疽芽孢杆菌菌株，显示在LB培养基中24小时内的生长曲线。对每种菌株显示在各时间点对EF、ALO、PA、LF和camelysin的Western印迹分析。在每组印迹中最缓慢迁移的条带似乎对应于相应的完整的，或近乎完整的蛋白质。

图3提供对通过某些经遗传修饰的菌株的LF和ALO的生产分析，所述菌株中一些具有被编码活性蛋白酶的质粒补充的缺陷性蛋白酶功能。显示(A)A35ΔMmpZ相比于A35ΔMmpZC的LF产生和(B)A35TM相比于A35TMC的ALO产生的Western印迹分析。(菌株名称末尾的C指示经补充的菌株。)每一道上方的数字指示取样品时的时间，按小时计。

图4提供从大肠杆菌BL21(DE3)、炭疽芽孢杆菌BH450(在nprB和spo0A中有遗传修饰)和炭疽芽孢杆菌BH460纯化的EF蛋白的比较。A)EF蛋白的SDS-PAGE分析。M-分子量标志物(Page Ruler Unstained Protein Ladder，Fermentas)。B)A)中显示的EF样品的(电子喷射离子化-质谱)Electron Spray Ionization–Mass Spectra(ESI-MS)。Y轴代表相对丰度而X轴代表质量/电荷比(m/z)。C)从ESI-MS数据外推的EF样品的实验分子量与从氨基酸序列计算的分子量的比较。来自ESI-MS数据的所得组分的相对丰度显示在括号中。最后一行显示实验质量和计算质量之间的差异。

图5提供EF活性分析。A)在用一定范围的EF浓度和一个固定的PA浓度(250ng/ml)处理RAW264.7细胞1小时后测量不同EF制备物的cAMP产生。B)将从BH460制备的EF与从BH450或大肠杆菌BL21(DE3)制备的EF在用25μg EF+25μg PA(对于分别从BH450、BH460或大肠杆菌制备的EF)或50μg EF+50μg PA(仅对从BH450制备的EF)激发的Balb/cJ小鼠中比较效力。

图6提供重组分子pSJ136EFOS(SEQ ID NO:62)的示意性图谱，其包含编码具有PA信号序列的成熟EF的核酸分子(SEQ ID NO:63)可操作地连接于pag启动子。Pag启动子大致跨越SEQ ID NO:62的核苷酸3496-3658。PA信号序列由开始于SEQ ID NO:62的核苷酸3659的核苷酸编码。EF成熟蛋白(SEQ ID NO:64)由开始于SEQ ID NO:62的核苷酸3746的核苷酸编码。大肠杆菌ORI(未显示)大致跨越SEQ ID NO:62的核苷酸6286-6755。

图7提供重组分子pSW4-HBL L1 His(SEQ ID NO:65)的示意性图谱，其包含编码HBL L1 His的核酸分子可操作地连接于pag启动子。HBL L1 His蛋白(SEQ ID NO:66)由开始于SEQ ID NO:65的核苷酸6611的核苷酸编码。

图8提供重组分子pSW4-HBL L2 His(SEQ ID NO:67)的示意性图谱，其包含编码HBL L2 His的核酸分子可操作地连接于pag启动子。HBL L2 His蛋白(SEQ ID NO:68)由开始于SEQ ID NO:67的核苷酸3660的核苷酸编码。

图9提供重组分子pSW4-HBL B His(SEQ ID NO:69)的示意性图谱，其包含编码HBLB His的核酸分子可操作地连接于pag启动子。HBL B His蛋白(SEQ ID NO:70)由开始于SEQID NO:69的核苷酸2的核苷酸编码。

图10提供对分别通过用重组分子pSJ136EFOS转化的炭疽芽孢杆菌BH480、用重组分子pSJ136EF-His转化的炭疽芽孢杆菌BH480、用重组分子pSJ136EF-Cys转化的炭疽芽孢杆菌BH480或用重组分子pSJ136EF-NEHY转化的炭疽芽孢杆菌BH480的EF蛋白EFOS(第4道)、EF-His(第6道)、EF-Cys(第7道)和EF-NEHY(第8道)生产的天然Phast凝胶(天然的8-25％丙烯酰胺梯度)分析。第1道和第2道显示通过经修饰炭疽芽孢杆菌BH480的PA-U2f和PA-U7f的生成。第3道显示通过用pSJ115-LF-OS转化的炭疽芽孢杆菌BH480的成熟致死因子(LF-OS)的生成。第5道显示通过用pSJ136Hfq1-FLAG转化的炭疽芽孢杆菌BH480的Hfq1-FLAG的生成。

图11提供对通过分别用编码LFnBlaY或PA-SNKE-deltaFF-E308D的重组分子转化的炭疽芽孢杆菌BH480的LFnBlaY(SEQ ID NO:91)和PA-SNKE-deltaFF-E308D(SEQ ID NO:92)蛋白生产的SDS Phast凝胶分析。第1道：SDS分子量标志混合物。第2道：通过用编码PA-SNKE-deltaFF-E308D的pYS5质粒转化的炭疽芽孢杆菌BH480产生的PA-SNKE-deltaFF-E308D；第3道：LF-BLA，在大肠杆菌中重组产生；第4和5道：通过用编码LFnBlaY的pSJ115质粒转化的炭疽芽孢杆菌BH480产生的LFnBlaY。

发明详述

本公开描述以下新发现，即，使超过一种分泌的蛋白酶失活的对炭疽芽孢杆菌的遗传修饰提供相比于其他细菌例如其他炭疽芽孢杆菌菌株，具有改进的产生重组分泌蛋白质的能力的蛋白酶缺陷性炭疽芽孢杆菌，包括那些具有单一失活的分泌蛋白酶的。改进包括经常以高产率产生完整的(即成熟的全长)蛋白质。例如，一个实施方案是炭疽芽孢杆菌BH460。BH460具有使6种蛋白酶失活的遗传修饰，是孢子形成缺陷性的，且没有病毒性质粒。该菌株提供改进的宿主用于产生重组蛋白质。一个例子是，从BH460产生的EF是高度活性的，而先前的炭疽芽孢杆菌宿主菌株产生具有较低效力的截短的EF蛋白。产生完整EF的能力允许EF成为重组炭疽疫苗的组分。举另一个例子，一个实施方案是炭疽芽孢杆菌BH480。BH480具有使8种蛋白酶失活的遗传修饰，是孢子形成缺陷性的，且没有病毒性质粒。该菌株也提供改进的宿主用于产生如本文中显示的重组蛋白质。

在进一步描述本发明之前，应理解本发明不限于描述的具体的实施方案，因为这类实施方案当然可以变化。还应理解本文中使用的术语学仅出于描述具体实施方案的目的，且不意图为限制性的，因为本发明的范围将仅由权利要求限制。

还应注意，权利要求可记载为排除任何任选的要素。如此，该陈述意图充当这类排除性术语如“单独的”、“仅”等连同主张要素的记载使用或“否定性”限制的使用的前提基础。

应理解，如本文中使用的，术语“一个”实体或“一种”实体指一种或多种的该实体。例如，一种遗传修饰指一种或多种遗传修饰。如此，术语“一个”、“一种”、“一种或多种”和“至少一种”可交换使用。类似地，术语“包含/包括”、“含有”和“具有”可交换使用。

提供本文中论述的出版物仅是由于它们是在本申请的提交日之前公开的。本文的任何文字都不应解释为承认本发明的发明人不能凭借较早的发明而具有早于这类出版物的资格。此外，实际发表日可能与所提供的有所不同而需要独立查证。

除非另有定义，本文中使用的所有技术和科学术语旨在具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。尽管可在本发明的实践或测试中使用与本文中描述的那些类似或等同的任何方法和材料，但现在描述的是优选的方法和材料。本文中提及的所有出版物通过提述连同该出版物引用的对方法和/或材料的公开和描述而并入本文。

应领会，出于清楚目的而在分开的实施方案的背景中描述的本发明的某些特征，还可在单个实施方案中组合提供。相反，出于简洁目的而在单个实施方案的背景中描述的本发明的多个特征，还可分开提供或以任何适宜的子组合提供。实施方案的所有组合均具体地涵盖在本发明中且在本文中如同每一个组合均单独和明确地公开的方式公开。另外，所有的子组合也具体地涵盖在本发明中且在本文中如同每一个子组合均单独和明确地公开的方式公开。

本公开提供一种炭疽芽胞杆菌，其包含使超过一种蛋白酶失活的遗传修饰。在一个实施方案中，这类失活的蛋白酶是失活的分泌的蛋白酶。如本文中使用的，短语“包含使蛋白酶失活的遗传修饰的炭疽芽孢杆菌”指其中通过至少一种遗传修饰已使其至少一种蛋白酶失活的炭疽芽胞杆菌菌株(亦称为炭疽芽孢杆菌生物或炭疽芽孢杆菌微生物)。应注意术语失活的、使…失活、有缺陷的和缺陷性可交换使用。

如本文中使用的，蛋白酶(亦称为蛋白酶(proteinase)或肽酶)是进行蛋白水解的任何酶，即通过水解将链中的氨基酸连接在一起以形成蛋白质的肽键来启动蛋白质分解代谢的酶。蛋白质是具有通过相邻氨基酸的羧基和氨基基团之间的肽键连接在一起的两个或更多个氨基酸的任何化合物；如此，术语蛋白质包括多肽和肽。分泌的蛋白酶是从产生其的细胞(例如炭疽芽孢杆菌)分泌的蛋白酶。失活的蛋白酶是不再作用于水解肽键的蛋白酶。失活的蛋白酶可具有缺失(例如，以形成截短的蛋白质)、插入、倒置、取代、衍生化(例如通过糖基化、磷酸化、乙酰化、十四烷基化、异戊二烯化、棕榈化(palmitation)、酰胺化和/或添加糖基磷脂酰肌醇)、或进行任何其他本领域技术人员已知的变化以使蛋白酶失活的氨基酸。可通过引起缺失、插入、倒置、取代、衍生化和/或在氨基酸水平上对氨基酸的任何其他变化以使蛋白酶失活来产生失活的蛋白酶。或者，失活可发生在核酸水平上，其通过遗传修饰(本文中亦称为突变)。遗传修饰包括缺失、插入、倒置、取代、衍生化和/或本领域技术人员已知的对编码蛋白酶的基因中的一个或多个核苷酸的任何其他变化，从而使得经遗传修饰的核酸不编码有活性的蛋白酶。在一些实施方案中，完全不产生蛋白酶。在一些实施方案中，所编码的蛋白酶是截短的。在一个实施方案中，遗传修饰包括在编码蛋白酶的基因中一个或多个核苷酸的缺失。在一个实施方案中，这类缺失包含Cre-loxP基因敲除，一种在本文实施例中进一步描述的技术。一个实施方案是条件性失活的蛋白酶，其可例如使用括入(bracketing)编码这类蛋白酶的结构基因的可诱导的反义或反平行loxP位点，从而Cre重组酶使基因在活性和失活形式之间变换而产生。在一个实施方案中，蛋白酶基因经由酿酒酵母Flp-FRT重组酶系统失活。

一个实施方案是包含使至少2种分泌的蛋白酶失活的炭疽芽孢杆菌。一个实施方案是包含使至少3种炭疽芽孢杆菌分泌的蛋白酶失活的炭疽芽孢杆菌。一个实施方案是包含使至少4种炭疽芽孢杆菌分泌的蛋白酶失活的炭疽芽孢杆菌。一个实施方案是包含使至少5种炭疽芽孢杆菌分泌的蛋白酶失活的炭疽芽孢杆菌。一个实施方案包含使至少6种炭疽芽孢杆菌分泌的蛋白酶失活的炭疽芽孢杆菌。一个实施方案是包含使至少7种炭疽芽孢杆菌分泌的蛋白酶失活的炭疽芽孢杆菌。一个实施方案是包含使至少8种炭疽芽孢杆菌分泌的蛋白酶失活的炭疽芽孢杆菌。一个实施方案是包含使至少9种炭疽芽孢杆菌分泌的蛋白酶失活的炭疽芽孢杆菌。一个实施方案是包含使至少10种炭疽芽孢杆菌分泌的蛋白酶失活的炭疽芽孢杆菌。一个实施方案是包含使至少11种炭疽芽孢杆菌分泌的蛋白酶失活的炭疽芽孢杆菌。一个实施方案是包含使至少12种炭疽芽孢杆菌分泌的蛋白酶失活的炭疽芽孢杆菌。

本公开提供一种炭疽芽孢杆菌，其包含使金属蛋白酶M4家族的蛋白酶失活的遗传修饰和使金属蛋白酶M6家族的蛋白酶失活的遗传修饰。金属蛋白酶的M4和M6家族如MEROPS数据库，Wellcome Trust Sanger Institute，同上中定义的。一个实施方案是包含失活的M4家族的蛋白酶和失活的M6家族的蛋白酶的炭疽芽孢杆菌。一个实施方案是包含失活的M4家族的蛋白酶和至少2种失活的M6家族的蛋白酶的炭疽芽孢杆菌。一个实施方案是包含失活的M4家族的蛋白酶和2种失活的M6家族的蛋白酶的炭疽芽孢杆菌。

金属蛋白酶M4家族的蛋白酶的一个非限制性例子是炭疽芽孢杆菌NprB蛋白酶，本文中亦称为NprB。在一个实施方案中，使金属蛋白酶M4家族的蛋白酶失活的遗传修饰是使NprB失活的遗传修饰。金属蛋白酶M6家族的蛋白酶的非限制性例子是炭疽芽孢杆菌InhA1蛋白酶和炭疽芽孢杆菌InhA2蛋白酶(本文中亦分别称为InhA1和InhA2)。在一个实施方案中，使金属蛋白酶M6家族的蛋白酶失活的遗传修饰是使选自下组的M6家族蛋白酶失活的遗传修饰：InhA1、InhA2及其组合。如此，遗传修饰能使InhA1失活，遗传修饰能使InhA2失活，或者遗传修饰能使InhA1和InhA2两者均失活。一个实施方案是具有使NprB和InhA1失活的遗传修饰的炭疽芽孢杆菌。一个实施方案是具有使NprB和InhA2失活的遗传修饰的炭疽芽孢杆菌。一个实施方案是具有使NprB、InhA1和InhA2失活的遗传修饰的炭疽芽孢杆菌。

本公开提供一种炭疽芽孢杆菌，其包含使金属蛋白酶M4家族的蛋白酶失活的遗传修饰、使金属蛋白酶M6家族的蛋白酶失活的遗传修饰、和使金属蛋白酶M73家族的蛋白酶失活的遗传修饰。M73家族的金属蛋白酶如MEROPS数据库，Wellcome Trust SangerInstitute，同上中定义的。令人惊讶地，包含这类遗传修饰的炭疽芽孢杆菌比具有失活的金属蛋白酶M4和/或M6家族的蛋白酶但M73家族蛋白酶有活性的菌株产生显著更多的完整分泌蛋白质。这类改进的生产例示在实施例中。

一个实施方案是包含失活的M4家族的蛋白酶、失活的M6家族的蛋白酶、和失活的M73家族的蛋白酶的炭疽芽孢杆菌。一个实施方案是包含失活的M4家族的蛋白酶、失活的M6家族的蛋白酶、和至少2种失活的M73家族的蛋白酶的炭疽芽孢杆菌。一个实施方案是包含失活的M4家族的蛋白酶、至少2种失活的M6家族的蛋白酶、和失活的M73家族的蛋白酶的炭疽芽孢杆菌。一个实施方案是包含失活的M4家族的蛋白酶、至少2种失活的M6家族的蛋白酶、和至少2种失活的M73家族的蛋白酶的炭疽芽孢杆菌。一个实施方案是包含失活的M4家族的蛋白酶、失活的M6家族的蛋白酶、和2种失活的M73家族的蛋白酶的炭疽芽孢杆菌。一个实施方案是包含失活的M4家族的蛋白酶、2种失活的M6家族的蛋白酶、和失活的M73家族的蛋白酶的炭疽芽孢杆菌。一个实施方案是包含失活的M4家族的蛋白酶、2种失活的M6家族的蛋白酶、和2种失活的M73家族的蛋白酶的炭疽芽孢杆菌。

金属蛋白酶M73家族的蛋白酶的非限制性例子是炭疽芽孢杆菌camelysin蛋白酶和炭疽芽孢杆菌TasA蛋白酶(本文中亦分别称为camelysin和TasA)。在一个实施方案中，使金属蛋白酶M73家族的蛋白酶失活的遗传修饰是使选自下组的M73家族蛋白酶失活的遗传修饰：camelysin、TasA及其组合。如此，遗传修饰能使camelysin失活，遗传修饰能使TasA失活，或者遗传修饰能使camelysin和TasA两者均失活。一个实施方案是具有使NprB、InhA1和camelysin失活的遗传修饰的炭疽芽孢杆菌。一个实施方案是具有使NprB、InhA2和camelysin失活的遗传修饰的炭疽芽孢杆菌。一个实施方案是具有使NprB、InhA1、InhA2和camelysin失活的遗传修饰的炭疽芽孢杆菌。一个实施方案是具有使NprB、InhA1和TasA失活的遗传修饰的炭疽芽孢杆菌。一个实施方案是具有使NprB、InhA2和TasA失活的遗传修饰的炭疽芽孢杆菌。一个实施方案是具有使NprB、InhA1、InhA2和TasA失活的遗传修饰的炭疽芽孢杆菌。一个实施方案是具有使NprB、InhA1、camelysin和TasA失活的遗传修饰的炭疽芽孢杆菌。一个实施方案是具有使NprB、InhA2、camelysin和TasA失活的遗传修饰的炭疽芽孢杆菌。一个实施方案是具有使NprB、InhA1、InhA2、camelysin和TasA失活的遗传修饰的炭疽芽孢杆菌。

