ES2911701T3

ES2911701T3 - Polipéptidos de citocromo P450 y citocromo P450 reductasa, moléculas de ácido nucleico codificantes y usos de los mismos

Info

Publication number: ES2911701T3
Application number: ES13850891T
Authority: ES
Inventors: Carl Joerg Bohlmann; Chavez Maria Luisa Diaz; Jessie Moniodis
Original assignee: University of Western Australia; University of British Columbia
Current assignee: University of Western Australia; University of British Columbia
Priority date: 2012-11-01
Filing date: 2013-10-31
Publication date: 2022-05-20
Anticipated expiration: 2033-10-31
Also published as: JP2015533285A; HK1214629A1; US20160108374A1; AU2013337574A1; EP2914729A1; EP2914729B1; WO2014067007A1; US20180355326A1; EP2914729A4; CN105121647A; US20200270585A1; BR112015009774A2; AU2013337574B2; US9885023B2; CA2889945A1

Abstract

Una célula hospedadora, que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una citocromo P450 reductasa, o una porción con actividad catalítica de la misma, donde: la citocromo P450 reductasa codificada, o una porción con actividad catalítica de la misma, presenta una identidad de secuencia de al menos un 80% con un polipéptido de citocromo P450 reductasa establecido en las SEC. N.º ID.:12 o 13, o una porción con actividad catalítica del mismo; el polipéptido codificado de citocromo P450 reductasa, o un fragmento con actividad catalítica del mismo, cataliza la transferencia de dos electrones del NADPH a un aceptor de electrones; y la molécula de ácido nucleico es heteróloga para la célula hospedadora.

Description

DESCRIPCIÓN

Polipéptidos de citocromo P450 y citocromo P450 reductasa, moléculas de ácido nucleico codificantes y usos de los mismos

CAMPO DE LA INVENCIÓN

Se proporcionan citocromo P450 santaleno oxidasas, citocromo P450 bergamoteno oxidasas y citocromo P450 reductasas, moléculas de ácido nucleico que codifican las P450 santaleno oxidasas, citocromo P450 bergamoteno oxidasas y citocromo P450 reductasas, y métodos para producir productos cuya síntesis incluye reacciones catalizadas por la citocromo P450 santaleno y bergamoteno oxidasas. Entre los productos se incluyen santaloles y bergamotoles, así como precursores y derivados de los mismos.

ANTECEDENTES

El sándalo (Santalum album) es un árbol tropical semiparasitario y con un gran valor económico que crece lentamente en el sur de la India, Sri Lanka, el este de Indonesia y el norte de Australia. La madera es muy apreciada por su grano fino, su elevada densidad y sus excelentes propiedades de tallado. El duramen de sándalo tiene una fragancia única impartida por las resinas y aceites esenciales, incluidos santaloles, santalenos y otros sesquiterpenoides, que hay en el duramen. En general, el duramen de Santalum album contiene hasta un 6% en peso seco de aceites sesquiterpénicos. El aceite de sándalo predominantemente contiene los alcoholes sesquiterpénicos a-santalol, psantalol, Z-a-trans-bergamotol y ep/'-p-santalol, y adicionalmente incluye a-santaleno, p-santaleno, a-bergamoteno, ep/'-p-santaleno, p-bisaboleno, a-curcumeno, p-curcumeno y Y-curcumeno. El aceite de sándalo tiene un olor suave, leñoso-dulce y balsámico-animal que proviene del terpenoide p-santalol, y es sumamente valorado. El aceite de sándalo se ha obtenido por destilación del duramen de especies de Santalum y se usa como ingrediente en perfumes, en inciensos, en medicina tradicional y en pesticidas.

Tras siglos de sobreexplotación se ha producido la desaparición del sándalo en los rodales naturales. Se están estableciendo grandes plantaciones en todo el norte de Australia para satisfacer la demanda y conservar las reservas restantes. Además, existe una gran variación en la cantidad producida de aceite de duramen, incluso en condiciones de cultivo casi idénticas, debido a factores genéticos y ambientales, como el clima y las condiciones locales. Por lo general, el precio y la disponibilidad de los extractos naturales de plantas dependen de la abundancia, la cantidad producida de aceite y el origen geográfico de las plantas.

