ES2375361T3 - Genes involucrados en la tolerancia al estrés por el medio ambiente. - Google Patents

Abstract

Un ácido polinucleico aislado como se identifica por: (a) SEQ ID NO 73, o la hebra complementaria de la misma; (b) secuencias de ácidos polinucleicos que hibridan a la secuencia definida en (a); o, (c) secuencias de ácidos polinucleicos que se degeneran como resultado del código genético para la secuencia de ácido polinucleico definida en (a) o (b); en donde el ácido polinucleico de (a) a (c) codifica un polipéptido de la SEQ ID NO: 74.

Description

Genes involucrados en la tolerancia al estrés por el medio ambiente

La presente invención se relaciona con biología molecular, en particular biología molecular de plantas. En particular, la invención se relaciona con mejoras de la productividad de cultivos de plantas útiles. Una de las limitaciones principales de la productividad de los cultivos es el efecto de las condiciones de estrés del medio ambiente en el crecimiento y desarrollo de la planta. Una meta importante de la biología molecular es la identificación y aislamiento de genes que pueden proporcionar resistencia o tolerancia a tal estrés. Para la agricultura, la creación de plantas transgénicas que contienen tales genes proporciona el potencial para mejorar la resistencia o tolerancia al estrés de las plantas.

La sequía, la carga salina, y el congelamiento son tensiones que provocan efectos adversos en el crecimiento de las plantas y la productividad de los cultivos. La respuesta fisiológica a estas tensiones surge de cambios en la expresión génica celular. La expresión de un número de genes ha demostrado que se induce por estas tensiones (Zhu et al., 1997; Shinozaki et al., 1996; Thomashow, 1994). Los productos de estos genes se pueden clasificar en dos grupos: aquellos que protegen directamente contra el estrés del medio ambiente y aquellos que regulan la expresión génica y la transducción de señal en la respuesta al estrés. El primer grupo incluye proteínas que funcionan probablemente al proteger las células de la deshidratación, tal como las enzimas requeridas para la biosíntesis de diversos osmoprotectores, proteínas abundantes en la embriogenia tardía (LEA), proteínas anticongelantes, chaperones, y enzimas de desintoxicación (Shinozaki et al., 1997, Ingram et al., 1996, Bray et al., 1997). El segundo grupo de productos de gen incluye factores de transcripción, proteínas quinasas, y enzimas involucradas en el metabolismo de fosfoinositida (Shinozaki et al., 1997). También se da un repaso de los métodos conocidos para mejorar la tolerancia al estrés en las plantas en Holmberg & Bülow, (1998).

Se necesitan definitivamente estudios adicionales para dar una idea de los mecanismos implicados en la respuesta de la planta a las condiciones de estrés del medio ambiente.

El estudio de las plantas adaptadas de forma natural a disecación extrema ha llevado a la hipótesis que la información genética para las condiciones de tolerancia al estrés del medio ambiente existe en todas las plantas mayores. En los glicofitos, esta información solo se expresaría en semillas y granos de polen que experimentan un proceso de disecación.

La inducción de osmotolerancia en las plantas es muy importante para la productividad de cultivo: 30 a 50 % de la tierra bajo irrigación se afecta actualmente por la salinidad. Diversas evidencias también demuestran que las condiciones moderadas al estrés del medio ambiente a través de la estación de crecimiento tienen un impacto negativo en el crecimiento de la planta y la productividad de cultivo. Por ejemplo se sabe que incluso limitaciones menores en la disponibilidad del agua provocan un índice fotosintético reducido. Lluvias impredecibles, aumento de la salinidad en el suelo al inicio y al final de la estación de crecimiento resultan frecuentemente en crecimiento de la planta y productividad de cultivo reducidos. Estos factores ambientales comparten por lo menos un elemento de estrés y que es el déficit de agua o deshidratación. La sequía es un problema significativo en la agricultura de hoy. Durante los últimos 40 años, por ejemplo, la sequía representó el 74 % de pérdidas totales de cultivos de maíz en los Estados Unidos. Para sostener la productividad bajo condiciones medio ambientales adversas, es importante proporcionar cultivos con una base genética para hacer frente al déficit de agua, por ejemplo mediante la reproducción de mecanismos de tolerancia y retención de agua en cultivos ya que estos pueden crecer y producir bajo estas condiciones adversas.

Es un objetivo de la presente invención proporcionar nuevos genes de planta, más particularmente genes de planta que proporcionan el potencial de mejorar las condiciones de tolerancia al estrés osmótico en las plantas.

También es un objetivo de la presente invención proporcionar polipéptidos codificados mediante dichos nuevos genes de planta.

Es un objetivo adicional de la presente invención proporcionar métodos para producir plantas con condiciones mejoradas de tolerancia o resistencia al estrés osmótico con base en dichos nuevos genes.

También es un objeto de la presente invención proporcionar ácidos polinucleicos recombinantes que comprenden dichos nuevos genes.

Es un objeto adicional de la presente invención proporcionar células de planta y plantas transformadas con dichos nuevos genes.

Es un objeto adicional de la presente invención proporcionar células de planta y plantas con condiciones mejoradas de tolerancia o resistencia al estrés osmótico.

La presente invención proporciona materia objeto como se establece en uno y todos los (i) a (xv) adelante:

(i)

Un ácido polinucleico aislado como se identifica por:

(a)

SEQ ID NO 73, o la hebra complementaria de la misma;

(b)

secuencias de ácido polinucleico que hibridan a la secuencia definida en (a); o,

(c)

secuencias de ácido polinucleico que se degeneran como resultado del código genético para la secuencia de ácido polinucleico definida en (a) o (b);

en donde el ácido polinucleico de (a) a (c) codifica un polipéptido de la SEQ ID NO: 74.

(ii)

Un polipéptido aislado que tiene la secuencia de la SEQ ID NO 74.

(iii) Un método para producir una planta con tolerancia o resistencia mejorada al estrés osmótico, dicho método comprende introducir transitoriamente en una célula de planta un ADN recombinante aislado que comprende:

-

un ácido polinucleico de o como se define en (i), y

-

un promotor heterólogo que se puede expresar en la planta, por lo que dicho ácido polinucleico está en la misma unidad transcripcional y bajo el control de dicho promotor heterólogo que se puede expresar en la planta, por lo que dicho ácido polinucleico se expresa en una cantidad efectiva para conferir tolerancia o resistencia mejorada al estrés osmótico.

(iv) Un método para producir una planta con tolerancia o resistencia mejorada al estrés osmótico, dicho método comprende introducir establemente en una célula de planta un ADN recombinante aislado que comprende:

-

un ácido polinucleico de o como se define en (i), y

-

un promotor heterólogo que se puede expresar en la planta,

por lo que dicho ácido polinucleico está en la misma unidad transcripcional y bajo el control de dicho promotor heterólogo que se puede expresar en la planta, por lo que dicho ácido polinucleico se expresa en una cantidad efectiva para conferir tolerancia o resistencia mejorada al estrés osmótico.

(v)

Un ácido polinucleico recombinante que comprende: un ácido polinucleico de acuerdo con o como se define en (i), y, un promotor heterólogo que se puede expresar en la planta, por lo que dicho ácido polinucleico está en la misma

unidad transcripcional y bajo el control de dicho promotor heterólogo que se puede expresar en la planta.

(vi)

El ácido polinucleico recombinante de (v) en donde dicho promotor heterólogo que se puede expresar en la planta es un promotor constitutivo.

(vii) El ácido polinucleico recombinante de (v) en donde dicho promotor heterólogo que se puede expresar en la planta es un promotor específico de tejido o de órgano o que puede inducir estrés.

(viii) El ácido polinucleico recombinante de (v) en donde dicho promotor heterólogo que se puede expresar en la planta es el promotor 35S de CaMV.

(ix)

Una célula anfitriona recombinante transformada con y que comprende el ácido polinucleico recombinante de (v).

(x)

una célula de planta transformada con y que comprende un ácido polinucleico recombinante de (v).

(xi)

una planta que consiste esencialmente de células de planta de (x).

(xii) Un callo que consiste esencialmente de células de planta de (x).

(xiii) Una parte cosechable, órgano, tejido o material de propagación de una planta de (xi), que comprende el ácido polinucleico recombinante de (v).

(xiv) El uso de un ácido polinucleico recombinante de (v) para producir plantas transgénicas.

(xv) Una composición que comprende una secuencia de ácido polinucleico de o como se define en (i).

La materia objeto proporcionada por la invención así pertenece específicamente a la divulgación, descripción y enseñanza de la presente especificación.

La presente especificación también describe un método para obtener ácidos polinucleicos que comprenden las secuencias codificantes y/o genes involucrados en el estrés del medio ambiente en las plantas, que comprende la preparación de una colección de cADN que comprende las secuencias codificantes de silicuas, introducir dichas secuencias codificantes en células de levadura en un formato funcional y detectar ácidos polinucleicos que conducen a condiciones mejoradas de tolerancia o resistencia al estrés del medio ambiente en dichas células de levadura transformadas.

Se ha encontrado que la transferencia de genes de plantas que son frecuentemente difíciles de ensayar para ciertas características, eucariotes inferiores, tales como levaduras y hongos, pero en particular levadura, especialmente Saccharomyces, es relativamente fácil de lograr, por lo cual ahora ha mostrado que los resultados de prueba de tolerancia o resistencia a las condiciones del medio ambiente en las células de levadura resultantes da una medición relativamente confiable de la capacidad de la secuencia de codificación insertada o gen para inducir tolerancia o resistencia al estrés del medio ambiente en las plantas. Así la expresión de las secuencias de ácidos polinucleicos que comprenden el gen o que codifican la secuencia que son responsables de inducir tolerancia o resistencia a condiciones de estrés del medio ambiente se puede mejorar en las especies de planta de las cuales se origina o en cualquier otra especie de planta.

En el presente contexto el término "que mejora" se puede entender que significa que los niveles de las moléculas correlacionadas con protección al estrés en una célula de planta transformada, tejido de planta o parte de planta será "sustancialmente aumentada" o "elevada" significa que este nivel será mayor que los niveles en una planta no transformada.

Esto se puede lograr al inducir la sobreexpresión de la información genética adecuada que ya está presente, o mediante cualesquier otros medios adecuados para introducir dentro de la información heteróloga de la célula de planta que resulta en una capacidad para tolerar o resistir el estrés del medio ambiente.

El término "estrés del medio ambiente" se ha definido en diferentes formas en la técnica anterior y se superpone en gran parte con el término "estrés osmótico". Holmberg et al., 1998 por ejemplo define diferentes factores de estrés del medio ambiente que resultan en estrés abiótico. La salinidad, sequía, calor, enfriamiento y congelamiento se describen como ejemplos de las condiciones que inducen el estrés osmótico. El término "estrés del medio ambiente" como se utiliza en la presente especificación se refiere a cualquier efecto adverso en el metabolismo, crecimiento o viabilidad de la célula, tejido, semilla, órgano o planta completa que se produce mediante un factor de estrés del medio ambiente no biológico o sin vida. Más particularmente, también abarca factores ambientales tales como estrés al agua (inundación, sequía, deshidratación), estrés anaeróbico (nivel bajo de oxígeno, CO2 etc.), estrés aeróbico, estrés osmótico, estrés por salinidad, estrés por la temperatura (calor, frío, congelamiento, helada) o estrés por nutrientes/contaminantes.

El término "estrés anaeróbico" significa cualquier reducción en los niveles de oxígeno suficientes para producir un estrés como se definió aquí anteriormente, que incluye hipoxia y anoxia.

El término "estrés por inundación" se refiere a cualquier estrés que se asocia con o se induce mediante inmersión prolongada o transitoria de una planta, parte de planta, tejido o célula aislada en un medio líquido tal como ocurre durante monzón, estación húmeda, inundación repentina o irrigación excesiva de las plantas, etc.

"Estrés por frío" y "estrés por calor" son tensiones inducidas por temperaturas que están respectivamente, por encima o por debajo, del rango óptimo de temperaturas de crecimiento para una especie de planta particular. Tales rangos de temperatura de crecimiento óptimos se determinan fácilmente o se conocen por aquellos expertos en la técnica.

"Estrés por deshidratación" es cualquier estrés que se asocia con o se induce por la pérdida de agua, turgencia reducida o contenido reducido de agua de una célula, tejido, órgano o planta completa.

"Estrés por sequía" se refiere a cualquier estrés que se induce por o se asocia con la privación de agua o el suministro reducido de agua a una célula, tejido, órgano u organismo.

"Estrés por oxidación" se refiere a cualquier estrés que aumenta el nivel intracelular de especies reactivas de oxígeno.

Los términos "estrés inducido por salinidad", "estrés por salinidad" o término similar se refiere a cualquier estrés que se asocia con o se induce por concentraciones elevadas de sal y que resulta en una perturbación en el potencial osmótico del medio ambiente intracelular o extracelular de una célula.

Dicha sal puede ser por ejemplo, sales inorgánicas solubles en agua tales como sulfato de sodio, sulfato de magnesio, sulfato de calcio, cloruro de sodio, cloruro de magnesio, cloruro de calcio, cloruro de potasio etc., sales de fertilizantes agrícolas y sales asociadas con condiciones de suelo ácido o alcalino.

Las plantas transgénicas obtenidas de acuerdo con el método de la presente invención, luego de la presencia del ácido polinucleico y/o la secuencia reguladora introducida en dicha planta, logran resistencia, tolerancia o tolerancia

o resistencia mejorada contra estrés osmótico que es susceptible a la planta tipo natural correspondiente.

Los términos "tolerancia" y "resistencia" cubren el rango de protección de un retraso para completar la inhibición de la alteración en el metabolismo celular, crecimiento celular reducido y/o muerte celular provocada por las condiciones de estrés del medio ambiente definidas aquí anteriormente. Preferiblemente, la planta transgénica obtenida de acuerdo con el método de la presente invención es tolerante o resistente a las condiciones de estrés osmótico en el sentido que dicha planta es capaz de crecer sustancialmente normal bajo condiciones osmóticas en donde la planta tipo natural correspondiente muestra crecimiento, metabolismo, viabilidad, productividad y/o esterilidad de macho o hembra reducidos. Las metodologías para determinar el crecimiento de planta o respuesta al estrés incluyen, pero no se limitan a mediciones de altura, área de hoja, relaciones de agua planta, capacidad de florecimiento, capacidad de generar la progenie y producción o cualquier otra metodología conocida por aquellos expertos en la técnica.

Los términos "tolerancia" y "resistencia" se pueden utilizar intercambiablemente en la presente invención.

Los métodos de acuerdo con la invención como se establecen aquí se pueden aplicar a cualquier, planta mayor, preferiblemente cultivos importantes, preferiblemente a todas las células de una planta que conduce a una tolerancia mejorada al estrés osmótico. Por medio de las realizaciones como se establece aquí, ahora llega a ser posible hacer crecer cultivos con producción, crecimiento, desarrollo y productividad mejorados bajo condiciones de estrés osmótico, esto puede llegar a ser posible por ejemplo para hacer crecer cultivos en áreas en donde no pueden crecer sin la osmotolerancia inducida de acuerdo con la invención.

Con el fin de hacer una detección para los genes de planta relevantes y/o las secuencias codificantes, se prefiere aplicar un método como se describe en esta especificación por lo que dicha colección de cADN comprende copias esencialmente de todos los mARN de dicha célula de planta. Probablemente solo son suficientes las secuencias codificantes. Para la detección de los genes involucrados en el estrés del medio ambiente, se prefiere utilizar una colección de cADN de silicuas (frutos, que contienen las semillas maduras), tales como las silicuas de Arabidopsis, debido a que los genes involucrados en por ejemplo osmotolerancia se expresan preferencialmente en estos órganos.

Aunque se puede introducir información genética en levadura para detección mediante cualquier método adecuado, mientras está en un formato funcional suficientemente largo para probar las condiciones de tolerancia o resistencia al estrés del medio ambiente, se prefiere para facilitar la operación utilizar un vector bien conocido tal como un plásmido 2μ. Se prefiere tener la secuencia de codificación o el gen bajo control de un promotor de levadura constitutivo fuerte, para mejorar la buena expresión del gen o la secuencia de codificación de interés. Los promotores de levadura constitutivos fuertes son bien conocidos en la técnica e incluyen, pero no se limitan al promotor de levadura TPI.

El término "gen" como se utiliza aquí se refiere a cualquier secuencia de ADN que comprende diversos fragmentos de ADN ligados en forma operable tal como un promotor y una región no traducida 5’ (5’UTR), una región codificante (que puede o no puede codificar una proteína), y una región 3’ no traducida (3’UTR) que comprende un sitio de poliadenilación. Típicamente en células de planta, el 5’UTR, la región codificante y el 3’UTR (juntos denominados como la región de ADN transcrita) se transcriben en un ARN que, en el caso de un gen que codifica la proteína, se traduce dentro de una proteína. Un gen puede incluir fragmentos de ADN adicionales tales como, por ejemplo, intrones. Como se utiliza aquí, un locus genético está en la posición de un gen dado en el genoma de una planta.