本公开提供一种炭疽芽孢杆菌，其包含使金属蛋白酶M4家族的蛋白酶失活的遗传修饰、使金属蛋白酶M6家族的蛋白酶失活的遗传修饰、使金属蛋白酶M73家族的蛋白酶失活的遗传修饰、和使锌依赖性金属蛋白酶ZnMc超家族的蛋白酶失活的遗传修饰。所述锌依赖性金属蛋白酶ZnMc超家族如MEROPS数据库，Wellcome Trust Sanger Institute，同上中定义的。一个实施方案是包含失活的M4家族的蛋白酶、失活的M6家族的蛋白酶、失活的M73家族的蛋白酶、和失活的ZnMc超家族的蛋白酶的炭疽芽孢杆菌。一个实施方案是包含失活的M4家族的蛋白酶、失活的M6家族的蛋白酶、至少2种失活的M73家族的蛋白酶、和失活的ZnMc超家族的蛋白酶的炭疽芽孢杆菌。一个实施方案是包含失活的M4家族的蛋白酶、至少2种失活的M6家族的蛋白酶、失活的M73家族的蛋白酶、和失活的ZnMc超家族的蛋白酶的炭疽芽孢杆菌。一个实施方案是包含失活的M4家族的蛋白酶、至少2种失活的M6家族的蛋白酶、至少2种失活的M73家族的蛋白酶、和失活的ZnMc超家族的蛋白酶的炭疽芽孢杆菌。一个实施方案是包含失活的M4家族的蛋白酶、失活的M6家族的蛋白酶、2种失活的M73家族的蛋白酶、和失活的ZnMc超家族的蛋白酶的炭疽芽孢杆菌。一个实施方案是包含失活的M4家族的蛋白酶、2种失活的M6家族的蛋白酶、失活的M73家族的蛋白酶、和失活的ZnMc超家族的蛋白酶的炭疽芽孢杆菌。一个实施方案是包含失活的M4家族的蛋白酶、2种失活的M6家族的蛋白酶、2种失活的M73家族的蛋白酶、和失活的ZnMc超家族的蛋白酶的炭疽芽孢杆菌。

金属蛋白酶ZnMc超家族的蛋白酶的一个非限制性例子是炭疽芽孢杆菌MmpZ蛋白酶，本文中亦称为MmpZ。在一个实施方案中，使金属蛋白酶ZnMc超家族的蛋白酶失活的遗传修饰是使MmpZ失活的遗传修饰。一个实施方案是具有使NprB、InhA1、camelysin和MmpZ失活的遗传修饰的炭疽芽孢杆菌。一个实施方案是具有使NprB、InhA2、camelysin和MmpZ失活的遗传修饰的炭疽芽孢杆菌。一个实施方案是具有使NprB、InhA1、InhA2、camelysin和MmpZ失活的遗传修饰的炭疽芽孢杆菌。一个实施方案是具有使NprB、InhA1、TasA和MmpZ失活的遗传修饰的炭疽芽孢杆菌。一个实施方案是具有使NprB、InhA2、TasA和MmpZ失活的遗传修饰的炭疽芽孢杆菌。一个实施方案是具有使NprB、InhA1、InhA2、TasA和MmpZ失活的遗传修饰的炭疽芽孢杆菌。一个实施方案是具有使NprB、InhA1、camelysin、TasA和MmpZ失活的遗传修饰的炭疽芽孢杆菌。一个实施方案是具有使NprB、InhA2、camelysin、TasA和MmpZ失活的遗传修饰的炭疽芽孢杆菌。一个实施方案是具有使NprB、InhA1、InhA2、camelysin、TasA和MmpZ失活的遗传修饰的炭疽芽孢杆菌。

本公开提供一种炭疽芽孢杆菌，其包含使至少两种蛋白酶失活的遗传修饰，其中所述蛋白酶选自下组：金属蛋白酶M4家族的蛋白酶、金属蛋白酶M6家族的蛋白酶、M73家族的蛋白酶、和锌依赖性金属蛋白酶ZnMc超家族的蛋白酶。本公开涵盖两种或更多种这类失活蛋白酶的任意组合。一种或多种遗传修饰能导致这样两种或更多种蛋白酶的失活。例如，跨越编码这类蛋白酶的两个基因至少一部分的缺失能产生至少两种缺失的蛋白酶。一个实施方案是一种炭疽芽孢杆菌，其包含使至少两种蛋白酶失活的遗传修饰，其中所述蛋白酶选自下组：NprB、InhA2、TasA、camelysin、InhA1和MmpZ。

本公开提供一种炭疽芽孢杆菌，其包含使NprB蛋白酶失活的遗传修饰、使nhA2蛋白酶失活的遗传修饰、使TasA蛋白酶失活的遗传修饰、使camelysin蛋白酶失活的遗传修饰、使InhA1蛋白酶失活的遗传修饰、和使MmpZ蛋白酶失活的遗传修饰。应领会使一种蛋白酶失活的遗传修饰可以是使一种或多种另外的蛋白酶失活的同一种遗传修饰。例如，缺失从tasA基因的至少一部分跨越至inhA1基因的至少一部分的炭疽芽孢杆菌基因组区域的遗传修饰是使TasA蛋白酶失活的遗传修饰、使camelysin蛋白酶失活的遗传修饰、和使InhA1蛋白酶失活的遗传修饰的一个例子。在一个实施方案中，这类缺失从编码SEQ ID NO:9的氨基酸残基63的密码子跨越至编码SEQ ID NO:17的氨基酸402的密码子。SEQ ID NO:9和SEQID NO:17分别编码野生型TasA和InhA1。这类缺失还使编码调节蛋白SinR和SinI的基因缺失。

一个实施方案是一种炭疽芽孢杆菌，其包含使NprB蛋白酶失活的遗传修饰和使InhA1蛋白酶失活的遗传修饰。一个包含使NprB蛋白酶和InhA1蛋白酶失活的遗传修饰的炭疽芽孢杆菌的实施方案是其中有如下情况的炭疽芽孢杆菌：(a)失活的NprB蛋白酶由在炭疽芽孢杆菌的基因座GBAA_0599处经遗传修饰的nprB基因编码；和(b)失活的InhA1蛋白酶由在炭疽芽孢杆菌的基因座GBAA_1295处经遗传修饰的inhA1基因编码。这些基因座中的每一个均对应于炭疽芽孢杆菌“Ames ancestor”菌株染色体(GenBank登录号NC 003997)的等同命名的基因座，如实施例中记载的。

一个实施方案是一种炭疽芽孢杆菌，其包含使NprB蛋白酶失活的遗传修饰、使camelysin蛋白酶失活的遗传修饰、和使InhA1蛋白酶失活的遗传修饰。一个包含使NprB蛋白酶、camelysin和InhA1蛋白酶失活的遗传修饰的炭疽芽孢杆菌的实施方案是其中有如下情况的炭疽芽孢杆菌：(a)失活的NprB蛋白酶由在炭疽芽孢杆菌的基因座GBAA_0599处经遗传修饰的nprB基因编码；(b)失活的camelysin由在炭疽芽孢杆菌的基因座GBAA_1290处经遗传修饰的calY基因编码；和(c)失活的InhA1蛋白酶由在炭疽芽孢杆菌的基因座GBAA_1295处经遗传修饰的inhA1基因编码。这些基因座中的每一个均对应于炭疽芽孢杆菌“Amesancestor”菌株染色体(GenBank登录号NC 003997)的等同命名的基因座，如实施例中记载的。

一个实施方案是一种炭疽芽孢杆菌，其包含使NprB蛋白酶失活的遗传修饰、使TasA蛋白酶失活的遗传修饰、使camelysin蛋白酶失活的遗传修饰、和使InhA1蛋白酶失活的遗传修饰。一个包含使NprB蛋白酶、TasA、camelysin和InhA1蛋白酶失活的遗传修饰的炭疽芽孢杆菌的实施方案是其中有如下情况的炭疽芽孢杆菌：(a)失活的NprB蛋白酶由在炭疽芽孢杆菌的基因座GBAA_0599处经遗传修饰的nprB基因编码；(b)失活的TasA蛋白酶由在炭疽芽孢杆菌的基因座GBAA_1288处经遗传修饰的tasA基因编码；(c)失活的camelysin由在炭疽芽孢杆菌的基因座GBAA_1290处经遗传修饰的calY基因编码；和(d)失活的InhA1蛋白酶由在炭疽芽孢杆菌的基因座GBAA_1295处经遗传修饰的inhA1基因编码。这些基因座中的每一个均对应于炭疽芽孢杆菌“Ames ancestor”菌株染色体(GenBank登录号NC 003997)的等同命名的基因座，如实施例中记载的。

一个实施方案是一种炭疽芽孢杆菌，其包含使NprB蛋白酶失活的遗传修饰、使InhA2蛋白酶失活的遗传修饰、使TasA蛋白酶失活的遗传修饰、使camelysin蛋白酶失活的遗传修饰、和使InhA1蛋白酶失活的遗传修饰。一个包含使NprB蛋白酶、InhA2、TasA、camelysin和InhA1蛋白酶失活的遗传修饰的炭疽芽孢杆菌的实施方案是其中有如下情况的炭疽芽孢杆菌：(a)失活的NprB蛋白酶由在炭疽芽孢杆菌的基因座GBAA_0599处经遗传修饰的nprB基因编码；(b)失活的InhA2蛋白酶由在炭疽芽孢杆菌的基因座GBAA_0672处经遗传修饰的inhA2基因编码；(c)失活的TasA蛋白酶由在炭疽芽孢杆菌的基因座GBAA_1288处经遗传修饰的tasA基因编码；(d)失活的camelysin由在炭疽芽孢杆菌的基因座GBAA_1290处经遗传修饰的calY基因编码；和(e)失活的InhA1蛋白酶由在炭疽芽孢杆菌的基因座GBAA_1295处经遗传修饰的inhA1基因编码。这些基因座中的每一个均对应于炭疽芽孢杆菌“Ames ancestor”菌株染色体(GenBank登录号NC 003997)的等同命名的基因座，如实施例中记载的。

一个实施方案是一种炭疽芽孢杆菌，其包含使NprB蛋白酶失活的遗传修饰、使InhA2蛋白酶失活的遗传修饰、使TasA蛋白酶失活的遗传修饰、使camelysin蛋白酶失活的遗传修饰、使InhA1蛋白酶失活的遗传修饰、和使MmpZ蛋白酶失活的遗传修饰。

一个包含使NprB蛋白酶、InhA2、TasA、camelysin、InhA1和MmpZ蛋白酶失活的遗传修饰的炭疽芽孢杆菌的实施方案是其中有如下情况的炭疽芽孢杆菌：(a)失活的NprB蛋白酶由在炭疽芽孢杆菌的基因座GBAA_0599处经遗传修饰的nprB基因编码；(b)失活的InhA2蛋白酶由在炭疽芽孢杆菌的基因座GBAA_0672处经遗传修饰的inhA2基因编码；(c)失活的TasA蛋白酶由在炭疽芽孢杆菌的基因座GBAA_1288处经遗传修饰的tasA基因编码；(d)失活的camelysin由在炭疽芽孢杆菌的基因座GBAA_1290处经遗传修饰的calY基因编码；(e)失活的InhA1蛋白酶由在炭疽芽孢杆菌的基因座GBAA_1295处经遗传修饰的inhA1基因编码；和(f)失活的MmpZ蛋白酶由在炭疽芽孢杆菌的基因座GBAA_3159处经遗传修饰的mmpZ基因编码。这些基因座中的每一个均对应于炭疽芽孢杆菌“Ames ancestor”菌株染色体(GenBank登录号NC 003997)的等同命名的基因座，如实施例中记载的。

一个包含使NprB、InhA2、TasA、camelysin、InhA1和MmpZ蛋白酶失活的遗传修饰的炭疽芽孢杆菌的实施方案是其中有如下情况的炭疽芽孢杆菌：(a)失活的NprB蛋白酶由nprB基因编码，其编码失活的包含氨基酸序列SEQ ID NO:2的NprB；(b)失活的InhA2蛋白酶由inhA2基因编码，其编码失活的包含氨基酸序列SEQ ID NO:6的InhA2；(c)失活的TasA蛋白酶由tasA基因编码，其编码失活的包含氨基酸序列SEQ ID NO:10的TasA；(d)失活的camelysin蛋白酶由calY基因编码，其编码失活的包含氨基酸序列SEQ ID NO:14的camelysin；(e)失活的InhA1蛋白酶由inhA1基因编码，其编码失活的包含氨基酸序列SEQID NO:18的InhA1；和(f)失活的MmpZ蛋白酶由mmpZ基因编码，其编码失活的包含氨基酸序列SEQ ID NO:22的MmpZ。在一个实施方案中，编码的失活的NprB蛋白酶的氨基酸序列是SEQID NO:2。在一个实施方案中，编码的失活的InhA2蛋白酶的氨基酸序列是SEQ ID NO:6。在一个实施方案中，编码的失活的TasA蛋白酶的氨基酸序列是SEQ ID NO:10。在一个实施方案中，编码的失活的camelysin蛋白酶的氨基酸序列是SEQ ID NO:14。在一个实施方案中，编码的失活的InhA1蛋白酶的氨基酸序列是SEQ ID NO:18。在一个实施方案中，编码的失活的MmpZ蛋白酶的氨基酸序列是SEQ ID NO:22。

一个包含使NprB、InhA2、TasA、camelysin、InhA1和MmpZ蛋白酶失活的遗传修饰的炭疽芽孢杆菌的实施方案是其中有如下情况的炭疽芽孢杆菌：(a)使NprB蛋白酶失活的遗传修饰是编码包含氨基酸序列SEQ ID NO:2的失活NprB的nprB基因；(b)使InhA2蛋白酶失活的遗传修饰是编码包含氨基酸序列SEQ ID NO:6的失活InhA2的inhA2基因；(c)使TasA蛋白酶、camelysin蛋白酶和InhA1蛋白酶失活的遗传修饰是从编码SEQ ID NO:9氨基酸残基63的密码子跨越至编码SEQ ID NO:17的氨基酸402的密码子的缺失(这类缺失还使编码SinR和SinI的基因缺失)；和(d)使MmpZ蛋白酶失活的遗传修饰是编码包含氨基酸序列SEQID NO:22的失活MmpZ的mmpZ基因。

一个包含使NprB、InhA2、TasA、camelysin、InhA1和MmpZ蛋白酶失活的遗传修饰的炭疽芽孢杆菌的实施方案是其中有如下情况的炭疽芽孢杆菌：(a)使NprB蛋白酶失活的遗传修饰是编码由氨基酸序列SEQ ID NO:2组成的失活NprB的nprB基因；(b)使InhA2蛋白酶失活的遗传修饰是编码由氨基酸序列SEQ ID NO:6组成的失活InhA2的inhA2基因；(c)使TasA蛋白酶、camelysin蛋白酶和InhA1蛋白酶失活的遗传修饰是从编码SEQ ID NO:9氨基酸残基63的密码子跨越至编码SEQ ID NO:17的氨基酸402的密码子的缺失(这类缺失还使编码SinR和SinI的基因缺失)；和(d)使MmpZ蛋白酶失活的遗传修饰是编码由氨基酸序列SEQ ID NO:22组成的失活MmpZ的mmpZ基因。

在一些实施方案中，本公开的炭疽芽孢杆菌还包含使调节蛋白SinR、调节蛋白SinI、或SinR和SinI两者失活的遗传修饰。SinR和SinI由分别位于炭疽芽孢杆菌基因组的GBAA_1292和GBAA_1293处的基因编码。

本公开提供一种炭疽芽孢杆菌，其包含使金属蛋白酶M4家族的蛋白酶失活的遗传修饰、使金属蛋白酶M6家族的蛋白酶失活的遗传修饰、使金属蛋白酶M73家族的蛋白酶失活的遗传修饰、使锌依赖性金属蛋白酶ZnMc超家族的蛋白酶失活的遗传修饰、和选自下组的遗传修饰：使BA1995蛋白酶失活的遗传修饰、使VpR蛋白酶失活的遗传修饰、使BA5414蛋白酶失活的遗传修饰及其组合。已鉴定BA1995、VpR和BA5414蛋白酶为存在于其中已使NprB、InhA2、TasA、camelysin、InhA1和MmpZ蛋白酶失活的炭疽芽孢杆菌的上清液中的分泌蛋白酶。BA1995由位于炭疽芽孢杆菌基因座GBAA_1995处的基因编码(参见例如，Sastalla I等,2010,Microbiology 156,2982-2993)。VpR或BA4584，是一种微小的胞外蛋白酶，其由位于炭疽芽孢杆菌基因座GBAA_4584处的vpR基因编码。BA 5414是一种丝氨酸蛋白酶，其由位于炭疽芽孢杆菌基因座GBAA_5414处的基因编码。

本公开提供一种炭疽芽孢杆菌，其包含使NprB蛋白酶失活的遗传修饰、使InhA2蛋白酶失活的遗传修饰、使TasA蛋白酶失活的遗传修饰、使camelysin蛋白酶失活的遗传修饰、使InhA1蛋白酶失活的遗传修饰、使MmpZ蛋白酶失活的遗传修饰和选自下组的遗传修饰：使BA1995蛋白酶失活的遗传修饰、使VpR蛋白酶失活的遗传修饰、使BA5414蛋白酶失活的遗传修饰及其组合。

可使用本领域技术人员已知的技术来鉴定其他分泌的蛋白酶，其失活将进一步改进所述实施方案的炭疽芽孢杆菌的蛋白质生产。例如，可在培养基中培养所述实施方案的蛋白酶缺陷性炭疽芽孢杆菌，并可针对由这类炭疽芽孢杆菌产生的期望蛋白质测试所得培养基或从培养基产生的上清液中的蛋白酶活性。可分离负责这类活性的蛋白酶，将其测序，并将序列与炭疽芽孢杆菌的基因图谱比较以鉴定编码其的基因。然后可使用本文中描述的技术来使这类基因失活。

本公开提供所述实施方案中任一种的炭疽芽孢杆菌可以是孢子形成缺陷性的。亦即，本文中描述的任一种炭疽芽孢杆菌还可包含阻止孢子形成的遗传修饰，如使Spo0A蛋白失活的遗传修饰。Spo0A蛋白，作为芽孢杆菌中孢子形成的关键调控物(参见例如，Molle V等,2003,Molec.Microbiol.50,1683-1701)，由位于炭疽芽孢杆菌基因座GBAA_4394处的spo0A基因编码。不能形成孢子的炭疽芽孢杆菌作为生产生物是有利的。

本公开还提供所述实施方案中任一种的炭疽芽孢杆菌在一种或多种病毒性质粒中可能有缺陷。一个实施方案是实施方案中的炭疽芽孢杆菌为pXO1-，即该炭疽芽孢杆菌缺少病毒性质粒pXO1。一个实施方案是实施方案中的炭疽芽孢杆菌为pXO1-、pXO2-；即该炭疽芽孢杆菌缺少病毒性质粒pXO1和pXO2。一个实施方案是实施方案中的炭疽芽孢杆菌为pXO1-、pXO2+。