Aunque se han intentado enfoques químicos para generar santaloles y el resto de sesquiterpenoides en el aceite de sándalo, las estructuras sumamente complejas de estos compuestos han hecho que los procesos de síntesis económicamente viables para su producción en grandes cantidades sean inaccesibles. Por lo tanto, se necesitan síntesis eficientes y rentables de santaloles y otros sesquiterpenoides que impartan la fragancia del sándalo, tan apreciada, para su uso en la industria de las fragancias.

Por lo tanto, entre los objetos detallados en la presente memoria, está la provisión de métodos para la producción de santaloles y otros sesquiterpenoides y los productos resultantes de los métodos.

RESUMEN

En la presente memoria se proporcionan moléculas de ácido nucleico que codifican polipéptidos de citocromo P450 o fragmentos de los mismos con actividad catalítica y los polipéptidos codificados, y células hospedadoras que contienen dichas moléculas de ácido nucleico o polipéptidos codificados.

El alcance de la invención está delimitado por las reivindicaciones. Cualquier materia que esté fuera del alcance de las reivindicaciones se aporta únicamente a título comparativo. Por ejemplo, el polipéptido codificado de citocromo P450 o un fragmento con actividad catalítica, o una porción del mismo, presenta una identidad de secuencia de al menos un 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% con la SEC. N.° ID.:50, como una identidad de secuencia de al menos un 90% con la SEC. N.° ID.:50. También se proporcionan moléculas de ácido nucleico que codifican polipéptidos de citocromo P450 reductasa o fragmentos con actividad catalítica de los mismos y los polipéptidos codificados, y células hospedadoras que contienen dichas moléculas de ácido nucleico o los polipéptidos codificados. Por ejemplo, el polipéptido codificado de citocromo reductasa, o un fragmento con actividad catalítica del mismo, presenta una identidad de secuencia de al menos un 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con un polipéptido de citocromo P450 reductasa establecido en las SEC. N.° ID.:12 o 13, como una identidad de secuencia de al menos un 90% con un polipéptido de citocromo P450 reductasa establecido en las SEC. N.° ID.:12 o 13. Cualquiera de las moléculas de ácido nucleico proporcionadas en la presente memoria pueden ser ADNc o pueden ser una molécula de ácido nucleico aislada o purificada. Entre las moléculas de ácido nucleico y polipéptidos dados a conocer en la presente memoria hay un conjunto de CYP450 que presentan actividad de santaleno/bergamoteno oxidasa, que aportan, entre otras cosas, la genomanipulación del metabolismo en la biosíntesis del aceite de sándalo, mejora de los cultivos de sándalo y conservación de los bosques nativos de sándalo.

En particular, entre la células hospedadoras dadas a conocer hay células hospedadoras que están genomanipuladas para contener un ácido nucleico heterólogo que codifica cualquiera de los polipéptidos de citocromo P450 proporcionados en la presente memoria, de manera que las células hospedadoras tienen la capacidad de producir uno o más de a-santalol a partir de a-santaleno, p-santalol a partir de p-santaleno, ep/-p-santatol a partir de ep/-psantaleno y a-trans-bergamotol a partir de a-trans-bergamoteno, como uno o más de (E)-a-santalol, (Z)-a-santalol, (E)-p-santalol, (Z)-p-santalol, (E)-ep/-p-santalol, (Z)-ep/-p-santalol, (Z)-a-trans-bergamotol o (E)-a-trans-bergamotol. Por ejemplo, las células hospedadoras también están genomanipuladas para contener también una santaleno sintasa según se describe en la presente memoria con el fin de producir un santaleno y/o bergamoteno que son sustratos terpénicos del polipéptido codificado de citocromo P450. Las células hospedadoras también se pueden genomanipular para que también contengan un ácido nucleico heterólogo que codifique una citocromo P450 reductasa, como cualquiera de las proporcionadas en la presente memoria. La célula hospedadora es una célula procariota o una célula eucariota, como una célula de bacteria, levadura, insecto, planta o mamífero. Por ejemplo, la célula hospedadora es una célula del género Saccharomyces, una célula del género P/ch/a o una célula de Escher/ch/a col/. En ejemplos concretos en la presente memoria, la célula hospedadora es una célula de Saccharomyces cerev/s/ae. La célula hospedadora produce o está modificada para producir o sobreexpresar un pirofosfato acíclico precursor de terpenos, como el farnesil difosfato.