La presente especificación también describe un ácido polinucleico aislado que se puede obtener por un método que comprende la preparación de un cADN como se estableció anteriormente que comprende las secuencias codificantes de silicuas, introducir dichas secuencias codificantes en células de levadura en un formato funcional y detectar los ácidos polinucleicos que conducen a condiciones mejoradas de tolerancia o resistencia al estrés del medio ambiente en dichas células de levadura transformadas.

El término "ácido polinucleico" se refiere a ADN o ARN, o versiones amplificadas de los mismos, o el complemento de los mismos.

La capacidad de un ácido polinucleico aislado para conferir condiciones de tolerancia o resistencia al estrés del medio ambiente se puede probar de acuerdo con métodos bien conocidos en la técnica, ver por ejemplo, Grillo et al. (1996), Peassarakli et al. (Editor), Nilsen et al. (1996), Shinozaki et al. (1999), Jones et al. (1989), Fowden et al. (1993) o como se describe en los Ejemplos adjuntos.

La presente invención se relaciona con más particularmente un ácido polinucleico aislado que codifica un polipéptido de la SEQ ID NO 74 que se selecciona de:

(a)

SEQ ID NO 73, o la hebra complementaria de la misma;

(b)

secuencias de ácidos polinucleicos que hibridan a la secuencia definida en (a) o

(c)

secuencias de ácidos polinucleicos que se degeneran como resultado del código genético para la secuencia de ácido polinucleico definida en (a) o (b).

Preferiblemente dichas secuencias de acuerdo con la parte (b) hibridan bajo condiciones exigentes a las secuencias de la parte (a).

El término "hibridar" se refiere a condiciones de hibridación como se describe en Sambrook (1989), preferiblemente se dirigen condiciones de hibridación específicas o exigentes.

Las condiciones exigentes son dependientes de la secuencia y serán diferentes en diferentes circunstancias. De manera general, se seleccionan condiciones exigentes que son aproximadamente 5° C menores que el punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia específica en una resistencia iónica y pH definidos. El Tm es la temperatura (bajo la resistencia iónica y pH definidos) en el que 50 % de la secuencia objetivo hibrida en una sonda perfectamente adaptada. Típicamente, las condiciones exigentes serán aquellas en las que la concentración de sal es aproximadamente 0.02 molar a pH 7 y la temperatura es por lo menos aproximadamente 60° C.

En la presente invención, el ADN genómico o ADN que comprende los ácidos polinucleicos de la invención se puede identificar en Southern blot estándar bajo condiciones exigentes utilizando las secuencias de cADN mostradas. La preparación de las colecciones de cADN y genómicas está dentro del alcance de la técnica. También se dan Ejemplos de las condiciones de hibridación en la sección de Ejemplos.

La presente especificación también describe un ácido polinucleico que comprende por lo menos parte de la SEQ ID NO 73 o por lo menos parte de un gen que es por lo menos 50 % idéntico, preferiblemente por lo menos 55 %, 60 %, 65 % o 70 % idéntico, más preferiblemente por lo menos 75 %, 80 % o idéntico, y más preferiblemente por lo menos 90 % o 95 % idéntico a la SEQ ID NO 73. Preferiblemente, dicho gen codifica la proteína que tiene sustancialmente la misma actividad biológica como la proteína que tiene la secuencia de la SEQ ID NO 74. Dicha parte de dicho gen es preferiblemente una parte única.

La presente especificación también describe el uso de un ácido polinucleico que comprende por lo menos parte de la SEQ ID NO 73 o por lo menos parte de la un gen que es por lo menos 50 % idéntico, preferiblemente por lo menos 55 %, 60 %, 65 % o 70 % idéntico, más preferiblemente por lo menos 75 %, 80 % o 85 % idéntico, y más preferiblemente por lo menos 90 % o 95 % idéntico a la SEQ ID NO 73 para la producción de plantas transgénicas que tienen condiciones mejoradas de tolerancia o resistencia al estrés del medio ambiente.

Preferiblemente, dicho gen codifica una proteína que tiene sustancialmente la misma actividad biológica que la proteína que tiene la secuencia de la SEQ ID NO 74. Dicha parte de dicho gen es preferiblemente una parte única.

Dos secuencias de ácido nucleico o los polipéptidos se dice que son "idénticos" de acuerdo con, la presente invención si la secuencia de nucleótidos o los residuos de aminoácido, respectivamente, en las dos secuencias es igual cuando se alinea para la correspondencia máxima como se describe adelante. El término "complementario con" se utiliza aquí para significar que la secuencia complementaria hibrida a todo o una porción de una secuencia de polinucleótidos dada.

Las comparaciones de secuencia entre dos (o más) secuencias de polipéptidos o ácido polinucleicos se realizan típicamente al comparar las secuencias de las dos secuencias sobre una "ventana de comparación" para identificar y comparar las regiones locales de similitud de secuencia. Una "ventana de comparación", como se utiliza aquí, se refiere a un segmento de por lo menos aproximadamente 20 posiciones contiguas, usualmente aproximadamente 50 a aproximadamente 200, más usualmente aproximadamente 100 a aproximadamente 150 en las que una secuencia se puede comparar con una secuencia de referencia en el mismo número de posiciones contiguas después que se alinean óptimamente las dos secuencias.

La alineación óptima de las secuencias para comparación se puede realizar mediante el algoritmo de homología local de Smith and Waterman (1981), mediante el algoritmo de alineación de homología de Needleman and Wunsch (1970), mediante la búsqueda del método de similitud de Pearson and Lipman (1988), mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA, y TFASTA en el Paquete de Software Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, WI), o mediante inspección visual.

"Porcentaje de identidad de secuencia" se determina al comparar dos secuencias óptimamente alineadas sobre una ventana de comparación, en donde la porción del ácido polinucleico o las secuencias de polipéptido en la ventana de comparación pueden comprender adiciones o eliminaciones (es decir, espacios) cuando se compara con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o eliminaciones) para alineación óptima de las dos secuencias. El porcentaje se calcula al determinar el número de posiciones en las que ocurre el residuo de aminoácido o base de ácido nucleico idéntico en ambas secuencias para producir el número de posiciones emparejadas, que divide el número de posiciones emparejadas mediante el número total de posiciones en la ventaja de comparación y multiplica el resultado por 100 para producir el porcentaje de identidad de secuencia.

El término "identidad sustancial" de ácido polinucleico o las secuencias de polipéptidos significa que una secuencia de polinucleótidos comprende una secuencia que tiene por lo menos 60 %, 65 %, 70 % o 75 % de identidad de secuencia, preferiblemente por lo menos 80 % o 85 %, más preferiblemente por lo menos 90 % y más preferiblemente por lo menos 95 %, comparado con una secuencia de referencia utilizando los programas descritos anteriormente (preferiblemente BLAST) utilizando parámetros estándar. Un experto reconocerá que estos valores se pueden ajustar apropiadamente para determinar la identidad correspondiente de las proteínas codificadas por dos secuencias de nucleótido al tener en cuenta la degeneración de codón, similitud de aminoácido, posicionamiento de marco de lectura y similares. La identidad sustancial de las secuencias de aminoácido para estos propósitos significa normalmente la identidad de secuencia de por lo menos 40 %, 45 %, 50 % o 55 % preferiblemente por lo menos 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 % o 85 % más preferiblemente por lo menos 90 %, y más preferiblemente por lo menos 95 %. Los polipéptidos que son "sustancialmente similares" comparten las secuencias como se anotó anteriormente excepto que las posiciones de residuo que no son idénticas pueden diferir mediante cambios de aminoácido conservadoras. Las sustituciones de aminoácido conservadoras se refieren a la intercambiabilidad de los residuos que tienen cadenas laterales similares. Por ejemplo, un grupo de aminoácidos que tiene cadenas alifáticas laterales es glicina, alanina, valina, leucina, e isoleucina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales hidroxilo alifáticas es serina y treonina; un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales que contienen amida es asparagina y glutamina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales aromáticas es fenilalanina, tirosina, y triptofan; un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales básicas es lisina, arginina, e histidina; y un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales que contienen azufre es cisteína y metionina. Los grupos de sustitución de aminoácidos conservadoras son: valina-leucina-isoleucina, fenilalaninatirosina, lisina-arginina, alanina-valina, y asparagina-glutamina.

Otra indicación que las secuencias de nucleótido son sustancialmente idénticas es si dos moléculas hibridan entre sí, o un tercer ácido nucleico, bajo condiciones exigentes.

Más particularmente, los ácidos polinucleicos como se utiliza aquí comprenderán por lo menos parte de una secuencia de ADN que es esencialmente similar, o, preferiblemente, esencialmente idéntica o idéntica a una o ambas secuencias de aminoácido o de nucleótido que corresponden a la SEQ ID NO 73 descrita aquí, más específicamente en la secuencia de nucleótidos que codifica, o la secuencia de aminoácidos que corresponde al "dominio activo" de la proteína o polipéptido respectivo.

Las secuencias de ácidos polinucleicos de acuerdo con la presente invención se pueden producir por medio de cualquier técnica de amplificación de ácido nucleico conocida en el arte tal como PCR o síntesis de química convencional.

Para una revisión general de PCR ver los Protocolos PCR (Innis et al. (1990)).

También se pueden sintetizar los polinucleótidos mediante técnicas bien conocidas como se describe en la literatura técnica. Ver, por ejemplo, Carruthers et al. (1982) y Adams et al. (1983). Los fragmentos de ADN de doble hebra se pueden obtener después al sintetizar la hebra complementaria e hibridar las hebras bajo condiciones apropiadas, o al agregar la hebra complementaria utilizando polimerasas de ADN con una secuencia de cebador apropiada.

La presente invención se relaciona con más particularmente un polipéptido aislado de la SEQ ID NO 74.

La presente especificación también describe un polipéptido aislado que tiene por lo menos parte de la secuencia de la SEQ ID NO 74. Preferiblemente, dicha parte es una parte única y preferiblemente incluye el dominio activo de dicho polipéptido. Preferiblemente dicho polipéptido es un polipéptido recombinante.

El término "aislado" distingue la proteína o ácido polinucleico de acuerdo con la invención de otra que ocurre en la naturaleza.

La presente especificación también describe un polipéptido que comprende por lo menos parte de un polipéptido que es por lo menos 50 %, 55 %, 60 %, 65 % idéntico, preferiblemente por lo menos 70 %, 75 % idéntico, más preferiblemente por lo menos 80 % o 85 % idéntico, y más preferiblemente por lo menos 90 % o 95 % idéntico a la SEQ ID NO 74.

Los términos "polipéptido" y "proteína" se utilizan intercambiablemente a través de la presente descripción.

Dicho polipéptido preferiblemente tiene la capacidad de conferir condiciones de tolerancia o resistencia al estrés del medio ambiente en por lo menos plantas, partes de plantas, tejidos de planta, células de planta, callo de planta o levadura.

El término "fragmento funcional" se refiere a un fragmento que tiene sustancialmente actividad biológica de la proteína de la cual se deriva.

Los polipéptidos de la presente invención se pueden producir mediante expresión recombinante en células procarióticas y eucarióticas construidas por ingeniería como bacterias, levadura u hongos. Se espera que aquellos expertos en la técnica tengan conocimiento de los numerosos sistemas de expresión disponibles para expresión en estos sistemas.

La presente especificación se relaciona más particularmente con un método para producir una planta con resistencia

o tolerancia mejorada al estrés del medio ambiente, dicho método comprende introducir transitoriamente en una célula de planta un ADN recombinante que comprende cualesquier ácidos polinucleicos como se definió anteriormente que cuando se (sobre)expresa en una célula de planta mejora la tolerancia o resistencia al estrés del medio ambiente de dicha planta.

El término "célula de planta" como se definió anteriormente también comprende tejido de planta o una planta como un todo. La presente especificación se relaciona más particularmente con un método para producir una planta con resistencia o tolerancia mejorada del estrés del medio ambiente, dicho método comprende introducir transitoriamente en una célula de planta un ADN recombinante que comprende cualesquier ácidos polinucleicos que codifican una proteína como se describió anteriormente que cuando se (sobre)expresan en una célula de planta mejora la tolerancia o resistencia al estrés del medio ambiente en dicha planta.

El término "(sobre)expresión" se refiere al hecho de que los polipéptidos de la invención codificados por dicho ácido polinucleico se expresan preferiblemente en una cantidad efectiva para conferir tolerancia o resistencia a la planta transformada, en una cantidad de sal, calor, frío, (u otros factores de estrés) que inhiben el crecimiento de la planta no transformada correspondiente.

Se conocen en la técnica diversos métodos para obtener la introducción transitoria y expresión de un ADN recombinante en una planta. Por ejemplo, se pueden utilizar vectores de virus de planta para obtener tal propósito. Ejemplos que confieren el uso de vectores víricos de planta se describen en Porta and Lomonossoff (1996), WO9320217 y US 5,589,367.

La presente especificación también describe un método para producir una planta con resistencia o tolerancia mejorada al estrés del medio ambiente, dicho método comprende introducir establemente en el genoma de una célula de planta un ADN recombinante que comprende cualesquier ácidos polinucleicos como se definió anteriormente que cuando se (sobre)expresan en una célula de planta mejoran la resistencia o tolerancia al estrés del medio ambiente de una planta.

La presente especificación también describe un método para producir una planta con condiciones mejoradas de tolerancia o resistencia al estrés del medio ambiente, dicho método comprende introducir dentro del genoma de una célula de planta un ADN recombinante que comprende cualesquier ácidos polinucleicos que codifican una proteína como se describió anteriormente que cuando se (sobre)expresan en una célula de planta mejoran la resistencia al estrés del medio ambiente de dicha planta.

Preferiblemente, la presente especificación describe un método como se definió anteriormente, que comprende:

(a) introducir en el genoma de una célula de planta una o más moléculas de ADN recombinantes, dichas moléculas de ADN recombinantes comprenden:

-

un ácido polinucleico como se definió anteriormente, y,

-

un promotor que puede expresar la planta, por lo que dicho ácido polinucleico está en la misma unidad transcripcional y bajo el control de dicho promotor que puede expresar la planta, y,

(b) regenerar dicha planta de dicha célula de planta.

La presente especificación también describe un método para producir una planta con tolerancia o resistencia mejorada al estrés del medio ambiente, dicho método comprende aumentar indirectamente para inducir la expresión de un gen endógeno en dicha planta comprendida dentro de un ácido polinucleico como se definió anteriormente o aumentar indirectamente para inducir la actividad de una proteína como se definió anteriormente.

La presente especificación también describe un método como se definió anteriormente, que comprende:

(a) introducir dentro del genoma de una célula de planta una o más moléculas de ADN recombinantes, dichas moléculas de ADN recombinantes comprenden:

-

un ADN que codifica una proteína que cuando se expresa en dicha célula de planta en una cantidad efectiva aumenta indirectamente o induce la expresión de un ácido polinucleico endógeno o indirectamente aumenta o induce la actividad de la proteína de una proteína codificada mediante dicho ácido polinucleico de la presente invención, y,

-

un promotor que se puede expresar en planta, por lo que dicho ADN está en la misma unidad transcripcional y bajo el control de dicho promotor que se puede expresar en la planta, y,

(b) regenerar dicha planta de dicha célula de planta.

Una molécula de ADN "recombinante" comprenderá una "secuencia heteróloga" significa que dicha molécula de ADN recombinante comprenderá una secuencia que se origina de una especie extraña, o, si de las mismas especies, se puede modificar sustancialmente de su forma original. Por ejemplo, un promotor ligado en forma operable a un gen estructural que es de una especie diferente de la que se deriva el gen estructural, o, de la misma especie, se puede modificar sustancialmente de su forma original.

La presente especificación también describe un método como se definió anteriormente para producir una planta con condiciones mejoradas de tolerancia o resistencia al estrés del medio ambiente, dicho método comprende aumentar indirectamente o inducir la expresión de un gen endógeno en dicha planta comprendida dentro de un ácido polinucleico como se definió anteriormente o aumentar indirectamente o inducir la actividad de una proteína como se definió anteriormente. Otros ácidos polinucleicos que modulan la expresión o la actividad de una proteína como se describe aquí se pueden introducir transitoriamente o establemente dentro del genoma de dichas plantas. El término "modular" significa mejorar, inducir, aumentar, reducir o inhibir.

Se requiere aumento o la inducción de la expresión o la inducción o el aumento de la actividad de la proteína cuando dicha proteína reguladora es un regulador positivo de la expresión o la actividad de por lo menos uno de los ácidos polinucleicos o proteína como se describe aquí.

Se requiere reducción o inhibición de la expresión o reducción o inhibición de la actividad de la proteína cuando dicha proteína reguladora es un regulador negativo de la expresión o actividad de por lo menos uno de los ácidos polinucleicos o proteínas como se describe aquí.