本公开提供一种包含以下的炭疽芽孢杆菌：使NprB蛋白酶失活的遗传修饰，其中所述失活的NprB蛋白酶由在炭疽芽孢杆菌的基因座GBAA_0599处经遗传修饰的nprB基因编码；使InhA2蛋白酶失活的遗传修饰，其中所述失活的InhA2蛋白酶由在炭疽芽孢杆菌的基因座GBAA_0672处经遗传修饰的inhA2基因编码；使TasA蛋白酶失活的遗传修饰，其中所述失活的TasA蛋白酶由在炭疽芽孢杆菌的基因座GBAA_1288处经遗传修饰的tasA基因编码；使camelysin失活的遗传修饰，其中所述失活的camelysin由在炭疽芽孢杆菌的基因座GBAA_1290处经遗传修饰的calY基因编码；使InhA1蛋白酶失活的遗传修饰，其中所述失活的InhA1蛋白酶由在炭疽芽孢杆菌的基因座GBAA_1295处经遗传修饰的inhA1基因编码；使MmpZ蛋白酶失活的遗传修饰，其中所述失活的MmpZ蛋白酶由在炭疽芽孢杆菌的基因座GBAA_3159处经遗传修饰的mmpZ基因编码；和使Spo0A蛋白失活的遗传修饰，其中所述失活的Spo0A蛋白由在炭疽芽孢杆菌的基因座GBAA_4394处经遗传修饰的spo0A基因编码，其中所述炭疽芽孢杆菌缺少病毒性质粒pXO1和pXO2。

本公开提供一种具有保藏在ATCC登录号PTA-12024下的BH460的鉴别特征的炭疽芽孢杆菌。炭疽芽孢杆菌BH460的保藏在2011年8月9日于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，10801 University Boulevard，Manassas，VA 20110-2209，USA进行，在ATCC登录号PTA-12024下。该ATCC保藏是依据国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约(BudapestTreaty)的规定进行的。BH460的鉴别特征包括(a)失活的NprB、InhA2、TasA、camelysin、InhA1和MmpZ蛋白酶，(b)孢子形成缺陷性和(c)缺少病毒性质粒pXO1和pXO2。本公开的一个实施方案是炭疽芽孢杆菌BH460。

本公开提供这些蛋白酶缺陷性炭疽芽孢杆菌中的任一种还可包含使选自下组的蛋白酶失活的遗传修饰：转谷氨酰胺酶样超家族的蛋白酶、肽酶家族S8的蛋白酶及其组合。一个实施方案是一种炭疽芽孢杆菌，其包含使金属蛋白酶M4家族的蛋白酶失活的遗传修饰、使金属蛋白酶M6家族的蛋白酶失活的遗传修饰、使金属蛋白酶M73家族的蛋白酶失活的遗传修饰、使锌依赖性金属蛋白酶ZnMc超家族的炭疽芽孢杆菌蛋白酶失活的遗传修饰、和使转谷氨酰胺酶样超家族的炭疽芽孢杆菌蛋白酶失活的遗传修饰。一个实施方案是一种炭疽芽孢杆菌，其包含使金属蛋白酶M4家族的蛋白酶失活的遗传修饰、使金属蛋白酶M6家族的蛋白酶失活的遗传修饰、使金属蛋白酶M73家族的蛋白酶失活的遗传修饰、使锌依赖性金属蛋白酶ZnMc超家族的炭疽芽孢杆菌蛋白酶失活的遗传修饰、和使肽酶家族S8的炭疽芽孢杆菌蛋白酶失活的遗传修饰。一个实施方案是一种炭疽芽孢杆菌，其包含使金属蛋白酶M4家族的蛋白酶失活的遗传修饰、使金属蛋白酶M6家族的蛋白酶失活的遗传修饰、使金属蛋白酶M73家族的蛋白酶失活的遗传修饰、使锌依赖性金属蛋白酶ZnMc超家族的炭疽芽孢杆菌蛋白酶失活的遗传修饰、使转谷氨酰胺酶样超家族的炭疽芽孢杆菌蛋白酶失活的遗传修饰和使肽酶家族S8的炭疽芽孢杆菌蛋白酶失活的遗传修饰。一个实施方案是一种炭疽芽孢杆菌，其包含失活的M4家族的蛋白酶、失活的M6家族的蛋白酶、失活的M73家族的蛋白酶、失活的ZnMc超家族的蛋白酶、和失活的转谷氨酰胺酶样超家族的蛋白酶。一个实施方案是一种炭疽芽孢杆菌，其包含失活的M4家族的蛋白酶、失活的M6家族的蛋白酶、失活的M73家族的蛋白酶、失活的ZnMc超家族的蛋白酶、和失活的肽酶家族S8的蛋白酶。一个实施方案是是一种炭疽芽孢杆菌，其包含失活的M4家族的蛋白酶、失活的M6家族的蛋白酶、失活的M73家族的蛋白酶、失活的ZnMc超家族的蛋白酶、失活的转谷氨酰胺酶样超家族的蛋白酶和失活的肽酶家族S8的蛋白酶。

转谷氨酰胺酶样超家族的蛋白酶一个非限制性例子是炭疽芽孢杆菌CysP1蛋白酶，本文中亦称为CysP1。在一个实施方案中，使转谷氨酰胺酶样超家族的蛋白酶失活的遗传修饰是使CysP1失活的遗传修饰。肽酶家族S8的蛋白酶的一个非限制性例子是炭疽芽孢杆菌VpR蛋白酶(本文中亦称为VpR)。在一个实施方案中，使肽酶家族S8的蛋白酶失活的遗传修饰是使VpR失活的遗传修饰。如此，遗传修饰能使CysP1失活，遗传修饰能使VpR失活，或遗传修饰能使CysP1和VpR两者失活。一个实施方案是一种炭疽芽孢杆菌，其具有使NprB、InhA2、TasA、camelysin、InhA1、MmpZ和CysP1失活的遗传修饰。一个实施方案是一种炭疽芽孢杆菌，其具有使NprB、InhA2、TasA、camelysin、InhA1、MmpZ和VpR失活的遗传修饰。一个实施方案是一种炭疽芽孢杆菌，其具有使NprB、InhA2、TasA、camelysin、InhA1、MmpZ、CysP1和VpR失活的遗传修饰。

本公开提供一种炭疽芽孢杆菌，其包含使NprB蛋白酶失活的遗传修饰、使InhA2蛋白酶失活的遗传修饰、使TasA蛋白酶失活的遗传修饰、使camelysin蛋白酶失活的遗传修饰、使InhA1蛋白酶失活的遗传修饰、使MmpZ蛋白酶失活的遗传修饰、使CysP1蛋白酶失活的遗传修饰和使VpR蛋白酶失活的遗传修饰。应领会使一种蛋白酶失活的遗传修饰可以是使一种或多种另外的蛋白酶失活的同一种遗传修饰。例如，如上文公开的，缺失从tasA基因的至少一部分跨越至inhA1基因的至少一部分的对炭疽芽孢杆菌基因组区域的遗传修饰是使TasA蛋白酶失活的遗传修饰、使camelysin蛋白酶失活的遗传修饰、和使InhA1蛋白酶失活的遗传修饰的一个例子。在一个实施方案中，这类缺失从编码SEQ ID NO:9的氨基酸残基63的密码子跨越至编码SEQ ID NO:17的氨基酸402的密码子。SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:17分别编码野生型TasA和InhA1。这类缺失还使编码调节蛋白SinR和SinI的基因缺失。

一个实施方案是一种炭疽芽孢杆菌，其包含使NprB蛋白酶失活的遗传修饰、使InhA2蛋白酶失活的遗传修饰、使TasA蛋白酶失活的遗传修饰、使camelysin蛋白酶失活的遗传修饰、使InhA1蛋白酶失活的遗传修饰、使MmpZ蛋白酶失活的遗传修饰、使CysP1蛋白酶失活的遗传修饰和使VpR蛋白酶失活的遗传修饰。

一个包含使NprB、InhA2、TasA、camelysin、InhA1、MmpZ、CysP1和VpR蛋白酶失活的遗传修饰的炭疽芽孢杆菌的实施方案是其中有如下情况的炭疽芽孢杆菌：(a)失活的NprB蛋白酶由在炭疽芽孢杆菌的基因座GBAA_0599处经遗传修饰的nprB基因编码；(b)失活的InhA2蛋白酶由在炭疽芽孢杆菌的基因座GBAA_0672处经遗传修饰的inhA2基因编码；(c)失活的TasA蛋白酶由在炭疽芽孢杆菌的基因座GBAA_1288处经遗传修饰的tasA基因编码；(d)失活的camelysin由在炭疽芽孢杆菌的基因座GBAA_1290处经遗传修饰的calY基因编码；(e)失活的InhA1蛋白酶由在炭疽芽孢杆菌的基因座GBAA_1295处经遗传修饰的inhA1基因编码；(f)失活的MmpZ蛋白酶由在炭疽芽孢杆菌的基因座GBAA_3159处经遗传修饰的mmpZ基因编码；(g)失活的CysP1蛋白酶由在炭疽芽孢杆菌的基因座GBAA_1995处经遗传修饰的cysP1基因编码；和(h)失活的VpR蛋白酶由在炭疽芽孢杆菌的基因座GBAA_34584处经遗传修饰的vpR基因编码。这些基因座中的每一个均对应于炭疽芽孢杆菌“Ames ancestor”菌株染色体(GenBank登录号NC 003997)的等同命名的基因座，如实施例中记载的。

一个包含使NprB、InhA2、TasA、camelysin、InhA1、MmpZ、CysP1和VpR蛋白酶失活的遗传修饰的炭疽芽孢杆菌的实施方案是其中有如下情况的炭疽芽孢杆菌：(a)失活的NprB蛋白酶由nprB基因编码，其编码失活的包含氨基酸序列SEQ ID NO:2的NprB；(b)失活的InhA2蛋白酶由inhA2基因编码，其编码失活的包含氨基酸序列SEQ ID NO:6的InhA2；(c)失活的TasA蛋白酶由tasA基因编码，其编码失活的包含氨基酸序列SEQ ID NO:10的TasA；(d)失活的camelysin蛋白酶由calY基因编码，其编码失活的包含氨基酸序列SEQ ID NO:14的camelysin；(e)失活的InhA1蛋白酶由inhA1基因编码，其编码失活的包含氨基酸序列SEQID NO:18的InhA1；(f)失活的MmpZ蛋白酶由mmpZ基因编码，其编码失活的包含氨基酸序列SEQ ID NO:22的MmpZ；(g)失活的CysP1蛋白酶由cysP1基因编码，其编码失活的包含氨基酸序列SEQ ID NO:72的CysP1；和(h)失活的VpR蛋白酶由vpR基因编码，其编码失活的包含氨基酸序列SEQ ID NO:76的VpR。在一个实施方案中，编码的失活的NprB蛋白酶的氨基酸序列是SEQ ID NO:2。在一个实施方案中，编码的失活的InhA2蛋白酶的氨基酸序列是SEQ IDNO:6。在一个实施方案中，编码的失活的TasA蛋白酶的氨基酸序列是SEQ ID NO:10。在一个实施方案中，编码的失活的camelysin蛋白酶的氨基酸序列是SEQ ID NO:14。在一个实施方案中，编码的失活的InhA1蛋白酶的氨基酸序列是SEQ ID NO:18。在一个实施方案中，编码的失活的MmpZ蛋白酶的氨基酸序列是SEQ ID NO:22。在一个实施方案中，编码的失活的CysP1蛋白酶的氨基酸序列是SEQ ID NO:72。在一个实施方案中，编码的失活的VpR蛋白酶的氨基酸序列是SEQ ID NO:76。

一个包含使NprB、InhA2、TasA、camelysin、InhA1、MmpZ、CysP1和VpR蛋白酶失活的遗传修饰的炭疽芽孢杆菌的实施方案是其中有如下情况的炭疽芽孢杆菌：(a)使NprB蛋白酶失活的遗传修饰是编码包含氨基酸序列SEQ ID NO:2的失活NprB的nprB基因；(b)使InhA2蛋白酶失活的遗传修饰是编码包含氨基酸序列SEQ ID NO:6的失活InhA2的inhA2基因；(c)使TasA蛋白酶、camelysin蛋白酶和InhA1蛋白酶失活的遗传修饰是从编码SEQ IDNO:9氨基酸残基63的密码子跨越至编码SEQ ID NO:17的氨基酸402的密码子的缺失(这类缺失还使编码SinR和SinI的基因缺失)；(d)使MmpZ蛋白酶失活的遗传修饰是编码包含氨基酸序列SEQ ID NO:22的失活MmpZ的mmpZ基因；(e)失活的CysP1蛋白酶由cysP1基因编码，其编码失活的包含氨基酸序列SEQ ID NO:72的CysP1；和(f)失活的VpR蛋白酶由vpR基因编码，其编码失活的包含氨基酸序列SEQ ID NO:76的VpR。

一个包含使NprB、InhA2、TasA、camelysin、InhA1、MmpZ、CysP1和VpR蛋白酶失活的遗传修饰的炭疽芽孢杆菌的实施方案是其中有如下情况的炭疽芽孢杆菌：(a)使NprB蛋白酶失活的遗传修饰是编码由氨基酸序列SEQ ID NO:2组成的失活NprB的nprB基因；(b)使InhA2蛋白酶失活的遗传修饰是编码由氨基酸序列SEQ ID NO:6组成的失活InhA2的inhA2基因；(c)使TasA蛋白酶、camelysin蛋白酶和InhA1蛋白酶失活的遗传修饰是从编码SEQ IDNO:9氨基酸残基63的密码子跨越至编码SEQ ID NO:17的氨基酸402的密码子的缺失(这类缺失还使编码SinR和SinI的基因缺失)；(d)使MmpZ蛋白酶失活的遗传修饰是编码由氨基酸序列SEQ ID NO:22组成的失活MmpZ的mmpZ基因；(e)失活的CysP1蛋白酶由cysP1基因编码，其编码失活的包含氨基酸序列SEQ ID NO:72的CysP1；和(f)失活的VpR蛋白酶由vpR基因编码，其编码失活的包含氨基酸序列SEQ ID NO:76的VpR。

在一些实施方案中，本公开的炭疽芽孢杆菌还包含选自下组的遗传修饰：使NprC蛋白酶失活的遗传修饰、使SprA蛋白酶失活的遗传修饰、使HtrA蛋白酶失活的遗传修饰、使HsIV蛋白酶失活的遗传修饰及其组合。炭疽芽孢杆菌NprC是一种由nprC编码的中性金属蛋白酶，该基因位于炭疽芽孢杆菌“Ames ancestor”菌株染色体(GenBank登录号NC 003997)的基因座GBAA_2183处。炭疽芽孢杆菌SprA是一种由sprA编码的丝氨酸蛋白酶，该基因位于炭疽芽孢杆菌“Ames ancestor”菌株染色体的基因座GBAA_5414处。炭疽芽孢杆菌HtrA是一种由htrA编码的丝氨酸蛋白酶，该基因位于炭疽芽孢杆菌“Ames ancestor”菌株染色体的基因座GBAA_3660处。HsIV蛋白酶是ATP依赖性蛋白酶HsIV，其已在BH480分泌组中发现且由炭疽芽孢杆菌“Ames ancestor”菌株染色体的基因座GBAA_3968处编码。蛋白酶HslV和ATPase/伴侣HslU是ATP依赖性蛋白水解系统的一部分，该系统是蛋白酶体的原核同源物。HslV是六聚体的二聚体(十二聚体)，其形成在穴的内部壁上具有活性位点的中央蛋白水解室。HslV与蛋白酶体beta-亚基共享显著的序列和结构相似性，且两者均为水解酶Ntn家族的成员。HslV在其N末端具有亲核性苏氨酸残基，其在多肽加工后暴露，且直接参与活性位点催化。

本公开提供一种包含以下遗传修饰的炭疽芽孢杆菌：使金属蛋白酶M4家族的蛋白酶失活的遗传修饰、使金属蛋白酶M6家族的蛋白酶失活的遗传修饰、使金属蛋白酶M73家族的蛋白酶失活的遗传修饰、使锌依赖性金属蛋白酶ZnMc超家族的蛋白酶失活的遗传修饰、使转谷氨酰胺酶样超家族的蛋白酶失活的遗传修饰、使肽酶家族S8的蛋白酶失活的遗传修饰、和选自下组的遗传修饰：使NprC蛋白酶失活的遗传修饰、使SprA蛋白酶失活的遗传修饰、使HtrA蛋白酶失活的遗传修饰、使HsIV蛋白酶失活的遗传修饰及其组合。

本公开提供一种炭疽芽孢杆菌，其包含使NprB、InhA2、TasA、camelysin、InhA1、MmpZ、CysP1和VpR蛋白酶失活的遗传修饰，且还包含选自下组的遗传修饰：使NprC蛋白酶失活的遗传修饰、使SprA蛋白酶失活的遗传修饰、使HtrA蛋白酶失活的遗传修饰、使HsIV蛋白酶失活的遗传修饰及其组合。一个实施方案是一种炭疽芽孢杆菌，其包含使NprB蛋白酶失活的遗传修饰、使InhA2蛋白酶失活的遗传修饰、使TasA蛋白酶失活的遗传修饰、使camelysin蛋白酶失活的遗传修饰、使InhA1蛋白酶失活的遗传修饰、使MmpZ蛋白酶失活的遗传修饰、使CysP1蛋白酶失活的遗传修饰、使VpR蛋白酶失活的遗传修饰、和选自下组的遗传修饰：使NprC蛋白酶失活的遗传修饰、使SprA蛋白酶失活的遗传修饰、使HtrA蛋白酶失活的遗传修饰、使HsIV蛋白酶失活的遗传修饰及其组合。

在一些实施方案中，本公开的包含使NprB、InhA2、TasA、camelysin、InhA1、MmpZ、CysP1和VpR蛋白酶失活的遗传修饰的炭疽芽孢杆菌还包含使调节蛋白SinR、调节蛋白SinI或SinR和SinI两者失活的遗传修饰。SinR和SinI分别由位于炭疽芽孢杆菌基因组GBAA_1292和GBAA_1293处的基因编码。