Por ejemplo, en la presente memoria se proporcionan polipéptidos de citocromo P450 aislados de Santalum album o fragmentos con actividad catalítica de los mismos, incluidos citocromo P450 santaleno oxidasas o fragmentos con actividad catalítica de las mismas y citocromo P450 bergamoteno oxidasas o fragmentos con actividad catalítica de las mismas. También se dan a conocer moléculas de ácido nucleico que codifican las citocromo P450 santaleno oxidasas y citocromo P450 bergamoteno oxidasas, o fragmentos con actividad catalítica de las mismas. También se dan a conocer formas modificadas de las mismas.

También se proporcionan moléculas de ácido nucleico que codifican polipéptidos de citocromo P450 reductasa, incluidos polipéptidos modificados de citocromo P450 reductasa. En la presente memoria se proporcionan polipéptidos de citocromo P450 reductasa aislados de Santalum album, y células hospedadoras que contienen los polipéptidos, donde los polipéptidos son heterólogos para la célula hospedadora. Se dan a conocer moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína de fusión que contiene una enzima de citocromo P450 y un segundo resto, como una sintasa o una porción con actividad catalítica de la misma.

También se proporcionan moléculas de ácido nucleico que codifican proteínas de fusión que contienen una santaleno sintasa de Santalum album y/o una citocromo P450 santaleno oxidasa o bergamoteno oxidasa y/o una citocromo P450 reductasa, o fragmentos con actividad catalítica de cualquiera de las enzimas. Entre los ejemplos de moléculas de ácido nucleico que codifican proteínas de fusión se encuentran las moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína de fusión que contiene: una santaleno sintasa y una citocromo P450 santaleno oxidasa; una santaleno sintasa y una bergamoteno oxidasa; una citocromo P450 santaleno oxidasa y una citocromo P450 reductasa; y una citocromo P450 bergamoteno oxidasa y una citocromo P450 reductasa o fragmentos con actividad catalítica de cualquiera de las enzimas precedentes. Se proporcionan proteínas codificadas y células hospedadoras que contienen los ácidos nucleicos y/o las proteínas.

En la presente memoria también se proporcionan métodos para producir cualquiera de los polipéptidos codificados de citocromo P450 o fragmentos con actividad catalítica de los mismos, incluidos métodos para producir un polipéptido de citocromo P450 reductasa. En la presente memoria también se proporcionan métodos para producir un santalol, bergamotol y/o mezclas de los mismos mediante la puesta en contacto de citocromo P450 santaleno oxidasas y/o citocromo p450 bergamoteno oxidasas con un sustrato para las mismas a partir del cual se forman estos productos. Los métodos se pueden ejecutar /n v/tro con reactivos aislados o reactivos parcialmente aislados, o /n vivo en una célula hospedadora que codifica las enzimas, y opcionalmente una sintasa y/u otro sustrato.

Por ejemplo, se dan a conocer citocromo P450 santaleno oxidasas aisladas de Santalum album o fragmentos con actividad catalítica de las mismas. Las citocromo P450 santaleno oxidasas aisladas de Santalum album catalizan la hidroxilación o monooxigenación del santaleno y/o el bergamoteno. En un ejemplo, las citocromo P450 santaleno oxidasas aisladas de Santalum album catalizan la formación de un santalol a partir de un santaleno y/o un bergamotol a partir de un bergamoteno. Por ejemplo, las citocromo P450 santaleno oxidasas aisladas de Santalum album catalizan la formación de a-santalol a partir de a-santaleno, p-santalol a partir de p-santaleno, ep/-p-santalol a partir de ep/-psantaleno y/o Z-a-trans-bergamotol a partir de a-trans-bergamoteno. Por ejemplo, las citocromo P450 santaleno oxidasas aisladas de Santalum album catalizan la formación de (E)-a-santalol, (Z)-a-santalol, (E)-p-santalol, (Z)-psantalol, (E)-ep/-p-santalol, (Z)-ep/-p-santalol, (Z)-a-trans-bergamotol o (E)-a-trans-bergamotol. También se dan a conocer citocromo P450 santaleno oxidasas aisladas que son miembros de la familia de CYP76.

