DE69620766T2

DE69620766T2 - Verfahren zur herstellung von polypeptidabkömmlingen

Info

Publication number: DE69620766T2
Application number: DE69620766T
Authority: DE
Inventors: Sigurd Jens OKKELS
Original assignee: Novozymes AS
Current assignee: Novozymes AS
Priority date: 1995-08-11
Filing date: 1996-08-12
Publication date: 2004-11-18
Anticipated expiration: 2016-08-13
Also published as: EP1213350A2; AU6655396A; JP4156666B2; JPH11510700A; EP1213350A3; DK0843725T3; AU6655496A; WO1997007206A1; CN1192782A; CN1128875C; EP0843725A1; ATE216427T1; EP0843725B1; US20030148441A1; DE69620766D1; US20050124066A9; WO1997007205A1; US20050048649A1

Description

UMFELD DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Polypeptidvarianten durch in vivo Rekombination.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Vorteile biologisch aktive Polypeptide durch Klonierung natürlich vorkommender DNA-Sequenzen von Mikroorganismen, wie Pilzorganismen und Bakterien unter Verwendung von rekombinanter DNA-Technologie herzustellen, sind seit einigen Jahren bekannt.
Die Herstellung neuer Polypeptidvarianten und -mutanten, wie neuer modifizierter Enzyme mit veränderten Eigenschaften, z. B. spezifische Aktivität, Substratspezifität, pH-Optimum, pI, K_m, V_max etc., wurden insbesondere während der letzten Jahre sorgfältig und erfolgreich verwendet, um Polypeptide mit verbesserten Eigenschaften zu erhalten.
Beispielsweise wurde innerhalb des technischen Felds von Enzymen die Leistung beim Waschen und/oder beim Geschirrspülen von z. B. Proteasen, Lipasen, Amylasen und Cellulasen signifikant verbessert.
In den meisten Fällen wurden diese Verbesserungen durch seitengerichtete Mutagenese erhalten, die zu Substitution, Deletion oder Insertion von spezifischen Aminosäureresten führte, die entweder ausgewählt wurden auf der Basis ihres Typs oder auf der Basis ihrer Lage in der Sekundär- oder Tertiärstruktur des reifen Enzyms (vgl. beispielsweise US-Patent Nr. 4,518,584).
Ein alternativer üblicher Ansatz, um Proteine und Enzyme zu modifizieren, beruht auf zufälliger Mutagenese wie beispielsweise in der US 4,894,331 und WO 93/01285 offenbart.
Da es ein mühsamer und zeitaufwändiger Prozess ist, Polypeptidvarianten oder – mutanten mit verbesserten funktionalen Eigenschaften zu erhalten, wurden einige alternative Verfahren für die schnelle Herstellung von modifizierten Polypeptiden vorgeschlagen.
Weber et al., (1983), Nucleic Acids Research, Vol. 11, 5661–5661, beschreibt ein Verfahren zur Modifikation von Genen durch in vivo Rekombination zwischen zwei homologen Genen. Es wird eine lineare DNA-Sequenz umfassend einen Plasmidvektor flankierend zu einer DNA-Sequenz kodierend alpha-1 Humaninterferon am 5'-Ende und einer DNA-Sequenz kodierend alpha-2 Humaninterferon am 3'-Ende konstruiert und in einen rec A positiven Stamm von E. coli transfiziert. Unter Verwendung eines Resistenzmarkers wurden Rekombinanten identifiziert und isoliert.
Pompon et al., (1989), Gene 83, S. 15–24 beschreibt ein Verfahren zum Mischen von Gendomänen von Säuger-Cytochrom P-450 durch in vivo Rekombination von teilweise homologen Sequenzen in Saccharomyces cerevisiae durch Transformieren von Saccharomyces cerevisiae mit einem linearisierten Plasmid mit aufge füllten Enden und einem DNA-Fragment, das teilweise homolog ist zu den Enden des Plasmids.
Stemmer, (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 91, 10747–10751; Stemmer, (1994), Nature, Vol. 370, 389–391 betreffen Verfahren zum Mischen von homologen DNA-Sequenzen mittels eines in vitro PCR-Verfahrens. Ein Mischzyklus besteht aus Spalten eines Pools von homologen Genen mit DNase I. Die resultierenden kleinen Fragmente werden wieder zu Gesamtlängen-Genen zusammengesetzt. Positive rekombinante Genen, die gemischte DNA-Sequenzen enthalten, werden aus einer DNA-Bibliothek basierend auf ihrer verbesserten Funktion selektiert. Positive Rekombinanten können als Ausgangsmaterial für (eine) weitere Mischrunde(n) verwendet werden.
Das US-Patent Nr. 5,093,257 (Patentinhaber: Genencor Int. Inc.) offenbart ein Verfahren zur Herstellung von Hybridpolypeptiden durch in vivo Rekombination. Hybrid-DNA-Sequenzen werden durch die Bildung eines ringförmigen Vektors umfassend eine Replikationssequenz, eine erste DNA-Sequenz kodierend den aminoterminalen Abschnitt des Hybridproteins, eine zweite DNA-Sequenz kodierend den carboxyterminalen Abschnitt des Hybridproteins, hergestellt. Der ringförmige Vektor wird in einen rec-positiven Mikroorganismus transformiert, in dem der ringförmige Vektor amplifiziert wird. Dies führt zur Rekombination des ringförmigen Vektors, die vermittelt wird durch den natürlicherweise vorkommenden Rekombinationsmechanismus des rec-positiven Mikroorganismus, welche Prokaryoten wie Bacillus und E. coli und Eukaryoten wie Saccharomyces cerevisiae einschließen.
Trotz dem Vorhandensein der oben genannten Verfahren besteht nach wie vor das Bedürfnis nach noch besseren, sich wiederholenden in vivo Rekombinationsverfahren zur Herstellung von neuen positiven Polypeptidvarianten.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Es ist das Ziel der vorliegenden Erfindung, ein verbessertes Verfahren zur Herstellung positiver Polypeptidvarianten durch ein in vivo Rekombinationsverfahren zur Verfügung zu stellen.
Der Erfinder der vorliegenden Erfindung hat überraschend festgestellt, dass solche positiven Polypeptidvarianten vorteilhafterweise hergestellt werden können durch Mischen von verschiedenen Nukleotidsequenzen homologer DNA-Sequenzen durch in vivo Rekombination, umfassend die Schritte

a) Bilden mindestens eines ringförmigen Plasmids umfassend eine DNA-Sequenz kodierend für ein Polypeptid,
b) Öffnen des ringförmigen Plasmids/der ringförmigen Plasmide innerhalb der DNA-Sequenz/en, kodierend für das Polypeptid/die Polypeptide,
c) Herstellen mindestens eines DNA-Fragments umfassend eine DNA-Sequenz, die mindestens zu einem Teil der Polypeptid-kodierenden Region auf mindestens einem des ringförmigen Plasmids/der ringförmigen Plasmide homolog ist,
d) Einführen mindestens eines geöffneten Plasmids/der geöffneten Plasmide, zusammen mit mindestens einem der homologen DNA-Fragmente/der homologen DNA-Fragmente, dass das bzw. die Gesamtlängen-DNA-Sequenzen abdeckt, welches das Polypeptid/die Polypeptide oder Teile davon kodiert, in eine Rekombinationswirtszelle,
e) Kultivieren der Rekombinationswirtszelle, und
f) Screenen nach positiven Polypeptidvarianten, wobei zwei oder mehr geöffnete Plasmide mit einem oder mehreren homologen DNA-Fragmenten in demselben Mischzyklus vermischt werden.

KURZBESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 zeigt das Hefeexpressionsplasmid pJSO26 umfassend eine DNA-Sequenz kodierend das Humicola lanuginosa Lipasegen.
2 zeigt das Hefeexpressionsplasmid pJSO37 umfassend eine DNA-Sequenz kodierend das Humicola lanuginosa Lipasegen enthaltend zwölf zusätzliche Restriktionsstellen.
3 zeigt das Plasmid pJSO26.
4 zeigt das Plasmid pJSO37.
5 zeigt die in vivo Rekombination der 0,9 kb synthetischen Wildtyp Humicola lanuginosa Lipase mit pJSO37 unter Verwendung von Saccharomyces cerevisiae als die Rekombinationswirtszelle (beschrieben in Beispiel 1).
6 zeigt die in vivo Rekombination eines DNA-Fragments, das aus einer Humicola lanuginosa Lipasevariante (y) hergestellt wurde, mit Humicola lanuginosa Lipasevariante (d), das in einem Plasmid enthalten ist, unter Verwendung von Saccharomyces cerevisiae als die Rekombinationswirtszelle (beschrieben in Beispiel 2).
7 zeigt eine Übersicht über die Lage der Inaktivierungsstelle des Humicola lanuginosa Lipasegens und die Zahl des Klons (auf die in den Tabellen mit "Blue Zahl" Bezug genommen wird). Die Lage der Restriktionsenzymstellen und die Klonzahlen sind relativ bzgl. des Initiationskodons des Lipolasegens. In allen Fällen lag ein Stoppkodon in dem neuen Leserahmen 10–50 bp von dem Frameshift entfernt.
8 zeigt einen Überblick der Schaffung von aktiven humicola Lanuginosa Lipasegenen aus den Rekombinationen in Tabelle 2A und B durch einen "Mosaikmechanismus". Die Linien zeigen die Einführung der Fragmentsequenz in den Vektor an, und Linien mit einem "X" bezeichnen Sequenzen, die nicht in die aktiven Lipasekolonien eingeführt wurden. Die Primer, die für das PCR-Fragment verwendet wurden, sind zusammen mit der Lage der Frameshiftmutation gezeigt (markiert durch die Restriktionsstelle, die für die Konstruktion verwendet wurde).
9 zeigt einen Überblick von Fragmenten, die in der Rekombination von 2 teilweise überlappenden Fragmenten in einen gespaltenen Vektor verwendet wurden. Die für die PCR-Fragmente verwendeten Primer sind zusammen mit der Lage der Frameshiftmutation (wenn es sich nicht um Wildtyp handelt) gezeigt.
10 zeigt einen Überblick von Fragmenten, die in der Rekombination von 3 überlappenden Fragmenten in einen gespaltenen Vektor verwendet wurden. Die für die PCR-Fragmente verwendeten Primer sind gezeigt. Die Überlappung zwischen Fragment PCR353 und Fragment PCR355 beträgt ca. 10 bp.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Es ist das Ziel der vorliegenden Erfindung, ein verbessertes Verfahren zur Herstellung positiver Polypeptidvarianten durch ein sich wiederholendes in vivo Rekombinationsverfahren zur Verfügung zu stellen.
Der Erfinder der vorliegenden Erfindung hat überraschend ein effizientes Verfahren zum Mischen homologer DNA-Sequenzen in einem in vivo Rekombinationssystem unter Verwendung einer eukaryotischen Zelle als Rekombinationswirtszelle gefunden.
Eine "Rekombinationswirtszelle" ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine Zelle, welche die Fähigkeit besitzt, das Mischen von mehreren homologen DNA-Sequenzen zu vermitteln.
Der Begriff "Mischen" bedeutet Rekombination von Nukleotidsequenz/en zwischen zwei oder mehreren homologen DNA-Sequenzen, was zu End-DNA-Sequenzen (d. h. DNA-Sequenzen wurden einem Mischzyklus unterzogen) mit einer Anzahl von ausgetauschten Nukleotiden im Vergleich zu den Ausgangs-DNA-Sequenzen (d. h. Startpunkt homologer DNA-Sequenzen).
Es ist ein bedeutender Vorteil der Erfindung, dass Mosaik-DNA-Sequenzen mit multiplen Austauschpunkten oder Austauschen, die nicht von der Öffnungsstelle abhängig sind, gebildet werden, was in Pompons Verfahren nicht entdeckt wurde.
Es ist ein anderer wichtiger Vorteil der vorliegenden Erfindung, dass bei Verwendung einer Mischung von Fragmenten und geöffneten Vektoren (in dem Screening-Setup) die Möglichkeit gegeben ist, dass viele verschiedene Klone paarweise oder sogar zu dritt rekombinieren (wie aus mehreren Beispielen weiter unten gesehen werden kann).
Das erfindungsgemäße in vivo Rekombinationsverfahren ist einfach auszuführen und führt zu einer hohen Durchmischung der homologen Gene oder Varianten. Es kann eine große Zahl von Varianten oder homologen Genen in einer Transforma tion gemischt werden. Das Mischen der verbesserten Varianten oder Wildtyp-Gene gefolgt von Screenen steigert die Zahl von weiter verbesserten Varianten vielfach im Vergleich zur Durchführung von nur zufälliger Mutagenese.
Die Rekombination von multiplen überlappenden Fragmenten ist mit einer hohen Effizienz möglich, wobei die Mischung der Varianten oder homologen Gene erhöht wird, wenn das in vivo Rekombinationsverfahren verwendet wird. Eine Überlappung so klein wie 10 bp ist ausreichend für die Rekombination, die für sehr einfaches Domänenmischen oder sogar für entfernt verwandte Gene verwendet werden kann.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Polypeptidvarianten durch Mischen von verschiedenen Nukleotidsequenzen homologer DNA-Sequenzen durch in vivo Rekombination, umfassend die Schritte