可使用本领域技术人员已知的和如本文中描述的技术，来鉴别另外的分泌蛋白酶，其失活将进一步改进所述实施方案的炭疽芽孢杆菌的蛋白质生产。

在一些实施方案中，本公开的包含使NprB、InhA2、TasA、camelysin、InhA1、MmpZ、CysP1和VpR蛋白酶失活的遗传修饰的炭疽芽孢杆菌是孢子形成缺陷性的。亦即，本文中描述的任一种炭疽芽孢杆菌还可包含阻止孢子形成的遗传修饰，如使Spo0A蛋白失活的遗传修饰。Spo0A蛋白，作为芽孢杆菌中孢子形成的关键调控物(参见例如，Molle V等,2003,Molec.Microbiol.50,1683-1701)，由位于炭疽芽孢杆菌基因座GBAA_4394处的spo0A基因编码。不能形成孢子的炭疽芽孢杆菌作为生产生物是有利的。

在一些实施方案中，本公开的包含使NprB、InhA2、TasA、camelysin、InhA1、MmpZ、CysP1和VpR蛋白酶失活的遗传修饰的炭疽芽孢杆菌是在一种或多种病毒性质粒中有缺陷的。一个实施方案是实施方案中的炭疽芽孢杆菌为pXO1-，即该炭疽芽孢杆菌缺少病毒性质粒pXO1。一个实施方案是实施方案中的炭疽芽孢杆菌为pXO1-、pXO2-；即该炭疽芽孢杆菌缺少病毒性质粒pXO1和pXO2。一个实施方案是实施方案中的炭疽芽孢杆菌为pXO1-、pXO2+。

本公开提供一种包含以下的炭疽芽孢杆菌：使NprB蛋白酶失活的遗传修饰，其中所述失活的NprB蛋白酶由在炭疽芽孢杆菌的基因座GBAA_0599处经遗传修饰的nprB基因编码；使InhA2蛋白酶失活的遗传修饰，其中所述失活的InhA2蛋白酶由在炭疽芽孢杆菌的基因座GBAA_0672处经遗传修饰的inhA2基因编码；使TasA蛋白酶失活的遗传修饰，其中所述失活的TasA蛋白酶由在炭疽芽孢杆菌的基因座GBAA_1288处经遗传修饰的tasA基因编码；使camelysin失活的遗传修饰，其中所述失活的camelysin由在炭疽芽孢杆菌的基因座GBAA_1290处经遗传修饰的calY基因编码；使InhA1蛋白酶失活的遗传修饰，其中所述失活的InhA1蛋白酶由在炭疽芽孢杆菌的基因座GBAA_1295处经遗传修饰的inhA1基因编码；使MmpZ蛋白酶失活的遗传修饰，其中所述失活的MmpZ蛋白酶由在炭疽芽孢杆菌的基因座GBAA_3159处经遗传修饰的mmpZ基因编码；使CysP1蛋白酶失活的遗传修饰，其中所述失活的CysP1蛋白酶由在炭疽芽孢杆菌的基因座GBAA_1995处经遗传修饰的cysP1基因编码；使VpR蛋白酶失活的遗传修饰，其中所述失活的VpR蛋白酶由在炭疽芽孢杆菌的基因座GBAA_34584处经遗传修饰的vpR基因编码；和使Spo0A蛋白失活的遗传修饰，其中所述失活的Spo0A蛋白由在炭疽芽孢杆菌的基因座GBAA_4394处经遗传修饰的spo0A基因编码，其中所述炭疽芽孢杆菌缺少病毒性质粒pXO1和pXO2。

本公开提供一种具有以ATCC登录号_____保藏的BH480的鉴别特征的炭疽芽孢杆菌。炭疽芽孢杆菌BH480的保藏在2012年7月31日于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，10801University Boulevard，Manassas，VA 20110-2209，USA进行，ATCC登录号______。该ATCC保藏是依据国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约(Budapest Treaty)的规定进行的。BH480的鉴别特征包括(a)失活的NprB、InhA2、TasA、camelysin、InhA1、MmpZ、CysP1和VpR蛋白酶，(b)孢子形成缺陷性，和(c)缺少病毒性质粒pXO1和pXO2。本公开的一个实施方案是炭疽芽孢杆菌BH480。

可使用本文中公开的方法来产生缺少超过一种分泌的蛋白酶的炭疽芽孢杆菌。本公开提供一种引起实施方案的炭疽芽孢杆菌的方法，包括：引起遗传修饰以使金属蛋白酶M4家族的蛋白酶失活；和引起遗传修饰以使金属蛋白酶M6家族的蛋白酶失活。本公开还提供一种产生实施方案的炭疽芽孢杆菌的方法，包括：引起遗传修饰以使金属蛋白酶M4家族的蛋白酶失活；引起遗传修饰以使金属蛋白酶M6家族的蛋白酶失活；和引起遗传修饰以使金属蛋白酶M73家族的蛋白酶失活。本公开还提供一种产生实施方案的炭疽芽孢杆菌的方法，包括：引起遗传修饰以使金属蛋白酶M4家族的蛋白酶失活；引起遗传修饰以使金属蛋白酶M6家族的蛋白酶失活；引起遗传修饰以使金属蛋白酶M73家族的蛋白酶失活；和引起遗传修饰以使锌依赖性金属蛋白酶ZnMc超家族的蛋白酶失活。本公开还提供一种产生实施方案的炭疽芽孢杆菌的方法，包括：引起遗传修饰以使金属蛋白酶M4家族的蛋白酶失活；引起遗传修饰以使金属蛋白酶M6家族的蛋白酶失活；引起遗传修饰以使金属蛋白酶M73家族的蛋白酶失活；引起遗传修饰以使锌依赖性金属蛋白酶ZnMc超家族的蛋白酶失活；引起遗传修饰以使转谷氨酰胺酶样超家族的蛋白酶失活；和引起遗传修饰以使肽酶家族S8的蛋白酶失活。一个实施方案是一种产生实施方案的炭疽芽孢杆菌的方法，包括遗传修饰炭疽芽孢杆菌以使金属蛋白酶M4家族的蛋白酶失活并使金属蛋白酶M6家族的蛋白酶失活。一个实施方案是一种产生实施方案的炭疽芽孢杆菌的方法，包括遗传修饰炭疽芽孢杆菌以使金属蛋白酶M4家族的蛋白酶失活、使金属蛋白酶M6家族的蛋白酶失活、并使金属蛋白酶M73家族的蛋白酶失活。一个实施方案是一种产生实施方案的炭疽芽孢杆菌的方法，包括遗传修饰炭疽芽孢杆菌以使金属蛋白酶M4家族的蛋白酶失活、使金属蛋白酶M6家族的蛋白酶失活、使金属蛋白酶M73家族的蛋白酶失活、并使锌依赖性金属蛋白酶ZnMc超家族的蛋白酶失活。一个实施方案是一种产生实施方案的炭疽芽孢杆菌的方法，包括遗传修饰炭疽芽孢杆菌以使金属蛋白酶M4家族的蛋白酶失活、使金属蛋白酶M6家族的蛋白酶失活、使金属蛋白酶M73家族的蛋白酶失活、使锌依赖性金属蛋白酶ZnMc超家族的蛋白酶失活、使转谷氨酰胺酶样超家族的蛋白酶失活、并使肽酶家族S8的蛋白酶失活。本文中教导的遗传修饰以及本领域技术人员已知的那些均可用于使本文中指定的蛋白酶失活。可使用本文中教导的或本领域技术人员已知的其他技术来产生孢子形成缺陷性炭疽芽孢杆菌。本领域技术人员还能产生没有一种或两种病毒性质粒的炭疽芽孢杆菌。

本公开提供一种产生实施方案的炭疽芽孢杆菌的方法，包括：在培养基中培养所述炭疽芽孢杆菌；和回收所述炭疽芽孢杆菌。本领域技术人员已知的任何合适培养基和培养条件均可用于产生这类炭疽芽孢杆菌。培养基的非限制性例子包括LB和FA，其组成在实施例中说明。回收细菌的方法也是本领域技术人员已知的。

本公开还提供一种产生内源性炭疽芽孢杆菌蛋白如内源性分泌的蛋白质的方法。这类方法包括在培养基中培养实施方案的炭疽芽孢杆菌；并回收所述蛋白质。在一个实施方案中，所述蛋白质是炭疽芽孢杆菌内源性的分泌的蛋白质。培养方法、回收方法和要使用的培养基是本领域技术人员已知的。

本公开提供一种用编码产物的重组分子转化的经修饰的炭疽芽孢杆菌，其中所述炭疽芽孢杆菌包含本文中公开的任一种经遗传修饰的炭疽芽孢杆菌(即实施方案的任一种炭疽芽孢杆菌)，且所述重组分子包含编码所述产物的核酸分子可操作地连接于表达载体。一个实施方案是一种用编码产物的重组分子转化的经修饰的炭疽芽孢杆菌，其中：所述炭疽芽孢杆菌包含使金属蛋白酶M4家族的蛋白酶失活的遗传修饰和使金属蛋白酶M6家族的蛋白酶失活的遗传修饰，且所述重组分子包含编码所述产物的核酸分子可操作地连接于表达载体。一个实施方案是一种用编码产物的重组分子转化的经修饰的炭疽芽孢杆菌，其中：所述炭疽芽孢杆菌包含使金属蛋白酶M4家族的蛋白酶失活的遗传修饰、使金属蛋白酶M6家族的蛋白酶失活的遗传修饰和使金属蛋白酶M73家族的蛋白酶失活的遗传修饰，且所述重组分子包含编码所述产物的核酸分子可操作地连接于表达载体。一个实施方案是一种用编码产物的重组分子转化的经修饰的炭疽芽孢杆菌，其中：所述炭疽芽孢杆菌包含使金属蛋白酶M4家族的蛋白酶失活的遗传修饰、使金属蛋白酶M6家族的蛋白酶失活的遗传修饰、使金属蛋白酶M73家族的蛋白酶失活的遗传修饰和使锌依赖性金属蛋白酶ZnMc超家族的蛋白酶失活的遗传修饰；且所述重组分子包含编码所述产物的核酸分子可操作地连接于表达载体。一个实施方案是一种用编码产物的重组分子转化的经修饰的炭疽芽孢杆菌，其中：所述炭疽芽孢杆菌包含使金属蛋白酶M4家族的蛋白酶失活的遗传修饰、使金属蛋白酶M6家族的蛋白酶失活的遗传修饰、使金属蛋白酶M73家族的蛋白酶失活的遗传修饰、使锌依赖性金属蛋白酶ZnMc超家族的蛋白酶失活的遗传修饰、使转谷氨酰胺酶样超家族的蛋白酶失活的遗传修饰和使肽酶家族S8的蛋白酶失活的遗传修饰；且所述重组分子包含编码所述产物的核酸分子可操作地连接于表达载体。

如本文中使用的，重组分子包含表达载体可操作地连接于编码期望产物的核酸分子。经修饰的炭疽芽孢杆菌可包含一种或多种重组分子。重组分子可包含编码一种或多种期望产物的一种或多种核酸分子。如本文中使用的，短语可操作地连接意指编码期望产物的核酸分子以使得产物产生的方式连接至载体。表达载体是能转化炭疽芽孢杆菌的任何载体(即将编码产物的核酸分子投递到炭疽芽孢杆菌中)且其包含能实现编码期望产物的核酸分子在炭疽芽孢杆菌中表达的表达调控序列。表达载体的非限制性例子是质粒表达载体、病毒表达载体、和其他本领域技术人员已知的载体。这类载体可以是DNA、RNA、或DNA或RNA的衍生物。表达调控序列的例子包括但不限于，启动子、增强子、阻遏子、核糖体结合位点、RNA剪接位点、多腺苷酸化位点、转录终止子序列和microRNA结合位点。启动子的例子包括但不限于，调控编码炭疽芽孢杆菌保护性抗原(PA)的pag基因表达的启动子，本文中称为pag启动子或PA启动子和在炭疽芽孢杆菌中有功能的其他启动子。在一个实施方案中，所述启动子是pag启动子。重组分子还可包含能实现载体复制的复制调控序列，如复制起点。本领域技术人员能完成对要纳入的复制和表达调控序列的选择。一个实施方案是对炭疽芽孢杆菌异源性的重组分子；即至少一部分的重组分子不是天然的炭疽芽孢杆菌质粒。一个实施方案是包含减弱的炭疽芽孢杆菌质粒的重组分子，例如已从其除去至少一种会导致病毒性的组分的病毒性质粒。

一个实施方案是重组分子pSJ136EFOS。一个实施方案是包含核酸序列SEQ ID NO:62的重组分子。

一个实施方案是选自下组的重组分子：包含核酸序列SEQ ID NO:65的重组分子、包含核酸序列SEQ ID NO:67的重组分子、和包含核酸序列SEQ ID NO:69的重组分子。一个实施方案是选自下组的重组分子：pSW4-HBL L1His、pSW4-HBL L2 His和pSW4-HBL B His。一个实施方案是重组分子pSW4-HBL L1 His。一个实施方案是重组分子pSW4-HBL L2 His。一个实施方案是重组分子pSW4-HBL B His。

一个实施方案是一种包含pSJ115质粒的重组分子，该质粒编码包含氨基酸序列SEQ ID NO:91的蛋白质。一个实施方案是包含pYS5质粒的重组分子，该质粒编码包含氨基酸序列SEQ ID NO:92的蛋白质。一个实施方案是选自下组的重组分子：重组分子pSJ136EF-His、重组分子pSJ136EF-Cys和重组分子pSJ136EF-NEHY。一个实施方案是重组分子pSJ136EF-His。一个实施方案是重组分子pSJ136EF-Cys。一个实施方案是重组分子pSJ136EF-NEHY。

本公开还提供包含选自下组的氨基酸序列的蛋白质：氨基酸序列SEQ ID NO:93、氨基酸序列SEQ ID NO:94和氨基酸序列SEQ ID NO:95。一个实施方案是包含氨基酸序列SEQ ID NO:93的蛋白质。一个实施方案是包含氨基酸序列SEQ ID NO:94的蛋白质。一个实施方案是包含氨基酸序列SEQ ID NO:95的蛋白质。

转化实施方案的炭疽芽孢杆菌和选择并产生用其转化炭疽芽孢杆菌的表达载体和重组分子的方法记载于实施例中，而且还可见于例如Sambrook J等,2001,MolecularCloning:a Laboratory Manual,3^rd edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press和Ausubel F等,1994,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons。

编码实施方案的期望产物的核酸分子可编码炭疽芽孢杆菌天然产生的产物(例如炭疽毒素蛋白)或炭疽芽孢杆菌异源性的产物(例如来自不同生物体的毒素)。异源产物可以是内源性和非内源性产物的组合(例如肿瘤靶向性炭疽毒素)。产物的例子包括但不限于，蛋白质、氨基酸、核酸分子、经由重组生物合成途径产生的化合物、小分子、药物、维生素、药物缀合物、和肽核酸缀合物。

一个实施方案是包含毒素的产物。毒素的例子包括但不限于，炭疽毒素、霍乱毒素、白喉毒素、溶血素、蓖麻素蛋白。另外的例子包括但不限于假单胞菌(Pseudomonas)毒素、杜克雷嗜血杆菌(Haemophilus ducreyi)毒素、大肠杆菌(Escherichia coli)毒素、核糖体失活蛋白(RIP)毒素。一个实施方案是选自下组的产物：炭疽水肿因子(EF)、炭疽致死因子(LF)、炭疽保护性抗原(PA)、anthrolysin(ALO)及其组合。一个实施方案是包含炭疽水肿因子的产物。一个实施方案是包含完整的炭疽水肿因子的产物。一个实施方案是包含炭疽致死因子的产物。一个实施方案是包含完整炭疽致死因子的产物。一个实施方案是包含炭疽保护性抗原的产物。一个实施方案是包含完整炭疽保护性抗原的产物。一个实施方案是包含anthrolysin的产物。一个实施方案是包含完整anthrolysin的产物。一个实施方案是包含溶血素的产物。一个实施方案是包含蜡样芽孢杆菌溶血素HBL的产物。一个实施方案是选自下组的产物：蜡样芽孢杆菌溶血素HBL L1、蜡样芽孢杆菌溶血素HBL L2、蜡样芽孢杆菌溶血素HBL B及其组合。一个实施方案是包含白喉毒素的产物。一个实施方案是包含霍乱毒素的产物。一个实施方案是包含蓖麻毒蛋白的产物。一个实施方案是包含假单胞菌毒素的产物。一个实施方案是包含杜克雷嗜血杆菌毒素的产物。一个实施方案是包含大肠杆菌毒素的产物。一个实施方案是包含核糖体失活蛋白(RIP)毒素的产物。

一个实施方案是包含毒素融合蛋白的产物。一个实施方案是包含缀合于肿瘤靶物的毒素的产物。肿瘤靶物的例子是本领域技术人员已知的。缀合物的例子包括但不限于，缀合于肿瘤靶物的炭疽毒素、缀合于肿瘤靶物的霍乱毒素、缀合于肿瘤靶物的白喉毒素、缀合于肿瘤靶物的溶血素、缀合于肿瘤靶物的蓖麻毒蛋白。一个实施方案是缀合于肿瘤靶物的炭疽毒素。一个实施方案是包含融合蛋白的产物，该融合蛋白包含位于EF或LF氨基末端区域(例如成熟蛋白质的氨基末端约250至约260个氨基酸)的PA结合模块连接至感兴趣的蛋白质，其可经由本领域技术人员已知的保护性抗原(PA)细胞易位机制投递到细胞。

实施方案的核酸分子能编码天然产物或保留天然产物活性的其任意变体。实施方案的核酸分子可使用本领域技术人员已知的许多方法产生；参见例如，Sambrook J等，同上和Ausubel F等，同上。例如，核酸分子可使用多种技术进行修饰，包括但不限于，经典的诱变技术和重组DNA技术，如定点诱变，对核酸分子进行化学处理以诱导突变，核酸片段的限制性酶切割，核酸片段的连接，选定的核酸序列区域的聚合酶链式反应(PCR)扩增和/或诱变，寡核苷酸混合物的合成和混合物组的连接以“建立”核酸分子及其组合的混合物。实施方案的核酸分子可选自经修饰的核酸的混合物，其通过筛选由核酸编码的蛋白质的功能(例如，可在效力测定法中测试从编码EF蛋白的核酸分子表达的EF的活性，如记载于实施例中的)。

实施方案的产物可通过培养用编码实施方案的产物的重组分子转化的经修饰的炭疽芽孢杆菌来产生。本公开提供一种产生产物的方法，包括：培养用编码实施方案的产物的重组分子转化的经修饰的炭疽芽孢杆菌；并回收所述产物。实现这类产生，包括培养这类经修饰的炭疽芽孢杆菌并回收这类产物的方法，记载于实施例中并且是本领域技术人员已知的，参见例如Sambrook J等，同上和Ausubel,F等，同上。