En la presente memoria se proporcionan moléculas de ácido nucleico aislado que codifican un polipéptido de citocromo P450 santaleno oxidasa de Santalum album o un fragmento con actividad catalítica del mismo. Por ejemplo, en la presente memoria se proporcionan moléculas de ácido nucleico aislado (y células hospedadoras que contienen las moléculas de ácido nucleico, que son heterólogas para las células hospedadoras) que codifican un polipéptido de citocromo P450 santaleno oxidasa que tiene una secuencia aminoacídica establecida en las SEC. N.° ID.:7, 74, 75, 76 o 77; o un polipéptido de citocromo P450 santaleno oxidasa que tiene una secuencia aminoacídica con una identidad de secuencia de al menos un 96% con una citocromo P450 santaleno oxidasa cuya secuencia está establecida en las SEC. N.° ID.:7, 74, 75, 76 o 77. En otro ejemplo se dan a conocer moléculas de ácido nucleico aislado que codifican un polipéptido de citocromo P450 santaleno oxidasa que tiene una secuencia aminoacídica con una identidad de secuencia de al menos un 50% con un polipéptido de citocromo P450 santaleno oxidasa establecido en las SEC. N.° ID.:7, 74, 75, 76 o 77. El polipéptido de citocromo P450 santaleno oxidasa cataliza la hidroxilación o monooxigenación del santaleno y/o el bergamoteno. Por ejemplo, el polipéptido codificado de citocromo P450 santaleno oxidasa presenta una identidad de secuencia aminoacídica de al menos un 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con una secuencia aminoacídica establecida en las SEC. N.° ID.:7, 74, 75, 76 o 77.

También se dan a conocer moléculas de ácido nucleico aislado que codifican una citocromo P450 santaleno oxidasa, o un fragmento con actividad catalítica de la misma, seleccionadas de entre moléculas de ácido nucleico que tienen una secuencia nucleotídica establecida en las SEC. N.° ID.:3, 68, 69, 70 o 71; una secuencia nucleotídica que tiene una identidad de secuencia de al menos un 98% con una secuencia nucleotídica establecida en las SEC. N.° ID.:3, 68, 69, 70 o 71; y degeneraciones de las mismas. Opcionalmente, la molécula de ácido nucleico aislado tiene la secuencia nucleotídica establecida en las SEC. N.° ID.:3, 68, 69, 70 o 71. En algunos ejemplos, las moléculas de ácido nucleico aislado codifican un polipéptido de citocromo P450 santaleno oxidasa que tiene una secuencia aminoacídica establecida en las SEC. N.° lD.:7, 74, 75, 76 o 77. Las moléculas de ácido nucleico aislado dadas a conocer codifican polipéptidos de citocromo P450 santaleno oxidasa que catalizan la formación de un santalol, como un a-santalol, psantalol o ep/'-p-santalol, a partir de un santaleno, como un a-santaleno, p-santaleno o ep/'-p-santaleno, y/o catalizan la hidroxilación o monooxigenación del santaleno. Opcionalmente, el polipéptido codificado de citocromo P450 santaleno oxidasa cataliza la formación de Z-a-trans-bergamotol a partir de a-trans-bergamoteno. En la presente memoria también se proporcionan polipéptidos de citocromo P450 santaleno oxidasa codificados por cualquiera de las moléculas de ácido nucleico aislado proporcionadas en la presente memoria.