a) Bilden mindestens eines ringförmigen Plasmids umfassend eine DNA-Sequenz kodierend für ein Polypeptid,
b) Öffnen des ringförmigen Plasmids/der ringförmigen Plasmide innerhalb der DNA-Sequenzen, kodierend für das Polypeptid/die Polypeptide,
c) Herstellen mindestens eines DNA-Fragments umfassend eine DNA-Sequenz, die mindestens zu einem Teil der Polypeptid-kodierenden Region auf mindestens einem des ringförmigen Plasmids/der ringförmigen Plasmide homolog ist,
d) Einführen mindestens eines geöffneten Plasmids/der geöffneten Plasmide, zusammen mit mindestens einem der homologen DNA-Fragmente/der homologen DNA-Fragmente, das das bzw. die Gesamtlängen-DNA- Sequenzen abdeckt, welches das Polypeptid/die Polypeptide oder Teile davon kodiert, in eine Rekombinationswirtszelle,
e) Kultivieren der Rekombinationswirtszelle, und
f) Screenen nach positiven Polypeptidvarianten, wobei zwei oder mehr geöffnete Plasmide mit einem oder mehreren homologen DNA-Fragmenten in demselben Mischzyklus vermischt werden.

Erfindungsgemäß kann mehr als ein Zyklus von Schritt a) bis f) durchgeführt werden.
Die Öffnung des Plasmids/der Plasmide in Schritt b) kann auf jede Stelle innerhalb der für das Polypeptid kodierenden Region des Plasmids gerichtet werden. Das Plasmid/die Plasmide kann/können mittels jedes geeigneten Verfahrens, das im Stand der Technik bekannt ist, geöffnet werden. Die geöffneten Enden des Plasmids können mit Nukleotiden, so wie in Pompon et al. (1989, supra), beschrieben, aufgefüllt werden. Vorzugsweise werden die geöffneten Enden nicht aufgefüllt, weil dies zu einem Frameshift führen kann.
Es ist bevorzugt, das Plasmid/die Plasmide rund um die Mitte der für das Polypeptid kodierenden DNA-Sequenzen zu öffnen, weil angenommen wird, dass dies zu einer effektiveren Rekombination zwischen DNA-Fragmenten und geöffnetem Plasmid/geöffneten Plasmiden führt.
In einer Ausführungsform der Erfindung wird/werden das DNA-Fragment/die DNA-Fragmente unter Bedingungen hergestellt, die zu einer niedrigen, mittleren oder hohen zufälligen Mutagenese-Frequenz führen.
Um eine niedrige Mutagenese-Frequenz zu erhalten, kann/können die DNA-Sequenz/en (umfassend das DNA-Fragment/die DNA-Fragmente) durch ein Standard-PCR-Amplifikationsverfahren hergestellt werden ( US 4,683,202 oder Saiki et al., (1988), Science 239, 487–491).
Eine mittlere oder hohe Mutagenesefrequenz kann erhalten werden, indem die PCR-Amplifikation unter Bedingungen durchgeführt wird, welche den Falscheinbau von Nukleotiden steigert, wie beispielsweise bei Deshler, Nr. 1, 11–15 beschrieben.
Es ist erfindungsgemäß ebenfalls vorgesehen, die PCR-Amplifikation, (d. h. gemäß dieser Ausführungsform ebenfalls DNA-Fragment-Mutation) mit einem Mutageneseschritt zu kombinieren, unter Verwendung eines geeigneten physikalischen oder chemischen Mutagenisierungsmittel, z. B. eines, welches Transitionen, Transversionen, Inversionen, Verschlüsselung, Deletionen und/oder Insertionen induziert.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung bedeutet der Begriff "positive Polypeptidvarianten" die resultierenden Polypeptidvarianten, die funktionale Eigenschaften besitzen, die im Vergleich zu den Polypeptiden, die aus den entsprechenden Ausgangs-DNA-Sequenzen herstellbar sind, verbessert wurden. Beispiele für solche verbesserten Eigenschaften können so verschieden sein wie z. B. biologische Aktivität, Enzymwaschleistung, Antibiotikaresistenz, etc.
Folglich hängt das verwendete Screeningverfahren, das für die Identifizierung der positiven Varianten verwendet wird, von den gewünschten verbesserten Eigenschaften der fraglichen Polypeptidvariante ab.
Falls beispielsweise das fragliche Polypeptid ein Enzym ist und die gewünschte verbesserte funktionale Eigenschaft die Waschleistung ist, kann das Screenen in Schritt f) in geeigneter Weise unter Verwendung eines Filterassays basierend auf den folgenden Grundsätzen durchgeführt werden:
Die Rekombinationswirtszelle wird auf einem geeigneten Medium und unter geeigneten Bedingungen inkubiert, unter denen das Enzym sekretiert werden kann, das Medium wird auf einem Doppelfilter, umfassend einen ersten Proteinbindefilter und über diesem einen zweiten Filter, der eine geringe Proteinbindungsfähigkeit aufweist, zur Verfügung gestellt. Die Rekombinationswirtszelle ist auf dem zweiten Filter angeordnet. Nach der Inkubation wird der erste Filter, umfassend das von der Rekombinationswirtszelle sekretierte Enzym von dem zweiten Filter, umfassend die Zellen entfernt. Der erste Filter wird dem Screenen nach der gewünschten enzymatischen Aktivität unterzogen, und die korrespondierenden mikrobiellen Kolonien auf dem zweiten Filter werden identifiziert.
Der Filter, der für die Bindung der enzymatischen Aktivität verwendet wird, kann jeder Proteinbindungsfilter sein, z. B. Nylon oder Nitrocellulose. Der Oberfilter, der die Kolonien des Expressionsorganismus trägt, kann jeder Filter sein, der keine oder eine geringe Affinität für die Bindung von Proteinen aufweist, z. B. Celluloseacetat oder DuraporeÔ. Der Filter kann mit jeder der Bedingungen, die für das Screenen verwendet werden, vorbehandelt sein, oder er kann während des Nachweises der enzymatischen Aktivität behandelt werden.
Die enzymatische Aktivität kann mit einem Farbstoff, Fluoreszenz, Niederschlag, pH-Indikator, IR-Absorption oder irgendeiner anderen bekannten Technik für den Nachweis von enzymatischer Aktivität nachgewiesen werden.
Die Nachweisverbindung kann durch jedes Immobilisierungsmittel, z. B. Agarose, Agar, Gelatine, Polyacrylamid, Stärke, Filterpapier, Stoff; oder jede Kombination von Immobilisierungsmitteln immobilisiert werden.
Wenn die verbesserte funktionale Eigenschaft des Polypeptids nach einem Mischzyklus nicht ausreichend gut ist, kann das Polypeptid einem weiteren Zyklus unterzogen werden.
In einer Ausführungsform der Erfindung ist mindestens ein Mischzyklus ein Zyklus zum Zurückkreuzen mit dem anfangs benutzten DNA-Fragment, das ein Wildtyp DNA-Fragment sein kann. Dies eliminiert nicht-essentielle Mutationen. Nicht-essentielle Mutationen können auch durch Verwendung von Wildtyp DNA-Fragmenten als anfangs benutztes Ausgangs-DNA-Material eliminiert werden.
Es versteht sich, dass das erfindungsgemäße Verfahren für alle Arten von Polypeptiden geeignet ist, einschließlich Enzymen wie Proteasen, Amylasen, Lipasen, Cutinasen, Amylasen, Cellulasen, Peroxidasen und Oxidasen.
Erfindungsgemäß sind ebenfalls Polypeptide mit biologischer Aktivität vorgesehen, wie Insulin, ACTH, Glucagon, Somatostatin, Somatotropin, Thymosin, Parathyroidhormon, Pigmenthormone, Somatomedin, Erythropoietin, Luteinisierungshormon, Choriongonadotropin, hypothalamische Freisetzungsfaktoren, Harn-hemmende Hormone, Thyroid-stimulierende Hormone, Relaxin, Interferon, Thrombopoietin (TPO) und Prolactin.
Insbesondere ist erfindungsgemäß vorgesehen, dass die anfangs verwendeten Ausgangs-DNA-Sequenzen entweder Wildtyp, Varianten oder modifizierte DNA-Sequenzen sind, wie eine DNA-Sequenz kodierend jeweils für Wildtyp, Variante oder modifizierte Enzyme, insbesondere Enzyme, die lipolytische Aktivität zeigen.
In einer Ausführungsform der Erfindung ist die lipolytische Aktivität eine Lipaseaktivität, abgeleitet von den filamentösen Pilzen von Humicola sp., insbesondere Humicola lanuginosa, vor allem Humicola lanuginosa.
In einer besonderen Ausführungsform ist das anfangs benutzte Ausgangs-DNA-Fragment, das mit einem homologen Polypeptid gemischt wird, die Wildtyp DNA-Sequenz kodierend die Humicola lanuginosa Lipase, abgeleitet von Humicola lanuginosa DSM 4109, beschrieben in der EP 305 216 (Novo Nordisk A/S).
Von dem Schutzbereich der Erfindung sind außerdem spezifisch umfasst Ausgangs-DNA-Sequenzen ausgewählt aus der Gruppe von Vektoren (a) bis (f) und/oder DNA-Fragmente (g) bis (aa) kodierend für Humicola lanuginosa Lipasevarianten aus der Aufstellung, die in dem folgenden Material- und Methoden-Abschnitt angegeben ist.
In der vorliegenden Anmeldung wurde der Name Humicola lanuginosa verwendet, um ein bevorzugtes Ausgangsenzym zu bezeichnen, d. h. jenes, das gerade oben erwähnt wurde. Jedoch wurde in den letzten Jahren Humicola lanuginosa auch als Thermomyces lanuginosus (eine Spezies, die erstmals durch Tsiklinsky 1989 eingeführt wurde) bezeichnet, weil der Pilz morphologische und physiologische Ähnlichkeit zu Thermomyces lanuginosus aufweist. Demzufolge soll verstanden werden, dass immer, wenn Bezug genommen wird auf H. lanuginosa die ser Begriff durch Thermomyces lanuginosus ersetzt werden kann. Die DNA kodierend für einen Teil des 18S ribosomalen Gens von Thermomyces lanuginosus (oder H. lanuginosa) wurde sequenziert. Die resultierende 18S Sequenz wurde mit anderen 18S Sequenzen in der GenBank-Datenbank verglichen, und eine phylogenetische Analyse unter Verwendung von Parsimony (PAUP, Version 3.1.1, Smithsonian Institution, 1993) wurde ebenfalls durchgeführt. Diese weist Thermomyces lanuginosus klar der Klasse von Plectomycetes, wahrscheinlich der Ordnung der Eurotiales zu. Gemäß dem Entrez-Browser bei dem NCBI (National Center for Biotechnology Information) setzt dies Thermomyces lanuginosus in Verbindung zu Familien wie Eremascaceae, Monoascaceae, Pseudoeurotiaceae und Trichocomaceae, wobei die letzte Gattungen aufweist wie Emericella, Aspergillus, Penicillium, Eupenicillium, Paecilomyces, Talaromyces, Thermoascus und Sclerocleista.
Deshalb sind solche Gene, die lipolytische Enzyme von filamentösen Pilzen der Gattungen Emericella, Aspergillus, Penicillium. Eupenicillium, Paecilomyces, Talaromyces, Thermoascus und Sclerocleista kodieren, ebenso besonders erfindungsgemäß vorgesehen.
Andere Beispiele von relevanten Genen von filamentösen Pilzen, die lipolytische Enzyme kodieren, schließen Stämme der Absidia sp. ein, z. B. die Stämme, die in der WO 96/13578 (von Novo Nordisk A/S) genannt sind, die hiermit durch Bezugnahme eingeschlossen sind. Absidia sp. Stämme, die in der WO 96/13578 genannt sind, schließen Absidia blakesleeana, Absidia corymbifera und Absidia reflexa ein.
Stämme von Rhizopus sp., insbesondere Rh. niveus und Rh. oryzea sind ebenfalls erfindungsgemäß vorgesehen.
Das lipolytische Gen kann ebenfalls abgeleitet sein von einem Bakterium, wie von einem Stamm von Pseudomonas sp., insbesondere Ps. fragi, Ps. stutzeri, Ps. cepacia und Ps. fluorescens (WO 89/04361) oder Ps. plantarii oder Ps. gladioli (US 4,950,417) oder Ps. alcaligenes und Ps. pseudoalcaligenes ( EP 218 272 , EP 331 376 oder WO 94/25578 (offenbaren Varianten des lipolytischen Enzyms von Ps. pseudoalcaligenes), die Pseudomonas sp. Varianten, die in der EP 407 225 offenbart sind oder ein Pseudomonas sp. lipolytisches Enzym, wie das Ps. mendocina (auch als Ps. putida bezeichnet) lipolytische Enzym, das in der WO 88/09367 und US 5,389,536 beschrieben ist oder Varianten davon, wie sie in der US 5,352,594 beschrieben sind, oder Ps. auroginosa oder Ps. glumae oder Ps. syringae oder Ps. wisconsinensis (WO 96/12012 von Solvay) oder ein Stamm von Bacillus sp., z. B. das B. subtilis, beschrieben bei Dartois et al., (1993) Biochemica et Biophysica acta 1131, 253–260 oder B. stearothermophilus (JP 64/7744992) oder B. pumilus (WO 91/16422) oder ein Stamm von Streptomyces sp., z. B. S. scabies oder ein Stamm von Chromobacterium sp., z. B. C. viscosum.
Im Zusammenhang mit den Pseudomonas sp. Lipasen wurde herausgefunden, dass Lipasen von den folgenden Organismen einen hohen Grad an Homologie aufweisen, wie wenigstens 60% Homologie, wenigstens 80% Homologie oder wenigstens 90% Homologie, und sie werden daher als zur selben Familie von Lipasen gehörend betrachtet: Ps. ATCC21808, Pseudomonas sp. Lipase, kommerziell erhältlich als Liposam^©, Ps. aeruginosa EF2, Ps. aeruginosa PAC1R, Ps. aeruginosa PAO1, Ps. aeruginosa TE 3285, Ps. sp. 109, Ps. pseudoalcaligenes M1, Ps. glumae, Ps. cepacia DSM 3959, Ps. cepacia M-12-33, Ps. sp. KWI-56, Ps. putida IFO 3458, Ps. putida IFO 12049 (Gilbert, E. J., (1993), Pseudomas lipases: Biochemical properties and molecular cloning, Enzyme Microb. Technol., 15, 634–645). Die Spezies Pseudomonas cepacia wurde kürzlich als Burkholderia cepacia reklassifiziert, aber sie wird in der vorliegenden Anmeldung als Ps. cepacia bezeichnet.