本公开提供针对由实施方案的炭疽芽孢杆菌产生的产物的抗体。抗体的例子包括多克隆抗体、单克隆抗体、和保留抗体结合活性的功能性等同物如抗体片段和遗传工程化的抗体(包括但不限于，单链抗体和能结合超过一种表位的嵌合抗体)。一个实施方案是针对由实施方案的经修饰炭疽芽孢杆菌产生的炭疽水肿因子的抗体。

本公开提供使用实施方案的产物的方法。本公开提供针对由实施方案的经修饰炭疽芽孢杆菌产生的产物而生成的抗体可用于检测这类产物，或者如适宜地，检测对应于这类产物的生物或毒素。一个实施方案是一种确定样品是否包含炭疽毒素的方法，该方法包括：使样品与针对由实施方案的经修饰炭疽芽孢杆菌产生的炭疽水肿因子的抗体接触；并确定抗体是否形成复合物，其中复合物的检出指示该样品包含炭疽。一个实施方案是一种确定样品是否包含炭疽毒素的方法，该方法包括：使样品与针对由实施方案的炭疽芽孢杆菌产生的完整炭疽水肿因子的抗体接触；并确定抗体是否形成复合物，其中复合物的检出指示该样品包含炭疽。实现这类检测的方法是本领域技术人员已知的。

本公开提供可将由实施方案的经修饰炭疽芽孢杆菌产生的产物用于其意图目的。例如，致病剂的产物可用于保护(例如，预防或治疗)动物免于这类疾病。一个实施方案是一种保护动物免于炭疽的方法，该方法包括对动物施用由实施方案的经修饰炭疽芽孢杆菌产生的炭疽水肿因子。一个实施方案是一种保护动物免于炭疽的方法，该方法包括对动物施用由实施方案的经修饰炭疽芽孢杆菌产生的完整炭疽水肿因子。这类炭疽水肿因子可单独地或与一种或多种其他剂如炭疽致死因子和/或保护性抗原组合施用。一个实施方案是一种保护动物免于炭疽的方法，该方法包括对动物施用针对由实施方案的经修饰炭疽芽孢杆菌产生的完整炭疽水肿因子的抗体。这类抗炭疽水肿因子可单独地或与一种或多种其他药剂，如针对炭疽致死因子和/或保护性抗原的抗体组合施用。实现这类施用的方法是本领域技术人员已知的。

下面是本申请中公开的SEQ ID NO的表。应领会，由于核酸测序技术并非完全无错，因此本文中呈现的核酸序列和氨基酸序列分别代表实施方案核酸分子的表观核酸序列和实施方案蛋白质的表观氨基酸序列。

实施例

提出以下实施例以向本领域普通技术人员提供关于如何进行和使用实施方案的完整的公开和描述，而既不意图限制发明人认为为其发明的范围也不意图代表下文的实验是所有的或唯一实施的实验。已努力确保关于使用的数字(例如量、温度等)的准确性，但应考虑到一些实验误差和偏差。除非另外指示，部分是按重量计的部分，分子量是重均分子量，而温度是摄氏温度。使用标准缩写。

实施例1.材料和方法

材料

本文中使用和/或分析的蛋白酶及编码这类蛋白酶的基因列于表1。

表1.在本文中失活和/或分析的炭疽芽孢杆菌Ames ancestor菌株基因和蛋白质.

本文中产生和/或使用的寡核苷酸引物列于表2。

表2.本文中产生和/或使用的引物.

^a限制位点划线

本文中产生、使用和/或分析的质粒列于表3。

表3.本文中产生和/或使用的质粒.

本文中产生、使用和/或分析的细菌菌株列于表4。

表4.本文中产生和/或使用的细菌菌株。

细菌生长条件和表型表征

在Luria-Bertani(LB)培养液中生长大肠杆菌菌株并将其用作克隆的宿主。将LB琼脂用于选择转化体(Sambrook J等,2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Third Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NewYork)。还在LB或FA培养基中生长炭疽芽孢杆菌菌株(Singh Y等,1989,J.Biol.Chem.264,19103-19107)。FA培养基每升含有33g胰化蛋白胨、20g酵母提取物、7.4g NaCl、8g Na₂HPO₄和4g KH₂P0₄，pH 7.5。适宜时向培养基加入抗生素(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)以产生下列最终浓度：氨苄亲霉素(Ap)，100μg/ml(仅对大肠杆菌)；红霉素(Em)，对大肠杆菌400μg/ml而对炭疽芽孢杆菌10μg/ml；壮观霉素(Sp)，对大肠杆菌和炭疽芽孢杆菌150μg/ml；卡那霉素(Km)，20μg/ml(仅对炭疽芽孢杆菌)。将SOC培养基(Quality Biologicals，Inc.，Gaithersburg，MD)用于转化混合物铺板于选择性培养基之前的长出。从如先前描述的能形成孢子的菌株在30℃NBY最小琼脂(营养液8g/升；酵母提取物3g/升；MnSO₄·H₂O,25mg/升；琼脂15g/升)上生长5天后制备炭疽芽孢杆菌孢子(Thorne C,1993,in Bacillus subtilisand other gram-positive bacteria:biochemistry,physiology和molecular genetics,113-124,Sonenshein AB等,(Eds.),American Society for Microbiology,Washington,D.C.)。孢子和营养细胞使用Nikon Eclipse E600W光学显微镜(Nikon Instrument Inc.,New York)可见。

DNA分离和操作

通过标准规程实施从大肠杆菌制备质粒DNA，转化大肠杆菌和重组DNA技术(Sambrook J等，同上)。大肠杆菌SCS110感受态细胞购自Stratagene(La Jolla,CA)，而大肠杆菌TOP10感受态细胞购自Invitrogen(Carlsbad,CA)。重组质粒构建在大肠杆菌TOP10中进行。依照针对从枯草芽孢杆菌纯化质粒DNA的方案(Qiagen,Valencia,CA)从炭疽芽孢杆菌分离质粒DNA。使用Wizard基因组纯化试剂盒(Promega,Madison,WI)从炭疽芽孢杆菌分离染色体DNA。将炭疽芽孢杆菌用从大肠杆菌SCS110(dam^–dcm^–)分离的未甲基化的质粒DNA电穿孔。如先前描述的制备并转化电穿孔感受态炭疽芽孢杆菌细胞(Pomerantsev AP等,2009,J.Bacteriol.191,5134-5136)。限制性酶、T4连接酶和Antarctic磷酸酶购自NewEngland Biolabs(Ipswich,MA)。Taq聚合酶、Platinum PCR SuperMix High Fidelity试剂盒和TOPO TA克隆试剂盒来自Invitrogen。pGEM-T Easy Vector系统来自Promega。Ready-To-Go PCR Bead来自GE Healthcare Biosciences Corp.(Piscataway,NJ)。对于常规的PCR分析，将单个菌落悬浮于200μl TE缓冲液(pH 8.0)，加热至95℃达45秒，然后降至室温(Sambrook J等，同上)。通过在15,000x g离心10min除去细胞碎片。2微升的裂解物含有足以支持PCR的模板。将来自MBI Fermentas(Glen Burnie,MD)的GeneRuler DNA Ladder Mix用于评估DNA片段长度。通过DNA测序和/或限制性酶消化验证所有构建体。

构建用于蛋白酶基因失活的载体

将炭疽芽孢杆菌Ames 35(pXO1+pXO2-)(A35)用于遗传操作。分析GenBank数据库(Ames菌株的GenBank登录号为NC_003997)以鉴定靶基因和用于相应的引物设计。将Cre/Lox遗传修饰方法改动为适应于将精确的遗传敲除导入编码推定蛋白酶的炭疽芽孢杆菌基因中。先前描述了用于使用Cre-loxP系统产生炭疽芽孢杆菌突变体的一般方案(Pomerantsev AP等,2006，同上；Pomerantsev AP等,2009，同上)。该系统采用一般称为pDC(对于双交叉质粒)或pSC(对于单交叉质粒)的载体。这些质粒源自高度温度敏感性的质粒pHY304(Pritzlaff等,2001,Mol.Microbiol.39,236-247)，其具有分别为30℃和37℃的允许和限制性温度。将pDC质粒(Pomerantsev AP等,2006，同上)用于使spo0A(GBAA_4394)、nprB(GBAA_0599)(Pomerantsev AP等、2006，同上)、inhA1(GBAA_1295)(Kastrup CJ等，同上)、inhA2(GBAA_0672)和calY(GBAA_1290)基因失活。将pSC质粒(Pomerantsev AP等，2009，同上)用于使tasA(GBAA_1288)和mmpZ(GBAA_3159)基因失活。两种质粒均用在产生从tasA(GBAA_1288)到inhA1(GBAA_1295)的区域的基因组缺失中。

如Pomerantsev等,2006，同上中描述的使nprB基因失活。如Kastrup CJ等，同上中描述的使inhA1基因失活。为了使inhA2基因失活，将左片段和右片段分别用引物对0672LL/0672LR和0672RL/0672RR扩增(表2)并插入pDC以产生pInhA2I质粒(蛋白酶基因数字末尾的I意为失活)。为了使tasA基因失活，将左片段和右片段分别用引物对1288LL/1288LR和1288RL/1288RR扩增，并插入pSC以产生pTasALI和pTasARI质粒。为了使camelysin基因calY失活，将与该蛋白酶基因重叠的DNA片段用引物对1290L/1290R扩增并插入pHY304的EcoRI位点。将calY基因的内部BglII片段用由两个BglII位点侧接的loxP-Ω-sp-loxP盒替换(Pomerantsev AP等,2006，同上)以创建用于基因失活的pCamI质粒。为了使mmpZ基因失活，将左片段和右片段分别用引物对3159LL/3159LR和3159RL/3159RR扩增，并插入pSC以产生pMmpZLI和pMmpZRI质粒。为了使tasA-inhA1基因簇缺失，将双重蛋白酶突变体A35DM菌株(在inhA1基因中具有LoxP位点)用pTasALI转化，且该质粒如先前描述的整合到基因组中(Pomerantsev AP等,2009，同上)。随后将该重组菌株用pCrePAS质粒转化(Pomerantsev AP等,2009，同上)消除了完整的tasA-inhA1基因簇并产生四重蛋白酶突变体菌株A35TM。

表达Cre重组酶的质粒pCrePAS(Pomerantsev AP等,2009，同上)和pCrePA(Pomerantsev AP等,2006，同上)均具有分别为30℃和37℃的允许和限制性温度，且仅在选择标志中不同。将pCrePA用于消除含有位于两个相似取向的loxP位点之间的壮观霉素抗性盒的DNA区域(Pomerantsev AP等,2006，同上)，而当受体菌株不含壮观霉素标志时以类似的方式使用pCrePAS。在该情况中，要缺失的区域一般含有红霉素抗性基因连同主链质粒pSC(Pomerantsev AP等,2009，同上)。在两种情况中，单个loxP位点替换了目标为缺失的DNA区域。

为了补充mmpZ基因中的缺失(A35ΔMmpZ菌株)和恢复A35TM菌株中的缺失的taksA-inhA1区域，将3159CF/3159CR PCR片段(使用引物对3159CF/3159CR扩增)和deltaCF/deltaCR PCR片段(使用引物对delta CF/delta CR扩增)插入pSC质粒。所得pMmpZC和pΔTasA-InhA1C质粒分别含有完整的mmpZ基因和全部的tasA-inhA1区域(蛋白酶基因末尾的C意为补充)，将其用于补充。通过单交叉事件将每种质粒分别插入相应的突变体。在交叉期间，mmpZ基因和整个tasA-inhA1区域均插入相应突变体的基因组中。随后通过Cre重组酶对质粒序列的消除留下原始突变基因的完整的功能性拷贝连同该基因片段的无活性的复制拷贝。

制备蛋白酶缺陷性炭疽芽孢杆菌

炭疽芽孢杆菌菌株A33(Pomerantsev AP等,2003,Infect Immun 71,6591-6606)、A35、A35ΔSpo0A、A35ΔNprB、BH450(后4种均记载于Pomerantsev AP等,2006，同上)和A35ΔInhA1(Kastrup CJ等，同上)及其有关的特征列于表4。还列于表4的是如本文中描述产生的蛋白酶缺陷性炭疽芽孢杆菌菌株。在A35菌株中构建经遗传修饰以分别使NprB、InhA2、TasA、camelysin、InhA1或MmpZ失活的炭疽芽孢杆菌，其通过将分别的编码序列用如本文中所述的loxP元件替换。

从A35ΔNprB菌株开始创建双重的NprB、InhA1突变体(A35DM)，其为一种包含使NprB失活的遗传修饰和使InhA1失活的遗传修饰的炭疽芽孢杆菌。四重蛋白酶突变体A35TM(一种包含使NprB失活的遗传修饰、使TasA失活的遗传修饰、使camelysin失活的遗传修饰和使InhA1失活的遗传修饰的炭疽芽孢杆菌)通过在A35DM菌株中缺失tasA-inhA1基因区域来创建。然后，将A35TM用于使用质粒pInhA2I和pMmpZLI/pMmpZRI来使inhA2和mmpZ基因失活。所得五重和六重蛋白酶突变体分别称为A35PM(包含使NprB失活的遗传修饰、使TasA失活的遗传修饰、使camelysin失活的遗传修饰、使InhA1失活的遗传修饰、和使InhA2失活的遗传修饰的炭疽芽孢杆菌)和A35HM(包含使NprB失活的遗传修饰、使TasA失活的遗传修饰、使camelysin失活的遗传修饰、使InhA1失活的遗传修饰、使InhA2失活的遗传修饰、和使MmpZ失活的遗传修饰的炭疽芽孢杆菌)。

在每个步骤检查突变体菌株以确保其保留形成孢子的能力(Sastalla等,2010,Appl.Environ.Microbiol.76,6318-6321)。为了有意地产生A35HM的孢子形成缺陷性的六重蛋白酶突变体，通过使用质粒pSΩL304使A35HM中的spo0A(GBAA_4394)基因失活来产生A35HMS(Pomerantsev等,2006)。获得最终的缺少pXO1的蛋白酶缺陷性spo0A阴性突变体，其通过在升高的温度重复A35HMS突变体的传代以消除pXO1，如先前描述的(Pomerantsev等,2003，同上)。最终菌株称为炭疽芽孢杆菌BH460(表4)。

染色体修饰的PCR和序列分析

扩增突变(即失活)基因内含loxP位点的PCR片段并使用列于表2的引物测序(0672seqF/0672seqR、1288seqF/1288seqR、1290seqF/1290seqR、3159seqF/3159seqR)。所有用于PCR和测序的引物均由Operon Biotechnologies,Inc.(Huntsville,AL)或FDA核心设施(core facility)(Bethesda,MD)合成。从PCR片段的两侧测定序列(Macrogen,Rockville,MD)。对于tasA-inhA1基因区域中基因组缺失的验证，通过使用引物对deltaF/deltaR的PCR扩增突变体菌株中涵盖tasA基因开始和inhA1基因末端的区域。通过对片段测序测定PCR片段内loxP位点的位置。

Western印迹分析

在LB中于37℃在空气中生长A35菌株和经遗传修饰的炭疽芽孢杆菌突变体来通过Western印迹分析炭疽芽孢杆菌毒素产生。将过夜培养物稀释到新鲜的LB中以产生A₆₀₀＝0.002，并在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、17和24h时测量生长。将每个时间点的上清液样品(6ml)过滤(0.22μm Millex注射器驱动的过滤装置,Millipore,Cork,Ireland)和使用Amicon Ultra-4膜(Millipore)浓缩10倍。将5μl样品与5μl 2X Tris-甘氨酸SDS样品加载缓冲液(126mM Tris-HCl、pH 6.8、4％SDS、20％甘油、0.005％溴酚蓝)(Invitrogen)混合，加热(96℃，10min)并使用NuPAGE MOPS SDS运行缓冲液(Invitrogen)在4-12％Bis-TrisNuPAGE凝胶上分离。将Precision Plus Protein Standard(All Blue,Bio-Rad,Hercules,CA)用作分子量标志。使用转移缓冲液(25mM Tris、190mM甘氨酸和20％甲醇)将蛋白转移至MagnaCharge 0.45μm尼龙膜(Osmonics Inc.,Minnetonka,MN)，在PBS+3％脱脂乳(Difco,Lawrence,KS)中于室温封闭1h，接着在PBST(PBS+0.05％Tween20)中清洗3次各10min。然后，将膜与在PBS+1％脱脂乳中稀释的一抗在4℃过夜温育。用于检测PA的小鼠单克隆抗体PA-05-A-G1Lot#071100-02，5.9mg/ml(Naval Medical Research Center,BiologicalDefense Research Directorate)和用于检测LF的小鼠单克隆抗体LF-03-A-G1Lot#150900-01，7.4mg/ml(NMRC,BDRD)均以1:2000使用。用于形成印迹的家兔抗血清包含抗EF血清#5900(以1:8000使用；生产于发明人的实验室)、抗camelysin血清(以1:2000使用；Molecular Biology Institute of Barcelona,Spain)和抗重组ALO血清(以1:2000使用；R.Rest,Drexel University College of Medicine,Philadelphia,PA)。适宜的缀合HRP的二抗IgG(KPL,Gaithersburg,MD)以1:10000使用接着用TMB(3,3’,5,5’-四甲基联苯胺)(KPL)显色。

EF蛋白的分离和纯化

在大肠杆菌BL21(DE3)(Promega)中从质粒pProEx-H6-EF(由Wei-Jen Tang提供)表达具有N末端6组氨酸标签的EF(炭疽芽孢杆菌水肿因子)蛋白，如先前描述的(SoelaimanS等,2003,J.Biol.Chem,278,25990-25997)。pProEx-H6-EF包含编码具有N末端6组氨酸标签的EF的核酸分子可操作地连接于pPROEX HTa(Addgene,Cambridge,MA)。

EF在炭疽芽孢杆菌宿主菌株中从质粒pSJ136EFOS(SEQ ID NO:62和图6)表达，其含有质粒pYS5中的EF结构性基因在PA(炭疽芽孢杆菌保护性抗原)启动子和信号序列的调控下(即可操作地连接)(Singh Y等,1989,J.Biol.Chem.264,19103-19107)。在含有15μg/ml卡那霉素的FA培养基中于37℃生长含有pSJ136EFOS的宿主菌株BH450和BH460达14h，基本按照先前用于产生LF的规程(Park S等,2000,蛋白Expr.Purif.18,293-302)。将培养物降温，用2μg/ml AEBSF[4-(2-氨乙基)-苯磺酰氟盐酸盐(benzenesulfonylfluoride^.HCl)](US Biological,Swampscott,MA)补充并在4550x g离心30min。所有随后步骤均在4℃实施。