Por ejemplo, se dan a conocer citocromo P450 bergamoteno oxidasas aisladas de Santalum album o fragmentos con actividad catalítica de las mismas. Las citocromo P450 bergamoteno oxidasas aisladas de Santalum album proporcionadas o fragmentos con actividad catalítica de las mismas catalizan la hidroxilación o monooxigenación del bergamoteno y/o catalizan la formación de un bergamotol a partir de un bergamoteno. Por ejemplo, las citocromo P450 bergamoteno oxidasas aisladas de Santalum album catalizan la formación de Z-a-trans-bergamotol o (E)-a-trans-bergamotol a partir de a-frans-bergamoteno. Opcionalmente, las citocromo P450 bergamoteno oxidasas aisladas de Santalum album no catalizan la hidroxilación de un santaleno. Como otra posibilidad, las citocromo P450 bergamoteno oxidasas aisladas de Santalum album catalizan la hidroxilación de un santaleno. También se dan a conocer citocromo P450 bergamoteno oxidasas aisladas de Santalum album que son miembros de la familia de CYP76.

Se dan a conocer moléculas de ácido nucleico aislado que codifican un polipéptido de citocromo P450 bergamoteno oxidasa de Santalum album o un fragmento con actividad catalítica del mismo. Por ejemplo, se dan a conocer moléculas de ácido nucleico aislado que codifican un polipéptido de citocromo P450 bergamoteno oxidasa que tiene una secuencia aminoacídica establecida en las SEC. N.° ID.:6, 8, 9 o 73; o un polipéptido de citocromo P450 bergamoteno oxidasa que tiene una secuencia aminoacídica con una identidad de secuencia de al menos un 96% con un polipéptido de citocromo P450 establecido en las SEC. N.° ID.:6, 8, 9 o 73. En otro ejemplo, se dan a conocer moléculas de ácido nucleico aislado que codifican un polipéptido de citocromo P450 bergamoteno oxidasa que tiene una secuencia aminoacídica con una identidad de secuencia de al menos un 50% con un polipéptido de citocromo P450 bergamoteno oxidasa establecido en las SEC. N.° ID.:6, 8, 9 o 73. El polipéptido de citocromo P450 bergamoteno oxidasa cataliza la hidroxilación o monooxigenación del bergamoteno. Por ejemplo, el polipéptido codificado de citocromo P450 bergamoteno oxidasa presenta una identidad de secuencia aminoacídica de al menos un 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con una secuencia aminoacídica establecida en las SEC. N.° ID.:6, 8, 9 o 73.

También se dan a conocer moléculas de ácido nucleico aislado que codifican un polipéptido de citocromo P450 bergamoteno oxidasa, o un fragmento con actividad catalítica del mismo, que tiene una secuencia nucleotídica establecida en cualquiera de las SEC. N.° ID.:2, 4, 5 o 67; una secuencia nucleotídica que tiene una identidad de secuencia de al menos un 98% con una secuencia nucleotídica establecida en cualquiera de las SEC. N.° ID.:2, 4, 5 o 67; y degeneraciones de las mismas. En una descripción, la molécula de ácido nucleico aislado tiene una secuencia nucleotídica establecida en las SEC. N.° ID.:2, 4, 5 o 67. Opcionalmente, la molécula de ácido nucleico aislado codifica un polipéptido de citocromo P450 bergamoteno oxidasa que tiene una secuencia aminoacídica establecida en las SEC. N.° ID.:6, 8, 9 o 73. Las moléculas de ácido nucleico aislado codifican un polipéptido de citocromo P450 bergamoteno oxidasa que cataliza la formación de un bergamotol, como Z-a-trans-bergamotol, a partir de un bergamoteno, como a-trans-bergamoteno, y/o cataliza la hidroxilación o monooxigenación de un bergamoteno, como el a-trans-bergamoteno. Opcionalmente, la citocromo P450 bergamoteno oxidasa codificada no cataliza la hidroxilación de un santaleno. También se dan a conocer polipéptidos de citocromo P450 bergamoteno oxidasa codificados por cualquiera de las moléculas de ácido nucleico aislado proporcionadas en la presente memoria.