Se obtiene el aumento de la actividad de dicho polipéptido como se describe aquí, de acuerdo con un caso al influenciar la expresión endógena del gen en la planta. Esto se logra preferiblemente mediante la introducción de una o más secuencias de ácidos polinucleicos como se describe aquí dentro del genoma de la planta, en una conformación adecuada para la expresión génica (por ejemplo bajo el control de un promotor que puede expresar la planta). Esto resultará en expresión aumentada o inducida (sobreexpresión) o aumentar o inducir la actividad de la proteína en las células de planta, y, en la presencia de un sustrato adecuado, en un aumento de tolerancia o resistencia a las condiciones de estrés del medio ambiente en una planta transgénica o célula de planta cuando se compara con una planta no transgénica o célula de planta. Esto aumenta la tolerancia que se puede medir al medir los niveles de mARN, o según sea apropiado, el nivel o actividad de la proteína respectiva (por ejemplo por medio de ELISA, actividad de la enzima según se mide mediante cualquier técnica conocida en el arte). La expresión endógena de gen se refiere a la expresión de una proteína que se encuentra en la naturaleza en la planta, parte de planta o célula de planta referida.

Alternativamente, dichas condiciones mejoradas de tolerancia o resistencia al estrés del medio ambiente se pueden lograr al introducir dentro del genoma de la planta, uno o más transgenes que interactúan con la expresión de los genes endógenos (ácidos polinucleicos) como se describe aquí mediante ARN anticodificante, co-supresión o supresión de ribozima de genes que inhiben normalmente la expresión de los ácidos polinucleicos como se describe aquí o mediante la supresión de genes que inhiben normalmente la actividad de los polipéptidos como se definió anteriormente.

Para la inhibición de la expresión, el segmento de ácido nucleico que se va a introducir de manera general será sustancialmente idéntico para por lo menos una porción del gen endógeno o genes que se van a reprimir. La secuencia, sin embargo, no necesita ser perfectamente idéntica para inhibir la expresión. Los vectores como se describe aquí se pueden diseñar de tal manera que aplica efecto inhibidor a otros genes dentro de una familia de genes que exhibe homología u homología sustancial con el gen objetivo.

Para la supresión anticodificante, la secuencia introducida tampoco necesita ser de longitud completa con relación al mARN completamente procesado o el producto de transcripción principal.

De manera general, se puede utilizar homología mayor para compensar el uso de una secuencia más corta.

Adicionalmente, la secuencia introducida no necesita tener el mismo patrón de intrón o exón, y la homología de los segmentos no codificantes puede ser igualmente efectiva. Normalmente, una secuencia de entre aproximadamente 30 o 40 nucleótidos hasta la secuencia de longitud completa que se debe utilizar, se prefiere a través de la secuencia de por lo menos aproximadamente 100 nucleótidos, es más preferido una secuencia de por lo menos aproximadamente 200 nucleótidos, y es especialmente preferido una secuencia de aproximadamente 500 a aproximadamente 1700 nucleótidos.

También se pueden utilizar moléculas o ribozimas de ARN catalíticas para inhibir la expresión de los genes como se explicó anteriormente. Es posible diseñar ribozimas que se emparejan específicamente virtualmente con cualquier ARN objetivo y dividen la estructura principal fosfodiéster en una ubicación específica, por lo cual se inactiva funcionalmente el ARN objetivo. Al llevar a cabo esta división, la ribozima no se altera por sí misma, y así es capaz de reciclar y dividir otras moléculas, haciendo una enzima verdadera. La inclusión de las secuencias de ribozima dentro de los ARN anticodificantes confiere actividad de división de ARN sobre ellos, por lo que se aumenta la actividad de las construcciones.

Se ha identificado un número de clases de ribozimas. Una clase de ribozimas se deriva de un número de ARN circulares pequeños que son capaces de dividirse por sí mismos y de replicación en las plantas. Los ARN replican solo (ARN viroides) o con un virus auxiliar (ARN satelitales). Ejemplos incluyen ARN de viroide de mancha de sol del aguacate y los ARN satélites del virus de mancha de anillo del tabaco, virus del veteado transitorio de la alfalfa, virus del moteado del tabaco suave, virus del moteado nodoso del género solanum y virus del moteado del trébol subterráneo. El diseño y uso de las ribozimas específicas del ARN objetivo se describe en Haseloff et al. (1988).

Otro método de supresión de la expresión génica es supresión codificante. La introducción del ácido nucleico configurado en la orientación codificante se ha mostrado que es un medio efectivo mediante el cual se bloquea la transcripción de los genes objetivo. Para un ejemplo del uso de este método para modular la expresión de los genes endógenos ver, Napoli et al. (1990), y Patentes Estadounidenses Nos. 5,034,323, 5,231,020, y 5,283,184.

Puede ocurrir un efecto supresor cuando la secuencia introducida no contiene la secuencia de codificación per se, pero solo el intrón o las secuencias no traducidas homólogas a las secuencias presentes en el transcripto principal de la secuencia endógena. La secuencia introducida de manera general será sustancialmente idéntica a la secuencia endógena destinada a ser reprimida. Esta identidad mínima será típicamente mayor de aproximadamente 65 %, pero una identidad mayor puede ejercer una represión más efectiva de la expresión de las secuencias endógenas. Se prefiere la identidad sustancialmente mayor de más de aproximadamente 80 %, sería más preferido aproximadamente 95 % de identidad absoluta. Con la regulación anticodificante, el efecto debe aplicar a cualesquier otras proteínas dentro de una familia similar de genes que exhiben homología u homología sustancial.

Para la supresión codificante, la secuencia introducida, que necesita menor identidad absoluta, tampoco necesita ser de longitud completa, con relación al producto de transcripción principal o mARN completamente procesado. Se puede preferir evitar la producción concurrente de algunas plantas que se sobreexpresan. Una identidad mayor en una secuencia de longitud más corta que de longitud completa compensa una secuencia menos idéntica, más larga. Adicionalmente, la secuencia introducida no necesita tener el mismo patrón de intrón o exón, y la identidad de segmentos no codificantes será igualmente efectiva. Normalmente, se utiliza una secuencia de los rangos de tamaño anotados anteriormente para la regulación anticodificante.

También se pueden utilizar otros métodos para alterar o reemplazar los genes conocidos en la técnica para inhibir la expresión de un gen. Por ejemplo, se pueden generar los mutantes insercionales utilizando T-ADN o transposones. Ver, por ejemplo, Haring et al. (1991) y Walbot (1992). Otra estrategia en la ingeniería genética de las plantas y animales es el reemplazo de gen objetivo. La recombinación homóloga se ha utilizado típicamente para este propósito (ver, Capecchi (1989)).

Alternativamente, la presente especificación describe un método como se definió anteriormente en donde dicho ADN codifica un ARN codificante o anticodificante o una ribozima capaz de aumentar indirectamente o inducir la expresión de una secuencia de ácido polinucleico endógena como se definió anteriormente o aumentar o inducir la actividad de una proteína como se definió anteriormente. Preferiblemente dicho ácido polinucleico endógeno codifica una proteína como se menciona en la Tabla 1.

La presente invención también se relaciona con un ácido polinucleico recombinante que comprende: un ácido polinucleico de la invención, y, un promotor heterólogo que se puede expresar en la planta, por lo que dicho ácido polinucleico está en la misma unidad transcripcional y bajo el control de dicho promotor que puede expresar la planta.

La presente especificación también describe un ácido polinucleico recombinante que comprende:

(a)

un ADN que codifica una proteína que cuando se expresa en dicha planta en una cantidad efectiva aumenta indirectamente o induce la expresión de un ácido polinucleico endógeno como se definió anteriormente o aumenta indirectamente o induce la actividad de la proteína de un polipéptido como se definió anteriormente, y,

(b)

un promotor que puede expresar la planta, por lo que dicho ADN está en la misma unidad transcripcional y bajo el control de dicho promotor que puede expresar la planta.

Un ácido polinucleico "endógeno" se refiere a un ácido polinucleico que ya está presente en las especies de plantas antes de transformación.

Dicho ácido polinucleico recombinante como se describió aquí anteriormente también se denomina de manera general como un "vector recombinante" o un "casete de expresión". Un casete de expresión como se describe aquí se puede clonar dentro de un vector de expresión mediante métodos estándar. El vector de expresión luego se puede introducir en células anfitrionas mediante métodos de transferencia de ADN actualmente disponibles.

La presente especificación también describe el ácido polinucleico recombinante como se definió anteriormente, que comprende un ADN que codifica un ARN anticodificante, una ribozima o un ARN codificante que aumenta o induce la actividad de una proteína como se definió anteriormente en dicha célula.

Más particularmente, la presente especificación también describe un ácido polinucleico recombinante que comprende por lo menos parte de la secuencia de nucleótido de la SEQ ID NO 73.

Preferiblemente, la presente especificación también describe un ácido polinucleico recombinante que comprende por lo menos parte de la secuencia de codificación de un gen que codifica una proteína como se describe aquí. Preferiblemente, dicha "parte" es una parte única de cualquiera de dichas secuencias de nucleótido. Como se utiliza aquí, el término un "promotor que puede expresar la planta" se refiere a un promotor que es capaz de dirigir la transcripción en una célula de planta. Esto incluye cualquier promotor de origen de planta, que incluye el promotor natural de la secuencia de ADN transcrita, pero también cualquier promotor de origen de no planta que es capaz de dirigir la transcripción en una célula de planta. El promotor también puede ser un promotor artificial o sintético. El término "promotor que puede expresar la planta" incluye, pero no se restringe a, promotores constitutivos, inducibles, específicos de órgano o de tejido o de desarrollo regulado.

De acuerdo con la especificación, la producción y/o la actividad de un polipéptido como se describe aquí en una planta o en partes de planta se aumenta al introducir uno o más ácidos polinucleicos como se describe aquí dentro del genoma de la planta. Más específicamente, el promotor constitutivo puede ser, pero no se restringe a, uno de los siguientes: un promotor 35S (Odell et al. (1985)), un promotor 35S’3 (Hull and Howell (1987)), el promotor del gen sintasa nopalina ("PNOS") del plásmido Ti (Herrera -Estrella, (1983)) o el promotor del gen sintasa octopina ("POCS", De Greve et al. (1982)). Es claro que se pueden utilizar otros promotores constitutivos para obtener efectos similares. En la Tabla 2 se da una lista de promotores que pueden expresar la planta que se pueden utilizar de acuerdo con la presente invención.

Para realizaciones específicas de esta invención, el uso de promotores inducibles puede proporcionar ciertas ventajas. Se puede requerir la modulación de los niveles de proteína o la actividad de la proteína en ciertas partes de la planta, haciendo posible limitar la modulación a un cierto periodo de cultivo o etapa de desarrollo de la planta.

Para realizaciones específicas de esta invención, el uso de promotores inducibles químicos o específicos de órgano

o de tejido puede proporcionar ciertas ventajas. Así, en realizaciones específicas de la invención, los genes o parte de los mismos se colocan bajo el control de un promotor que dirige la expresión en tejidos o órganos específicos de planta, tal como por ejemplo raíces, hojas, partes cosechables, etc.

También es posible utilizar un promotor que se puede inducir luego de las condiciones de estrés del medio ambiente. Tales promotores se pueden tomar por ejemplo de genes relacionados con el estrés que se regulan directamente mediante un medio ambiente, es decir estrés abiótico preferible en una célula de planta, que incluye genes para los que se aumenta, reduce o de otra forma se altera la expresión. Estos genes relacionados con el estrés comprenden la expresión de los genes de los que se induce o reprime mediante estrés anaeróbica, estrés por inundación, estrés por frío, estrés por deshidratación, estrés por sequía, estrés por calor o salinidad. En la Tabla 3 se da una lista de ejemplo de tales promotores.

El ácido polinucleico recombinante de acuerdo con la presente invención puede incluir secuencias reguladoras adicionales u otras secuencias de otros genes, tales como secuencias líderes (por ejemplo el líder cab22 de Petunia), las señales de poliadenilación y de terminación de transcripción 3’ (por ejemplo del gen sintasa octopina o del gen sintasa nopalina), las secuencias consensus de inicio de traducción de planta, intrones, mejoradores de transcripción y otros elementos reguladores tales como el intrón 1 adh, etc., que es o se ligan en forma operable al gen o un fragmento del mismo. Adicionalmente, el ácido polinucleico recombinante se puede construir y emplear para dirigir el producto de gen del ácido polinucleico de la invención a un compartimiento intracelular específico dentro de una célula de planta para dirigir una proteína al medio ambiente extracelular. Esto se puede obtener de manera general al unir en forma operable una secuencia de ADN que codifica un péptido de señal o transitorio al ácido polinucleico recombinante.

El ADN recombinante que comprende uno o más ácidos polinucleicos de acuerdo con la presente invención se puede acompañar por un gen de marcador quimérico (Hansen et al., 1999 y referencias allí). El gen de marcador quimérico puede comprender un ADN marcador que se liga en forma operable a su extremo 5’ a un promotor que puede expresar la planta, preferiblemente un promotor constitutivo, tal como el promotor CaMV 35S, o un promotor inducible por luz tal como el promotor del gen que codifica la subunidad pequeña de Rubisco; y ligado en forma operable a su extremo 3’ para la formación de extremo 3’ de transcripción de planta adecuada y las señales de poliadenilación. Se espera que la elección del ADN marcador no sea crítica, y se pueda utilizar cualquier ADN marcador adecuado. Por ejemplo, un ADN marcador puede codificar una proteína que proporciona un color distinguible para la célula de planta transformada, tal como el gen A1 (Meyer et al., (1987)), puede proporcionar resistencia al herbicida para la célula de planta transformada, tal como el gen bar, que codifica resistencia a fosfinotricina (EP 0 242 246), o puede proporcionar resistencia antibiótica a las células transformadas, tales como el gen aac(6’), que codifica resistencia a la gentamicina (WO 94/01560). La especificación también describe

Los vectores de ADN recombinantes de acuerdo con la presente invención que comprenden las secuencias de los genes de la invención también comprenderán típicamente un gen marcador que confiere un fenotipo seleccionable en las células de planta. Por ejemplo, el marcador puede codificar resistencia a biocidas, particularmente resistencia a los antibióticos, tal como resistencia a canamicina, G418, bleomicina, higromicina, o resistencia a herbicidas, tal como resistencia a clorosulforón o Basta.

La presente especificación también describe una célula anfitriona recombinante transformada con un ácido polinucleico aislado como se definió anteriormente. Dicho anfitrión puede ser cualquier anfitrión conocido en la técnica. Preferiblemente dicha célula anfitriona recombinante es una célula de planta, levadura, hongo, célula de insecto, etc. Con el fin de ser expresado eficientemente en dicho anfitrión, dichos ácidos polinucleicos se pueden combinar con cualquier promotor conocido para funcionar en dicho sistema anfitrión. Los métodos para transformar dichas células anfitrionas también se conocen bien en la técnica.

La presente especificación también describe una célula de planta transformada con por lo menos un ácido polinucleico recombinante como se definió anteriormente.

La presente especificación también describe una planta que consiste esencialmente de células de planta transformadas con por lo menos un ácido polinucleico recombinante como se definió anteriormente.

Una "planta transgénica" se refiere a una planta que comprende un transgen en el genoma de esencialmente todas sus células.

Las construcciones de ADN de la invención se pueden introducir dentro del genoma del anfitrión deseado de la planta mediante una variedad de técnicas convencionales (ver por ejemplo Hansen et al., 1999 para revisión y WO 99/05902). Por ejemplo, las construcciones de ADN de la invención se pueden introducir dentro del genoma del anfitrión de planta deseado al utilizar técnicas tal como transformación de protoplasto, bombardeos biolísticos o de microproyectil o transformación mediada por Agrobacterium.

Las técnicas de microinyección se conocen en la técnica y se describen bien en la literatura científica y de patentes. La introducción de las construcciones de ADN utilizando precipitación de polietilenglicol se describe en Paszkowski et al. (1984).

Las técnicas de electroporación se describen en Fromm et al. (1985). Las técnicas de transformación biolística se describen en Klein et al. (1987).

Alternativamente, se pueden combinar las construcciones de ADN con regiones de flanqueo de T-ADN adecuadas y se introducen en un vector anfitrión de Agrobacterium convencional. Las funciones de virulencia del anfitrión Agrobacterium dirigirán la inserción de la construcción y el marcador adyacente dentro del ADN de célula de planta cuando la célula se infecta por la bacteria. Las técnicas de transformación mediadas por Agrobacterium tumefaciens, que incluyen desarme y el uso de vectores binarios, se describen bien en la literatura científica. Ver, por ejemplo Horsch et al. (1984), y Fraley et al. (1983).