将上清液无菌过滤并用5mM EDTA补充。向上清液加入固体硫酸铵以获得40％饱和。加入Phenyl-Sepharose Fast Flow(低取代，GE Healthcare Biosciences Corp.)并在冷温温和混合上清液达1.5h。在多孔的塑料漏斗(BelArt Plastics,Pequannock,NJ)上收集树脂并用含有1.5M硫酸铵、10mM Tris-HCl和1mM EDTA(pH 8.0)的缓冲液清洗。将EF蛋白用0.3M硫酸铵、10mM Tris-HCl和1mM EDTA(pH 8.0)洗脱，通过再添加30g硫酸铵每100ml洗脱物沉淀，并在18,370x g离心20min。将蛋白对5mM HEPES,0.5mM EDTA(pH 7.5)溶解并透析。将透析后的样品施加到Q-Sepharose Fast Flow柱(GE Healthcare BiosciencesCorp.)并用20mM Tris-HCl、0.5mM EDTA(pH 8.0)中0-0.5M的NaCl梯度洗脱。将通过SDS-PhastGel分析鉴定的含EF级分在陶瓷羟基磷灰石(ceramic hydroxyapatite)的柱(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA)上用含0.1M NaCl(pH 7.0)的0.02-1.0M磷酸钾梯度纯化。将含有EF的级分对5mM HEPES和0.5mM EDTA，pH 7.5过夜透析，如需要的浓缩，冷冻并储存于-80℃。通过使用HP/Agilent 1100MSD仪(Hewlett Packard,Palo Alto,CA)的液相层析-电喷射质谱估测纯化的EF的分子量(在NIDDK core facility,Bethesda,MD)。

体外和体内EF活性的分析

通过分析RAW264.7巨噬细胞细胞系(ATCC TIB-71)中的环AMP(cAMP)产生来测量EF活性。在37℃、5％CO₂中在具有10％胎牛血清、2mM Glutamax、2mM HEPES和50μg/ml艮他霉素(均来自Invitrogen)的Dulbecco’s Modified Eagle培养基(DMEM)中生长细胞。在测定前24h将细胞接种到96孔板中。将EF制备物在恒定PA(炭疽芽孢杆菌保护性抗原)浓度(250ng/ml)中系列稀释，接着加入细胞并在37℃温育1h。总cAMP水平使用BioTRAK cAMP酶免疫测定试剂盒(GE Healthcare Biosciences Corp.)依照制造商方案评估。为了分析EF效力，对5只8周龄雌性Balb/cJ小鼠的组(Jackson Laboratories,Bar Harbor,ME)经由尾部静脉注射EF制备物与等同剂量PA的组合。在无菌PBS中制备毒素。监测小鼠存活达168h。所有涉及动物的实验均依照由国家过敏症和传染病研究院(National Institute ofAllergy and Infectious Diseases)、国家卫生研究院(National Institutes ofHealth)的动物护理和使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee)批准的方案实施。

实施例2.炭疽芽孢杆菌蛋白酶基因的遗传修饰

本实施例显示其中将loxP插入编码炭疽芽孢杆菌蛋白酶的基因的炭疽芽孢杆菌遗传修饰导致相应蛋白质的截短。

在本实验中目的是使炭疽芽孢杆菌染色体上的许多蛋白酶基因以及spo0A基因失活。本文中其以The Institute for Genomic Research，现在的J Craig VentnerInstitute(Rockville,Maryland)对“Ames ancestor”菌株染色体(GenBank登录号NC007530，基因命名GBAA_基因号)指定的基因号鉴别(Ravel J等,2009,J.Bacteriol.191,445-446)。该基因号与先前的"Ames"菌株染色体(GenBank登录号NC 003997,基因命名BA_基因号)一致(Read TD等,2003,Nature 423,81-86)。在本研究中失活或分析的所有基因和蛋白质均与相应的基因座标签一起列于表1。

先前已描述了nprB和inhA1基因的失活(Pomerantsev AP等,2006，同上,KastrupCJ，同上)。如本文中描述的使inhA2、tasA、calY和mmpZ基因失活。炭疽芽孢杆菌InhA2蛋白在序列中与苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)的InhA2蛋白酶96％相同，后者是昆虫病原体中的基本病毒性因子(Fedhila S等,2003,J.Bacteriol.185,2820-2825)。位于推定的信号蛋白酶基因sipW(GBAA_1287)下游的tasA基因(GBAA_1288)仅在InhA1基因(GBAA_1295)上游5个基因。介入基因包括calY蛋白酶基因和两个调节性基因sinI和sinR(表4)。SinI和SinR蛋白在枯草芽孢杆菌生物膜(biofilm)形成中起着重要作用，其经由蛋白酶依赖性过程作用(Chai Y,2010,Mol.Microbiol.78,218-229)，而在炭疽芽孢杆菌中这些蛋白调节分泌的蛋白酶(Pflughoeft KJ等,2010,J.Bacteriol.193,631-639)。有意思的是，对应于calY和inhA1的基因未见于枯草芽孢杆菌基因组的sinI、sinR区域。仅TasA蛋白酶的基因tasA位于sipW下游以及sinR和sinI的上游(Pflughoeft等，同上)。TasA和camelysin均类似于枯草芽孢杆菌TasA蛋白酶(分别有36％和34％序列同一性)。选择失活的最后基因mmpZ报告为与下游基因(GBAA_3160)形成操纵子(Passalacqua KD等,2009,J.Bacteriol.191,3203-3211)。后一基因编码在炭疽芽孢杆菌中过度生产的假定的分泌蛋白质(Antelmann H等，同上)。MmpZ蛋白酶在炭疽芽孢杆菌分泌组中的缺失指示该蛋白酶可能是在生长稳定期期间通过其他蛋白酶的蛋白水解性降解的靶物(Antelmann H等，同上)。

如实施例1中描述的使蛋白酶基因失活，接着通过测序定位loxP插入并推断突变的蛋白质中相应的氨基酸变化。这些显示于图1。通常地，34-bp loxP序列将生成移码和在loxP序列内或其后不远处的备选阅读框中终止密码子的早期下游发生。如此，所有4种失活的蛋白酶基因均编码极大缩短的蛋白质。

实施例3.比较经遗传修饰的炭疽芽孢杆菌和A35菌株的蛋白质降解

本实施例比较数种经遗传修饰的炭疽芽孢杆菌，包括实施方案的一些炭疽芽孢杆菌和Ames 35菌株的蛋白质降解。

通过Western印迹将由炭疽芽孢杆菌突变体产生的3种炭疽芽孢杆菌毒素组分、ALO和camelysin的水平与亲本A35菌株的那些比较(图2)。10种菌株在LB中于37℃生长达24-h时段。所有菌株均类似生长，除了六重蛋白酶突变体BH460，其似乎在达到指数生长期之前有稍微的滞后。

生长5h时开始可检测到Ames 35对PA的表达。然而，完整的PA(83kDa)在生长到9h时因蛋白水解性降解而消失。对InhA2蛋白酶的失活未影响PA的产生，而对Spo0A或camelysin的失活实际将PA的半衰期降低了1-2h。对NprB、TasA、或MmpZ的失活导致直至10h时的升高的PA稳定性。然而，由所有这些菌株产生的PA在17h后完全降解。在单敲除突变体中最稳定的PA产生见于InhA1菌株。PA甚至在生长24h时存在于该菌株，尽管发生了一些降解。令人惊讶地，A35DM双重突变体未显示增强的PA产生。PA降解一般开始于生长的6-7h并持续至24h。惊人地，具有6种失活蛋白酶的A35HMS菌株在生长的整个24h期间产生具有最小至无降解的PA。实施类似的分析来观察其他炭疽芽孢杆菌毒素组分EF和LF的产生。发现完整的EF(89kDa)比PA更易受到降解，而LF(90kDa)在从大多数突变体菌株产生时相当稳定。对于每种突变体菌株，完整的EF和LF的水平以及其产生的时机均与对PA看到的相当。

在A35DM菌株中发现的增强的PA和EF分解可由A35DM中相比于A35或两种相应的单蛋白酶敲除增加的camelysin产生解释。尽管NprB和InhA1敲除菌株均具有增加的camelysin水平，但双重突变产生了似乎大于加和效应的效应。由A35DM菌株产生的camelysin水平与由Spo0A突变体菌株A35ΔSpo0A产生的相似。两种菌株均产生在24-h时段内保持稳定的camelysin(19kDa)。这些对几种蛋白酶的翻译后调节camelysin产生的观察证实并扩展了最近公开的数据，该数据显示培养上清液中InhA1的浓度与camelysin的浓度成反比(Pflughoeft等，同上)。这些研究中的另一个有意思的发现是全局转录调控物Spo0A抑制camelysin产生。Pflughoeft等，同上，最近证明炭疽芽孢杆菌sinR(其在含有tasA-ihhA1缺失的那些突变体中缺失)还负向调节camelysin和InhA1的转录，而这两者均已提出与病毒性有关(Chung MC等，同上,Liu YT等,2008,Protein Expr.Purif.57,72-80)。

敲除TasA还增加了camelysin的产生，但其程度小于NprB和InhA1的消除。InhA2敲除相比于A35时未导致camelysin降解或产生中的任何变化，而MmpZ消除实际对于camelysin产生有害。这些研究指示在炭疽芽孢杆菌中6种蛋白酶的失活导致相对于A35，单或双重蛋白酶突变体的在培养上清液中增加的完整毒素蛋白的产生。

相比于所有蛋白酶敲除(除了InhA2突变体以外)，从A35菌株产生非常低水平的ALO。由A35菌株产生的ALO在生长9小时后完全消失。每种蛋白酶敲除菌株显示ALO的增加的产生水平或更大的稳定性(53-kDa条带)。有意思的是，仅在生长17h后，在A35DM(在A35ΔInhA1中更少)中开始ALO分解。在A35HMS菌株中未看到类似的效应，该菌株允许在生长的整个24h内完整ALO的累积。ALO基因在PlcR依赖性启动子的调控下，因此预期炭疽芽孢杆菌中PlcR蛋白的截短极大地限制ALO合成，连同所有其他PlcR依赖性蛋白质(Sastalla,2010,Microbiology 156,2892-2993)。可在几种蛋白酶缺陷性突变体中观察到ALO的事实暗示先前的低ALO产生的报告至少部分可归因于其降解而非低表达。Camelysin过表达未影响ALO产生，指示该毒素不是camelysin的靶物。总之，结果证明多种蛋白酶参与调控炭疽芽孢杆菌中胞外蛋白的累积。

实施例4.对使炭疽芽孢杆菌蛋白酶失活的遗传修饰的补充

本实施例证明对使炭疽芽孢杆菌蛋白酶失活的遗传修饰的补充恢复蛋白水解活性。

为了验证上文观察到的变化是由于意图的基因敲除而非未认出的第二位点突变，进行评估对几种突变体的补充的研究。为了补充mmpZ突变，将A35ΔMmpZ菌株用pMmpZC转化。该质粒经历单交叉以在突变的基因相邻处插入全长、野生型mmpZ基因。pSC载体通过Cre重组酶处理消除，如先前描述的(Pomerantsev AP等,2009，同上)。A35MmpZC中完整mmpZ基因的存在由PCR和测序确认。对在24h内从A35ΔMmpZC的LF产生的Western印迹分析(图3A)指示蛋白水解活性恢复至类似于A35的水平(图2)。为了恢复A35TM菌株的基因组中的大tasA-inhA1缺失，将该菌株用质粒pΔTasA-InhA1C(含有完整的tasA-inhA1区域)转化并以类似于上文描述的方式评估补充。对从补充后菌株的ALO产生的分析验证了蛋白水解活性的恢复(图3B)。然而，对A35ΔInhA2菌株的补充和以相同方式对InhA2蛋白酶的恢复未导致分泌的蛋白质中的任何差异(数据未显示)。

上文描述的所有研究均在Ames 35的衍生物中进行，其中毒素蛋白编码在大病毒性质粒pXO1上。这些菌株中毒素蛋白和分泌的蛋白酶的产生高度依赖于生长培养基。具体地，3种毒素蛋白和某些蛋白酶的产生通过加入碳酸氢盐得到极大增强(Chitlaru T等，同上,Passalacqua KD等，同上,Bartkus JM,1989,Infect.Immun.57,2295-2300)。如此，可能在某些培养基中生长能产生更高浓度的两种蛋白酶和底物(例如，PA、LF、EF等)，而这能导致甚至比此处观察到的更大的降解。

在生物技术工艺中广泛使用芽孢杆菌宿主菌株，且多年来已将无毒性的炭疽芽孢杆菌菌株用于产生PA和LF(参见例如Varughese M等，同上,Park S等，同上,Gupta PK等,2008,PLoS.ONE 3,e3130)。然而，因为由上文呈现的工作显示的分泌的蛋白酶，这些菌株对于作为重组蛋白质生产的遗传宿主一直是不可用的。本文中描述的许多最富含的蛋白酶的成功消除表明所得菌株作为蛋白表达宿主能具有价值。为了创建最优宿主，通过从A35HMS菌株除去质粒pXO1将其进一步修饰。所得菌株称为BH460，是无产毒性的，且可视为无毒的，因为其缺少炭疽芽孢杆菌的主要病毒性因子。spo0A基因的永久性缺失确保该菌株在指数生长结束时快速死亡，从而消除关于实验室污染的担忧。

实施例5.炭疽芽孢杆菌BH460的完整EF蛋白的产生

本实施例显示通过实施方案的经修饰炭疽芽孢杆菌，即经重组分子pSJ136EFOS转化的炭疽芽孢杆菌BH460的完整的EF产生。

之前从炭疽芽孢杆菌宿主产生EF一直是困难的，因为该蛋白比PA和LF更易受蛋白水解性降解影响。质粒pSJ136EFOS(其核酸序列为SEQ ID NO:62)编码成熟的EF蛋白，其天然N末端(如此，“OS”为原始序列)融合至PA信号序列，且其在pag启动子的调控下。另外，该质粒与发明人常规分别用于产生PA和LF的质粒pYS5和pSJ115相似；参见例如，Park S等，同上。将从转化体BH460(pSJ136EFOS)纯化的蛋白质与以类似方式从单蛋白酶突变体宿主BH450制得的制备物比较，以及与从大肠杆菌纯化的带His6标签的EF蛋白比较(SoelaimanS等，同上)，后者是用于先前在Firoved AM等,2005,Am.J.Pathol.167,1306-1320中报告的毒性分析的材料类型。重组EF蛋白的SDS-PAGE概况显示于图4A。从BH460产生的EF似乎比从BH450分离的降解得稍微较少。通过质谱分析确认该发现(图4B)。从BH460分离的重组蛋白的分子量(88,820Da)与EF的理论分子量(88,822Da)比较得较好，相差2Da，其在仪器误差以内。发现第二种具有较低质量的(88,687Da)，这与N末端甲硫氨酸的丧失一致。这两个蛋白种类以约相等量存在(对于较大的47％，对于较小的53％)。从BH450产生的EF的质谱显示降解，由产生87,326和86,366Da蛋白的1495.7和2455.7Da的丧失指示，所述蛋白以分别为54％和46％的类似丰度发现(图4C)。将由BH450产生的成熟EF中的表观蛋白酶切割位点映射到氨基酸残基Arg-12和Lys-20。从大肠杆菌纯化的EF是单形的，质量为89,995Da，与理论分子量(89,989Da，图4C)仅相差6Da。这些结果清楚地显示来自BH460的完整EF相比于由BH450制备的截短蛋白的产生。

实施例6.由经遗传修饰的蛋白酶缺陷性炭疽芽孢杆菌产生的EF的活性

本实施例显示由实施方案的经修饰炭疽芽孢杆菌，即经重组分子pSJ136EFOS转化的炭疽芽孢杆菌BH460产生的EF在效力测定法中有活性。

如上文记载的，先前从用质粒如pSJ136转导的炭疽芽孢杆菌宿主菌株难以产生重组EF。此外，从炭疽芽孢杆菌Sterne菌株培养上清液(Leppla SH,1991,MethodsEnzymol.195,153-168)或大肠杆菌(Soelaiman S等，同上)获得的EF在诱导培养细胞中的cAMP产生或对小鼠致死性中一贯具有比从炭疽芽孢杆菌产生的EF更高的效力(数据未显示)。事实上，即使当以高至100μg的剂量(与等摩尔PA组合)注射时，来自炭疽芽孢杆菌的先前的重组EF制备物对小鼠均不致死(数据未显示)。显示于图4的ES-MS分析表明先前的炭疽芽孢杆菌来源的EF制备物的低效力可能是由于降解所致。与先前结果一致，BH450来源的EF展现出非常低的比活性水平且对小鼠不致死(图5A和图5B)。然而，从BH460培养上清液纯化的重组EF具有超过高度活性的大肠杆菌BL21(DE3)来源的EF的比活性(图5A)。类似地，当与等同剂量的PA一起注射时，从BH460制备的重组EF在25μg剂量对动物致死，而该剂量的大肠杆菌来源的EF具有最小影响(图5B)。从BH450纯化的EF在50μg(图5B)且甚至在高达100μg的剂量不致死(数据未显示)。如此，产生5-7mg EF每升培养物的BH460菌株允许首次从炭疽芽孢杆菌纯化出大量的高度活性的EF。由于以相同方式从炭疽芽孢杆菌纯化的其他蛋白一贯没有内毒素，因此使用这些EF制备物也消除了关于与大肠杆菌来源制备物有关的内毒素介导的cAMP共信号传导的担心。还证实BH460菌株对于多种其他蛋白质的表达非常有用，通常得到超过10mg的最终纯蛋白每升培养物，其例子在实施例7中提供。

实施例7.通过炭疽芽孢杆菌BH460产生完整的蜡样芽孢杆菌溶血素HBL毒素

本实施例显示实施方案的经修饰的炭疽芽孢杆菌，即经重组分子pSW4-HBL L1His,pSW4-HBL L2 His、或pSW4-HBL B His转化的炭疽芽孢杆菌BH460，分别产生大量完整的HBL L1、HBL L2、或HBL B。