Ebenso sind Gene kodierend für lipolytische Enzyme von Hefen relevant und schließen lipolytische Gene von Candida sp., insbesondere Candida rugosa oder Geotrichum sp., insbesondere Geotrichum candidum ein.
Besondere Beispiele für Mikroorganismen, die Gene kodierend für lipolytische Enzyme aufweisen, die für kommerziell erhältliche Produkte verwendet werden und die als Donor für Gene, die erfindungsgemäß gemischt werden, dienen können, schließen ein: Humicola lanuginosa, verwendet in Lipolase^®, Lipolase^® Ultra, Ps. mendocina, verwendet in Lumafast^®, Ps. alcaligenes, verwendet in Lipomax^®, Fusarium solani, Bacillus sp. ( US 5,427,936 , EP 528 828 ), Ps. mendocina, verwendet in Liposam^®.
Es wird betont, dass Gene kodierend für lipolytische Enzyme, die erfindungsgemäß gemischt werden, irgendeines der o. g. Gene von lipolytischen Enzymen und jede Variante, Modifikation oder Verkürzung davon sein kann. Beispiele für solche Gene, die besonders vorgesehen sind, schließen die Gene kodierend die Enzyme ein, die beschrieben sind in WO 92/05249, WO 94/01541, WP 94/14951, WO 94/25577, WO 95/22615 und eine Lipasevariante, die Protein-verändert ist, wie beschrieben in der EP 407 225 ; eine Protein-veränderte Ps. mendocina Lipase, wie in der US 5,352,594 beschrieben; eine Cutinasevariante, wie beschrieben in der WO 94/14964; eine Variante eines Aspergillus-lipolytischen Enzyms, wie beschrieben in dem EP-Patent 167 309; und Pseudomonas sp. Lipase, beschrieben in WO 95/06720.
Eine Voraussetzung der DNA-Sequenzen kodierend das Polypeptid/die Polypeptide, die gemischt werden, ist, dass sie wenigstens 60%, vorzugsweise wenigstens 70%, weiter bevorzugt mehr als 80%, insbesondere mehr als 90% und noch weiter bis zu fast 100% homolog sind. DNA-Sequenzen, die weniger homolog sind, werden eine geringere Neigung haben, zu interagieren und zu rekombinieren.
Ebenso ist das Pseudomonas sp. Lipasegen, das in SEQ ID NO. 14 gezeigt ist, erfindungsgemäß besonders vorgesehen.
Es ist außerdem erfindungsgemäß vorgesehen Ausgangs (homologe)-Wildtyp-Organismen von verschiedenen Gattungen zu mischen.
Weiterhin hat/haben das DNA-Fragment/die DNA-Fragmente, das/die gemischt wird/werden, bevorzugt eine Länge von ca. 20 bp bis 8 kb, vorzugsweise ca. 40 bp bis 6 kb, weiter bevorzugt ca. 80 bp bis 4 kb, insbesondere ca. 100 bp bis 2 kb, um optimal mit den geöffnetem Plasmid interagieren zu können.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist sehr effizient für die Herstellung von Polypeptidvarianten im Vergleich zu Verfahren des Standes der Technik, welche das Transformieren linearer DNA-Fragmente/Sequenzen umfassen.
Der Erfinder fand heraus, dass die Transformationsfrequenz einer Mischung aus geöffnetem Plasmid und einem DNA-Fragment signifikant höher war als wenn ein Plasmid, das an derselben Stelle alleine geschnitten war, transformiert wurde. Die Transformationsfrequenz des geöffneten Plasmids und des DNA-Fragments waren genauso hoch wie für ungeschnittenes Plasmid.
Ohne auf irgendeine Theorie beschränkt zu sein, wird angenommen, dass das Öffnen des Plasmids/der Plasmide die Replikation von (geöffnetem geöffneten) Plasmid/en beschränkt, wenn sie nicht mit wenigstens einem DNA-Fragment interagieren. In Übereinstimmung damit wurde eine erhöhte Zahl von rekombinierten DNA-Sequenzen nach nur einem Mischzyklus gefunden.
Wie in Beispiel 1 beschrieben, enthielten 50% der resultierenden Transformanten rekombinierte DNA-Sequenzen von beiden Ausgangs-DNA-Sequenzen. Sogar 20% der Gesamtzahl der rekombinierten DNA-Sequenzen waren "beliebige" Mischungen (d. h. sie hatten mehr als eine Region von Nukleotiden ausgetauscht).
Die Ausgangs-DNA-Sequenzen können irgendwelche DNA-Sequenzen sein, einschließlich Wildtyp DNA-Sequenzen, DNA-Sequenzen kodierend Varianten oder Mutanten oder Modifikationen davon, wie verlängerte oder elongierte DNA-Sequenzen, und sie können ebenso die Schluss-DNA-Sequenzen sein, die einem oder mehreren Mischzyklen unterworfen wurden (d. h. die End-DNA-Sequenzen) gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren oder irgendeinem anderen Verfahren (z. B. einem der Verfahren, die in dem Stand der Technik-Abschnitt beschrieben sind.
Wenn das erfindungsgemäße Verfahren verwendet wird, haben die End-DNA-Sequenzen (d. h. gemischte DNA-Sequenzen) mehrere Nukleotid/e-Austausche. Dies führt zu wenigstens einem Aminosäureaustausch in der Polypeptidvariante, wenn sie mit dem Ausgangspolypeptid verglichen wird. Es versteht sich, dass auch stille Mutationen umfasst sind (d. h. Nukleotidaustausch, der nicht zu einem Austausch in der Aminosäuresequenz führt).
Jedoch wird das erfindungsgemäße Verfahren in den meisten Fällen zu einer beträchtlichen Zahl von Aminosäureaustauschen führen und wird in manchen Fällen sogar die Struktur von einer oder mehreren Polypeptiddomänen (d. h. eine gefaltete Einheit der Polypeptidstruktur) verändern.
Erfindungsgemäß werden mehr als zwei DNA-Sequenzen gleichzeitig gemischt. Genau genommen, kann jede Zahl von verschiedenen DNA-Fragmenten und homologen Polypeptiden, die in geeigneten Plasmiden enthalten sind, gleichzeitig gemischt werden. Dies ist vorteilhaft, weil eine große Zahl von sehr verschiedenen Varianten schnell ohne eine Vielzahl von sich wiederholenden Vorgängen hergestellt werden kann.
Der Erfinder hat das erfindungsgemäße Verfahren zum Mischen von Nukleotiden unter Verwendung von signifikant mehr als zwei homologen DNA-Sequenzen getestet. Wie in Beispiel 2 beschrieben ist, wurde überraschend gefunden, dass das erfindungsgemäße Verfahren vorteilhafterweise für das Rekombinieren von mehr als zwei DNA-Sequenzen verwendet werden kann.
Ein Mischzyklus nach dem erfindungsgemäßen Verfahren kann zu dem Austausch von 1 bis 1000 Nukleotiden in der geöffneten Plasmid-DNA-Sequenz kodierend das fragliche Polypeptid führen. Die ausgetauschte/n Nukleotidsequenz/en kann können fortlaufend sein oder sie können als eine Anzahl von Subsequenzen innerhalb der Gesamtlängensequenz/en vorliegen.
Um die vorliegende Erfindung zu stützen, hat der Erfinder eine Anzahl von zusätzlichen Experimenten zu verschiedenen Aspekten des erfindungsgemäßen Verfahrens durchgeführt. Die Experimente sind unten beschrieben, und sie sind in den Beispielen 3 bis 6 unten dargestellt.
Es wurde eine Anzahl von Vektoren und Fragmenten umfassend inaktivierte synthetische Humicola lanuginosa Lipasegene durch Einführung von Frameshift-Stoppkodon-Mutationen in das Lipasegen an verschiedenen Stellen konstruiert. Diese wurden für die Überwachung der in vivo Rekombination von verschiedenen Rekombinationen des/der geöffneten Vektor/en und DNA-Fragmenten verwendet. Die Anzahl der aktiven Lipasekolonien wurde bestimmt, wie in Beispiel 3 beschrieben. Die Anzahl der Kolonien bestimmt die Wirksamkeit der Rekombination zwischen dem geöffneten Vektor/den geöffneten Vektoren und dem/den DNA-Fragment/en.
Eine Frameshift-Mutation in dem Humicola lanuginosa Lipasegen in dem geöffneten Vektor und eine weitere in dem Fragment auf der, der Öffnungsstelle gegenüber liegenden Seite, ergaben 3 bis 32% aktiver Lipasekolonien in Abhängigkeit von der Lage und der Kombination. Daraus wurde geschlossen, dass, je näher die Mutation an den Enden des Vektors liegt, desto höher die Mischung ist.
Eine Frameshift-Mutation in dem geöffneten Vektor und zwei in dem Fragment auf jeder Seite der Öffnungsstelle ergaben 4 bis 42% aktiver Kolonien in Abhängigkeit von der Lage und Kombination. Einige dieser aktiven Kolonien können als Mosaiken bezeichnet werden, die nicht nur die Öffnungsstelle betreffen.
Zwei Frameshift-Mutationen in dem geöffneten Vektor auf jeder Seite der Öffnungsstelle und eine in dem Fragment ergaben 0,5 bis 3,1% aktiver Kolonien in Abhängigkeit von der Lage und der Kombination. Die meisten dieser aktiven Kolonien sind Mosaiken der "Ausgangs"-DNA.
Zwei Frameshift-Mutationen in dem geöffneten Vektor auf jeder Seite der Öffnungsstelle und ein Wildtyp-Fragment ergaben 7,7 bis 10,70% aktiver Kolonien in Abhängigkeit von der Lage.
Es wurde ebenfalls gefunden, dass die Menge an Vektoren in Bezug zu den Fragmenten und der Größe der Fragmente das Ergebnis ebenfalls beeinflussen.
Die Verwendung der S. cerevisiae rad52 Mutanten als Rekombinationswirtszelle zeigte, dass die rad52 Mutante sehr gut mit Wildtyp-Plasmid/en transformierte und das Humicola lanuginosa Lipasegen exprimierte, aber überhaupt keine Transformanten mit den geöffneten Vektoren und Fragmenten ergab.
Die RAD52 Funktion wird für die "klassische Rekombination" (aber nicht für die ungleiche Schwesterstrang-mitotische Rekombination) benötigt, was zeigte, dass bei der Rekombination von geöffnetem Vektor und Fragment ein klassischer Rekombinationsmechanismus involviert sein könnte.
Die klassische Rekombination ist der Rekombinationsmechanismus, der in der Rekombination zwischen Genen, die auf Nicht-Schwester-Chromatiden von homologen Chromosomen liegen, involviert ist, so beispielsweise definiert in Petes TD, Malone RE und Symington LS (1991) "Recombination in Yeast", Seite 407–522, in The Molecular and Cellular Biology of the Yeast Saccharomyces, Volume 1 (Hrsg. Broach JR, Pringle JR und Jones EW), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.
Multiple, teilweise überlappende Fragmente
Der Erfinder hat außerdem die Rekombination von multiplen, teilweise überlappenden DNA-Fragmenten unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens getestet.
Die Rekombination von zwei und drei teilweise überlappenden Fragmenten in einem gespalteten Vektor (d. h. dass die Öffnung zu dem Ausschneiden eines kleinen Teils des Gens führte) wurde getestet und ergab eine hohe Ausbeute an rekombiniertem Humicola lanuginosa Lipasegen. Die Ausbeute an aktivem Lipa segen aus verschiedenen Rekombinationen von inaktiven Humicola lanuginosa Genen wurde hinsichtlich der Rekombination von zwei teilweise überlappenden Fragmenten untersucht. Die Tendenz war eine höhere Mischung in der überlappenden Region zwischen den zwei Fragmenten in der gespaltenen Region als in der Vektor- und Fragmentüberlappung.
Wenn viele Fragmente aus derselben Region rekombiniert werden, wird die Technik des multiplen überlappenden Fragments das Mischen von selbst steigern, aber es ist ebenso wichtig, eine relativ hohe beliebige Mischung in den überlappenden Regionen zu haben, um nahe zusammen liegende Varianten/Unterschiede zu mischen.
Eine Überlappung von nur 10 bp zwischen zwei Fragmenten wurde als ausreichend gefunden, um eine sehr effiziente Rekombination zu erhalten. Deshalb sind Überlappungen im Bereich von 5 bis 5000 bp, vorzugsweise von 10 bp bis 500 bp, insbesondere 10 bp bis 100 bp für das erfindungsgemäße Verfahren geeignet.
Gemäß dieser Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können vorteilhafterweise zwei oder mehr überlappende Fragmente, vorzugsweise zwei bis sechs überlappende Fragmente, insbesondere zwei bis vier überlappende Fragmente, als Ausgangsfragmente in einem Mischzyklus verwendet werden.
Neben der Steigerung der Mischung von Genen ist dies ein sehr nützliches Verfahren für Domänenmischen, in dem kurze Überlappungen zwischen DNA-Fragmenten von verschiedenen Domänen gebildet und auf die beste Kombination gescreent werden.
Beispielsweise können in dem Fall von drei DNA-Fragmenten die überlappenden Regionen wie folgt sein:

– das erste Ende des ersten Fragmentes überlappt mit dem ersten Ende des geöffneten Plasmids,
– das erste Ende des zweiten Fragments überlappt mit dem zweiten Ende des ersten Fragments, und das zweite Ende des zweiten Fragments überlappt mit dem ersten Ende des dritten Fragments,
– das erste Ende des dritten Fragments überlappt (wie oben beschrieben) mit dem zweiten Ende des zweiten Fragments, und das zweite Ende des dritten Fragments überlappt mit dem zweiten Ende des geöffneten Plasmids.

Es versteht sich, dass bei Verwendung von zwei oder mehr DNA-Fragmenten als Startmaterial es bevorzugt ist, ständige Überlappungen zwischen den Enden des Plasmids und den DNA-Fragmenten zu haben.
Obwohl es bevorzugt ist, homologe DNA-Sequenzen in Form von DNA-Fragment/en und geöffnetem Plasmid/geöffneten Plasmiden zu mischen, ist es ebenfalls erfindungsgemäß vorgesehen, zwei oder mehr geöffnete Plasmide umfassend homologe DNA-Sequenzen kodierend Polypeptide zu mischen. Jedoch ist es in einem solchen Fall zwingend, die Plasmide an verschiedenen Stellen zu öffnen.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden zwei oder mehr geöffnete Plasmide und ein oder mehrere homologe DNA-Fragmente als zu mischendes Startmaterial verwendet. Das Verhältnis zwischen dem geöffneten Plasmid/den geöffneten Plasmiden und dem homologen DNA-Fragment/den homologen DNA-Fragmenten liegt vorzugsweise im Bereich von 20 : 1 bis 1 : 50, vorzugs weise von 2 : 1 bis 1 : 10 (Mol Vektor : Mol Fragmente) mit spezifischen Konzentrationen von 1 pM bis 10 M der DNA.
Die geöffneten Plasmide können vorteilhafterweise so gespalten sein, dass die Überlappung zwischen den Fragmenten in dem Vektor deletiert ist, um bezüglich der Rekombination zu selektieren.
Herstellung des DNA-Fragments
Das DNA-Fragment, das mit dem homologen Polypeptid, umfasst in einem geöffneten Plasmid, gemischt werden soll, kann durch jedes geeignete Verfahren hergestellt werden. Beispielsweise kann das DNA-Fragment durch PCR-Amplifikation (Polymerase-Kettenreaktion), wie oben beschrieben, hergestellt werden, ausgehend von einem Plasmid oder Vektor umfassend das Gen für das Polypeptid, unter Verwendung von spezifischen Primern. beispielsweise wie beschrieben in der US 4,683,202 oder Saiki et al., (1988), Science 239, 487–491. Das DNA-Fragment kann außerdem aus einem Vektor oder Plasmid umfassend die gewünschte DNA-Sequenz durch Spaltung mit Restriktionsenzymen ausgeschnitten werden, gefolgt von der Isolierung durch z. B. Elektrophorese.
Das DNA-Fragment kodierend das fragliche homologe Polypeptid kann alternativ synthetisch durch etablierte Standardverfahren hergestellt werden, z. B. das Phosphoamiditverfahren, beschrieben bei Beaucage und Caruthers, (1981), Tetrahedron Letters 22, 1859–1869, oder mit Hilfe des Verfahrens, beschrieben bei Matthes et al., (1984), EMBO Journal 3, 801–805. Gemäß dem Phosphoamiditverfahren werden Oligonucleotide synthetisiert, z. B. in einem automatischen DNA-Synthetisierer, gereinigt, annealed, ligiert und in geeignete Vektoren kloniert.
Außerdem kann das DNA-Fragment gemischten synthetischen und genomischen, gemischten synthetischen und cDNA oder gemischten genomischen und cDNA-Ursprungs sein, hergestellt durch Ligieren von Fragmenten aus synthetischen, genomischen oder cDNA-Ursprungs (je nach dem, was geeignet ist), die Fragmente entsprechend den verschiedenen Abschnitten der gesamten DNA-Sequenz in Übereinstimmung mit Standardverfahren.
Das Plasmid
Das Plasmid umfassend die DNA-Sequenz kodierend das fragliche Polypeptid kann hergestellt werden durch Ligieren der DNA-Sequenz in einen geeigneten Vektor oder Plasmid oder durch jedes andere geeignete Verfahren.
Der Vektor kann jeder Vektor sein, der gut rekombinanten DNA-Verfahren unterzogen werden kann. Die Wahl des Vektors wird oft von der Rekombinationswirtszelle, in die er eingeführt werden soll, abhängen.
Daher kann der Vektor ein selbstreplizierender Vektor sein, d. h. ein Vektor, der als extrachromosomale Einheit besteht, dessen Replikation unabhängig von der chromosomalen Replikation ist, d. h. ein Plasmid. Alternativ dazu kann der Vektor einer sein, der, wenn er in die Replikationswirtszelle eingeführt ist, in das Wirtszellgenom integriert und zusammen mit dem Chromosom/den Chromosomen, in das bzw. die er eingeführ wurde, repliziert.
Um den Screeningprozess zu erleichtern, ist es bevorzugt, dass der Vektor ein Expressionsvektor ist, in dem die DNA-Sequenz kodierend das fragliche Polypeptid operativ mit zusätzlichen Segmenten, die für die Transkription der DNA benötigt werden, verbunden ist. Für gewöhnlich ist der Expressionsvektor abge leitet von einem Plasmid, einem Cosmid oder einem Bakteriophagen, oder er kann Elemente von jedem oder von allen aufweisen.
Der Begriff "operativ verbunden" bedeutet, dass die Segmente so angeordnet sind, dass sie gemeinsam ihren beabsichtigten Zweck erfüllen, d. h. die Transkription beginnt an einem Promotor und setzt sich über die DNA-Sequenz kodierend für das fragliche Polypeptid fort.
Der Promotor kann jede DNA-Sequenz sein, die transkriptionelle Aktivität in der gewählten Rekombinationswirtszelle zeigt, und er kann abgeleitet sein von Genen kodierend Proteine, wie Enzyme, entweder homolog oder heterolog zu der Wirtszelle.
Beispiele für geeignete Promotoren für die Verwendung in Hefewirtszellen schließen Promotoren von Hefe-glykolytischen Genen ein (Hitzeman et al., (1980), J. Biol. Chem. 255, 12073–12080; Alber und Kawasaki, (1982), J. Mol. Appl. Gen. 1, 419–434) oder Alkohol-Dehydrogenasegene (Young et al. in Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals (Hollaender et al., Hrsg.), Plenum Press, New York, 1982), oder die TPI1 ( US 4,599,311 ) oder die ADH2-4c (Russell et al., (1983), Nature 304, 652–654) Promotoren.
Beispiele für geeignete Promotoren für die Verwendung in Wirtszellen aus filamentösem Pilz sind beispielsweise der ADH3 Promotor (McKnight et al., (1985), The EMBO J. 4, 2093–2099) oder der tpiA Promotor. Beispiele für andere geeignete Promotoren sind solche, die abgeleitet sind von dem Gen kodierend A. oryzae TAKA Amylase, Rhizomucor miehei Aspartatproteinase, A. niger Neutral a-Amylase, A. niger säurestabile a-Amylase, A. niger oder A. awamori Glucoamylase (gluA), Rhizomucor miehei Lipase, A. oryzae alkalische Protease, A. ory zae Triosephosphatisomerase oder A. nidulans Acetamidase. Bevorzugt sind die TAKA-Amylase und gluA Promotoren.
Die erfindungsgemäße DNA-Sequenz kodierend das fragliche Polypeptid kann ebenso, falls notwendig, operativ mit einem geeigneten Terminator verbunden sein, wie dem humanen Wachstumshormon-Terminator (Palmiter et al., op. cit.) oder (für Pilzwirte) die TPI1 (Alber und Kawasaki, op. cit.) oder ADH3 (McKnight et al., op. cit.) Terminatoren. Der Vektor kann außerdem Elemente wie Polyadenylierungssignale (z. B. von SV40 oder der Adenovirus 5 E1b-Region), transkriptionelle Enhancersequenzen (z. B. den SV40 Enhancer) und translatorische Enhancersequenzen (z. B. jene, die Adenovirus VA RNAs kodieren) umfassen.
Der Vektor kann weiterhin eine DNA-Sequenz aufweisen, die es dem Vektor erlaubt, in der fraglichen Replikationswirtszelle zu replizieren. Wenn die Wirtszelle eine Hefezelle ist, sind geeignete Sequenzen, die dem Vektor erlauben zu replizieren, die Hefeplasmid 2m, Replikationsgene REP 1–3 und der Replikationsursprung.
Das Plasmid pY1 kann für die Herstellung von geeigneten Proteinen und Peptiden verwendet werden, unter Verwendung von filamentösen Pilzen, wie Aspergillus sp. und Hefen als rekombinante Wirtszellen (JP 06245777-A).
Der Vektor kann außerdem einen Selektionsmarker aufweisen, z. B. ein Gen, dessen Produkt einen Defekt in der Rekombinationswirtszelle komplementiert, wie das Gen kodierend für Dihydrofolat-Reductase (DHFR) oder das Schizosaccharomyces pompe TPI Gen (beschrieben von P. R. Russell, (1985), Gene 40, 125–130).