Las células de planta transformadas que se derivan mediante cualquiera de las técnicas de transformación anteriores se pueden cultivar para regenerar una planta completa que posee el genotipo transformado y así el fenotipo deseado. Tales técnicas de regeneración se basan en la manipulación de ciertas fitohormonas en un medio de crecimiento de cultivo de tejido. La regeneración de la planta de los protoplastos cultivados se describe en Evans et al. (1983); y Binding (1985). La regeneración también se puede obtener de los callos de planta, explantes, órganos, o partes de las mismas. Tales técnicas de regeneración se describen de manera general en Klee et al. (1987).

Los ácidos polinucleicos y polipéptidos de la invención se pueden utilizar para conferir rasgos deseados en un amplio rango de las plantas, que incluyen plantas monocotiledóneas o dicotiledóneas, preferiblemente pertenecen a una especie de planta de interés en la agricultura, cultivo de madera o horticultura, tal como una planta de cultivo, planta de raíz, planta que produce aceite, planta que produce madera, plantas que producen frutos, forraje o leguminosas forrajeras, plantas ornamentales o de horticultura. Las plantas pueden incluir especies del género Actinidia, Apium, Allium, Ananas, Arachis, Arisaema, Asparagus, Atropa, Avena, Beta, Brassica, Carica, Cichorium, Citrus, Citrullus, Capsicum, Cucumis, Cucurbita, Cydonia, Daucus, Diospyros, Fragaria, Glycine, Gossypium, Helianthus, Heterocallis, Hordeum, Hyoscyamus, Ipomoea, Lactuca, Linum, Lolium, Lycopersicon, Malus, Mangifera, Manihot, Majorana, Medicago, Musa, Nicotiana, Oryza, Panicum, Pannesetum, Persea, Petroselinum, Phaseolus, Pisum, Pyrus, Prunus, Raphanus, Rheum, Ribes, Rubus, Saccharum, Secale, Senecio, Sinapis, Solanum, Sorghum, Spinacia, Trigonella, Triticum, Vaccinium, Vitis, Vigna, Zea, y Zingiber. No se excluyen especies adicionales. Los cultivos que crecen en tierras cultivadas en áreas áridas o semiáridas en las que se necesita irrigación con agua puede beneficiar ventajosamente la invención.

Un experto en la técnica reconocerá que después que se incorpora establemente el ácido polinucleico recombinante en las plantas transgénicas y se confirma que es operable, se puede introducir en otras plantas por cruce sexual. Se puede utilizar cualquiera de un número de técnicas de siembra estándar, dependiendo de la especie que se va a cruzar. Como se describió anteriormente, las células de planta, tejido de planta, en particular, plantas transgénicas de la invención exhiben un cierto grado mayor o mejorado de tolerancia (o aún resistencia) a condiciones de estrés del medio ambiente comparado con las plantas tipo natural correspondientes. Para el significado de "estrés del medio ambiente", ver supra. En la presente invención, la planta transgénica exhibe tolerancia aumentada al estrés osmótico, estrés por salinidad. Un aumento en la tolerancia a tal estrés del medio ambiente se entiende que se refiere a un nivel de tolerancia de tal estrés que inhibe el crecimiento y productividad de la planta no transformada correspondiente, como se determina mediante metodologías conocidas en la técnica. Tal tolerancia aumentada en las plantas transgénicas se relaciona con un nivel de expresión aumentado en la planta transgénica o partes de la misma de uno o más ácidos polinucleicos de la presente invención y/o con un nivel aumentado de actividad de los polipéptidos codificados por dicho ácido polinucleico, como se determina mediante las metodologías conocidas en la técnica. En comparación con sus contrapartes no transformadas, y determinadas de acuerdo con las metodologías conocidas en la técnica, una planta transgénica de acuerdo con la presente invención muestra un crecimiento aumentado, viabilidad, metabolismo, fertilidad y/o productividad bajo condiciones moderadas de estrés del medio ambiente. En la alternativa, una planta transgénica de acuerdo con la invención puede crecer bajo condiciones de estrés osmótico en donde las contrapartes no transformadas no pueden crecer. Un aumento en la tolerancia al estrés por salinidad se entiende que se refiere a la capacidad de la planta transgénica para crecer bajo condiciones de estrés que inhiben el crecimiento de por lo menos 95 % de las plantas no tolerantes al estrés, progenitoras de las que se derivan las plantas transgénicas tolerantes al estrés. Típicamente, el índice de crecimiento de plantas tolerantes al estrés de la invención se inhibirá mediante menos de 50 %, preferiblemente menos de 30 %, y más preferiblemente tendrán un índice de crecimiento que no se inhibe significativamente mediante condiciones de crecimiento que inhiben el crecimiento de por lo menos 95 % de las plantas no tolerantes al estrés, parentales. En un ejemplo alternativo, bajo condiciones moderadas al estrés del medio ambiente, el crecimiento y/ lo productividad de las plantas transgénicas es estadísticamente por lo menos 1 % más para sus contrapartes no transformadas, preferiblemente más de 5 % mayor y más preferiblemente más de 10 % mayor.

Cualquier planta transformada obtenida de acuerdo con la invención se puede utilizar en un esquema de siembra convencional o en propagación de planta in vitro para producir más plantas transformadas con las mismas características y/o se puede utilizar para introducir la misma característica en otras variedades de la misma especie

o especies relacionadas.

Adicionalmente, la característica de las plantas transgénicas de la presente invención para mantener los índices de crecimiento normal/rápido/alto bajo las condiciones de estrés del medio ambiente se puede combinar con diversos métodos para conferir tolerancia al estrés del medio ambiente con el uso de otros genes de tolerancia al estrés. Algunos ejemplos de tales genes tolerantes al estrés se proporcionan en Holmberg and Bülow (1998). La mayor parte de los métodos de la técnica anterior que incluyen la introducción de diversos genes de tolerancia al estrés tienen el inconveniente que resultan en crecimiento reducido o anormal (comparado con controles no transgénicos) bajo condiciones normales, sin estrés, a saber la tolerancia al estrés se produce a expensas del crecimiento y la productividad (Kasuga et al., 1999). Esta correlación entre la expresión constitutiva de los genes que responden al estrés y los índices de crecimiento reducidos bajo condiciones de crecimiento normales indica la presencia de mecanismos de comunicación cruzada entre el control de respuesta al estrés y el control del crecimiento.

Adicionalmente, la característica de las plantas transgénicas de la presente invención exhibe tolerancia a las condiciones de estrés osmótico que se pueden combinar con diversos métodos para conferir a las plantas otros genes de tolerancia al estrés, por ejemplo, protectores osmóticos tales como manitol, prolina; acuaporina, glicinabetaína, etc. Así, el método de la presente invención para conferir condiciones de tolerancia al estrés osmótico a las plantas se puede combinar con métodos de la técnica anterior que incluyen la introducción de diversos genes de tolerancia al estrés. La combinación de estos métodos puede tener efectos aditivos y/o sinérgicos en mejorar la tolerancia o resistencia al estrés del medio ambiente.

Así, es inmediatamente evidente para la persona experta en la técnica que el método de la presente invención se puede emplear para producir plantas tolerantes al estrés transgénicas con cualquier rasgo deseado (ver para revisión TIPTEC Plant Product & Crop Biotechnology 13 (1995), 312-39T) que comprende:

(i)

Tolerancia al herbicida (DE-A 3701623; Stalker (1988)),

(ii)

Resistencia a los insectos (Vaek (1987)),

(iii) Resistencia a los virus (Powell (1986), Pappu (1995), Lawson (1996)),

(iv) Resistencia al ozono (Van Camp (1994)),

(v)Mejora en la preservación de los frutos (Oeller (1991)),

(vi) Mejora de la composición de almidón y/o producción (Stark (1992), Visser (1991)),

(vii) Alterar la composición de lípido (Voelker (1992)), (viii)Producción de (bio)polímeros (Poirer (1992)),

(ix)

Alteración del color de flor, por ejemplo, manipular la ruta biosintética de antocianina y flavonoide (Meyer (1987), WO90/12084), (x)resistencia a las bacterias, insectos y hongos (Duering (1996), Strittmatter (1995), Estruch (1997)),

(xi)

alteración de la composición de glicosida cardia y/o alcaloide,

(xii) inducir el mantenimiento de la esterilidad de machos y/o hembras (EP-A1 0 412 006; EP-A1 0 223 399; WO93/25695); (xiii)longevidad mayor de las inflorescencias/flores, y

(xiv) resistencia al estrés.

Así, la presente especificación describe cualquier célula de planta, tejido de planta, o planta que debido a la ingeniería genética exhibe una tolerancia o resistencia mejorada al estrés del medio ambiente que se puede obtener de acuerdo con el método de la presente invención y que comprende una molécula de ácido nucleico adicional que confiere un fenotipo novedoso para la planta tal como uno de aquellos descritos anteriormente.

La presente especificación también describe un callo o callos que consisten esencialmente de células de planta como se definió aquí anteriormente. Tales callos transgénicos se pueden utilizar preferiblemente para la producción de metabolitos secundarios en los cultivos de suspensión de células de planta.

La presente especificación también describe cualquier otra parte cosechable, órgano o tejido o material de propagación de la planta como se definió aquí anteriormente.

La presente especificación también describe la semilla de una planta transgénica como se definió aquí anteriormente, que comprende dicho ADN recombinante.

La presente especificación también describe el uso de cualquier ácido polinucleico aislado como se definió anteriormente para producir plantas transgénicas.

La presente especificación también describe el uso de un ácido polinucleico recombinante como se definió anteriormente, para producir plantas transgénicas, preferiblemente plantas transgénicas que tienen condiciones mejoradas de tolerancia o resistencia al estrés del medio ambiente.

La presente especificación también describe el uso de un ácido polinucleico aislado como se definió anteriormente, para producir callos transgénicos que tienen condiciones mejoradas de tolerancia o resistencia al estrés del medio ambiente.

La presente especificación también describe sondas y cebadores derivados de los genes de la invención que son útiles por ejemplo para el aislamiento de genes adicionales que tienen secuencias que son similares a pero que difieren de la SEQ ID NO 73 pero que codifican una proteína que tiene sustancialmente la misma actividad biológica como una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO 74 mediante las técnicas conocidas en el arte, tal como PCR. La presencia de un gen homólogo en otra especie de planta se puede verificar por ejemplo por medio de experimentos Northern de Southern blot.

La presente especificación también describe la clonación de la contraparte genómica de las secuencias de cADN como se representa en la SEQ ID NO 73 Estas contrapartes genómicas se pueden seleccionar de una colección genómica utilizando estas secuencias de cADN como una sonda. La presente especificación también describe la región codificante así como también la región promotora de cualquiera de dichos clones genómicos.

El término "sonda" de acuerdo con la presente invención se refiere a una secuencia de oligonucleótido de hebra sencilla que se diseña para hibridar específicamente cualesquier ácidos polinucleicos de la invención.

El término "cebador" se refiere a una secuencia de oligonucleótido de hebra sencilla capaz de actuar como un punto de inicio para la síntesis de de un producto de extensión de cebador que es complementario con la hebra de ácido nucleico que se va a copiar. Preferiblemente el cebador tiene aproximadamente 5-50 nucleótidos de largo. El término "región objetivo" de una sonda o un cebador como se describe aquí es una secuencia dentro de los ácidos polinucleicos para los que la sonda o el cebador es completamente complementario o parcialmente complementario (es decir con algún grado de emparejamiento incorrecto). Se entiende que el complemento de dicha secuencia objetivo también es una secuencia objetivo adecuada en algunos casos.

"Hibridación específica" de una sonda a una región objetivo del ácido polinucleico significa que la sonda forma un dúplex con la parte de esta región o con la región completa bajo las condiciones experimentales utilizadas, y que bajo aquellas condiciones esta sonda no forma sustancialmente un dúplex con otras regiones de los ácidos polinucleicos presentes en la muestra que se va a analizar.

"Hibridación específica" de un cebador a una región objetivo del ácido polinucleico significa que, durante la etapa de amplificación, dicho cebador forma un dúplex con parte de esta región o con la región completa bajo las condiciones experimentales utilizadas, y que bajo aquellas condiciones el cebador no forma un dúplex con otras regiones de los ácidos polinucleicos presentes en la muestra que se va a analizar. Se entiende que "dúplex" como se utiliza aquí, significa un dúplex que conducirá a amplificación específica.

Preferiblemente, las sondas como se describe aquí tiene aproximadamente 5 nucleótidos a aproximadamente 1 Kb de largo, más preferiblemente de aproximadamente 10 a 25 nucleótidos. Los nucleótidos como se describe aquí pueden ser ribonucleótidos, desoxiribonucleótidos y nucleótidos modificados tales como inosina o nucleótidos que contienen grupos modificados que no hacen esencialmente después de sus características de hibridación. Las sondas como se describe aquí incluyen preferiblemente partes de las secuencias de cDNA de cualesquier ácidos polinucleicos como se definió anteriormente.

La presente especificación también describe una composición que comprende una secuencia de ácido polinucleico como se definió anteriormente, un polipéptido como se definió anteriormente, una sonda como se definió anteriormente o un cebador como se definió anteriormente.

La presente especificación también describe una composición farmacéutica o agroquímica que comprende dicho ácido polinucleico, un polipéptido de la invención como se definió anteriormente.

La presente especificación también describe anticuerpos que reaccionan específicamente con una proteína o polipéptido como se describe aquí.

Los siguientes Ejemplos describe por vía de ejemplo la tolerancia y/o resistencia a diversas condiciones de estrés del medio ambiente observadas para plantas transgénicas y levadura que sobreexpresa algo de los ácidos polinucleicos como se describe aquí. A menos que se indique otra cosa en los Ejemplos, todas las técnicas de ADN recombinante se llevan a cabo de acuerdo con protocolos estándar como se describe en Sambrook et al. (1989) y en volúmenes 1 y 2 de Ausubel et al. (1994). Los materiales estándar y métodos para el trabajo molecular de planta se describen en Biología molecular de planta Labfax (1993) por R.D.D. Croy, jointly publicado por BIOS Scientific Publications Ltd. (UK) y Blackwell Scientific Publications, UK.

Estos ejemplos y figuras no se construyen como limitantes de cualquiera de las realizaciones de la presente invención como se estableció anteriormente.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Y TABLAS

Figura 1. At-DBF2 codifica un homólogo funcional de la levadura Dbf2. (A) Comparación de la secuencia de aminoácidos deducida de At-DBF2 con aquella de la levadura DBF2. Se introducen espacios para optimizar la alineación. Los numerales romanos por encima de la secuencia At-DBF2 indican los subdominios catalíticos de la proteína quinasa definidos por Hanks et al. (1988). (B) Complementación de dbf2. El mutante dbf S7-4A [MATa db2L ::URA3 ura3 leu2 ade5 trp1 his7] (Toyn and Johnston, 1994) (B1) forma pares hinchados de células hijas (mancuernas) en temperatura restrictiva (37° C). La morfología defectuosa del mutante dbf2 se puede complementar mediante transformación con el plásmido centromérico pYX112 (Ingenius, R&D system) que contiene el cADN At-DBF (B2) o DBF2 (B3); tipo natural (cepa CG378, MATa ade5 leu2 trp1 ura3) (B4). Los cultivos de fase log se cambian de 28° C a 37° C y se fotografían después de 16 horas. Después de 16 horas, 98 % de las células S7-4A disminuidas con una morfología de mancuerna (B1) mientras que 6,1 y 0% de mancuernas se observan en B1, B3 y B4. Las cepas se proporcionan amablemente por (Dr Lindl, Max Planck Institut fur Zuchtungsforschung, Koln, Alemania).

Figura 2. La sobreexpresión de DBF2 o At-DBF2 mejora la tolerancia al estrés osmótico, a la sal, al calor y al frío. Las células de levadura crecen en YPD y se ajusta la densidad celular a OD600 a 2. (1) DY, (2) DY transformada con pYX212 que contienen DBF2, pYX-YDBF2, (3) DY transformada con el vector solo o (4) con el vector que contiene At-DBF2, pYXAtDBF2. Se hacen diluciones en serie en la etapa 1:10. Se coloca diez μl de cada dilución en medio sólido YPD (control) complementado con 2M sorbitol (estrés osmótico) o 1.2 M NaCl (estrés por salinidad) o 4 μl de H2O2 (estrés oxidativo) y se incuba a 28° C o a 42°C (estrés por calor) o a 4° C (estrés por frío) durante 3 días.

Figura 3. Se inducen DBF2 y At-DBF2 mediante estrés. (a) El análisis Northern muestra las cinéticas de inducción At-DBF2 en las plantas tratadas con PEG 6000 al 20 % y uno de DBF2 en levadura tratada con sorbitol 2M durante el tiempo indicado. (b) El análisis Northern de At-DBF2 en plantas de 10 días de edad que crecen durante 5 horas en condiciones de control (como se describe en Verbruggen et al. 1993) (1), a 37° C (2), con PEG 6000 20 % (3), NaCl 1% (4), a 4° C (5) o con 0.4 mM H2O2 (6); y de DBF2 en células de levadura durante 11/2 hora en YPD (1), a 37° C (2), con sorbitol 2M (3), con NaCl 1.2 M (4), a 4° C (5) o con 0.4 mM H2O2 (6). Se hace control de carga con teñido EtBr y se muestra bajo cada análisis Northern. (c) El análisis Western de At-DBF2 en Arabidopsis. Las muestras son similares a aquellas analizadas en (b). Los anticuerpos utilizados se elevan contra levadura Dbf2 y se proporcionan amablemente por el Dr L. Leindl (Max Planck Institut fur Zuchtungsforschung, Koln, Alemania).