蜡样芽孢杆菌能导致免疫受损患者中的感染，如脓毒病、脑膜炎、肺炎和伤口感染。还有关于未受损患者中脓疱病样损伤的报告。已显示HBL毒素促进蜡样芽孢杆菌导致的腹泻食物中毒，且其存在被用作蜡样芽孢杆菌食物污染的指示物。

蜡样芽孢杆菌569具有两个HBL操纵子。第一个操纵子位于染色体上，而第二个位于质粒上。染色体操纵子似乎包含编码以下蛋白质的3种基因：L2(1320bp，439个氨基酸，连同信号序列为49.3kDa)；L1(1221bp，406个氨基酸，连同信号序列为43.8kDa)；和B(1146bp，381个氨基酸，连同信号序列为42.5kDa)。这些蛋白质在蛋白质水平上不共享同源性：L1对L2具有24％同一性；L1对B具有26％同一性；而L2对B还具有26％同一性。已显示所有这些HBL蛋白经由Sec途径分泌且含有革兰氏阳性信号序列(Fagerlund A等,2010,BMCMicrobiol 10,304)。

单一的HBL毒素组分是无毒性的；引起细胞裂解需要所有3种组分(即L1、L2和B)。尚未很好地理解毒素组分协同起作用的确切机制。

已显示HBL影响多种细胞类型和组织如视网膜组织(Beecher DJ等,1995,Infect.Immun.63,4423-4428)、家兔皮肤、回肠、CHO细胞(Beecher DJ等,1997,J.Biol.Chem.272,233-239)和来自豚鼠、猪、牛、绵羊、家兔、山羊和人的红血球细胞(活性递减)。由Beecher等,1997，同上实施的研究显示在与L1和L2组分温育后，B(结合)模块能引发红血球裂解。细胞还可用任一种L组分引发，指示所有3种组分均能结合红血球细胞膜。另外，可通过添加特异于结合组分的抗体，以及通过添加过量的L1组分来抑制毒素作用，这指示L1结合L2或结合组分(Beecher等,1997，同上)。

重组分子pSW4-HBL L1 His(绘于图7)通过将编码HBL L1(包括其天然信号序列)的核酸分子和C末端6xHis标签可操作地连接于表达载体pSW4，从而使HBL L1 His的表达在炭疽芽孢杆菌pag启动子的调控下来产生。将炭疽芽孢杆菌BH460用重组分子pSW4-HBL L1His转化，而经修饰的炭疽芽孢杆菌在2升FA培养液中过夜生长(～16h)时，产生28mg的纯HBL L1 His蛋白。

重组分子pSW4-HBL L2 His(绘于图8)通过将编码HBL L2(包括其天然信号序列)的核酸分子和C末端6xHis标签可操作地连接于表达载体pSW4，从而使HBL L2 His的表达在炭疽芽孢杆菌pag启动子的调控下来产生。将炭疽芽孢杆菌BH460用重组分子pSW4-HBL L2His转化，而经修饰的炭疽芽孢杆菌在2升FA培养液中过夜生长(～16h)时，产生151mg的纯HBL L2 His蛋白。

重组分子pSW4-HBL B His(绘于图9)通过将编码HBL B(包括其天然信号序列)的核酸分子和C末端6xHis标签可操作地连接于表达载体pSW4，从而使HBL B His的表达在炭疽芽孢杆菌pag启动子的调控下来产生。将炭疽芽孢杆菌BH460用重组分子pSW4-HBL B His转化，而经修饰的炭疽芽孢杆菌在2升FA培养液中过夜生长(～16h)时，产生75mg的纯HBL BHis蛋白。

通过以下步骤实现对相应蛋白质的纯化：在2M硫酸铵将蛋白质吸附到苯基-Sepharose；用0.3M硫酸铵从苯基-Sepharose洗脱蛋白质；沉淀蛋白质，重悬并对5mMHEPES、0.5mM EDTA，pH 7.5透析，接着加载到Q-Sepharose柱上(GE Healthcare)；使用NaCl梯度(缓冲液A为20mM Tris-HCl，0.5mM EDTA，pH 8.0；缓冲液B为20mM Tris-HCl，0.5mMEDTA，pH 8.0，加上0.5M NaCl)从Q-Sepharose洗脱蛋白质；组合含蛋白质的级分并对5mMHEPES，0.5mM EDTA，pH 7.5透析，接着加载到羟基磷灰石(BioRad陶瓷型)柱上；从羟基磷灰石使用磷酸盐梯度(缓冲液A为0.02mM磷酸钾，pH 7.0，0.10M NaCl；缓冲液B为1M磷酸钾，pH7.0，0.10M NaCl)洗脱蛋白质；收集蛋白质峰；并在超滤装置上浓缩之前将纯蛋白透析。

实施例8.炭疽芽孢杆菌蛋白酶基因的遗传修饰

本实施例显示使用Flp-FRT重组酶系统对编码炭疽芽孢杆菌中蛋白酶蛋白的基因的遗传修饰导致相应蛋白质的截短，并产生不再表达这类活性蛋白酶的炭疽芽孢杆菌菌株。

通过质谱分析菌株BH460的培养上清液以确定持续产生的哪种/些蛋白酶可能降解有价值的内源性蛋白质(例如为疫苗候选物的炭疽毒素蛋白)或异源性蛋白质。鉴定了两种另外的蛋白酶(GBAA_1995半胱氨酸蛋白酶CysP1和GBAA_4584微小胞外蛋白酶VpR)。编码这些蛋白酶的基因的至少一部分从炭疽芽孢杆菌BH460遗传缺失，导致炭疽芽孢杆菌BH480，其缺少8种活性蛋白酶，这是由导致相应编码蛋白的失活的对以下基因的遗传修饰所致：nprB、inhA2、tasA、calY、inhA1、mmpZ、cysP1和vpR。工程化到炭疽芽孢杆菌cysP1和vpR中的突变指示于图1C。

具体地，将酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Flp-FRT重组酶系统(Park,YN,等,2011,Yeast 28,673-681)改动为适用于炭疽芽孢杆菌cysP1和vpR基因缺失，其通过将酿酒酵母Flp重组酶和酿酒酵母FRT位点导入炭疽芽孢杆菌的基因组中；将FRT位点和Flp重组酶基因两者插入适合在炭疽芽孢杆菌中复制、表达和重组的载体中。该系统以类似于先前和本文中描述的Cre-loxP重组酶系统(Pomerantsev AP等,2009，同上)的方式使用。Flp-FRT方法允许使用Flp重组酶将cysP1和vpR基因两者用48-bp FRT位点替换。将FRT位点和flp-基因均分别克隆到质粒pSCF和pFPAS中，其记载于表3。在cysP1和vpR基因的遗传修饰中使用的其他质粒包括质粒pCysP1LI、pCysP1RI、pVpRLI和pVpRRI，其记载于表3。将引物对1995 seqF和1995 seqR用于验证cysP1基因破坏；而引物对4584 seqF和4584 seqR用于验证vpR基因破坏。表5提供确认CysP1和VpR蛋白酶在炭疽芽孢杆菌BH480菌株的分泌组中缺失的质谱(MS)分析。

表5.对炭疽芽孢杆菌BH460和炭疽芽孢杆菌BH480上清液中CysP1和VpR蛋白酶的MS-肽命中。

蛋白酶	BH460	BH480
			GBAA_1995_CysP1	69	0
GBAA_4584_VpR	36	0

表10显示与炭疽芽孢杆菌BH460的相比，CysP1和VpR蛋白酶不存在于炭疽芽孢杆菌BH480的上清液中。

如上文描述的检查BH480的上清液，并鉴定出几种另外的蛋白酶：(GBAA_2183中性金属蛋白酶NprC、GBAA_5414丝氨酸蛋白酶SprA、GBAA_3660丝氨酸蛋白酶HtrA和蛋白酶体HslV的GBAA_3968原核同源物)。

实施例9.炭疽芽孢杆菌BH480的完整EF、LF和uPA蛋白的产生

本实施例显示通过实施方案的经修饰的炭疽芽孢杆菌，即经编码多种EF蛋白的重组分子转化的炭疽芽孢杆菌BH480的EF蛋白产生。还显示完整LF和uPA蛋白的产生。

将炭疽芽孢杆菌BH480用重组分子pSJ136EFOS以类似于如本文中描述的用重组分子pSJ136EFOS转化炭疽芽孢杆菌BH460的方式转化。还将炭疽芽孢杆菌BH480用重组分子pSJ136EF-His、重组pSJ136EF-Cys、或重组分子pSJ136EF-NEHY转化，其与pSJ136EFOS相同，只不过它们编码在N末端序列中具有如表6中指示的小修饰的成熟EF蛋白。

表6.重组分子和由这类重组分子编码的蛋白质

重组分子	编码的EF蛋白	EF蛋白的N末端
			pSJ136EFOS	EFOS(SEQ ID NO:64)	MNEHY...
pSJ136EF-His	EF-His(SEQ ID NO:93)	HNEHY...
			pSJ136EF-Cys	EF-Cys(SEQ ID NO:94)	CNEHY...
pSJ136EF-NEHY	EF-NEHY(SEQ ID NO:95)	NEHY...

将用pSJ136EFOS、pSJ136EF-His、pSJ136EF-Cys或pSJ136EF-NEHY转化的炭疽芽孢杆菌菌株接种到10ml FA培养基中，其包含10微克每ml(μg/ml)的卡那霉素。通过天然Phast凝胶(天然8-25％丙烯酰胺梯度)分析显示每份样品的蛋白质产生，蛋白质通过考马斯蓝染色。结果显示于图10。结果指示通过用pSJ136EFOS、pSJ136EF-His、pSJ136EF-Cys、或pSJ136EF-NEHY转化的炭疽芽孢杆菌BH480的完整EF蛋白的产生，如分别在图10的第4、6、7和8道显示的。

图10还显示完整的尿激酶血纤蛋白溶解酶原激活剂(uPA)变体PA-U2f(第1道)和PA-U7f(第2道)的产生，其分别通过用编码PA-U2f和PA-U7f的pYS5质粒转化并如本文所述培养的炭疽芽孢杆菌BH480；PA-U2、PA-U7、和包含编码这类蛋白的核酸分子的重组分子记载于2001年3月29日公布的国际公开文本No.WO 01/21656；PA-U2f和PA-U7f缺少存在于PA-U2和PA-U7的C末端丝氨酸。

图10，第3道显示通过用pSJ115-LF-OS转化并如本文描述培养的炭疽芽孢杆菌BH480的完整的成熟致死因子(LF-OS)产生。第5道显示用pSJ136 Hfq1-FLAG转化并如本文描述培养的炭疽芽孢杆菌BH480未产生可检测量的蛋白质。Hfq1-FLAG是具有C末端FLAG标签的小RNA伴侣Hfq1。

实施例10.通过炭疽芽孢杆菌BH480的完整重组蛋白质的产生

本实施例显示通过实施方案的经修饰炭疽芽孢杆菌的重组蛋白的产生。

如下产生完整的融合蛋白LFnBlaY：将炭疽芽孢杆菌BH480用包含编码LFnBlaY的pSJ115质粒的重组分子转化。LFnBlaY是炭疽芽孢杆菌致死因子LFn对蜡样芽孢杆菌beta-内酰胺酶(BlaY)的融合蛋白，其具有由SEQ ID NO:91代表的氨基酸序列。在大肠杆菌中产生的类似的融合蛋白LF-BLA记载于Hobson JP等,2006,Nature Methods 3,259-261。如本文中描述的培养经修饰的炭疽芽孢杆菌并纯化LFnBlaY。2升制备物得到184mg完整的LFnBlaY，其纯度显示于图11第4道和第5道，并与来自大肠杆菌的LF-BLA(第3道)的纯度比较。

如下产生完整的保护性抗原(PA)变体PA-SNKE-deltaFF-E308D：将炭疽芽孢杆菌BH480用包含编码PA-SNKE-deltaFF-E308D的pYS5质粒的重组分子转化。PA-SNKE-deltaFF-E308D记载于Ramirez DM等,2002,J Industrial Microbiology&Biotechnology 28,232-238。PA变体的氨基酸序列由氨基酸序列SEQ ID NO:92代表。培养经修饰的炭疽芽孢杆菌并纯化PA-SNKE-deltaFF-E308D，其使用类似于在2004年4月22日公布的US 2004/0076638 A1中描述的那些技术。2升制备物得到122mg完整的PA-SNKE-deltaFF-E308D，其纯度显示于图5第2道。

本实施例连同本文中的其他实施例证明了炭疽芽孢杆菌BH460和炭疽芽孢杆菌BH480制备多种完整重组蛋白的能力。

实施例11.结论的汇总

这些实施例描述了将改进的Cre-loxP系统改动为适应于连续缺失炭疽芽孢杆菌中另外的编码蛋白酶的基因。它们还描述了每种蛋白酶在降解炭疽芽孢杆菌毒素组分和另一种潜在的病毒性因子anthrolysin O(ALO)中的作用(Shannon JG等,2003,Infect.Immun.71,3183-318)。

炭疽芽孢杆菌产生许多胞外蛋白酶，其影响炭疽芽孢杆菌分泌组中其他蛋白的完整性和产率。本研究显示从炭疽芽孢杆菌Ames 35菌株(pXO1⁺，pXO2^-)产生的anthrolysin O(ALO)和3种炭疽毒素蛋白保护性抗原(PA)、致死因子(LF)和水肿因子(EF)，由于蛋白酶作用在稳定期开始时就完全降解。将改进的Cre-loxP基因敲除系统用于连续缺失编码6种蛋白酶(NprB、InhA2、TasA、camelysin、InhA1和MmpZ)的基因。还显示了每种蛋白酶在降解炭疽芽孢杆菌毒素组分和ALO中的作用。在孢子形成缺陷性的pXO1⁺A35HMS突变体菌株(缺失6种蛋白酶)的上清液中炭疽毒素组分和ALO的水平显著增加并在24小时内保持稳定。该六重蛋白酶突变体菌株的无pXO1变体(称为BH460)提供改进的宿主菌株用于制备重组蛋白。例如，将BH460用于产生重组EF，其先前是难以从炭疽芽孢杆菌获得的。从BH460产生的EF蛋白具有先前从炭疽芽孢杆菌或大肠杆菌宿主纯化出的任意EF中最高的体内效力。推荐BH460作为有效的宿主菌株用于重组蛋白质产生，通常得到超过10mg纯蛋白每升培养物。

这些实施例还描述了将经修饰的酿酒酵母Flp-FRT重组酶系统成功改动为适应于缺失炭疽芽孢杆菌另外的编码蛋白酶的基因。将该系统用于使BH460中的CysP1和VpR蛋白酶失活，由此创建炭疽芽孢杆菌BH480。也推荐BH480作为有效的宿主菌株用于重组蛋白质产生，通常得到超过10mg纯完整蛋白每升培养物。在一些实施方案中，产率为超过50mg纯的完整蛋白每升培养物。在一些实施方案中，产率为超过90mg纯的完整蛋白每升培养物。

尽管已参照其具体的实施方案描述了本发明，但本领域技术人员应理解可进行各种变化且可用等同物取代而不背离本发明的真实精神和范围。另外，可进行许多修改以适应具体的情况、材料、物质组成、工艺、工艺步骤或步骤、目的、本发明的精神和范围。所有此类修改均意图落入权利要求的范围内。

Claims

1.一种炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)，其包含使金属蛋白酶M4家族的NprB蛋白酶失活的遗传修饰和使金属蛋白酶M6家族的蛋白酶失活的遗传修饰，其中所述M6家族的蛋白酶选自下组：InhA1、InhA2及其组合。

2.权利要求1的炭疽芽孢杆菌，其中所述炭疽芽孢杆菌包含使金属蛋白酶M73家族的蛋白酶失活的遗传修饰，其中所述M73家族的蛋白酶选自下组：camelysin、TasA及其组合。

3.权利要求2的炭疽芽孢杆菌，其中所述炭疽芽孢杆菌包含使锌依赖性金属蛋白酶ZnMc超家族的炭疽芽孢杆菌MmpZ蛋白酶失活的遗传修饰。

4.权利要求1-3中任一项的炭疽芽孢杆菌，其中所述炭疽芽孢杆菌包含M6家族的两种失活的蛋白酶。

5.权利要求2-3中任一项的炭疽芽孢杆菌，其中所述炭疽芽孢杆菌包含M73家族的两种失活的蛋白酶。

6.权利要求1的炭疽芽孢杆菌，其中所述炭疽芽孢杆菌包含使NprB蛋白酶失活的遗传修饰和使InhA1蛋白酶失活的遗传修饰。

7.权利要求6的炭疽芽孢杆菌，其中：

所述失活的NprB蛋白酶由在炭疽芽孢杆菌的基因座GBAA_0599处经遗传修饰的nprB基因编码；和

所述失活的InhA1蛋白酶由在炭疽芽孢杆菌的基因座GBAA_1295处经遗传修饰的inhA1基因编码。

8.权利要求1的炭疽芽孢杆菌，其中所述炭疽芽孢杆菌包含使NprB蛋白酶失活的遗传修饰、使camelysin蛋白酶失活的遗传修饰和使InhA1蛋白酶失活的遗传修饰。

9.权利要求8的炭疽芽孢杆菌，其中：

所述失活的NprB蛋白酶由在炭疽芽孢杆菌的基因座GBAA_0599处经遗传修饰的nprB基因编码；

所述失活的camelysin由在炭疽芽孢杆菌的基因座GBAA_1290处经遗传修饰的calY基因编码；和

10.权利要求1的炭疽芽孢杆菌，其中所述炭疽芽孢杆菌包含使NprB蛋白酶失活的遗传修饰、使TasA蛋白酶失活的遗传修饰、使camelysin蛋白酶失活的遗传修饰和使InhA1蛋白酶失活的遗传修饰。

11.权利要求10的炭疽芽孢杆菌，其中：

所述失活的TasA蛋白酶由在炭疽芽孢杆菌的基因座GBAA_1288处经遗传修饰的tasA基因编码；

12.权利要求1的炭疽芽孢杆菌，其中所述炭疽芽孢杆菌包含使NprB蛋白酶失活的遗传修饰、使InhA2蛋白酶失活的遗传修饰、使TasA蛋白酶失活的遗传修饰、使camelysin蛋白酶失活的遗传修饰和使InhA1蛋白酶失活的遗传修饰。