Ein weiteres Beispiel solcher geeigneter Selektionsmarker sind die ura3 und leu2 Gene, welche die korrespondierenden defekten Gene von z. B. dem Hefestamm Saccharomyces cerevisiae YNG318 komplementieren.
Der Vektor kann auch einen Selektionsmarker aufweisen, der eine Resistenz gegenüber einer Droge verleiht, z. B. Ampicillin, Kanamycin, Tetracyclin, Chloramphenicol, Neomycin, Hygromycin oder Methotrexat. Für filamentöse Pilze schließen Selektionsmarker amdS, pyrG, argB, niaD, sC, trpC, pyr4 und DHFR ein.
Um das fragliche Polypeptid in den sekretorischen Weg der Rekombinationswirtszelle zu leiten, kann eine sekretorische Signalsequenz (auch als Leader-Sequenz, Prepro-Sequenz oder Presequenz bekannt) in dem Rekombinationsvektor vorgesehen sein. Die sekretorische Signalsequenz ist mit der DNA-Sequenz kodierend das lipolytische Enzym in dem richtigen Leserahmen verbunden. Sekretorische Signalsequenzen sind für gewöhnlich am 5'-Ende der DNA-Sequenzen kodierend das Polypeptid positioniert. Die sekretorische Signalsequenz kann jenes Signal sein, das normalerweise mit dem fraglichen Polypeptid assoziiert ist oder sie kann von einem Gen kodierend ein anderes Sekretionsprotein abgeleitet sein.
Das Signalpeptid kann ein natürlicherweise vorkommendes Signalpeptid oder ein funktioneller Teil davon sein, oder es kann ein synthetisches Peptid sein. Für die Sekretion aus Hefezellen wurde gefunden, dass geeignete Signalpeptide das a-Faktor-Signalpeptid (vgl. US 4,870,008 ), das Signalpeptid der Mausspeichelamylase (vgl. O. Hagenbuchle et al. (1981), Nature 289, 643–646), ein modifiziertes Carboxypeptidase-Signalpeptid (vgl. L. A. Valls et al., (1987), Cell 48, 887–897), das Humicola lanuginosa Lipase-Signalpeptid, das Hefe BAR1 Signalpeptid (vgl. WO 87/02670) oder das Hefe-Aspartatprotease 3 (YAP3) Signalpeptid (vgl. M. Egel-Mitani et al., (1990), Yeast 6, 127–137) sind.
Für effiziente Sekretion in Hefe kann auch eine Sequenz, kodierend ein Leaderpeptid downstream von der Signalsequenz inseriert werden und upstream von der DNA-Sequenz kodierend das fragliche Polypeptid. Die Funktion des Leaderpeptids ist es, das exprimierte Polypeptid von dem endoplasmatischen Reticulum zu dem Golgi-Apparat zu leiten und von dort in ein sekretorisches Vesikel für die Sekretion in das Kulturmedium (d. h. der Hinaustransport des Polypeptids über die Zellwand oder wenigstens durch die Zellmembran in den periplasmatischen Raum der Hefezelle). Das Leaderpeptid kann der Hefe A-Faktorleader sein (dessen Verwendung beispielsweise beschrieben ist in US 4,546,082 , EP 16 201 , EP 123 294 , EP 123 544 und EP 163 529 ). Alternativ kann das Leaderpeptid ein synthetisches Leaderpeptid sein, was bedeutet, dass das Leaderpeptid nicht in der Natur vorkommt. Synthetische Leaderpeptide können beispielsweise konstruiert werden wie in der WO 89/02463 oder WO 92/11378 beschrieben.
Für die Verwendung in filamentösen Pilzen kann das Signalpeptid praktischerweise abgeleitet sein von einem Gen kodierend eine Aspergillus sp. Amylase oder Glucoamylase, einem Gen kodierend eine Rhizomucor miehei Lipase oder Protease, eine Humicola lanuginosa Lipase. Das Signalpeptid ist vorzugsweise abgeleitet von einem Gen kodierend A. oryzae TAKA Amylase, A. niger neutral a-Amylase, A. niger säurestabile Amylase oder A. niger Glucoamylase.
Die Rekombinationswirtszelle
Die Rekombinationswirtszelle, in welche die Mischung aus Plasmid/Fragment-DNA-Sequenzen eingeführt wird, kann jede eukaryote Zelle sein, einschließlich Pilzzellen und Pflanzenzellen, welche die Fähigkeit besitzen, die fraglichen homologen DNA-Sequenzen zu rekombinieren.
Gemäß dem Stand der Technik wurden prokaryotische Mikroorganismen wie Bakterien, einschließlich Bacillus und E. coli; eukaryotische Organismen wie filamentöse Pilze, einschließlich Aspergillus und Hefen wie Saccharomyces cerevisiae; und Gewebezellkulturen mit einem Ursprung in Vögeln oder Säugetieren für in vivo Rekombination vorgeschlagen. Alle diese Organismen können als Rekombinationswirtszelle verwendet werden, aber im allgemeinen sind prokaryotische Zellen nicht ausreichend effektiv (d. h. es führt nicht zu einer ausreichenden Zahl von Varianten), um für Rekombinationsverfahren im industriellen Maßstab geeignet zu sein.
Demzufolge sind erfindungsgemäß bevorzugte rekombinante Wirtszellen Pilzzellen wie Hefezellen oder filamentöse Pilze.
Beispiele für geeignete Hefezellen schließen Zellen von Saccharomyces sp., insbesondere Stämme von Saccharomyces cerevisiae oder Saccharomyces kluyveri oder Schizosaccharomyces sp. ein, Verfahren zur Transformation von Hefezellen mit heterologer DNA und die Herstellung von heterologen Polypeptiden daraus sind beschrieben z. B. in US 4,599,311 , US 4,931,373 , US 4,870,008 , US 5,037,743 und US 4,845,075 , die alle hiermit durch Bezugnahme eingeschlossen sind. Transformierte Zellen können selektiert werden durch z. B. einen Phänotyp, der durch einen selektierbaren Marker bestimmt wird, gewöhnliche Drogenresistenz oder die Fähigkeit, in Abwesenheit eines bestimmten Nährstoffs zu wachsen, z. B. Leucin. Ein bevorzugter Vektor für die Verwendung in Hefe ist der POT1 Vektor, der in der US 4,931,373 offenbart ist. Der DNA-Sequenz kodierend das Polypeptid kann eine Signalsequenz und optional eine Leadersequenz, z. B. wie oben beschrieben, vorangehen. Weitere Beispiele für geeignete Hefezellen sind Stämme von Kluyveromyces, wie K. lactis, Hansenula, z. B. N. polymorpha oder Pichia, z. B. B. pastoris (vgl. Gleeson et al., (1986), J. Gen. Microbiol. 132, 3459–3465; US 4,882,279 ).
Beispiele für andere Pilzzellen sind Zellen von filamentösen Pilzen, z. B. Aspergillus sp., Neurospora sp., Fusarium sp. oder Trichoderma sp., insbesondere Stämme von A. oryzae, A. nidulans oder A. niger. Die Verwendung von Aspergillus sp. zur Expression von Proteinen ist beispielsweise beschrieben in EP 272 277 , EP 230 023 . Die Transformation von F. oxysporum kann beispielsweise durchgeführt werden wie beschrieben bei Malardier et al., (1989), Gene 78, 147–156.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Rekombinationswirtszelle eine Zelle der Gattung Saccharomyces, insbesondere S. cerevisiae.
METHODEN UND MATERIAL
DNA-Sequenz
Humicola lanuginosa DSM 4109 abgeleitete Lipase kodierende DNA-Sequenz.
Humicola lanuginosa Lipasevarianten
Varianten, die für die Herstellung von Vektoren verwendet wurden die in Beispiel 2 mit NruI geöffnet wurden

(a) E56R, D57L, I90F, D96L, E99K
(b) E56R, D57L, V60M, D62N, S83T, D96P, D102E
(c) D57G, N94K, D96L, L97M
(d) E87K, G91A, D96R, I100V, E129K, K237M, I252L, P256T, G263A, L264Q
(e) E56R, D57G, S58F, D62C, T64R, E87G, G91A, F95L, D96P, K98I, (K237M)
(f) E210K

Varianten die verwendet wurden für die Herstellung von DNA-Fragmenten mittels Standard-PCR Amplifikation in Beispiel 2

(g) S83T, N94K, D96N
(h) E87K, D96V
(i) N94K, D96A
(j) E87K, G91A, D96A
(k) D167G, E210V
(l) S83T, G91A, Q249R
(m) E87K, G91A
(n) S83T, E87K, G91A, N94K, D96N, D111N.
(o) N73D, E87K, G91A, N94I, D96G.
(p) L67P, I76V, S83T, E87N, I90N, G91A, D96A, K98R.
(q) S83T, E87K, G91A, N92H, N94K, D96M
(s) S85P, E87K, G91A, D96L, L97V.
(t) E87K, I90N, G91A, N94S, D96N, I100T.
(u) I34V, S54P, F80L, S85T, D96G, R108W, G109V, D111G, S116P, L124S, V132M, V140Q, V141A, F142S, H145R, N162T, I166V, F181P, F183S, R205G, A243T, D254G, F262L.
(v) E56R, D56L, I90F, D96L, E99K
(x) E56R, D57L, V60M, D62N, S83T, D96P, D102E
(y) D57G, N94K, D96L, L97M
(z) E87K, G91A, D96R, I100V, E129K, K237M, I252L, P256T, G263A, L264Q
(aa) E56T, D57G, S58F, D62C, T64R, E87G, G91A, F95L, D96P, K98I

Stämme
Wirtsexpressionssystem

Saccharomyces cerevisiae YNG318: MATa Dpep4[cir⁺] ura3-52, leu2-D2, his 4-539
Saccharomyces cerevisiae Rad52: Stamm M1533 = MATa rad 52 ura3, erhalten von Torsten Nilsson Tillgren, Institute of Genetics, Universität von Kopenhagen.