Figura 4. La sobreexpresión de DBF2 puede suprimir la osmosensibilidad hog1. El mutante hog1 (4) [W303-1A, MATa, hog1L :: TRP1] y tipo natural (W303) (1) se proporcionan amablemente por el Dr Thevelein (Katholieke Universiteit Leuven, Bélgica). El mutante hog1 se transforma con pYX-YDBF2 (2) o pYX-AtDBF2 (3). Se hace crecer cada una de las 4 cepas durante 16 horas en YPD (medio rico), y se ajusta la densidad celular a OD600 a 2. Se hacen diluciones en serie, 1:10 en cinco etapas consecutivas. Se colocan diez microlitros de cada dilución en medio sólido YPD (control) o medio sólido YPD complementado con 0,9 M NaCl y se incuba a 28° C durante 3 días.

Figura 5. Se expresa periódicamente el T-DBF2 (Nicotiana tabacum DBF2) durante el ciclo celular de la planta. La expresión del tabaco DBF2 ha seguido en células BY2 sincronizadas con afidicolina (a & b) o con propizamida (c & d) con At- DBF2 como sonda. Se ha descrito previamente la medición del índice relativo de la síntesis de ADN y del índice mitótico, el uso de marcadores de ciclo celular CYCB1.2 y marcadores H4 (Reicheld et al., 1995). Se cuantifican los niveles del transcripto T-DBF2 de las transferencias mostradas en b y d utilizando un Phosphorimager (Molecular Dynamics).

Figura 6. Muestra los resultados de una comparación del crecimiento de A. Las plantas thaliana transformadas con las siguientes construcciones: P35S-At-DBF2 (sección izquierda superior y derecha inferior), control P35S (sección derecha superior) y At-DBF2 antocodificante P35S (sección izquierda inferior) luego de aplicar una estrés por salinidad de 200 mM NaCl durante la noche.

Figura 7 muestra los resultados de una comparación del crecimiento de las plantas A. thaliana transformadas con las siguientes construcciones: P35S-At-DBF2 (sección izquierda superior y derecha inferior), control P35S (sección derecha superior) y At-DBF2 anticodificante P35S (sección izquierda inferior) luego de aplicar una estrés osmótico inducido por 20% de PEG durante la noche.

Figura 8 muestra los resultados de una comparación del crecimiento de plantas A. thaliana transformadas con las siguientes construcciones: P35S-At-DBF2 (sección izquierda superior y derecha inferior), control P35S (sección derecha superior) y At-DBF2 anticodificante P35S (sección izquierda inferior) luego de aplicar un estrés por frío al reducir gradualmente la temperatura hasta - 7° C.

Figura 9 muestra los resultados de una comparación del crecimiento de plantas A. thaliana transformadas con las siguientes construcciones: P35S-At-DBF2 (sección izquierda superior y derecha inferior), control P35S (sección derecha superior) y At-DBF2 anticodificante P35S (sección izquierda inferior) luego de aplicar un estrés por calor de 2 horas a 48° C.

Figura 10 muestra los resultados de una comparación del crecimiento de plantas A. thaliana transformadas con las siguientes construcciones: P35S-At-DBF2 (sección izquierda superior y derecha inferior), control P35S (sección derecha superior) y At-DBF2 anticodificante P35S (sección izquierda inferior). Se puede concluir que las plantas transformadas P35S-At-DBF2 no muestran anormalidades morfológicas comparado con las plantas transgénicas de control.

Figura 11 muestra los resultados de la prueba de tolerancia al estrés a una sal con plantas transgénicas A. thaliana que sobrexpresan HSP 17.6A (A) o c74 (B). Las plantas de control (izquierdo inferior en A en B) es una estirpe transgénica transformada con pBIN-35S-CaMVter. Las otras secciones en A tienen 5 estirpes transgénicas independientemente obtenidas que sobreexpresan HSP17.6A. Las otras secciones en B tienen 5 estirpes transgénicas obtenidas independientemente que sobreexpresan c74.

Figura 12 muestra la influencia de la expresión At-DBF2 en las orientaciones codificante y anticodificante en tolerancia al estrés. Se transforman las células BY2 mediante A. tumefaciens con vectores de T-ADN recombinantes que contienen At-DBF2 conducido por el promotor de ARN CaMV 35S, pBIN-35S-At-DBF2 (secciones derecha e izquierda superior en A o diamantes en B), el promotor CaMV 35S y el terminador pBIN-35S-CaMVter (sección izquierda inferior en A o triángulos en B), o At-DBF2 anticodificante bajo el control del promotor CaMV 35S pBIN-35S-ASAt-DBF2 (secciones derechas inferiores en A o círculos en B). (A) La gráfica de las mismas cantidades de células transgénicas después de 3 semanas de crecimiento en medio sólido complementado con 300 mM NaCl, 25% PEG, 2mM H2O2, o a 47° C (calor). (B) Crecimiento de las células de suspensión en medio líquido. Luego de estrés, el crecimiento se mide como el peso fresco y se expresa como un porcentaje de crecimiento sin estrés (control) (a). Se aplican tensiones después de subcultivar (= día 0) en temperaturas indicadas (e) y concentraciones de NaCl (b) PEG (c), y H2O2 (f). Para el choque de frío (d), las células se mantienen a 0° C durante 2 días antes de cultivo de 2 semanas a 22° C. Para cada dato de construcción se agrupan las tres estirpes transgénicas independientes. Para no sobrecargar la figura, los SD no se muestran (máximo 15% de los valores medidos). (C) El análisis Northern de At-DBF2+TDBF2, kin1, y HSP17.6. Se extraen los ARN totales de estirpes independientes transformadas con pBIN-35S-At-DBF2 (1) y (2), pBIN-35S-CaMter (3), y pBIN-35S-ASAt- DBF2 (4). El estrés osmótico se induce con 10 % de tratamiento de PEG durante 5 hr (estrés).

Figura 13 muestra los resultados del crecimiento de plantas A. thaliana transformadas con p35S-AtHSP17.6A y control P35S (sección derecha superior) luego de aplicar una estrés osmótico inducida por 20% de PEG durante la noche. Los resultados de dos experimentos independientes se muestran, cada uno se realiza con 3 estirpes transgénicas obtenidas independientemente que sobreexpresan At- HSP17.6A (izquierda superior e izquierda y derecha inferior).

Figura 14 muestra los resultados de la germinación de plantas A. thaliana transformadas con p35S-Atc74 y control P35S (sección inferior) en medio mineral complementado con 125 mM NaCl. Los resultados de dos experimentos independientes se muestran, cada uno se realiza con 2 estirpes transgénicas obtenidas independientemente que sobreexpresan Atc74 (2 secciones superiores).

Tabla 1. Clasificación de los clones Arabidopsis thaliana aislados en el Ejemplo 2. Los clones aislados de acuerdo con la descripción en el ejemplo 2 se han analizado en su potencial para conferir tolerancia. De acuerdo con el método descrito en el ejemplo 2, la tolerancia de diferentes transformantes de levadura que expresan un cADN Arabidopsis para estrés osmótico y estrés por salinidad se compara con la tolerancia de células tipo natural DY.

+ : crecimiento similar para las células tipo natural DY;

++ : Crecimiento del transformante es visible en una dilución 10 veces mayor (1:10) que el control (1:1);

+++ : Crecimiento del transformante es visible en una dilución 100 veces mayor (1:100) que el control (1:1);

++++ : Crecimiento del transformante es visible en una dilución 1000 veces mayor (1:1000) que el control (1:1).

Tabla 2. Promotores que pueden expresar la planta de ejemplo para uso en el desempeño de la presente invención.

Tabla 3. Promotores inducibles de estrés de ejemplo para uso en el desempeño de la presente invención.

EJEMPLOS Ejemplo 1. Construcción de la colección de cADN.

Se ha aislado el ARN total de silicuas verdes de Arabidopsis thaliana al moler 1 g de silicuas en 4 ml de regulador de extracción (100 mM tris-Hcl, pH 8, 10 mM EDTA, 100 mM LiCl) a 4° C, seguido por fenolización y extracción de cloroformo: isoamilalcohol (24:1). A la fase acuosa, se agrega LiCl en una concentración final de 2M, y el ARN total se le permite precipitar durante la noche a 4° C. Después de centrifugación, el glóbulo se vuelve a disolver en 400 μl de H2O y se reprecipita con etanol. Se aísla ARN mensajero Poly(A) del ARN total al unirlo a una columna de centrifugado de celulosa oligo-dT (Pharmacia), se lava la columna tres veces con 10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 mM EDTA , 0.5 M NaCl y se eluye el mARN con 10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 mM EDTA a 65° C.

El eluado se precipita con etanol, y se sintetiza el cADN utilizando transcriptasa inversa MMLV (Pharmacia) y un cebador d(T)14-Xhol para la primera hebra y la polimerasa I de ADN E. coli (Pharmacia) para la segunda hebra.

Ejemplo 2. Transformación de levadura y selección para osmotolerancia.

El cADN se clona en vectores pYX (Ingenius, R&D systems; 2 P basado en pYX 212 para el banco 1, ARS/CEN basado en pYX112 para el banco 2) como los fragmentos EcoRI - Xhol, utilizando un adaptador Eco RI/Not I.

En estas construcciones, el cADN está bajo el control del promotor constitutivo TPI fuerte. La cepa de levadura DY (MATa, his3, can1-100, ade2, leu2, trp1, ura3::3xSV40AP1-lacZ; proporcionada amablemente por N. Jones, Imperial Cancer Research Fund, London, UK) se ha transformado con estas colecciones de cADN, utilizando el procedimiento de transformación de Acetato de Litio (Gietz and Schietsl, 1995). Después de transformación con el banco de cADN Arabidopsis, se han seleccionado transformantes para la capacidad de crecer en la presencia de 100mM LiCl en una selección en forma de etapas (Lee et al., 1999). Se utiliza comúnmente LiCl para detección de tolerancia a la sal en levadura (Haro et al. 1991). Se han aislado diversos genes A. thaliana, que confieren osmotolerancia a la levadura (Tabla 1). Para analizar adicionalmente el potencial de los cADN de Arabidopsis seleccionados para conferir tolerancia al estrés del medio ambiente en levadura, cada transformante de levadura que expresa tales cADN de Arabidopsis seleccionados se ha expuesto al estrés osmótico y estrés por salinidad. Cada uno de los transformantes por lo tanto se hace crecer durante 16 horas en YPD (medio rico), y se ajusta la densidad celular a OD600 t 2. Se hacen diluciones en serie, 1:10, en tres etapas consecutivas. Se colocan diez microlitros de cada dilución en medio sólido YPD (control) complementado con 2 M sorbitol (estrés osmótico) o 1.2 M NaCl (estrés por salinidad) y se incuba a 28° C durante 3 días. Los resultados de esta prueba de reducción de crecimiento (ver también Lee et al., 1999) se muestran en la Tabla 1.

Ejemplo 3. Caracterización de At-DBF2.

Se ha identifica At-DBF2, un cADN 1.8 kb (SEQ ID NO 1) en esta detección que codifica una proteína predicha 60.2 kDa que muestra 81 % de similitud con el regulador transcripcional de levadura Dbf2. También se ha encontrado homología (menos de 40 % de similitud) con los homólogos putativos Dbf2 en el humano, C. elegans y Drosophila (nombrados Ndr para el Dbf2 nuclear relacionado, Millward et al. 1995). La secuencia de proteína deducida At-DBF2 (SEQ ID NO 2) contiene los dominios 11 de las proteínas quinasas (Figura 1A). Los aminoácidos que se ubican entre los residuos invariantes D y N del dominio VI no coinciden con las características de la especificidad de serina/treonina (LKPE) definida por Hanks et al. (1988) pero el péptido GSPDYIALE en el dominio VIII indicará bien la especificidad de serina/treonina y el At-DBF2 puede complementar el mutante de levadura dbf2 (Figura 1 B).

En plantas Arabidopsis maduras, el At-DBF2 se expresa en todos los órganos probados. La abundancia mayor de los transcriptos se ha encontrado en silicuas. Un análisis Southern en Arabidopsis, tabaco y tomate ha revelado que el DBF2 parece ser conservado en las plantas (ver Ejemplo 13 adelante). Cuando el At-DBF2 se ha identificado en una detección para la tolerancia de LiCl, su efecto en otras situaciones de estrés se ha probado en levadura (Figura 2).

Ejemplo 4. Sobreexpresión de DBF2 Arabidopsis y Saccharomyces cerevisiae que mejora la tolerancia al frío, al calor, a la sal y a la sequía en levadura.

Con el fin de probar si el efecto es específico para el gene de la planta, el gen de levadura DBF2 se ha sobreeexpresado en el mismo vector. Luego de una prueba de reducción de crecimiento (Figura 2 y Lee et al., 1999). Una mejora remarcable de la tolerancia al estrés se puede ver a 42° C, durante el estrés osmótico (sorbitol), y después de tratamientos de sal y frío en levadura. No existe diferencia entre la tolerancia al estrés proporcionada por el gen de planta o levadura. La mejora de la tolerancia al estrés debido a la sobreexpresión de At-DBF2 o DBF2 refleja una función para estos genes en situaciones de estrés. Por lo tanto la levadura y las plantas Arabidopsis se han expuesto al estrés osmótico inducida por sorbitol- y PEG. El At-DBF2 así como también DBF2 se induce rápidamente (1 a 2 horas) y transitoriamente luego de estrés osmótico (Figura 3A). La expresión de At-DBF2 y DBF2 se ha analizado durante otras tensiones del medio ambiente en plantas Arabidopsis o en células de levadura después del tiempo que corresponde a la inducción mayor vista en la Fig. 3A (Figura 3B). En plantas como en levadura, existe una inducción clara después de estrés por calor, sal, osmótico y a un menor grado después de frío, que se correlaciona perfectamente con tensiones a las que la sobreexpresión mejora la tolerancia. Sin embargo, se inducen muchos genes luego de estrés sin función adaptiva relevante, entre otros debido a que los mecanismos post-transcripcionales inhiben la producción posterior. Aquí la cantidad de proteína At-DBF2, cuando se detecta por los anticuerpos anti-Dbf2, claramente aumenta luego de estrés (Figura 3C).

Ejemplo 5. El At-DBF2 y DBF2 puede complementar funcionalmente la mutación hog1.

Para investigar una posible interacción entre las rutas de señalización al estrés y DBF2, el mutante sensible a la sal hog1 se transforma con At-BDF2 y DBF2. La ruta de quinasa HOG1 MAP regula la inducción osmótica de transcripción en levadura (Schuller et al. 1994). La osmosensibilidad del mutante se puede recuperar mediante la sobreexpresión de DBF2 y At-DBF2 (Figura 4).

Ejemplo 6. At-DBF2 es el ciclo celular regulado.

La expresión DBF2 es el ciclo celular regulado en donde este cumple una función en el inicio de la síntesis de ADN pero también en la división nuclear a través de su asociación con el complejo CCR4 (Komarnitsky et al. 1998, Johnston et al. 1990). Esta regulación se investiga en las plantas. Se utiliza una estirpe celular de tabaco BY-2 en la que el nivel mayor de sincronización de cultivo, comparado con otras estirpes celulares de planta se ha logrado (Shaul et al. 1996, Reicheld et al. 1995). Las células de fase estacionaria se diluyen en medio fresco y se tratan con afidicolina (células de bloqueo en el inicio de la fase S durante 24 horas, luego se lavan. El porcentaje de mitosis sincrónoma después de liberación del bloque afidicolina es aproximadamente 65 % (Figura 5A-B). Un homólogo DBF2 de tabaco 1.6-Kb (T-DBF2) se puede detectar en Northern blot con el At-DBF2 como una sonda. El nivel de transcripto de estado estable T-DBF2 claramente oscila durante el ciclo celular y está principalmente presente durante S, se reduce durante G2 hasta la última M cuando esto aumenta hasta un pico en la fase S. La expresión 7’-DBF22 ocurre claramente antes de CYCB1.2 (un marcador de las fases G2-M), pero los paralelos de uno de H4 (un marcador de fase S) excepto en la transición S/G2, en donde los transcriptos T-DBF2 declinan más temprano, y en la transición M/G1, en donde la expresión T-DBF2 aumenta más temprano. El uso de los marcadores de ciclo celular CYCB1.2 y H4 se describe en Reicheld et al.