También se dan a conocer moléculas de ácido nucleico aislado que codifican un polipéptido de citocromo P450 de Santalum album, o fragmentos con actividad catalítica del mismo, que tiene una secuencia nucleotídica establecida en las SEC. N.° ID.:1 o 72; una secuencia nucleotídica que tiene una identidad de secuencia de al menos un 99% con una secuencia nucleotídica establecida en las SEC. N.° ID.:1 o 72; y degeneraciones de las mismas. También se dan a conocer moléculas de ácido nucleico aislado que codifican un polipéptido de citocromo P450 que tiene una secuencia aminoacídica establecida en las SEC. N.° ID.:50 o 78; o que tiene una secuencia aminoacídica con una identidad de secuencia de al menos un 99% con la secuencia aminoacídica establecida en las SEC. N.° ID.:50 o 78. En la presente memoria también se proporcionan polipéptidos de citocromo P450 de Santalum album codificados por cualquiera de las moléculas de ácido nucleico aislado proporcionadas en la presente memoria.

En la presente memoria también se proporcionan moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido de citocromo P450, o fragmentos con actividad catalítica del mismo, que tiene uno o más dominios heterólogos, o porciones de los mismos, de uno o más citocromos P450. El dominio se selecciona de entre hélice A, hebra p 1-1, hebra p 1-2, hélice B, hebra p 1-5, hélice B', hélice C, hélice D, hebra p 3-1, hélice E, hélice F, hélice G, hélice H, hebra p 5-1, hebra p 5-2, hélice I, hélice J, hélice J', hélice K, hebra p 1-4, hebra p 2-1, hebra p 2-2, hebra p 1-3. Dominio hemo, hélice L, hebra p 3-3, hebra p 4-1, hebra p 4-2 y hebra p 3-2. Opcionalmente, el dominio heterólogo, o una porción contigua del mismo, reemplaza la totalidad o una porción contigua del dominio nativo correspondiente del polipéptido de citocromo P450 que no contiene el dominio heterólogo. Por ejemplo, el polipéptido modificado de citocromo P450 codificado contiene la totalidad de un dominio heterólogo de un citocromo P450 distinto. En otros ejemplos, el polipéptido modificado de citocromo P450 codificado tiene al menos un 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 95% de los aminoácidos contiguos de un dominio heterólogo de uno o más citocromos P450 distintos.

En la presente memoria se proporcionan citocromo P450 reductasas aisladas de Santalum album o fragmentos con actividad catalítica de las mismas. Por ejemplo, en la presente memoria se proporcionan citocromo P450 reductasas aisladas de Santalum album que catalizan la transferencia de dos electrones del NADPH a un aceptor de electrones, que es un citocromo P450, hemo oxigenasa, citocromo b5 o escualeno epoxidasa. En ejemplos concretos, el aceptor de electrones es un citocromo P450.

En la presente memoria también se proporcionan moléculas de ácido nucleico aislado que codifican un polipéptido de citocromo P450 reductasa de Santalum album o fragmentos con actividad catalítica del mismo. Por ejemplo, en la presente memoria se proporcionan moléculas de ácido nucleico aislado que codifican un polipéptido de citocromo P450 reductasa que tiene una secuencia aminoacídica establecida en las SEC. N.° ID.:12 o 13; o que codifican un polipéptido de citocromo P450 reductasa que tiene una secuencia aminoacídica con una identidad de secuencia de al menos un 80% con un polipéptido de citocromo P450 reductasa establecido en las SEC. N.° ID.:12 o 13. En otro ejemplo, en la presente memoria se proporciona una molécula de ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido de citocromo p450 reductasa que presenta una identidad de secuencia aminoacídica de al menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con una secuencia aminoacídica establecida en las SEC. N.° ID.:12 o 13.

También se dan a conocer moléculas de ácido nucleico aislado que tienen una secuencia nucleotídica establecida en las SEC. N.° ID.:10 o 11; una secuencia nucleotídica que tiene una identidad de secuencia de al menos un 95% con una secuencia nucleotídica establecida en las SEC. N.° ID.:10 o 11; y degeneraciones de las mismas. Por ejemplo, se dan a conocer moléculas de ácido nucleico aislado que tienen una secuencia nucleotídica establecida en las SEC. N.° ID.:10 o 11. En algunos ejemplos, la moléculas de ácido nucleico aislado codifican polipéptidos de citocromo P405 reductasa que tienen una secuencia aminoacídica con una identidad de secuencia de al menos un 95% con un polipéptido de citocromo P450 reductasa establecido en las SEC. N.° ID.:12 o 13. En un ejemplo concreto, la molécula de ácido nucleico aislado codifica un polipéptido de citocromo P450 reductasa que tiene una secuencia aminoacídica establecida en las SEC. N.° ID.:12 o 13. Las moléculas de ácido nucleico codifican polipéptidos de citocromo P450 reductasa que catalizan la transferencia de dos electrones del NADPH a un aceptor de electrones, como un citocromo P450, hemo oxigenasa, citocromo b5 o escualeno epoxidasa. En un ejemplo concreto, el aceptor de electrones es un citocromo P450. En la presente memoria también se proporcionan polipéptidos de citocromo P450 reductasa codificados por las moléculas de ácido nucleico.