Plasmide

pJSO26 (siehe 3)
pJSO37 (siehe 4)
pYES 2.0 (Invitrogen)

Transformationsselektionsmarker

ura3
leu2

Medien

SC-ura^–: 90 ml 10 × Basalsalz, 22,5 ml 20% Caseinhydrolysat, 9 ml 1% Tryptophan, mit H₂O aufgefüllt auf 806 ml, autoklaviert, 3,6 ml 5% Threonin und 90 ml 20% Glucose oder 20% Galactose wurden hinzugefügt.
LB-Medium: 10 g Bacto-Trypton, 5 g Bactohefeextrakt, 10 g NaCl in 1 Liter Wasser.
Brilliant Green (BG) (Merck, Art.-Nr. 1.01310)
BG-Reagens: 4 mg/ml Brilliant Green (BG) gelöst in Wasser

Substrat 1

10 ml Olivenöl (Sigma CAT Nr. 0-1500)
20 ml 2% Polyvinylalkohol (PVA)

Das Substrat wurde für 15–20 Minuten homogenisiert.
Methoden
Konstruktion des Hefeexpressionsvektors
Die Expressionsplasmide pJSO26 und pJSO37 sind abgeleitet von pYES 2.0. Der induzierbare GAL1-Promotor aus pYES 2.0 wurden durch den konstitutiv exprimierten TPI (Triosephosphatisomerase)-Promotor aus Saccharomyces cerevisiae ersetzt (Albert und Karwasaki, (1982), J. Mol. Appl Genet., 1, 419–434), und der ura3 Promotor wurde deletiert. Eine Restriktionskarte von pJSO26 und pJSO37 ist jeweils in 3 und 4 gezeigt.
Herstellung des Wildtyp DNA-Fragments
Ein Lipase Wildtyp DNA-Fragment kann entweder mittels PCR-Amplifikation (führt zu geringer, mittlerer oder hoher Mutagenese) des pJSO26 Plasmids hergestellt werden oder durch Ausschneiden des DNA-Fragments durch Verdau mit einem geeigneten Restriktionsenzym.
Fermentation von Humicola lanuginosa Lipasevarianten in Hefe

10 ml von SC-ura^– Medium wurden mit einer S. cerevisiae Kolonie inokuliert und bei 30°C für 2 Tage angezogen. Die 10 ml wurden verwendet, um 300 ml SC-ura^– zu inokulieren, das bei 30°C für 3 Tage angezogen wurde. Die 300 ml wurden verwendet für die Inokulation von 5 l des folgenden G-Substrats:

400 g	Amicase
6,7 g	Hefeextrakt (Difco)
12,5 g	L-Leucin (Fluka)
6,7 g	(NH₄)₂SO₄
10 g	MgSO₄·7H₂O
17 g	K₂SO₄
10 ml	Spurenelemente
5 ml	Vitaminlösung
6,7 ml	H₃PO₄
25 ml	20% Pluronic (nicht schäumend)

In einem Gesamtvolumen von 5000 ml
Die Hefezellen wurden für 5 Tage bei 30°C fermentiert. Es wurde ihnen eine Startdosierung von 100 ml 70% Glucose gegeben, und es wurden täglich 400 ml 70% Glucose hinzugefügt. Ein pH = 5,0 wurde durch Hinzufügen einer 10% NH₃ Lösung gehalten. Die Bewegung betrug 300 rpm für die ersten 22 Stunden, gefolgt von 900 rpm für die restliche Fermentation. Luft wurde mit 1 l Luft/l/min. für die ersten 22 Stunden hinzugefügt, gefolgt von 1,5 l Luft/l/min. für die restliche Fermentation.
Spurenelemente

6,8 g ZnCl₂

54,0 g FeCl₂·6H₂O

19,1 g MnCl₂·4H₂O

2,2 g CuSO₄·5H₂O

2,58 g CoCl₂

0,62 g H₃BO₃

0,024 g (NH₄)₆MO₇O₂₄·4H₂O

0,2 g KI

100 ml HCl (konzentriert)
In einem Gesamtvolumen von 1 l.
Vitaminlösung

250 mg Biotin

3 g Thiamin

10 g D-Calciumpanthetonat

100 g Myo-Inositol

50 g Cholinchlorid

1,6 g Pyridoxin

1,2 g Niacinamid

0,4 g Folsäure

0,4 g Riboflavin
In einem Gesamtvolumen von 1 l.
Transformation von Hefe
Saccharomyces cerevisiae wird mittels Standardmethoden transformiert (vgl. Sambrooks et al. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor)
Bestimmung der Frequenz der Hefetransformation
Die Transformationsfrequenz wird bestimmt durch Kultivieren der Transformanten auf SC-ura^– Platten für 3 Tage und Zählen der Anzahl der erschienenen Kolonien. Die Zahl der Transformanten pro mg geöffnetem Plasmid ist die Transformationsfrequenz.
Screenen nach positiven Varianten mit gesteigerter Waschleistung
Der folgende Filterassay kann für das Screenen nach positiven Varianten mit gesteigerter Waschleistung verwendet werden.
Filterassay mit geringem Calcium

1) Bereitstellen von SC Ura^– Replikaplatten (hilfreich für die Selektion von Stämmen, die den Expressionsvektor tragen), mit einem ersten Proteinbindefilter (Nylonmembran) und einem zweiten Filter, der Protein gering bildet (Celluloseacetat) darüber.
2) Ausbringen der Hefezellen enthaltend ein Ausgangslipasegen oder ein mutiertes Lipasegen auf den Doppelfilter und Inkubieren für 2 oder 3 Tage bei 30°C.
3) Halten der Kolonien auf dem oberen Filter durch Transferieren des oberen Filters auf eine neue Platte.
4) Abnehmen des Proteinbindefilters und Einfügen in eine leere Petrischale.
5) Gießen einer Agaroselösung umfassend eine Olivenölemulsion (2% PVA : Olivenöl = 3 : 1), Brilliant Green (Indiktor 0,004%), 100 mM Trispuffer pH9 und EGTA (Endkonzentration 5 mM) auf den unteren Filter, so dass die Kolonien, welche Lipaseaktivität exprimieren, in Form von blaugrünen Punkten identifiziert werden können.
6) Identifizieren der Kolonien, die in Schritt 5) gefunden wurden, die eine reduzierte Calciumabhängigkeit im Vergleich zu der Ausgangslipase aufweisen.

DNA-Sequenzierung wurde durchgeführt unter Verwendung des Applied Biosystems ABI DNA-Sequenziergerätes 373A gemäß dem Protokoll in dem ABI Dye Terminator Cycle Sequencing Kit.
Bewertung der Rekombinationseffizienz
Die Anzahl der Kolonien bestimmt die Effizienz der Rekombination des geöffneten Vektors und des Fragments. Der Prozentsatz an Kolonien mit aktiver Lipaseaktivität gibt eine Einschätzung der Mischung von aktiven und inaktiven Genen – theoretisch kann er aus einem Frameshift kalkuliert werden, da, je näher bei 50%, um so besser ist die Mischung, falls die Wahrscheinlichkeit von Wildtyp und Frameshift gleich ist, 25% für 2 Frameshifts und 12,5% für 3 Frameshifts.
Frameshiftmutation
Die Frameshiftmutation wurde gebildet entweder durch Auffüllen einer Restriktionsstelle (im Falle eines 5'-Überhangs) oder Deletieren der "klebrigen Enden" (im Falle des 3'-Überhangs) durch T4 DNA-Polymerase mit oder ohne dNTP (Deoxynukleotide = gleiche Mengen an dATP, dTTP, dCTP und dGTP). Verfahren zum Auffüllen von Restriktionsstellen (als "F" in 7 bezeichnet) und Deletieren von klebrigen Enden (als "(D)" in 7 bezeichnet) sind im Stand der Technik gut bekannt.
Verfahren zur Bestimmung von Kolonien mit Lipaseaktivität
Die Zahl der Kolonien und positiven (d. h. mit Lipaseaktivität) werden aus einem Durchschnitt von 3 Platten kalkuliert. Die verwendeten Kultivierungsbedingungen und Screeningbedingungen sind die folgenden:

1) Bereitstellen von SC Ura-Platten mit einem Proteinbindefilter (Nylonfilter) auf der Platte.
2) Ausbringen von Hefezellen enthaltend ein Ausgangslipasegen oder ein mutiertes Lipasegen auf den Filter und Inkubieren für 3 oder 4 Tage bei 30°C.
3) Abnehmen des Proteinbindefilters mit den Kolonien und Einfügen in eine Petrischale enthaltend: eine Agaroselösung mit einer Olivenölemulsion (2% PVA : Olivenöl = 2 : 1), Brilliant Green (Indiktor, 0,004%), 100 mM Trispuffer pH 9.
5) Identifizieren der Kolonien, welche Lipaseaktivität exprimieren, in Form von blaugrünen Punkten.

BEISPIELE
Beispiel 1
Testen der in vivo Rekombination von zwei homologen Genen
Das Saccharomyces cerevisiae Expressionsplasmid pJSO26 wurden wie oben in dem "Material und Methoden"-Abschnitt beschrieben, konstruiert.
Ein synthetisches Humicola lanuginosa Lipasegen (in pJSO37) enthaltend 12 zusätzliche Restriktionsstellen (siehe 4) wurde mit jeweils NruI, PstI, und NruI und PstI geschnitten, um das Gen ca. in der Mitte der DNA-Sequenz kodierend die Lipase zu öffnen.
Das geöffnete Plasmid (pJSO37) wurde in Saccharomyces cerevisiae YNG318 zusammen mit einem ca. 0,9 kb Wildtyp Humicola lanuginosa Lipase-DNA-Fragment (siehe 1), das aus pJSO26 durch PCR-Amplifikation hergestellt wurde, transformiert.
Außerdem wurde das geöffnete Plasmid ebenfalls alleine in die Hefe-Rekombinationswirtszelle transformiert (d. h. ohne das 0,9 kb synthetische Lipase-DNA-Fragment).
Die transformierten Hefezellen wurden, wie oben in dem "Material und Methoden"-Abschnitt beschrieben, angezogen, und die Transformationsfrequenz wurde wie oben beschrieben bestimmt.
Es wurde gefunden, dass die Transformationsfrequenz des geöffneten Plasmids alleine sehr gering war (10 Transformanten pro mg geöffnetem Plasmid), im Vergleich zu der Transformationsfrequenz des Plasmids/Fragments (50.000 Transformanten pro mg geöffnetem Plasmid).
Das Plasmid/Fragment war PCR-amplifiziert und resultierte in 20 Transformanten enthaltend Fragmente, welche die Lipasegenregion des rekombinierten Plasmids/Fragments abdeckten. Die Rekombinationsmischungen der 20 Transformanten wurden durch Restriktionsstellenverdau unter Verwendung von Standardverfahren analysiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1

P: Plasmid geöffnet mit PstI
N: Plasmid geöffnet mit NruI
P/N: Plasmid geöffnet mit PstI und NruI (führte zu der Entfernung eines 75 bp Fragments)
wt: Wildtyp Gen-Restriktionsenrymmuster
sg: synthetisches Gen-Restriktionsenzymmuster
nd: nicht durchgeführt

Wie aus Tabelle 1 entnommen werden kann, enthielten 10 Transformanten (äquivalent zu 50%) rekombinante DNA-Sequenzen. 4 von diesen 10 DNA-Sequenzen (äquivalent zu 20%) enthielten entweder eine Region des Wildtyp Gens rekombiniert in das synthetische Gen oder eine Region des synthetischen Gens rekombiniert in das Wildtyp Fragment.
Beispiel 2
In vivo Rekombination von Humicola lanuginosa Lipasevarianten
Die DNA-Sequenzen von 20 Varianten der Humicola lanuginosa Lipase wurden in vivo in derselben Mischung rekombiniert.
Sechs Vektoren wurden aus den Lipasevarianten (a) bis (f) (siehe die unten folgende Liste) durch Ligation in den Hefeexpressionsvektor pJSO37 hergestellt. Alle Vektoren wurden mit NruI aufgeschnitten.
Die DNA-Fragmenten von allen 20 homologen DNA-Sequenzen (g) bis (aa) (siehe die unten folgende Liste) wurden durch PCR-Amplifikation unter Verwendung von Standardverfahren hergestellt.
Die 20 DNA-Fragmente und die 6 geöffneten Vektoren wurden gemischt und in die Hefe Saccharomyces cerevisiae YNG318 durch Standardverfahren transformiert. Die Rekombinationswirtszelle wurde wie oben beschrieben kultiviert und wie oben beschrieben gescreent. Ca. 20 Transformanten wurden isoliert und hinsichtlich gesteigerter Waschleistung unter Verwendung des Filterassay-Verfahrens, das in dem "Material und Methoden"-Abschnitt beschrieben ist, getestet.
Zwei positive Transformanten (als A und B bezeichnet) wurden unter Verwendung des Filterassays identifiziert. Im Vergleich zu der Wildtyp Aminosäuresequenz wiesen die zwei rekombinierten positiven Transformanten folgende Mutationen auf:
A ist eine Rekombination von zwei Varianten.
---- stammt von dem Vektor (d)
==== stammt von dem DNA-Fragment, hergestellt aus der Variante (y)
B ist eine Rekombination des Vektors (c), der DNA-Fragmente (n) und (u).
---- stammt von dem Vektor (c)
<<<< stammt von dem DNA-Fragment, hergestellt aus der Variante (u)
==== stammt von dem DNA-Fragment, hergestellt aus der Variante (n)
???? Aminosäuremutation, die kein Ergebnis von Rekombination ist.
Wie gesehen werden kann, wurden die resultierenden positiven Varianten durch Rekombination von zwei oder mehr Varianten gebildet. Die Aminosäuremutation, die mit "?????" markiert ist, ist kein Ergebnis von in vivo Rekombination, weil keine der gemischten Lipasevarianten (siehe die Liste oben) eine der Mutationen aufweist. Demzufolge sind diese Mutationen ein Ergebnis der beliebigen Mutagenese, die während der Präparation der DNA-Fragmente durch Standard-PCR-Amplifikation auftrat.
Beispiel 3
Rekombination mit einer Frameshift-Mutation
Das synthetische Humicola lanuginosa Lipasegen (in Vektor JSO37) wurde an verschiedenen Stellen inaktiviert durch Deletieren (Positionen 184/385) oder Auffüllen (Position 290/317/518/746) von Restriktionsenzymstellen oder durch seitengerichtete Einführung eines Stopp-Kodons. Alle inaktiven synthetischen Lipasegene von 900 bp können aus 7) entnommen werden.
Es wurde eine Anzahl von verschiedenen 900 bp DNA-Fragmenten von den oben beschriebenen Vektoren unter Verwendung von Primer 4699 und Primer 5164 unter Verwendung einer Standard-PCR-Technik hergestellt. Kleinere PCR-Fragmente wurden unter Verwendung von Primer 8487 und Primer 4548 (260bp), Primer 2843 und Primer 4548 (488bp) hergestellt.
0,5 ml (ca. 0,1 mg) der Vektoren Blue 425, Blue 426, Blue 428 und Blue 429, geöffnet mit PstI (d. h. Position 385), Vektoren Blue 424 und Blue 425, geöffnet mit NruI (d. h. Position 464) wurden zusammen mit 3 ml (ca. 0,5 mg) der Fragmente 424, 425, 426, 428, 429 in verschiedenen Kombinationen in 100 ml Saccharomyces cerevisiae YNG318 kompetente Zellen, wie in Tabelle 1A gezeigt, transformiert.
Die Zahl der Kolonien und positiven (d. h. mit Lipaseaktivität) wurden aus dem Durchschnitt von drei Platten, wie in dem Material und Methoden-Abschnitt beschrieben, bestimmt.
Das Ergebnis des Tests ist in Tabelle 1A gezeigt. Tabelle 1A
Paarweise Rekombinationen einer Frameshift-Mutation in dem Vektor und einer anderen in dem Fragment auf der gegenüberliegenden Seite der Öffnungsstelle.X bestimmt durch 9 Platten;