Para seguir las fases no perturbadas G1 y S, se sincroniza la suspensión celular BY2 utilizando un procedimiento de bloqueo doble (Nagata et al., 1992). Después de la liberación del bloque afidicolina, las células se tratan durante 4 horas con propizamida al inicio de la preprofase. El porcentaje de mitosis sincrónoma después de la liberación del bloque propizamida es mayor de 75 %. El T-DBF2 se expresa periódicamente con una expresión no detectable hasta M tardío, un fuerte aumento en G1 y un pico en S medio (Figura 5C-D) que confirma los resultados de las Figuras 5A-B. Sin embargo una función para la planta DBF2 en el ciclo celular solo se puede asignar con la medición de la actividad quinasa. En levadura, los niveles de transcripto DBF2 no se correlacionan con la activación de la quinasa que ocurre mediante desfosforilación (Toyn and Johnson, 1994). No se conoce la función precisa de Dbf2 en la regulación del ciclo celular. Se ha propuesto una función esencial durante la anafase o telofase. No se ha medido la actividad en G1 a pesar de la evidencia para una función de Dbf2 en el inicio de la síntesis de ADN.

Como otras proteínas recientemente identificadas, el Dbf2 controla la transición M/G1 que es una transición del ciclo celular principal en levadura (Aerne et al. 1998). La existencia de un punto de revisión de control M/G1 se ha sugerido en células de planta (Hemmerlin and Bach 1998) pero no se ha investigado su importancia comparado con G1/S y G2/M.

La sobreexpresión de DBF2 en levadura resulta en la actividad quinasa a través del ciclo celular, que puede ser debido a la saturación de un mecanismo desactivante post-traduccional (Toyn and Johnston, 1994). La sobreexpresión del At-DBF2 funcionalmente conservado tiene más probablemente el mismo efecto. Sin embargo, la presencia de la actividad quinasa Dbf2 en el momento equivocado en el ciclo celular no afecta aparentemente su progresión. En la actividad constitutiva de contraste marcado tiene un efecto marcado en la tolerancia al estrés. La función cumplida por At-DBF2 o DBF2 en el estrés es más probablemente independiente del ciclo de división celular. Está presente la expresión At-DBF2 en todos los órganos de la planta (se observa la expresión abundante en tallos en donde solo 1-2 % de las células tienen una actividad mitótica) y se puede inducir rápidamente luego de estrés. Sin embargo, un enlace con el ciclo celular no se excluye. La tolerancia al estrés mayor en levadura que sobreexpresa DBF2 o At-DBF2 se puede correlacionar con la sobreproducción de la quinasa de G1 en donde las células de levadura son particularmente sensibles a la presión. También se considera que la mayor parte de las células de plantas se bloquean en G1 pero se conoce pobremente la relación con la respuesta al estrés.

Ejemplo 7. Transformación de célula de tabaco y construcción del vector de T-ADN recombinante

Las células BY2 se transforman establemente como se describe (Shaul et al., 1996) por la cepa Agrobacterium tumefaciens C58C1RifR (pGV2260) (Deblaere et al., 1985) que lleva los vectores binarios recombinantes pBIN-35S-At-DBF2 o pBIN-35S-ASAt-DBF2. El PBIN-35S-At-DBF2 es el vector binario de planta pBIN m-gfp4 en el que el fragmento BamHI-Sacl contiene el gen indicador gfp se reemplaza con un fragmento BamHI-Sacl que contiene el cADN At-DBF2 de pYX-At-DBF2. El p-Bin- 35S-CaMVter es el vector binario de planta pBIN19 en los sitios de restricción HindIII-Sacl de los que el fragmento hindIII-Sacl de pDH51 contiene el virus mosaico de coliflor (CaMV) se clona el promotor de ARN 35S y el terminador. El pBIN-35S-ASAt- DBF2 es el vector pBIN-35S-CaMVter en el que se clona el cADN At-DBF2 en la orientación anticodificante de pYXAt- DBF2 en los sitios de restricción BamHI-Smal, entre el promotor de ARN CaMV 35S y el terminador. Se describe más detalles en Lee et al. (1999).

Ejemplo 8. Sobreexpresión de ARN codificante y anticodificante At-DBF2 en células de planta

Las células de planta transgénicas que sobreexpresan At-DBF2 se generan para probar la función de esta proteína en la tolerancia al estrés en la planta. Las células de tabaco BY2 se transforman establemente mediante A. tumefaciens que llevan el cADN At-DBF2 conducido por el promotor de ARN CaMV 35S constitutivo fuerte. El ARN At-DBF2 anticodificante también se sobreexpresa bajo el control del mismo promotor. Se obtienen estirpes de control al transformar las células de tabaco BY2 con pBIN-35S-CaMVter. Se han seleccionado tres estirpes celulares transgénicas de tabaco que sobreexpresan At-DBF2 obtenidas independientemente con una expresión At-DBF2 alta y similar y se analizan adicionalmente. Se seleccionan tres estirpes celulares transgénicas de tabaco que sobreexpresan el At-DBF2 anticodificante que muestran un nivel de transcripto DBF2 de tabaco no detectable. La sobreexpresión de At-DBF2 y la regulación por disminución del gen endógeno por la estrategia anticodificante no resulta en diferencias significativas en el crecimiento después de 2 semanas (Fig. 12A y 12B). Por el contrario, se observan diferencias marcadas en el crecimiento después de un tratamiento de 2 semanas con NaCl, sequía inducida por PEG, frío, o altas temperaturas. Las estirpes transgénicas que sobreexpresan el At-DBF2 son claramente más tolerantes que las estirpes de control. La inhibición de la expresión endógena DBF2 se correlaciona con una sensibilidad mayor para aquellas tensiones. Para entender la base de la tolerancia al estrés en At-DBF2que sobreexpresa células de planta, la expresión génica es inducida por estrés se sigue en control y condiciones de estrés (Fig. 12C). Los homólogos de tabaco kin1 y HSP17.6A ya se inducen en células de tabaco que sobreexpresan At-DBF2- en condiciones de control en un nivel similar a aquel observado durante condiciones de estrés (sequía inducida por PEG), que sugiere que la sobreexpresión de At-DBF2 puede imitar una señal de estrés.

Ejemplo 9. La transformación de Arabidopsis y la construcción del vector de T-ADN recombinante con genes que confieren tolerancia al estrés del medio ambiente

Se transforman establemente Arabidopsis como se describe en Clarke, Wei and Lindsey (1992) mediante Agrobacterium tumefaciens C58C1RifR (pGV2260) las cepas que llevan vectores binarios recombinantes pBIN-35S-At-DBF2, pBIN-35S-At-HSP17.6A, pBIN-35S-At-c74. El pBIN-35S-At-DBF2 se describe en Lee et al. 1999. Se construye el vector binario recombinante pBIN-35S-At-HSP17.6A como sigue: el fragmento EcoRI-Xhol que contienen el cADN At-HSP17.6A en pYX-HSP17.6A (pYX212 recombinante) primero se clona en pYES2 (Invitrogen) que resulta en pYES-HSP17.6A. El fragmento BamHI-Sphl de pYES-HSP17.6A que contiene el cADN At-HSP17.6A se clona en el vector binario de planta pBIN m-gfp4 en el que el fragmento BamHI-Sacl que contiene el gen receptor gfp se elimina y se reemplaza por el cADN At-HSP17.6A. Los extremos que sobresalen 3’ generados por Sacl y Sphl tenían extremos romos mediante polimerasa de ADN T4. Se construye el pBIN-35S-c74 con una estrategia similar como pBIN-35S-AtHSP17.6A con un vector intermedio pYES-Atc74. El cADN At-c74 primero se amplifica con PCR utilizando los cebadores 5’ AAA AAA CAC ATA CAG GAA TTC 3’ (SEQ ID NO 122) y 5’ AGT TAG CTA GCT GAG CTC GAG 3’ (SEQ ID NO 123), luego el "extremo romo" clonado en el vector pYES2 se corta con Notl y BstXl y finaliza romo con la polimerasa de ADN T4. Posteriormente, el fragmento BamHI-Sphl de pYES-c74 se clona en pBlNm-gfp4 como se explica supra.

Ejemplo 10. Tolerancia al estrés del medio ambiente en células de planta

Se aíslan callos transgénicos de cada una de las estirpes transgénicas Arabidopsis transformadas con At-DBF2, At HSP17.6A y At-c74. El crecimiento de estos callos transgénicos durante el estrés por salinidad se mide y se compara con los callos de control derivados de las estirpes transgénicas Arabidopsis transformadas con pBIN-35S-CaMVter. Las piezas de callo (25 para cada estirpe transgénica) de peso fresco similar (50 a 100 mg) se hacen crecer por lo tanto en medio que induce callo (Clarke et al., 1992) complementado con 200mM NaCl. Después de dos semanas, de inspección visual, es claro que el callo transgénico transformado con At-DBF2 o At-HSP17.6A o Atc74 se ve mucho mejor que el callo transgénico de control transformado con pBIN-35S-CaMVter. Los últimos callos se vuelven amarillos y se comienzan a morir. Para confirmar la observación, se mide el peso fresco de los callos. En comparación con los callos transgénicos de control, el peso fresco de los callos transgénicos es para cada una de las tres estirpes por lo menos cinco veces mayor que el peso fresco de los callos transgénicos de control.

Ejemplo 11. Tolerancia al estrés del medio ambiente en las plantas.

Las semillas de plantas transgénicas Arabidopsis tranformadas con pBIN-35S-At-DBF2, p-BIN-35S-At-c74, o pBIN35S-At-HSP17.6A, se siembran en masa en filtros de nylon (como se describe en Verbruggen et al. 1993) se colocan en medio sólido K1 complementado con canamicina (75 microgramos/ml). Para cada vector binario recombinante pBIN por lo menos cinco estirpes transgénicas independientes se prueban para tolerancia al estrés.

En cada una de estas estirpes la sobreexpresión del transgen se ha confirmado con experimentos de hibridación Northern. Las plantas de control son aquellas transformadas con pBIN-35S-CaMVter y plantas transgénicas transformadas con pBIN-35S-AS+At-DBF2. Después de siembra, las semillas se mantienen durante la noche a 4 grados (para mejorar la germinación). El crecimiento es a 22 grados, 60 % de humedad, 16 horas de luz/8 horas de oscuridad, 70 microeinsteins. Después de 9 días de crecimiento, se transfieren filtros al medio líquido K1 complementado con 200 mM NaCl de incubación durante la noche. Las plantas se dejan recuperar durante 5 a 6 días al transferir los filtros a medio sólido K1. Bajo estas condiciones, las plantas transgénicas de control se vuelven amarillas, se inhibe su crecimiento y eventualmente luego mueren. Por el contrario, las estirpes transgénicas transformadas con At-DBF2 o At-HSP17.6A o At-c74 sobreviven muy bien (Figura 6 y Figura 11).

Para evaluar adicionalmente el alcance de la protección al estrés del medio ambiente, se exponen plantas transgénicas al estrés osmótico. Por lo tanto las semillas de plantas transgénicas Arabidopsis transformadas con pBIN-35S-At-DBF2, pBIN-35S-At-c74 o pBIN-35S-At-HSP17.6A se siembran en masa en filtros de nylon (como se describe en Verbruggen et al. 1993) se ponen en medio sólido K1 complementado con canamicina (75 microgramos/ml). Para cada vector binario recombinante pBIN se prueban por lo menos cinco estirpes transgénicas independientes para tolerancia al estrés. En cada una de estas estirpes se ha confirmado la sobreexpresión del transgen con experimentos de hibridación Northern. Las plantas de control son aquellas transformadas con pBIN35SCaMVter y plantas transgénicas transformadas con pBIN-35S-ASAt-DBF2. Después de siembra, las semillas se mantienen durante la noche a 4 grados (para mejorar la germinación). El crecimiento es a 22 grados, 60 % de humedad, 16 horas de luz/8 horas de oscuridad, 70 microeinsteins. Después de 9 días de crecimiento, se transfieren filtros al medio líquido K1 complementado con 20 % de polietilenglicol para incubación durante la noche. Las plantas se dejan recuperar durante 5 a 6 días al transferir los filtros al medio sólido K1. Bajo estas condiciones, las plantas transgénicas de control se vuelven amarillas, su crecimiento se inhibe y eventualmente mueren. Por el contrario, las estirpes transgénicas transformadas con At-DBF2, At-HSP17.6A o At-c74 sobreviven muy bien (ver Figura 7 y 13). Su crecimiento es comparable para crecer en medio de control sin polietilenglicol.

Para analizar adicionalmente el alcance de protección al estrés del medio ambiente, las plantas transgénicas se exponen a temperaturas bajas y altas. Por los tanto las semillas de las plantas transgénicas transformadas con pBIN-35S-At-DBF2 o pBIN-35S-At-c74 se siembran en masa en filtros de nylon (como se describe en Verbruggen et al. 1993) se colocan en medio sólido K1 complementado con canamicina (75 microgramos/ml). Para cada vector binario recombinante pBIN por lo menos se prueban cinco estirpes transgénicas independientes para tolerancia al estrés. En cada una de esta sobreexpresión de las estirpes del transgen se ha confirmado con experimentos de hibridación Northern. Las plantas de control son aquellas transformadas con pBIN-35S-CaMVter y plantas transgénicas transformada con pBIN-35S-ASAt-DBF2. Después de siembra, las semillas se mantienen durante la noche a 4 grados (para mejorar la germinación). El crecimiento es a 22 grados, 60 % de humedad, 16 horas de luz/8 horas de oscuridad, 70 microeinsteins. Después de 9 días de crecimiento, para los experimentos con tensiones a altas temperaturas, las plantas se exponen a 48° C durante dos horas. Para los experimentos con estrés a temperaturas bajas, las plantas se exponen a temperaturas gradualmente reducidas, por debajo de -7° C. Las plantas se dejan recuperar durante 5 a 6 días al transferir los filtros a medio sólido K1.

Bajo tensiones a baja temperatura y alta temperatura, el crecimiento de las plantas transgénicas de control se inhibe y eventualmente estas mueren. Las estirpes transgénicas transformadas con At-DBF2 o At-c74 sobreviven muy bien. Su crecimiento es comparable para crecer bajo condiciones de control con temperatura normal (ver Figura 8 y 9).

Para analizar adicionalmente el alcance de protección al estrés del medio ambiente, las plantas transgénicas se exponen a estrés por salinidad durante germinación. Las semillas maduras esterilizadas de las plantas transgénicas transformadas con pBIN-35S-At-DBF2 o pBIN- 35S-At-c74 se ponen en la parte superior de platos petri que contienen medio MS (Murashige y Skoog) con 0,8 % de agar y 30 g l-1 de sacarosa. Las plantas de control son aquellas transformadas con pBIN-35S-CaMVter. Antes de germinación y ajuste de pH 5.7, se agrega NaCl en una concentración final de 125 mM. Se utilizan tres platos petri con una media de 40-50 semillas por tratamiento en cada experimento. El experimento completo se repite dos veces. Sigue la germinación de semilla a 22° C. Las semillas se considera que germinan después que ocurre la emergencia de cotiledón verde y radical.

En el medio de control (sin 125 mM NaCl), la germinación de todas las estirpes transgénicas es muy similar entre sí y a plantas tipos natural. En medio complementado con 125 mM NaCl, las semillas de las estirpes transgénicas que sobreexpresan DBF2 o At-c74 germinan significativamente mejor que las estirpes transgénicas de control. Menos de 10 % de las semillas de las estirpes transgénicas transformadas con pBIN-35S-CaMVter germinan bajo estas condiciones. En contraste, más de 70 % de las semillas de las estirpes transgénicas que sobreexpresan At-DBF2 o At-c74 germinan en medio que contiene 125 mM NaCl (Figura14).

Ejemplo 12. Hibridación Southern de genes At-DBF2 en otras plantas

Para investigar si existe los homólogos DBF2 en otras especies de planta, se realiza un análisis de hibridación Southern utilizando el At-DBF2 de longitud completa como una sonda. Se extrae ADN genómico de tabaco, tomate y arroz de acuerdo con Dellaporta et al. (1983) y se purifica adicionalmente mediante extracciones de fenol :

cloroformo. Se digiere el ADN (10 μg) con enzimas de restricción y se separan 1% (p/v) de geles de agarosa utilizando ADN Lambda digerido con Hind III como estándares de tamaño molecular. El ADN se transforma en membranas de nylon (Hybond N; Amersham, little Chalfont, UK) en 0.4 N NaOH. Los filtros se entrecruzan UV durante 30 segundos, se prehibridan durante 3 horas a 56° C en solución de hibridación (2x SSPE, 0.1 % (p/v) SDS, 5 5x solución de Denhardt) utilizando 200 gm-3 de ADN de esperma de salmón desnaturalizado, y se hibridan durante la noche con sondas radiomarcadas. El 1X SSPE es 0.15 M NaCl/ 0.01 M dihidrogen fosfato de sodio / 1 mM EDTA.