En la presente memoria también se proporcionan moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido modificado de citocromo P450 reductasa de Santalum album o fragmentos con actividad catalítica del mismo. Por ejemplo, se dan a conocer moléculas de ácido nucleico que codifican polipéptidos modificados de citocromo P450 reductasa que contienen al menos un reemplazo, adición o deleción de un aminoácido con respecto al polipéptido de citocromo P450 reductasa que no contiene la modificación. Opcionalmente, el polipéptido modificado de citocromo P450 reductasa codificado está trucado en el extremo aminoterminal o el extremo carboxiterminal. Por ejemplo, se dan a conocer moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido modificado de citocromo P450 reductasa que está trucado en el extremo aminoterminal. Por ejemplo, la molécula de ácido nucleico codifica un polipéptido modificado de citocromo P450 reductasa que tiene una secuencia aminoacídica establecida en las SEC. N.° ID.:14 o 15; o tiene una secuencia aminoacídica que es idéntica en al menos un 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% a las SEC. N.° ID.:14 o 15. También se dan a conocer moléculas de ácido nucleico que tienen una secuencia nucleotídica establecida en las SEC. N.° ID.:63 o 64; una secuencia nucleotídica que tiene una identidad de secuencia de al menos un 95% con una secuencia nucleotídica establecida en las SEC. N.° ID.:63 o 64; y degeneraciones de las mismas. Las moléculas de ácido nucleico dadas a conocer codifican polipéptidos de citocromo P450 reductasa que catalizan la transferencia de dos electrones del NADPH a un aceptor de electrones, como un citocromo P450, hemo oxigenasa, citocromo b5 o escualeno epoxidasa. Opcionalmente, el aceptor de electrones es un citocromo P450. En la presente memoria también se proporcionan polipéptidos de citocromo P450 reductasa codificados por las moléculas de ácido nucleico.

Se dan a conocer moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína de fusión que contiene una santaleno sintasa de Santalum album, o un fragmento con actividad catalítica de la misma, y/o una citocromo P450 santaleno oxidasa o bergamoteno oxidasa, o un fragmento con actividad catalítica de las mismas, y/o una citocromo P450 reductasa, o un fragmento con actividad catalítica de la misma.

Se dan a conocer moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína de fusión que contiene santaleno sintasa y una citocromo P450 santaleno oxidasa o un fragmento con actividad catalítica de la misma. La santaleno sintasa de secuencia completa es codificada por una secuencia nucleotídica establecida en cualquiera de las SEC. N.° ID.:58-60 y la citocromo P450 santaleno oxidasa es codificada por cualquier molécula de ácido nucleico proporcionada en la presente memoria que codifica una citocromo P450 santaleno oxidasa. También se dan a conocer moléculas de ácido nucleico que codifican una santaleno sintasa y una citocromo P450 santaleno oxidasa. La santaleno sintasa tiene una secuencia aminoacídica establecida en cualquiera de las SEC. N.° ID.:17, 52 y 53, y la citocromo P450 santaleno oxidasa tiene una secuencia aminoacídica establecida en cualquiera de las SEC. N.° ID.:7, 73, 74, 75 y 76.