#: bestimmt durch 6 Platten.

Die ersten zwei Reihen in Tabelle 1A zeigen Vektoren und Fragmente mit einem Frameshift auf jeder Seite der PstI Stelle. Das "Spiegelbild"-Experiment in Reihe 2, verglichen mit Reihe 1, ergibt eine reproduzierbar geringere Anzahl von aktiven Kolonien. Das gleiche gilt für Reihe 3 und 4, wenn auch nicht so deutlich. Wenn die Öffnungsstelle näher an dem Frameshift in dem Vektor liegt, dann steigt die Zahl der aktiven, wie aus Reihe 5 gesehen werden kann. Dies kann den Grund für den Unterschied in den "Spiegelbild"-Experimenten erklären. In beiden Fällen hat die höhere Anzahl von positiven die Öffnungsstelle näher an dem Frameshift in dem Vektor.
Es kann daher geschlossen werden, dass, je näher die Mutation an dem Ende des Vektors liegt, desto höher ist die Chance zur Mischung. Dies beruht wahrscheinlich auf der gut bekannten Tatsache, dass freie DNA-Enden ein hohes rekombinatorisches Potential aufweisen. Daher ist es wünschenswert, so viele freie DNA-Enden wie möglich zu haben, um das Mischen der Gene zu steigern. Dies wird beispielsweise in dem späteren Beispiel mit Rekombination von multiplen überlappenden Fragmenten erreicht.
Reihe 6 weist eine eher geringe Anzahl von aktiven auf, was wahrscheinlich darauf zurückzuführen ist, dass die Lage des Frameshifts in dem Fragment exakt an der PstI Öffnungsstelle des Vektors liegt.
Reihe 7 weist den Frameshift des Vektors nahe an der Öffnungsstelle auf und ergibt wieder eine hohe Anzahl von aktiven.
Rekombination mit einer Stoppkodon-Mutation
Um zu untersuchen, ob es irgendwelche Unterschiede in der Rekombinationseffizienz von Stoppkodon-Mutationen im Vergleich zu Frameshift-Mutationen gibt, wurden die folgenden Experimente durchgeführt.
Auf die gleiche Weise wie oben beschrieben wurden 0,5 ml (ca. 0,1 mg) der Vektoren Blue 624, Blue 625 und Blue 626 (siehe Tabelle 1B), geöffnet mit PstI umfassend Stoppkodons an spezifischen Positionen (jeweils die Position 184, 317 und 746) (hergestellt durch seitengerichtete Mutagenese) zusammen mit 3 ml (ca. 0,5 mg) der Fragmente 624, 625 und 626 in 100 ml Saccharomyces cerevisiae YNG318 kompetente Zellen in verschiedenen Kombinationen, wie in Tabelle 1B gezeigt, transformiert. Tabelle 1B
Paarweise Rekombinationen einer Stoppkodon-Mutation in dem Vektor und einer anderen in dem Fragment auf der gegenüberliegenden Seite der Öffnungsstelle.

NB: nicht bestimmt, aber eine hohe Anzahl.

Reihe 1 und 2 (in Tabelle 1B) weisen die Mutationen an derselben Stelle auf, wie in Reihe 1 und 2 in Tabelle 1A. Wie gesehen werden kann, ist die Zahl der Kolonien mit Lipaseaktivität deutlich höher für Stoppkodon-Mutationen im Vergleich zu Frameshift-Mutationen, aber mit derselben relativen Differenz zwischen den "Spiegelbild"-Experimenten.
Dies könnte bedeuten, dass die Stoppkodon-Mutation, die näher an der "Anwendung" des Verfahrens liegt, ein besseres Mischen als die Frameshift-Mutationen ergibt. Reihe 3 und 4 bestätigen, dass, je näher die Mutation an dem Ende des Vektors liegt, desto höher ist die Chance des Mischens.
Rekombination mit einem oder zwei Frameshift-Mutationen in dem Vektor und einer oder zwei Frameshift-Mutationen in dem Fragment
Unter Verwendung desselben Ansatzes wie oben beschrieben wurde der Einfluss von ein oder zwei Frameshift-Mutationen in dem Vektor und ein oder zwei Frameshift-Mutationen in dem Fragment untersucht unter Verwendung der Vektoren Blue 425, 426 und 428 (eine Mutation) und Vektoren Blue 442, Blue 443 (zwei Mutationen) und Fragmente 442 und 443 (zwei Frameshift-Mutationen) und Fragmente 424, 425, 426, 427, 428 (eine Mutation) und Wildtyp (keine Mutation).
Die Vektoren Blue 442 und 443 sind Doppel-Frameshift-Mutationen. Blue 442 = 428 + 429 und Blue 443 = 427 + 429 (siehe 7).
Die Rekombination wurde durchgeführt durch Transformieren von 0,5 ml Vektor (ca. 0,1 mg) geöffnet mit PstI und 3 ml PCR-Fragment (ca. 0,5 mg) in 100 ml Saccharomyces cerevisiae YNG318 kompetente Zellen.
Das Ergebnis des Tests ist in Tabelle 2A und Tabelle 2B gezeigt. Tabelle 2A
Eine Frameshift-Mutation in dem Vektor und zwei in dem Fragment auf jeder Seite der Öffnungsstelle.

#: bestimmt durch 6 Platten.

#: bestimmt durch 6 Platten.

Tabelle 2A zeigt eine eher hohe Anzahl von Kolonien mit Lipaseaktivität, sogar bei insgesamt 3 Frameshifts (aber nur einem Frameshift in dem Vektor), außer für die letzte Reihe, wo der Frameshift auf dem Vektor weit von der Öffnungsstelle entfernt ist. Zeile 4 weist weniger aktive als Reihe 3 auf, was wahrscheinlich darauf zurückzuführen ist, dass der Frameshift auf dem Vektor noch weiter von der Öffnungsstelle entfernt ist als der Frameshift auf dem Fragment, wodurch die aktiven Genmosaiken entstehen, die nicht von der Öffnungsstelle abhängen (siehe 2A). In Tabelle 2B wird eine sehr geringe Anzahl von aktiven beobachtet, wenn 2 Frameshifts auf dem Vektor lokalisiert sind. Die meisten dieser aktiven Kolonien sind Mosaiken der "Ausgangs"-DNA, was bedeutet, dass das Mischen nicht von der Öffnungsstelle abhängt (siehe 2B).
Rekombination mit zwei verschiedenen Vektoren oder Fragmenten
Das Ergebnis des Tests der Rekombination mit zwei verschiedenen Vektoren oder Fragmenten ist in Tabelle 3 gezeigt. Tabelle 3
Rekombinationen mit zwei verschiedenen Vektoren oder Fragmenten.

#: bestimmt durch 1 Platte

Wie erwartet, wird eine geringe Anzahl von Kolonien für das Kontrollexperiment in Reihe 1 der Tabelle 3 gesehen. Das Fragment, das in der mittleren Reihe hinzugefügt wurde, weist zwei Frameshifts auf, die beide dem Frameshift auf jedem Vektor entsprechen. Durch eine dreifache Rekombination wurde 4,2% aktive gebildet. Mit zwei Fragmenten mit je einem Frameshift und einem Vektor mit denselben beiden Frameshifts werden sehr wenig aktive gefunden.
Rekombination mit Vektoren die an verschiedenen Stellen geöffnet sind
Das Öffnen des Vektors an einer Seite anstelle von dem Öffnen ca. in der Mitte erzielt immer noch eine gute Rekombination, wie in Tabelle 4 gezeigt ist. Zwei Vektoren, die an verschiedenen Stellen geöffnet sind, können ebenfalls bis zu einem gewissen Grad rekombinieren (vergleiche mit den Vektorkontrollen in Tabelle 13). Tabelle 4

Öffnen des Vektors an einer Seite anstelle des Öffnens in der Mitte.

#: bestimmt durch 6 Platten.