Los filtros se lavan a 56° C en 2x SSPE, 0.1 % (p/v) SDS durante 20 min, luego 1x SSPE, 0.1 % (p/v) SDS durante 20 min, y finalmente en 0.1 x SSPE, 0.1 % (p/v) SDS durante 20 min. Los filtros se exponen a película de rayos X (Kodak X-AR ; Kodak, NY, USA) en la presencia de intensificar detecciones durante 24 horas.

10 Los resultados de los experimentos de hibridación muestran que el tabaco, tomate y arroz tienen por lo menos un homólogo para At-DBF2.

Tabla 1

Función putativa en

Características de la proteína codificada SEQ ID NO. Crecimiento en medio con 1,2 NaCl crecimiento en medio con 2,0 M sorbitol

señalización

Similar a una proteína de ciclo celular DBF2 de levadura 1 ++++ ++++

metabolismo

HSP17.6A 3 ++++ ++++

desconocido

C74 5 +++ +++

metabolismo

Similar a AD H2 7 + ++++

metabolismo

Similar a D. melanogaster catalasa/catalasa 3 9 ++++ +

metabolismo

Similar a la familia de proteína de choque término HSP90 11 ++++ ++++

metabolismo

similar a fosfoenolpiruvato carboxilasa 13 + +++

metabolismo

Proteínas relacionadas con patógeno, clase 10 15 + ++++

metabolismo

Peroxidasa de ascorbato Arabidopsis 17 ++++ ++++

metabolismo

similar a la proteína de unión fosfatasa 19 ++++ ++++

metabolismo

similar a la proteína de unión fosfatasa 21 ++++ ++++

metabolismo

similar a la retinol deshidrogenasa 23 +++ ++++

metabolismo

similar a la retinol deshidrogenasa 25 ++++ ++++

(continuación) (continuación) (continuación) (continuación)

Función putativa en

Características de la proteína codificada SEQ ID NO. Crecimiento en medio con 1,2 NaCl crecimiento en medio con 2,0 M sorbitol

metabolismo

Proteína ribosómica 27 ++++ ++++

metabolismo

Proteína ribosómica 29 ++++ ++++

metabolismo

similar a un transportador de proteína (homólogo de quinasa) 31 ++++ ++++

metabolismo

similar a un trasportador de péptido 33 ++++ +

metabolismo

similar a un transportador de catión de baja afinidad de trigo LCT1 35 ++++ ++++

metabolismo

similar a iso-1- citocromo c de levadura (CYC-1) 37 ++++ ++++

metabolismo

similar a la levadura OSM1 39 ++++

metabolismo

similar al gen de retoma de cobre de levadura (CUP1) 41 ++++ +++

metabolismo

similar a la proteína de reparación de daño inducido por UV de levadura (RAD7) 43 ++++ ++++

metabolismo

Transportador de electrón, apocitocromo b 45 ++++ ++++

metabolismo

similar a la lipoproteína de membrana LPPL1 47 ++++ ++++

metabolismo

similar a la proteína de unión auxina de tabaco 49 + ++++

metabolismo

similar a la proteínad e unión citoquinina CBP 57 51 +++ ++++

señalización

similar a la calcineurina B de levadura de proteína de unión a calcio 53 +++ ++++

señalización

similar a calnexina max de glicina de proteína de unión a calcio 55 ++++ +++

Función putativa en

Características de la proteína codificada SEQ ID NO. Crecimiento en medio con 1,2 NaCl crecimiento en medio con 2,0 M sorbitol

señalización

Similar a calreticulin Dictyostelium discoideum de la proteína de unión a calcio 57 ++++ ++++

señalización

similar a calmodulin 1 de la proteína de unión a calcio 59 ++++ +

señalización

similar a calmodulin 2 de la proteína de unión a calcio 61 + ++++

señalización

Quinasa de la quinasa MAP, homólogo a Dyctyostelium mekA (DdMek1) 63 ++++ +++

señalización

similar a la quinasa adenosina humana 65 + ++++

señalización

Similar a la tirosina quinasa humana 67 ++++ ++++

señalización

similar a la tirosina quinasa de planta helada común 69 ++++ ++++

señalización

similar al receptor de quinasa C de proteína de levadura 71 ++++ ++++

señalización

similar a la proteína homeótica de tabaco y Arabidopsis HAT7 73 ++ ++++

señalización

similar al regulador del factor sigma E. coli (RSEB) 75 + ++++

señalización

similar a la fosfatasa 2C de proteína humana 77 ++++ ++++

metabolismo

Proteínas abundantes en embriogenia tardía, proteína Arabidopsis LEA 10 & 14 79 ++ ++++

metabolismo

Proteínas abundantes en embriogenia tardía, proteína Arabidopsis LEA 10 & 14 81 ++ ++++

Función putativa en

Características de la proteína codificada SEQ ID NO. Crecimiento en medio con 1,2 NaCl crecimiento en medio con 2,0 M sorbitol

metabolismo

Proteínas relacionadas con patógeno, clase 10 83 ++++ ++++

metabolismo

Peroxidasa de pared celular 85 ++++ +++

metabolismo

Proteína ribosómica 87 +++ ++++

metabolismo

Proteína que induce estrés por salinidad, SAS 1 89 ++++ ++++

metabolismo

Gen PR (AlG2) 91 ++++ ++++

metabolismo

MT1 c 93 ++++ ++++

metabolismo

IPP2 (Isopentenil difosfato) 95 +++ ++++

metabolismo

Proteína de unión clorofilo a/b 97 +++ +++

metabolismo

glutationa transferasa 99 ++ ++++

señalización

Quinasa dependiente de calcio, inducida de ABA y frío, Kin1 101 ++++ ++++

señalización

Quinasa MAP, Atmpk1 103 ++ ++++

señalización

Histona H2A de proteína de ciclo celular Arabidopsis 105 ++++ ++++

Desconocido

cromosoma 4 – secuencia 107 +++ ++++

desconocido

cromosoma 4 – secuencia 109 + ++++

desconocido

cromosoma 5 – secuencia 111 ++++ +++

desconocido

cromosoma 5 – secuencia 113 ++++ ++

desconocido

cromosoma 5 – secuencia 115 ++++ ++++

desconocido

cromosoma 5 – secuencia 117 + ++++

Función putativa en

Características de la proteína codificada SEQ ID NO. Crecimiento medio conNaCl en 1,2 crecimiento en medio con 2,0 M sorbitol

desconocido

cromosoma 5 – secuencia 119 + ++++

señalización

similar a centrina de la proteína de unión a calcio (caltractina) 121 ++++ ++++

TABLA 2 (continuación) (continuación)

PROMOTORES QUE PUEDEN EXPRESAR LA PLANTA DE EJEMPLO PARA USO EN EL DESEMPEÑO DELA PRESENTE INVENCIÓN

FUENTE DE GEN

PATRÓN DE EXPRESIÓN REFERENCIA

a-amIlasA (Amy32b)

Aleurona Lanahan et al (1992); Skriver et al. (1991)

Gen similar a catepsina �

Aleurona Cejudo et al. (1992)

Agrobacterium rhizogenes ro/ B

Cambium Nilsson et al. (1997)

genes PRP

Pared celular http://salus.medium.edu/ mmg/ tierney/html

Promotor de cebada ltr1

Endospermo

Promotor sintético

Endospermo Vicente-Carbajosa et al. (1998)

AtPRP4

Flores http://salus.medium.edu/ mmg/ tierney/html

sintasa chaleno (chsA)

Flores van der Meer et al. (1990)

apetala-3

Flores

Chitinasa

frutos (bayas, uvas, etc.) Thomas et al. CSIRO Plant Industry, Urrbrae, South Australia, Australia; http://winetitles.com.au /gwrdc/csh95-1.html

rbcs-3A

Tejido verde (por ejemplo hoja) Lam et al. (1990); Tucker et al. (1992)

Genes específicos de hoja

Hoja Baszczynski et al. (1988)

AtPRP4

Hoja http://salus.medium.edu/ mmg/ tierney/html

Pinus cab-6

Hoja Yamamoto et al. (1994)

PROMOTORES QUE PUEDEN EXPRESAR LA PLANTA DE EJEMPLO PARA USO EN EL DESEMPEÑO DELA PRESENTE INVENCIÓN

FUENTE DE GEN

PATRÓN DE EXPRESIÓN REFERENCIA

SAM22

Hoja senescente Crowell et al. (1992)

Gen R. japonicum nif

Nódulo Patente Estadounidense No. 4, 803, 165

Gen B. japonicum nifH

Nódulo Patente Estadounidense No. 5, 008, 194

GmENOD40

Nódulo Yang et al. (1993)

Carboxilasa PEP (PEPC)

Nódulo Pathirana et al. (1992)

Leghemoglobina (Lb)

Nódulo Gordon et al. (1993)

Gen del virus Tungro bacilliform

Floema Bhattacharyya-Pakrasi et al. (1992)

Gen de la proteína de unión a sacarosa

Membrana de plasma Grimes et al. (1992)

Genes específicos de polen

polen; microespora Albani et al. (1990); Albani et al. (1991)

Gen específico de polen de maíz

Polen Hamilton et al. (1992)

Gen que expresa el polen de girasol

Polen Baltz et al. (1992)

Gen específico de polen B. napus

polen; antera; tapetum Arnoldo et al. (1992)

Genes que pueden expresar la raíz

Raíces ingey et al. (1987); An et al. (1988);

Gen inducible de auxina de tabaco

Punta de raíz Van der Zaal et al. (1991)

�-tubulina

Raíz Oppenheimer et al. (1988)

Genes específicos de raíz de tabaco

Raíz Conkling et al. (1990)

Gen B. napus G1-3b

Raíz Patente Estadounidense No. 5, 401, 836

SbPRP1

Raíces Suzuki et al. (1993)

AtPRP1; AtPRP3

Raíces; vellosidades de raíz http://salus.medium.edu/ mmg/ tierney/html

Gen RD2

Corteza de raíz http://www2.cnsu.edu/ncsu/research

Gen TobRB7

Vasculatura de raíz http://www2.cnsu.edu/ncsu/research

PROMOTORES QUE PUEDEN EXPRESAR LA PLANTA DE EJEMPLO PARA USO EN EL DESEMPEÑO DELA PRESENTE INVENCIÓN

FUENTE DE GEN

PATRÓN DE EXPRESIÓN REFERENCIA

AtPRP4

hojas; flores; raíz lateral http://salus.medium.edu/ primordia mmg /tierney/html

Genes específicos de semilla

Seed Simon et al. (1985); Scofield et al. (1987); Baszczynski et al. (1990)

Albúmina de Nuez de Brasil

Semillas Pearson et al. (1992)

Leguminas

Semilla Ellis et al. (1988)

Glutelina (arroz)

Semilla Takaiwa et al. (1986); Takaiwa et al. (1987)

Zeína

Semilla Matzke et al. (1990)

NapA

Semilla Stalberg et al. (1996)

Oleosina de girasol

Semilla (embrión y semilla seca) Cummins et al. (1992)

LEAFY

meristema de brote Weigel et al. (1992)

Arabidopsis thaliana knat1

meristema de brote Número de acceso AJ131822

Malus domestica kn1

meristema de brote Número de acceso Z71981

CLAVATA1

meristema de brote Número de acceso AF049870

Genes específicos de estigma

Estigma Nasrallah et al. (1988); Trick et al. (1990)

Gen patatin clase I

Tubérculo Liu et al. (1991)

Blz2

Endospermo EP99106056.7

PCNA

Meristema de arroz Kosugi et al (1991); Kosugi y Ohashi (1997)

Tabla 3. Promotores inducibles de estrés (continuación)

Nombre

Estrés Referencia

P5CS (delta(1)-pirrolina-5carboxilato sintasa)

Sal, agua Zhang et al; Plant Science. Oct 28 1997; 129 (1): 81-89

cor15a

Frío Hajela et al., Plant Physiol. 93: 1246-1252 (1990)

Nombre

Estrés Referencia

cor15b

Frío Wlihelm et al., Plant Mol Biol. 1993 Dec; 23 (5):1073-7

cor15a (-305 a +78 nt)

Frío, sequía Baker et al., Plant Mol Biol. 1994 Mar; 24(5): 701-13

rd29

Sal, sequía, frío Kasuga et al., Nature Biotechnology, vol 18, 287291,1999

Proteínas de choque término, que incluye promotores artificiales que contienen el elemento de choque término (HSE)

Calor Barros et al., Plant Mol Biol, 19(4): 665-75, 1992. Marrs et al., Dev Genet., 14 (1): 27-41, 1993. Schoffl et al., Mol Gen Gent, 217(2-3): 246-53, 1989.

smHSP (proteínas de choque término pequeñas)

Calor Waters et al, J Experimental Botany, vol 47, 296, 325-338, 1996

wcs120

Frío Ouellet et al., FEBS Lett. 423, 324-328 (1998)

ci7

Frío Kirch et al., Plant Mol Biol, 33(5): 897-909, 1997 Mar

Adh

frío, sequía, hipoxia Dolferus et al., Plant Physiol, 105(4): 1075-87, 1994 Aug

pwsi18

agua: sal y sequía Joshee et al., Plant Cell Physiol, 39(1): 64-72, 1998, Jan

ci21A

Frío Schneider et al., Plant Physiol, 113(2): 335-45, 1997

Trg-31

Sequía Chaudhary et al., Plant Mol Biol, 30(6): 1247-57, 1996

Osmotina

Osmótico Raghothama et al., Plant Mol Biol, 23(6): 1117-28, 1993

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> CROPDESIGN N.V. 5 <120> Genes involucrados en tolerancia al estrés del medio ambiente

<130> CROP-014-EP-DIV

<140>

<141>

<150> 98202634.6 10 <151> 1998-08-04

<160> 126

<170> PatentIn Ver. 2.1

<210> 1

<211> 1909 5 <212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<220>

<221> CDS

<222> (40)..(1626) 10 <400> 1

<210> 2

<211> 528

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 2

<210> 3

<211> 695

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<220>

<221> CDS

<222> (94)..(564)

<400> 3

<210> 4

<211> 156

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 4

<210> 5

<211> 1311

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<220>

<221> CDS

<222> (133)..(1083)

<400> 5

<210> 6

<211> 316

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 6

<210> 7

<211> 863

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<220>

<221> CDS

<222> (19)..(837)

<400> 7

<210> 8

<211> 272

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 8

<210> 9 5 <211> 3107

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<220>

<221>

CDS 10 <222> (20)..(34)

<220>

<221> CDS

<222> (958)..(1054)

<220>

<221>

CDS 5 <222> (1209)..(1486)

<220>

<221> CDS

<222> (1578)..(2354)

<220> 10 <221> CDS

<222> (2440)..(2529)

<220>

<221> CDS

<222> (2629)..(2790) 15 <220>

<221> CDS

<222> (2884)..(2943)

<400> 9

<210> 10

<211> 492

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 10

<210> 11

<211> 2687

<212> ADN 5 <213> Arabidopsis thaliana

<220>

<221> CDS

<222> (67)..(204)

<220> 10 <221> CDS

<222> (521)..(661)

<220>

<221> CDS

<222> (745)..(1026) 15 <220>

<221> CDS

<222> (1114)..(2667)

<400> 11

<210> 12

<211> 704

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 12

<210> 13

<211> 2932

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<220>

<221> CDS

<222> (18)..(2924)

<400> 13

<210> 14

<211> 968

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 14

<210> 15

<211> 271

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<220>

<221> CDS

<222> (17)..(259)

<400> 15

<210> 16

<211> 80 10 <212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 16

<210> 17 15 <211> 2580

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<220> <221> CDS

<222> (30)..(143)

<220>

<221> CDS

<222> (295)..(417)

<220>

<221> CDS

<222> (582)..(632)

<220>

<221> CDS

<222> (1179)..(1245)

<220>

<221> CDS

<222> (1334)..(1383)

<220>

<221> CDS

<222> (1497)..(1577)

<220>

<221> CDS

<222> (1661)..(1740)

<220>

<221> CDS

<222> (1882)..(1984)

<220>

<221> CDS

<222> (2370)..(2564)

<400> 17

<210> 18

<211> 287

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 18

<210> 19

<211> 1861

<212> ADN 5 <213> Arabidopsis thaliana

<220>

<221> CDS

<222> (26)..(284)

<220>

10 <221> CDS

<222> (541)..(917)

<220>

<221> CDS

<222> (1257)..(1493)

<220>

<221> CDS

<222> (1584)..(1853)

<400> 19

<210> 20

<211> 380

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 20

<210> 21

<211> 3633

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<220>

<221> CDS

<222> (41)..(356)

<220>

<221> CDS

<222> (811)..(956)

<220>

<221> CDS

<222> (1076)..(1389)

<220>

<221> CDS

<222> (1544)..(1592)

<220>

<221> CDS

<222> (1925)..(2010)

<220>

<221> CDS

<222> (2037)..(2120)

<220>

<221> CDS

<222> (2399)..(2501)