13.权利要求12的炭疽芽孢杆菌，其中：

所述失活的InhA2蛋白酶由在炭疽芽孢杆菌的基因座GBAA_0672处经遗传修饰的inhA2基因编码；

14.权利要求1的炭疽芽孢杆菌，其中所述炭疽芽孢杆菌包含使NprB蛋白酶失活的遗传修饰、使InhA2蛋白酶失活的遗传修饰、使TasA蛋白酶失活的遗传修饰、使camelysin蛋白酶失活的遗传修饰、使InhA1蛋白酶失活的遗传修饰和使MmpZ蛋白酶失活的遗传修饰。

15.权利要求14的炭疽芽孢杆菌，其中：

所述失活的camelysin由在炭疽芽孢杆菌的基因座GBAA_1290处经遗传修饰的calY基因编码；

所述失活的InhA1蛋白酶由在炭疽芽孢杆菌的基因座GBAA_1295处经遗传修饰的inhA1基因编码；和

所述失活的MmpZ蛋白酶由在炭疽芽孢杆菌的基因座GBAA_3159处经遗传修饰的mmpZ基因编码。

16.权利要求1的炭疽芽孢杆菌，其中所述炭疽芽孢杆菌缺少SinR和SinI调节蛋白。

17.权利要求10-16中任一项的炭疽芽孢杆菌，其中所述炭疽芽孢杆菌的基因组从tasA基因至inhA1基因缺失。

18.权利要求10-16中任一项的炭疽芽孢杆菌，其中所述炭疽芽孢杆菌的基因组从编码SEQ ID NO:9的氨基酸残基63的密码子到编码SEQ ID NO:17的氨基酸残基402的密码子缺失。

19.权利要求1的炭疽芽孢杆菌，其中所述炭疽芽孢杆菌包含选自下组的遗传修饰：使BA1995蛋白酶失活的遗传修饰、使VpR蛋白酶失活的遗传修饰、使BA5414蛋白酶失活的遗传修饰及其组合。

20.权利要求19的炭疽芽孢杆菌，其中所述炭疽芽孢杆菌包含使NprB蛋白酶失活的遗传修饰、使InhA2蛋白酶失活的遗传修饰、使TasA蛋白酶失活的遗传修饰、使camelysin蛋白酶失活的遗传修饰、使InhA1蛋白酶失活的遗传修饰、使MmpZ蛋白酶失活的遗传修饰、和选自下组的遗传修饰：使BA1995蛋白酶失活的遗传修饰、使VpR蛋白酶失活的遗传修饰、使BA5414蛋白酶失活的遗传修饰及其组合。

21.权利要求1的炭疽芽孢杆菌，其中所述炭疽芽孢杆菌是孢子形成缺陷性的。

22.权利要求21的炭疽芽孢杆菌，其中所述炭疽芽孢杆菌包含使Spo0A蛋白失活的遗传修饰。

23.权利要求22的炭疽芽孢杆菌，其中所述失活的Spo0A蛋白由位于炭疽芽孢杆菌的基因座GBAA_4394处的spo0A基因编码。

24.权利要求1的炭疽芽孢杆菌，其中所述炭疽芽孢杆菌缺少病毒性质粒pXO1。

25.权利要求1的炭疽芽孢杆菌，其中所述炭疽芽孢杆菌缺少病毒性质粒pXO1和pXO2。

26.权利要求1的炭疽芽孢杆菌，其中所述炭疽芽孢杆菌包含使选自下组的蛋白酶失活的遗传修饰：转谷氨酰胺酶样超家族的CysP1蛋白酶、肽酶家族S8的VpR蛋白酶及其组合。

27.权利要求1的炭疽芽孢杆菌，其中所述炭疽芽孢杆菌包含使CysP1蛋白酶失活的遗传修饰和使VpR蛋白酶失活的遗传修饰。

28.权利要求1的炭疽芽孢杆菌，其中所述炭疽芽孢杆菌包含使NprB蛋白酶失活的遗传修饰、使InhA2蛋白酶失活的遗传修饰、使TasA蛋白酶失活的遗传修饰、使camelysin蛋白酶失活的遗传修饰、使InhA1蛋白酶失活的遗传修饰、使MmpZ蛋白酶失活的遗传修饰、使CysP1蛋白酶失活的遗传修饰和使VpR蛋白酶失活的遗传修饰。

29.权利要求28的炭疽芽孢杆菌，其中：

所述失活的InhA1蛋白酶由在炭疽芽孢杆菌的基因座GBAA_1295处经遗传修饰的inhA1基因编码；

所述失活的MmpZ蛋白酶由在炭疽芽孢杆菌的基因座GBAA_3159处经遗传修饰的mmpZ基因编码；

所述失活的CysP1蛋白酶由在炭疽芽孢杆菌的基因座GBAA_1995处经遗传修饰的cysP1基因编码；和

所述失活的VpR蛋白酶由在炭疽芽孢杆菌的基因座GBAA_4584处经遗传修饰的vpR基因编码。

30.权利要求1的炭疽芽孢杆菌，其中所述炭疽芽孢杆菌包含选自下组的遗传修饰：使NprC蛋白酶失活的遗传修饰、使SprA蛋白酶失活的遗传修饰、使HtrA蛋白酶失活的遗传修饰、使HsIV蛋白酶失活的遗传修饰及其组合。

31.权利要求1的炭疽芽孢杆菌，其中所述炭疽芽孢杆菌包含使NprB蛋白酶失活的遗传修饰、使InhA2蛋白酶失活的遗传修饰、使TasA蛋白酶失活的遗传修饰、使camelysin蛋白酶失活的遗传修饰、使InhA1蛋白酶失活的遗传修饰、使MmpZ蛋白酶失活的遗传修饰、使CysP1蛋白酶失活的遗传修饰、使VpR蛋白酶失活的遗传修饰、和选自下组的遗传修饰：使NprC蛋白酶失活的遗传修饰、使SprA蛋白酶失活的遗传修饰、使HtrA蛋白酶失活的遗传修饰、使HsIV蛋白酶失活的遗传修饰及其组合。

32.权利要求26-31中任一项的炭疽芽孢杆菌，其中所述炭疽芽孢杆菌缺少SinR和SinI调节蛋白。

33.权利要求26-31中任一项的炭疽芽孢杆菌，其中所述炭疽芽孢杆菌的基因组从tasA基因至inhA1基因缺失。

34.权利要求26-31中任一项的炭疽芽孢杆菌，其中所述炭疽芽孢杆菌的基因组从编码SEQ ID NO:9的氨基酸残基63的密码子到编码SEQ ID NO:17的氨基酸残基402的密码子缺失。

35.权利要求26-31中任一项的炭疽芽孢杆菌，其中所述炭疽芽孢杆菌是孢子形成缺陷性的。

36.权利要求35的炭疽芽孢杆菌，其中所述炭疽芽孢杆菌包含使Spo0A蛋白失活的遗传修饰。

37.权利要求36的炭疽芽孢杆菌，其中所述失活的Spo0A蛋白由位于炭疽芽孢杆菌的基因座GBAA_4394处的spo0A基因编码。

38.权利要求26-31，36-37中任一项的炭疽芽孢杆菌，其中所述炭疽芽孢杆菌缺少病毒性质粒pXO1。

39.权利要求26-31，36-37中任一项的炭疽芽孢杆菌，其中所述炭疽芽孢杆菌缺少病毒性质粒pXO1和pXO2。

40.权利要求1的炭疽芽孢杆菌，其中所述遗传修饰选自下组：缺失、插入、倒置、取代、衍生化及其组合，其中所述遗传修饰影响编码所述蛋白质的基因中的一个或多个核苷酸。

41.权利要求1的炭疽芽孢杆菌，其中所述遗传修饰选自下组：编码蛋白质的基因中一个或多个核苷酸的缺失、编码蛋白质的基因中一个或多个核苷酸的插入或其组合。

42.一种炭疽芽孢杆菌，其包含：

一种使NprB蛋白酶失活的遗传修饰，其中所述失活的NprB蛋白酶由在炭疽芽孢杆菌的基因座GBAA_0599处经遗传修饰的nprB基因编码；

一种使InhA2蛋白酶失活的遗传修饰，其中所述失活的InhA2蛋白酶由在炭疽芽孢杆菌的基因座GBAA_0672处经遗传修饰的inhA2基因编码；

一种使TasA蛋白酶失活的遗传修饰，其中所述失活的TasA蛋白酶由在炭疽芽孢杆菌的基因座GBAA_1288处经遗传修饰的tasA基因编码；

一种使camelysin失活的遗传修饰，其中所述失活的camelysin由在炭疽芽孢杆菌的基因座GBAA_1290处经遗传修饰的calY基因编码；

一种使InhA1蛋白酶失活的遗传修饰，其中所述失活的InhA1蛋白酶由在炭疽芽孢杆菌的基因座GBAA_1295处经遗传修饰的inhA1基因编码；

一种使MmpZ蛋白酶失活的遗传修饰，其中所述失活的MmpZ蛋白酶由在炭疽芽孢杆菌的基因座GBAA_3159处经遗传修饰的mmpZ基因编码；和

一种使Spo0A蛋白失活的遗传修饰，其中所述失活的Spo0A蛋白由在炭疽芽孢杆菌的基因座GBAA_4394处经遗传修饰的spo0A基因编码，

其中所述炭疽芽孢杆菌缺少病毒性质粒pXO1和pXO2。

43.一种炭疽芽孢杆菌，其包含：

一种使CysP1蛋白酶失活的遗传修饰，其中所述失活的CysP1蛋白酶由在炭疽芽孢杆菌的基因座GBAA_1995处经遗传修饰的cysP1基因编码；

一种使VpR蛋白酶失活的遗传修饰，其中所述失活的VpR蛋白酶由在炭疽芽孢杆菌的基因座GBAA_4584处经遗传修饰的vpR基因编码；

和

其中所述炭疽芽孢杆菌缺少病毒性质粒pXO1和pXO2。

44.一种产生权利要求1的炭疽芽孢杆菌的方法，包括遗传修饰炭疽芽孢杆菌以使金属蛋白酶M4家族的NprB蛋白酶失活并使金属蛋白酶M6家族的蛋白酶失活。

45.一种产生权利要求2的炭疽芽孢杆菌的方法，包括遗传修饰炭疽芽孢杆菌以使金属蛋白酶M4家族的NprB蛋白酶失活、使金属蛋白酶M6家族的蛋白酶失活、并使金属蛋白酶M73家族的蛋白酶失活。

46.一种产生权利要求3的炭疽芽孢杆菌的方法，包括遗传修饰炭疽芽孢杆菌以使金属蛋白酶M4家族的NprB蛋白酶失活、使金属蛋白酶M6家族的蛋白酶失活、使金属蛋白酶M73家族的蛋白酶失活、并使锌依赖性金属蛋白酶ZnMc超家族的MmpZ蛋白酶失活。

47.一种产生权利要求30的炭疽芽孢杆菌的方法，包括遗传修饰炭疽芽孢杆菌以使金属蛋白酶M4家族的NprB蛋白酶失活、使金属蛋白酶M6家族的蛋白酶失活、使金属蛋白酶M73家族的蛋白酶失活、使锌依赖性金属蛋白酶ZnMc超家族的MmpZ蛋白酶失活、使转谷氨酰胺酶样超家族的CysP1蛋白酶失活、并使肽酶家族S8的VpR蛋白酶失活。

48.一种产生权利要求1-47中任一项的炭疽芽孢杆菌的方法，包括：

在培养基中培养所述炭疽芽孢杆菌；和

回收所述炭疽芽孢杆菌。

49.一种用编码产物的重组分子转化的经修饰的炭疽芽孢杆菌，其中：

所述炭疽芽孢杆菌包含使金属蛋白酶M4家族的NprB蛋白酶失活的遗传修饰和使金属蛋白酶M6家族的蛋白酶失活的遗传修饰，其中所述M6家族的蛋白酶选自下组：InhA1、InhA2及其组合，且

所述重组分子包含编码所述产物的核酸分子可操作地连接于表达载体。

50.权利要求49的经修饰的炭疽芽孢杆菌，其中所述炭疽芽孢杆菌包含使金属蛋白酶M73家族的蛋白酶失活的遗传修饰，其中所述M73家族的蛋白酶选自下组：camelysin、TasA及其组合。

51.权利要求50的经修饰的炭疽芽孢杆菌，其中所述炭疽芽孢杆菌包含使锌依赖性金属蛋白酶ZnMc超家族的MmpZ蛋白酶失活的遗传修饰。

52.权利要求51的经修饰的炭疽芽孢杆菌，其中所述炭疽芽孢杆菌包含使转谷氨酰胺酶样超家族的CysP1蛋白酶失活和使肽酶家族S8的VpR蛋白酶失活的遗传修饰。

53.权利要求49的经修饰的炭疽芽孢杆菌，其中所述炭疽芽孢杆菌包括用重组分子转化的权利要求1-52中任一项的炭疽芽孢杆菌。

54.权利要求49的经修饰的炭疽芽孢杆菌，其中所述产物选自下组：蛋白质、氨基酸、核酸分子、经由重组生物合成途径产生的化合物、小分子、药物、维生素、药物缀合物、和肽核酸缀合物。

55.权利要求49的经修饰的炭疽芽孢杆菌，其中所述产物是毒素。

56.权利要求55的经修饰的炭疽芽孢杆菌，其中所述毒素选自下组：炭疽毒素、霍乱毒素、白喉毒素、溶血素、蓖麻素蛋白、假单胞菌(Pseudomonas)毒素、杜克雷嗜血杆菌(Haemophilus ducreyi)毒素、大肠杆菌(Escherichia coli)毒素、核糖体失活蛋白(RIP)毒素。

57.权利要求49的经修饰的炭疽芽孢杆菌，其中所述产物选自下组：炭疽水肿因子(EF)、炭疽致死因子(LF)、炭疽保护性抗原(PA)、anthrolysin(ALO)及其组合。

58.权利要求49的经修饰的炭疽芽孢杆菌，其中所述产物包含炭疽水肿因子。

59.权利要求58的经修饰的炭疽芽孢杆菌，其中所述产物包含完整的炭疽水肿因子。

60.权利要求49的经修饰的炭疽芽孢杆菌，其中所述产物包含选自下组的蛋白质：炭疽致死因子和炭疽保护性抗原。

61.权利要求60的经修饰的炭疽芽孢杆菌，其中所述产物包含完整的蛋白质。

62.权利要求49的经修饰的炭疽芽孢杆菌，其中所述产物包含蜡样芽胞杆菌(Bacilluscereus)溶血素HBL。

63.权利要求62的经修饰的炭疽芽孢杆菌，其中所述产物选自下组：蜡样芽胞杆菌溶血素HBL L1、蜡样芽胞杆菌溶血素HBL L2、蜡样芽胞杆菌溶血素HBL B及其组合。

64.权利要求55的经修饰的炭疽芽孢杆菌，其中所述毒素缀合于肿瘤靶物。

65.权利要求49的经修饰的炭疽芽孢杆菌，其中所述产物包含炭疽芽孢杆菌anthrolysin。

66.一种产生产物的方法，包括：

在培养基中培养权利要求49的经修饰的炭疽芽孢杆菌以产生所述产物；并回收所述产物。

67.权利要求30的炭疽芽孢杆菌，其中所述炭疽芽孢杆菌包含使NprB蛋白酶失活的遗传修饰、使InhA2蛋白酶失活的遗传修饰、使TasA蛋白酶失活的遗传修饰、使camelysin蛋白酶失活的遗传修饰、使InhA1蛋白酶失活的遗传修饰、使MmpZ蛋白酶失活的遗传修饰、使CysP1蛋白酶失活的遗传修饰、使VpR蛋白酶失活的遗传修饰、以及使NprC蛋白酶失活的遗传修饰。

68.权利要求67的炭疽芽孢杆菌，其中：

所述失活的MmpZ蛋白酶由在炭疽芽孢杆菌的基因座GBAA_3159处经遗传修饰的mmpZ基因编码；和

所述失活的CysP1蛋白酶由在炭疽芽孢杆菌的基因座GBAA_1995处经遗传修饰的cysP1基因编码；

所述失活的VpR蛋白酶由在炭疽芽孢杆菌的基因座GBAA_4584处经遗传修饰的vpR基因编码；和

所述失活的NprC蛋白酶由在炭疽芽孢杆菌的基因座GBAA_2183处经遗传修饰的nprC基因编码。

69.权利要求30的炭疽芽孢杆菌，其中所述炭疽芽孢杆菌包含使NprB蛋白酶失活的遗传修饰、使InhA2蛋白酶失活的遗传修饰、使TasA蛋白酶失活的遗传修饰、使camelysin蛋白酶失活的遗传修饰、使InhA1蛋白酶失活的遗传修饰、使MmpZ蛋白酶失活的遗传修饰、使CysP1蛋白酶失活的遗传修饰、使VpR蛋白酶失活的遗传修饰、使NprC蛋白酶失活的遗传修饰，以及使SprA蛋白酶失活的遗传修饰。

70.权利要求69的炭疽芽孢杆菌，其中：

所述失活的VpR蛋白酶由在炭疽芽孢杆菌的基因座GBAA_4584处经遗传修饰的vpR基因编码；

所述失活的NprC蛋白酶由在炭疽芽孢杆菌的基因座GBAA_2183处经遗传修饰的nprC基因编码；和

所述失活的SprA蛋白酶由在炭疽芽孢杆菌的基因座GBAA_5414处经遗传修饰的sprA基因编码。

71.权利要求30的炭疽芽孢杆菌，其中所述炭疽芽孢杆菌包含使NprB蛋白酶失活的遗传修饰、使InhA2蛋白酶失活的遗传修饰、使TasA蛋白酶失活的遗传修饰、使camelysin蛋白酶失活的遗传修饰、使InhA1蛋白酶失活的遗传修饰、使MmpZ蛋白酶失活的遗传修饰、使CysP1蛋白酶失活的遗传修饰、使VpR蛋白酶失活的遗传修饰、使NprC蛋白酶失活的遗传修饰，使SprA蛋白酶失活的遗传修饰、以及使HtrA蛋白酶失活的遗传修饰。

72.权利要求71的炭疽芽孢杆菌，其中：

所述失活的NprC蛋白酶由在炭疽芽孢杆菌的基因座GBAA_2183处经遗传修饰的nprC基因编码；

所述失活的SprA蛋白酶由在炭疽芽孢杆菌的基因座GBAA_5414处经遗传修饰的sprA基因编码；和

所述失活的HtrA蛋白酶由在炭疽芽孢杆菌的基因座GBAA_3660处经遗传修饰的htrA基因编码。