Rekombination bei verschiedenen Konzentrationen von Vektor und Fragment
Die relative Konzentration von Vektor zu Fragment beeinflusst den Prozentsatz der positiven Kolonien, wie aus Tabelle 5 zu sehen ist.
Tabelle 5
Variieren der Konzentration von Vektor oder Fragment.
Rekombination mit Fragmenten verschiedener Größe
Die Größe des Fragments beeinflusst ebenfalls das Rekombinationsergebnis, wie in Tabelle 6 zu sehen ist.
Tabelle 6
Rekombination mit kleineren Fragmenten als 900 bp.
Rekombination mit ungeöffneten Vektoren
Die Transformation mit ungeöffneten Vektoren zeigt einen sehr geringen Grad an Rekombination (Tabelle 7).
Tabelle 7
Rekombination mit ungeöffneten Plasmiden.
Beispiel 4
Test der S. cerevisiae Mutanten, die durch Rekombination verändert wurden
Unter Verwendung desselben Ansatzes, der in Beispiel 3 beschrieben ist, wurde die Rekombination von geöffneten und ungeöffneten Vektoren und Fragmenten unter Verwendung einer Saccharomyces cerevisiae rad52 Mutante als Rekombinationswirtszelle getestet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 gezeigt.
Tabelle 8
Rekombinationsergebnis in der rad52 Mutante.
Die Ergebnisse mit rad52 zeigten, dass die Rekombination vollständig aufgehoben war. Die RAD52 Funktion wird für klassische Rekombination benötigt (aber nicht für ungleiche Schwesterstrangmitotische Rekombination), was zeigt, dass die Rekombination von geöffnetem Vektor und Fragment einen klassischen Rekombinationsmechanismus umfassen kann.
Beispiel 6
Rekombination von multiplen teilweise überlappenden Fragmenten
Um das Mischen der Mutationen durch das erfindungsgemäße Rekombinationsverfahren zu steigern, wurde Rekombination von zwei Fragmenten und einem gespalteten Vektor versucht.
Tabelle 15
Rekombinationsergebnis von zwei Fragmenten und einem gespaltenen Vektor. Die letzten 5 Reihen sind Kontrollen.
Wie aus Tabelle 15 gesehen werden kann, ist die Gewinnung des Humicola lanuginosa Lipasegens sehr effizient. Die letzten 5 Reihen in Tabelle 15 zeigen, dass der geöffnete Vektor alleine oder mit nur einem Fragment, das nicht die gesamte Lücke abdeckt (siehe 3) nur sehr wenige Kolonien ergibt.
Die erste Reihe wurde mit Wildtyp Fragmenten durchgeführt und ergibt 100% aktive Kolonien.
Die zweite Reihe wurde mit zwei Fragmenten durchgeführt, von denen jedes einen Frameshift enthält. Das Fragment PCR331-Fragment weist einen Frameshift an der BglII Seite auf, der, in dieser Rekombination, nicht durch ein Wildtyp Fragment (siehe 3) abgedeckt ist und daher ca. 0% aktive Lipase ergibt. Dasselbe ist der Fall für Reihe 3 und 6.
In Reihe 4 enthält das Fragment PCR386 einen Frameshift an der SphI Stelle, die von Wildtyp Sequenzen in dem gespalteten Vektor überlappt wird. Der Frameshift wurde in weniger als 10% der Gene rekombiniert, was geringer ist als das Ergebnis für eine Fragmentrekombination in der letzten Reihe von Tabelle 1A oben.
In Reihe 5 wird eine eher hohe Mischung zwischen zwei Fragmenten beobachtet, von denen jedes einen Frameshift und den Wildtyp-gespalteten Vektor aufweist, was zu 25% aktiven und 75% inaktiven Lipasekolonien führt. Dies ist wahrscheinlich darauf zurückzuführen, dass das Fragment PCR321 einen Frameshift in der Überlappung zwischen den zwei Fragmenten und in der gespalteten Region des Vektors aufweist. Wenn Fragment PCR386 zu 10% inaktiven wie in Reihe 4 beiträgt, dann ergibt Fragment PCR321 die restlichen 65% inaktiven – daher ergibt PCR386 35% Wildtyp in der Überlappung.
Reihe 7 ist das "Spiegelbild" von Reihe 4 mit zwei Frameshifts an der SphI Seite des Vektors (siehe 7) und 2 Wildtyp Fragmenten, was eine Integration des Wildtyp Fragments in mehr als 90% der Vektoren ergibt.
Reihe 8 zeigt, wie in Reihe 5, dass der Frameshift von PCR321 in der Überlappung und der gespalteten Region eine sehr hohe Zahl von inaktiven ergibt.
In Reihe 9 verursacht Fragment PCR385 mit einem Frameshift in der Vektorüberlappung eine sehr hohe Zahl von inaktiven.
Reihe 10 ergibt eine eher hohe Zahl von inaktiven, verglichen mit Reihe 7 und 4. Sie wird in Reihe 11 nicht gesteigert.
Reihe 12 zeigt, dass zwei Frameshifts in dem Vektor eine geringere Zahl von aktiven im Vergleich zu einem Frameshift in Reihe 7 ergeben.
Die Rekombination von drei teilweise überlappenden Fragmenten in einen gespalteten Vektor ist ebenfalls sehr effizient, wie in Tabelle 16 gesehen werden kann. Die letzte Reihe mit dem Vektor alleine ergibt sehr wenige Kolonien. Wie in 4 gesehen werden kann, sind alle verwendeten Fragmente Wildtyp. In der ersten Reihe in Tabelle 16 sind die Überlappungen zwischen dem Vektor und den Fragmenten eher lang, aber in der mittleren Reihe ist die Überlappung zwischen PCR353 und 355 nur 10 bp lang, und es wird immer noch sehr effizient rekombiniert! Dieses überraschende Ergebnis kann für sehr einfaches Domänenmischen von sogar nur gering verwandten Genen verwendet werden. Zum Beispiel können 3 verschiedene Domänen von 10 verschiedenen Genen als PCR Fragmente hergestellt werden, wobei sie durch das Primerdesign so designed sind, dass sie eine 10 bis 20 bp Überlappung aufweisen und zusammen rekombiniert und anschließend hinsichtlich der besten Kombination (1000 mögliche Kombinationen) gescreent werden.
Tabelle 16
Rekombinationsergebnis von 3 Fragmenten und einem gespalteten Vektor. Die letzte Reihe ist eine Kontrolle.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zur Herstellung von Polypeptidvarianten durch Mischen von verschiedenen Nukleotidsequenzen homologer DNA-Sequenzen durch in vivo Rekombination, umfassend die Schritte a) Bilden mindestens eines ringförmigen Plasmids umfassend eine DNA-Sequenz kodierend für ein Polypeptid, b) Öffnen des ringförmigen Plasmids/der ringförmigen Plasmide innerhalb der DNA-Sequenzen, kodierend für das Polypeptid/die Polypeptide, c) Herstellen mindestens eines DNA-Fragments umfassend eine DNA-Sequenz, die mindestens zu einem Teil der Polypeptid-kodierenden Regionen auf mindestens einem des ringförmigen Plasmids/der ringförmigen Plasmide homolog ist, d) Einführen mindestens eines geöffneten Plasmids/der geöffneten Plasmide, zusammen mit mindestens einem der homologen DNA-Fragmente/der homologen DNA-Fragmente, dass bzw. die Gesamtlängen-DNA-Sequenzen abdeckt, welches das Polypeptid/die Polypeptide oder Teile davon koliert, in eine Rekombinationswirtszelle, e) Kultivieren der Rekombinationswirtszelle, und f) Screenen nach positiven Polypeptidvarianten, dadurch gekennzeichnet, dass 2 oder mehr geöffnete Plasmide mit einem oder mehreren homologen DNA-Fragmenten in demselben Mischzyklus vermischt werden.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei mehr als ein Zyklus von Schritt a) bis f) durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei das geöffnete Plasmid/die geöffneten Plasmide gespalten ist/sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–3, wobei das Verhältnis zwischen dem geöffneten Plasmid/den geöffneten Plasmiden und dem homologen DNA-Fragment/den homologen DNA-Fragmenten im Bereich von 20 : 1 bis 1 : 50, beträgt vorzugsweise von 2 : 1 bis 1 : 10 (molvektor : molfragmente) mit spezifischen Konzentrationen von 1 pM bis 10 M der DNA.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–4, wobei 2 oder mehr, vorzugsweise 2–6, insbesondere 2–4 der DNA-Fragmente teilweise überlappende Regionen aufweisen.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei die überlappenden Regionen der DNA-Fragmente im Bereich von 5 bis 5000 bp, vorzugsweise von 10 bp bis 500 bp, insbesondere 10 bp bis 100 bp liegen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–6, wobei mindestens ein Zyklus der Schritt a) bis f) mit den Anfangs benutzten DNA-Fragmenten zurückgekreuzt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–7, wobei das Plasmid/die Plasmide in der Region rund um die Mitte der DNA-Sequenz/en kodierend das Polypeptid/die Polypeptide geöffnet wird/werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–8, wobei das Plasmid/die Plasmide in der Nähe einer Mutation in der DNA-Sequenzen kodierend das Poylpeptide/die Polypeptide geöffnet wird/werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–9, wobei das DNA-Fragment/die DNA-Fragmente, hergestellt in Schritt c) unter Bedingungen, die geeignet sind für hohe, mittlere oder niedrige Mutagenese hergestellt wird/werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–10, wobei die Polypeptide herstellbar aus den Ausgangs-DNA-Sequenzen Enzyme oder Proteine mit biologischer Aktivität sind.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei die Polypeptide Enzyme sind, die ausgewählt sind aus der Gruppe umfassend Protease, Lipasen, Cutinasen, Cellulasen, Amylasen, Peroxidasen, Oxidasen und Phytasen.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei die Polypeptide Proteine mit biologischer Aktivität sind, die ausgewählt sind aus der Gruppe umfassend Insulin, ACTH, Glucagon, Samatostatin, Samatotropin, Thymosin, Parathyroidhormon, Pigmenthormone, Samatomedin, Erythropoietin, Luteinisierungshormon, Choriongonadotropin, Hypothalamische Freisetzungsfaktoren, harnhemmende Hormone, Thyroidstimulierende Hormone, Relaxin, Interferon, Thrombopoietin (TPO) und Prolactin.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–12, wobei mindestens eine der anfangs benutzten Ausgangs-DNA-Sequenzen eine Wildtyp DNA-Sequenz ist, eine solche DNA-Sequenz für Wildtyp-Enzyme kodiert, insbesondere Lipasen, abgeleitet von filamentösen Pilzen wie Humicola sp., insbesondere Humicola lanuginosa, vor allem Humicola lanuginosa DSM 4109.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei mindestens eine der Ausgangs-DNA-Sequenzen ausgewählt ist aus der Gruppe von Vektoren (a) bis (f) und/oder DNA-Fragmenten (g) bis (aa) kodierend Humicola lanuginosa Lipasevarianten.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–12, wobei mindestens eine der anfangs benutzten Ausgangs-DNA-Sequenzen eine Wildtyp-DNA-Sequenz ist, wie eine DNA-Sequenz kodierend für Wildtyp-Enzyme, insbesondere Lipasen, abgeleitet von filamentösen Pilzen der Gattung Absidia, Rhizopus, Emericella, Aspergillus, Penicillium, Eupenicillium, Paecilomyces, Talaromyces, Thermoascus und Sclerocleista.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–12, wobei mindestens eine der anfangs benutzten Ausgangs-DNA-Sequenzen eine Wildtyp-DNA-Sequenz ist, wie eine DNA-Sequenz kodierend für Wildtypenzyme, insbesondere Lipasen, abgeleitet von Bakterien wie Pseudomonas sp., insbesondere Ps. fragi, Ps. stutzeri, Ps. cepacia, Ps. fluorescens, Ps. plantarii, Ps. gladioli, Ps. alcaligenes, Ps. pseudoalcaligenes, Ps. mendocina, Ps. auroginosa, Ps. glumae, Ps. syringae, Ps. wisconsinensis, oder ein Stamm von Bacillus sp., insbesondere B. subtilis, B. stearothermophilus, oder B. pumilus, oder ein Stamm von Streptomyces sp., insbesondere S. scabies, oder ein Stamm von Chromobacterium sp. insbesondere C. viscosum.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–12, wobei mindestens eine der anfangs benutzten Ausführungs-DNA-Sequenzen eine DNA-Sequenzvariante ist, wie eine DNA-Sequenz kodierend für eine Enzymvariante, insbesondere Lipasevarianten, abgeleitet von Hefen, wie Candida sp., insbesondere Candida rugosa, oder Geotrichum sp., insbesondere Geotrichum candidum.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–18, wobei die homologen Ausgangs-DNA-Sequenzen mindestens 60%, vorzugsweise mindestens 70% weiter bevorzugt mindestens 80%, vor allem mehr als 90% und sogar bis zu 100% homolog sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–19, wobei die Rekombinations-Wirtszelle eine eukaryonte Zelle ist, wie eine Pilzzelle oder eine Pflanzenzelle.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei die Pilzzelle eine Hefezelle aus der Gruppe von Zellen von Saccharomyces sp., insbesondere Stämmen von Saccharomyces cerevisiae oder Saccharomyces kluyveri oder Schizosaccharomyces sp., insbesondere Schizosaccharomyces pombe, oder Kluyveromyces sp., wie K. lactis, oder Hansenula sp., insbesondere H. polymorpha, oder Pichia sp., insbesondere P. pastoris, oder ein filamentöser Pilz aus der Gruppe von Aspergillus sp., insbesondere A. niger, A. nidulans oder A. oryzae, oder Neurospora sp., oder Fusarium sp., insbesondere F. oxysporum, oder Trichoderma sp. ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–21, wobei die Plasmid-DNA-Sequenz/en kodierend für das Polypeptid/die Polypeptide operativ mit einer Replikationssequenz verbunden ist/sind.
Verfahren nach Anspruch 22, wobei die Plasmid-DNA-Sequenzen kodierend das Polypeptid/die Polypeptide operativ mit einer funktionalen Promotorsequenz verbunden ist/sind.
Verfahren nach Anspruch 23, wobei das Plasmid ein Expressionsplasmid ist.
Verfahren nach Anspruch 24, wobei das Expresssionsplasmid pJSO26 oder pJSO37 ist.