<220>

<221> CDS

<222> (2621)..(2718)

<220>

<221> CDS

<222> (2802)..(2924)

<220>

<221> CDS

<222> (3071)..(3185)

<220>

5 <221> CDS

<222> (3324)..(3431)

<220>

<221> CDS

<222> (3518)..(3619) 10 <400> 21

<210> 22

<211> 546

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 22

<210> 23

<211> 1108 5 <212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<220>

<221> CDS

<222> (22)..(1107) 10 <400> 23

<210> 24

<211> 361

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 24

<210> 25

<211> 1071

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<220>

<221> CDS

<222> (9)..(1055)

<400> 25 <210> 26

<211> 348

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 26

<210> 27

<211> 768

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<220>

<221> CDS

<222> (3)..(752)

<400> 27

<210> 28

<211> 249

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 28

<210> 29 5 <211> 1201

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<220>

<221> CDS 10 <222> (24)..(35)

<220>

<221> CDS

<222> (147)..(187)

<220>

<221> CDS

<222> (283)..(383)

<220> 5 <221> CDS

<222> (689)..(833)

<220>

<221> CDS

<222> (916)..(1005) 10 <220>

<221> CDS

<222> (1103)..(1196)

<400> 29 <210> 30 <211> 160

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 30

<210> 31

<211> 1790

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana 10 <220>

<221> CDS

<222> (23)..(1780)

<400> 31

<210> 32

<211> 585

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 32

<210> 33

<211> 1984

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<220>

<221> CDS

<222> (20)..(1975)

<400> 33

<210> 34

<211> 651

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 34

<210> 35

<211> 1736

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1605)

<400> 35

<210> 36

<211> 534

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 36

<210> 37

<211> 508

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<220>

<221> CDS

<222> (18)..(77)

<220>

<221> CDS

<222> (156)..(314)

<220>

<221> CDS

<222> (374)..(493)

<400> 37

10 <210> 38

<211> 112

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 38

<210> 39

<211> 5156

<212> ADN 5 <213> Arabidopsis thaliana

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(609)

<220> 10 <221> CDS

<222> (686)..(841)

<220>

<221> CDS

<222> (933)..(1040) 15 <220>

<221> CDS

<222> (1130)..(1240)

<220>

<221> CDS 20 <222> (1341)..(2729)

<220>

<221> CDS

<222> (2772)..(2984)

<220>

<221> CDS

<222> (4112)..(4200)

<220> 5 <221> CDS

<222> (4241)..(4332)

<220>

<221> CDS

<222> (4478)..(4521) 10 <220>

<221> CDS

<222> (5088)..(5156)

<400> 39

<210> 40

<211> 959 <212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 40

<210> 41

<211> 6960

<212> ADN 5 <213> Arabidopsis thaliana

<220>

<221> CDS

<222> (147)..(327)

<220> 10 <221> CDS

<222> (405)..(796)

<220>

<221> CDS

<222> (1426)..(1500) 15 <220>

<221> CDS

<222> (3486)..(3638)

<220>

<221> CDS 20 <222> (3754)..(3864)

<220>

<221> CDS

<222> (4030)..(4096)

<220> 5 <221> CDS

<222> (4252)..(4523)

<220>

<221> CDS

<222> (4732)..(4834) 10 <220>

<221> CDS

<222> (6735)..(6907)

<400> 41

<210> 42

<211> 508

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 42

<210> 43

<211> 729

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<220>

<221> CDS

<222> (26)..(718)

<400> 43

<210> 44

<211> 230

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 44

<210> 45

<211> 1203

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<220>

<221> CDS

<222> (12)..(1193)

<400> 45

<210> 46

<211> 393

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 46 <210> 47

<211> 1194

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1194)

<400> 47

<210> 48

<211> 397

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 48

<210> 49

<211> 611

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<220>

<221> CDS

<222> (5)..(601)

<400> 49

<210> 50

<211>

198 10 <212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 50

<210> 51

<211>

1398 5 <212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1398) 10 <400> 51

<210> 52

<211> 464

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 52

<210> 53

<211> 771

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana <220>

<221> CDS

<222> (1) .. (537)

<400> 53

<210> 54

<211> 178

<212> PRT

<213>

Arabidopsis thaliana 10 <400> 54

<210> 55

<211> 1617

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<220>

<221> CDS

<222> (10)..(1557)

<400> 55

<210> 56

<211> 515

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 56

<210> 57

<211> 1281

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<220>

<221> CDS

<222> (13)..(1266)

<400> 57

<210> 58

<211> 417

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 58

<210> 59

<211> 416

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(411)

<400> 59

<210> 60

<211> 136

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 60

<210> 61

<211> 6069

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<220>

<221> CDS

<222> (34)..(173)

<220>

<221> CDS

<222> (282)..(492)

<220>

<221> CDS

<222> (539)..(1135)

<220>

<221> CDS

<222> (1224)..(1320)

<220>

<221> CDS

<222> (1404)..(1585)

<220>

<221> CDS

<222> (1663)..(1778)

<220>

<221> CDS

<222> (1891)..(1993)

<220>

<221> CDS

<222> (2114)..(2266)

<220>

<221> CDS

<222> (2376)..(2522)

<220>

<221> CDS

<222> (2608)..(2808)

<220>

<221> CDS

<222> (3071)..(3235)

<220>

<221> CDS

<222> (3315)..(3419)

<220>

<221> CDS

<222> (3519)..(3656)

<220>

<221> CDS

<222> (3742)..(3936)

<220>

<221> CDS

<222> (4061)..(4187)

<220>

<221> CDS

<222> (4268)..(4470)

<220>

<221> CDS

<222> (4556)..(4738)

<220>

<221> CDS

<222> (4809)..(4904)

<220>

<221> CDS

<222> (4991)..(5188)

<220>

<221> CDS

<222> (5509)..(5780)

<220>

<221> CDS

<222> (5879)..(6059)

<400> 61

<210> 62

<211> 1269

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 62

<210> 63

<211> 2105

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1947)

<400> 63

<210> 64

<211> 648

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 64

<210> 65

<211> 920

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<220>

<221> CDS

<222> (26)..(907)

<400> 65

<210> 66

<211> 293

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 66

<210> 67

<211> 1257

<212> ADN

<213>

Arabidopsis thaliana 10 <220>

<221> CDS

<222> (13)..(1245)

<400> 67

<210> 68

<211> 410

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 68

<210> 69

<211> 3240

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<220>

<221> CDS

<222> (69)..(236)

<220>

<221> CDS

<222> (420)..(506)

<220>

<221> CDS

<222> (581)..(822)

<220>

<221> CDS

<222> (907)..(1126)

<220>

<221> CDS

<222> (1276)..(1355)

<220>

<221> CDS

<222> (1442)..(1526)

<220>

<221> CDS

<222> (1684)..(1815)

<220>

<221> CDS

<222> (1911)..(2024)

<220>

<221> CDS

<222> (2196)..(2243)

<220>

<221> CDS

<222> (2734)..(2818)

<220> 5 <221> CDS

<222> (2928)..(2984)

<220>

<221> CDS

<222> (3079)..(3191) 10 <400> 69

<210> 70

<211> 476

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 70

<210> 71

<211> 979

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<220>

<221> CDS

<222> (28)..(843)

<400> 71

<210> 72

<211> 271

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 72

<210> 73

<211> 1260

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<220>

<221> CDS 5 <222> (101)..(155)

<220>

<221> CDS

<222> (254)..(660)

<220>

10 <221> CDS

<222> (750)..(1193)

<400> 73

<210> 74

<211> 301

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 74

<210> 75

<211> 1122

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<220>

<221> CDS

<222> (22)..(1122)

<400> 75

<210> 76

<211> 366

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 76

<210> 77

<211> 1650

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<220>

<221> CDS

<222> (21)..(203)

<220>

5 <221> CDS

<222> (291)..(482)

<220>

<221> CDS

<222> (633)..(838) 10 <220>

<221> CDS

<222> (1044)..(1605)

<400> 77

<210> 78

<211> 380

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 78

<210> 79

<211> 589

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<220>

<221> CDS

<222> (18)..(575)

<400> 79

<210> 80

<211> 185 10 <212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 80

<210> 81

<211> 1376

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<220>

<221> CDS

<222> (20)..(1366)

<400> 81

<210> 82

<211> 448

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 82

<210> 83

<211> 561

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<220>

<221> CDS

<222> (18)..(548)

<400> 83

<210> 84

<211> 176

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 84

<210> 85

<211> 988

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<220>

<221> CDS

<222> (12)..(977)

<400> 85

<210> 86

<211> 321

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 86

<210> 87

<211> 650

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<220>

<221> CDS

<222> (8)..(634)

<400> 87

<210> 88

<211> 208

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 88

<210> 89

<211> 1223

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<220>

<221> CDS

<222> (16)..(1215)

<400> 89

<210> 90

<211> 399

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 90

<210> 91

<211> 536

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<220>

<221> CDS

<222> (12)..(524)

<400> 91

<210> 92 10 <211> 170

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 92 <210> 93

<211> 293

<212> ADN 5 <213> Arabidopsis thaliana

<220>

<221> CDS

<222> (16)..(71)

<220> 10 <221> CDS

<222> (197)..(278)

<400> 93

<210> 94

<211> 45

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 94

<210> 95

<211> 880 10 <212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<220>

<221> CDS

<222> (14)..(868) 15 <400> 95

<210> 96

<211> 284

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 96

<210> 97

<211> 831

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<220>

<221> CDS

<222> (18)..(821)

<400> 97

<210> 98 <211> 267

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 98

<210> 99

<211> 855

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana 10 <220>

<221> CDS

<222> (15)..(164)

<220>

<221> CDS

<222> (257)..(305)

<220>

<221> CDS

<222> (416)..(843)

<400> 99

<210> 100

<211> 208

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 100

<210> 101

<211> 512

<212> ADN 5 <213> Arabidopsis thaliana

<220>

<221> CDS

<222> (12)..(67)

<220> 10 <221> CDS

<222> (241)..(309)

<220>

<221> CDS

<222> (417)..(492) 15 <400> 101

<210> 102

<211> 66

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 102

<210> 103

<211>

1138 10 <212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<220>

<221> CDS

<222> (11)..(1123)

<400> 103

<210> 104

<211> 370

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 104

<210> 105

<211> 445

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<220>

<221> CDS

<222> (20)..(430)

<400> 105

<210> 106

<211>

136 10 <212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 106

<210> 107

<211> 930

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<220>

<221> CDS

<222> (14)..(916)

<400> 107

<210> 108

<211> 300

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 108

<210> 109

<211> 2640

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<220>

<221> CDS

<222> (145) .. (981)

<220>

<221> CDS 5 <222> (1439)..(1727)

<220>

<221> CDS

<222> (1817)..(2126)

<220> 10 <221> CDS

<222> (2204)..(2330)

<220>

<221> CDS

<222> (2405)..(2518) 15 <400> 109

<210> 110

<211> 558

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 110

<210> 111

<211> 1560

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<220>

<221> CDS

<222> (130)..(265)

<220>

<221> CDS

<222> (386)..(515)

<220>

<221> CDS

<222> (622)..(1480)

<400> 111

<210> 112

<211> 374

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 112

<210> 113

<211> 3790 <212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<220>

<221> CDS 5 <222> (38)..(1597)

<220>

<221> CDS

<222> (1717)..(1943)

<220> 10 <221> CDS

<222> (2052)..(2384)

<220>

<221> CDS

<222> (2468)..(2714) 15 <220>

<221> CDS

<222> (2800)..(2928)

<220>

<221> CDS 20 <222> (3020)..(3203)

<220>

<221> CDS

<222> (3532) .. (3773)

<400> 113

<210> 114

<211> 947

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 114

<210> 115

<211> 1200

<212> ADN 5 <213> Arabidopsis thaliana

<220>

<221> CDS

<222> (25)..(151)

<220> 10 <221> CDS

<222> (257)..(357)

<220>

<221> CDS

<222> (465)..(662) 15 <220>

<221> CDS

<222> (783)..(1166)

<400> 115

<210> 116

<211> 269

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 116

<210> 117

<211> 1399

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<220>

<221> CDS

<222> (25)..(1386)

<400> 117

<210> 118

<211> 453

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 118

<210> 119

<211> 3180

<212> ADN 5 <213> Arabidopsis thaliana

<220>

<221> CDS

<222> (8)..(1781)

<220> 10 <221> CDS

<222> (1833)..(2609)

<220>

<221> CDS

<222> (2697)..(3076) 15 <400> 119

<210> 120

<211> 976

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 120

<210> 121

<211> 731

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 121

<210> 122

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<400> 122 aaaaaacaca tacaggaatt c

<210> 123

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<400> 123 agttagctag ctgagctcga g REFERENCIAS Adams et al. (1983), J. Am. Chem. Soc. 105:661 Aerne et al. (1998). Molecular Biology of the Cell,vol 9, 945-956. Bray et al. (1997), Plant responses to water deficit. Trends Plant Sci 2, 48-54 Carruthers et al. (1982), Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 47:411-418 Capecchi (1989), Science 244:1288-1292 Deblaere et al. (1985), Efficient octopine Ti plasmid-derived vectors for Agrobacterium-mediated gene transfer to

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Claims (16)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un ácido polinucleico aislado como se identifica por:

   (a)

   SEQ ID NO 73, o la hebra complementaria de la misma;

   (b)

   secuencias de ácidos polinucleicos que hibridan a la secuencia definida en (a); o,

   (c)

   secuencias de ácidos polinucleicos que se degeneran como resultado del código genético para la secuencia de ácido polinucleico definida en (a) o (b);

   en donde el ácido polinucleico de (a) a (c) codifica un polipéptido de la SEQ ID NO: 74.

2. 2.

   Un polipéptido aislado que tiene la secuencia de la SEQ ID NO 74.

3. 3.

   Un método para producir una planta con tolerancia o resistencia mejorada al estrés osmótico, dicho método comprende introducir transitoriamente en una célula de planta un ADN recombinante aislado que comprende:

   -

   un ácido polinucleico de o como se define en la reivindicación 1, y

   -

   un promotor heterólogo que se puede expresar en la planta, por lo que dicho ácido polinucleico está en la misma unidad transcripcional y bajo el control de dicho promotor heterólogo que se puede expresar en la planta, por lo que dicho ácido polinucleico se expresa en una cantidad efectiva para conferir tolerancia o resistencia mejorada al estrés osmótico.

4. 4. Un método para producir una planta con tolerancia o resistencia mejorada al estrés osmótico, dicho método comprende introducir establemente en una célula de planta un ADN recombinante aislado que comprende:

   -

   un ácido polinucleico de o como se define en la reivindicación 1, y

   -

   un promotor heterólogo que se puede expresar en la planta, por lo que dicho ácido polinucleico está en la misma unidad transcripcional y bajo el control de dicho promotor heterólogo que se puede expresar en la planta, por lo que dicho ácido polinucleico se expresa en una cantidad efectiva para conferir tolerancia o resistencia mejorada al estrés osmótico.

5. 5.

   Un ácido polinucleico recombinante que comprende: un ácido polinucleico de acuerdo con o como se define en la reivindicación 1, y, un promotor heterólogo que se puede expresar en la planta, por lo que dicho ácido polinucleico está en la misma

   unidad transcripcional y bajo el control de dicho promotor heterólogo que se puede expresar en la planta.

6. 6.

   El ácido polinucleico recombinante de la reivindicación 5 en donde dicho promotor heterólogo que se puede expresar en la planta es un promotor constitutivo.

7. 7.

   El ácido polinucleico recombinante de la reivindicación 5 en donde dicho promotor heterólogo que se puede expresar en la planta es un promotor específico de tejido o de órgano o que puede inducir estrés.

8. 8.

   El ácido polinucleico recombinante de la reivindicación 5 en donde dicho promotor heterólogo que se puede expresar en la planta es el promotor 35S de CaMV.

9. 9.

   Una célula anfitriona recombinante transformada con y que comprende el ácido polinucleico recombinante de la reivindicación 5.

10. 10.

    Una célula de planta transformada con y que comprende un ácido polinucleico recombinante de la reivindicación

11. 5.

12. 11.

    Una planta que consiste esencialmente de células de planta de la reivindicación 10.

13. 12.

    Un callo que consiste esencialmente de células de planta de la reivindicación 10.

14. 13.

    Una parte cosechable, órgano, tejido o material de propagación de una planta de la reivindicación 11, que comprende el ácido polinucleico recombinante de la reivindicación 5.

15. 14.

    El uso de un ácido polinucleico recombinante de la reivindicación 5 para producir plantas transgénicas.

16. 15.

    Una composición que comprende una secuencia de ácidos polinucleicos de o como se define en la reivindicación 1.

    FIGURA 1 A FIGURA 1B FIGURA 2 FIGURA 3

    FIGURA 6 FIGURA 7 FIGURA 8 FIGURA 9 FIGURA 10

    FIGURA 13 FIGURA 14