Se dan a conocer moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína de fusión que contiene santaleno sintasa y una citocromo P450 bergamoteno oxidasa o un fragmento con actividad catalítica de la misma. La santaleno sintasa tiene una secuencia nucleotídica establecida en cualquiera de las SEC. N.° ID.:58-60 y la citocromo P450 bergamoteno oxidasa es cualquier molécula de ácido nucleico proporcionada en la presente memoria que codifica una citocromo P450 bergamoteno oxidasa. También se dan a conocer moléculas de ácido nucleico que codifican una santaleno sintasa y una citocromo P450 bergamoteno oxidasa. La santaleno sintasa tiene una secuencia aminoacídica establecida en cualquiera de las SEC. N.° ID.:17, 52 y 53 y la citocromo P450 bergamoteno oxidasa tiene una secuencia aminoacídica establecida en cualquiera de las SEC. N.° ID.:6, 8, 9 y 73.

En la presente memoria se proporcionan moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína de fusión que contiene un citocromo P450, o un fragmento con actividad catalítica del mismo, y una citocromo P450 reductasa, o un fragmento con actividad catalítica de la misma, donde el citocromo P450 es cualquier molécula de ácido nucleico proporcionada en la presente memoria que codifica una citocromo P450 oxidasa y la citocromo P450 reductasa es cualquier molécula de ácido nucleico proporcionada en la presente memoria que codifica una citocromo P450 reductasa. Por ejemplo, en la presente memoria se proporcionan moléculas de ácido nucleico que codifican un citocromo P450 que tiene una secuencia aminoacídica establecida en cualquiera de las SEC. N.° ID.:6-9 y 73-78 y una citocromo P450 reductasa que tiene una secuencia aminoacídica establecida en cualquiera de las SEC. N.° ID.:12-15.

Opcionalmente, en las moléculas de ácido nucleico proporcionadas en la presente memoria que codifican una proteína de fusión, la santaleno sintasa y/o citocromo P450 santaleno oxidasa o bergamoteno oxidasa y/o citocromo P450 reductasa están conectadas de manera directa. Como otra posibilidad, en las moléculas de ácido nucleico proporcionadas en la presente memoria que codifican una proteína de fusión, la santaleno sintasa y/o citocromo P450 santaleno oxidasa o bergamoteno oxidasa y/o citocromo P450 reductasa están conectadas mediante un conector.

En la presente memoria también se proporcionan vectores que contienen cualquier molécula de ácido nucleico proporcionada en la presente memoria, incluidas moléculas de ácido nucleico que codifican citocromos P450, como santaleno oxidasas y bergamoteno oxidasas, citocromo P450 reductasas, citocromo P450 reductasas modificadas y proteínas de fusión. Opcionalmente, el vector es un vector procariótico, un vector vírico o un vector eucariótico. Por ejemplo, el vector es un vector de levadura. En la presente memoria también se proporcionan células que contienen cualquier vector proporcionado en la presente memoria. En la presente memoria también se proporcionan células que contienen cualquier molécula de ácido nucleico proporcionada en la presente memoria, incluidas moléculas de ácido nucleico que codifican citocromos P450, como santaleno oxidasas y bergamoteno oxidasas, citocromo P450 reductasas, citocromo P450 reductasas modificadas y proteínas de fusión. Opcionalmente, la célula es una célula procariota o una célula eucariota. Como otra posibilidad, la célula se selecciona de entre una célula de bacteria, levadura, insecto, planta o mamífero. Opcionalmente, la célula es una célula de levadura. Entre las células de levadura se encuentra una célula del género Saccharomyces y una célula del género Pichia. Por ejemplo, la célula es una célula de Saccharomyces cerevisiae. En otro ejemplo, la célula es una célula de Escherichia coli. Por lo tanto, se proporcionan células recombinantes, incluidas células de levadura, para la producción de santaloles y bergamotol.

Las células pueden incluir un ácido nucleico que codifica una sintasa, como santaleno sintasa, como una sintasa de Santalum album, para catalizar la producción de un sustrato para las enzimas de P450 proporcionadas en la presente memoria.

En la presente memoria también se proporcionan células que expresan un polipéptido de citocromo P450 santaleno oxidasa, un polipéptido de citocromo P450 bergamoteno oxidasa, un polipéptido de citocromo P450 reductasa y/o una proteína de fusión que contiene una santaleno sintasa de Santalum album y/o una citocromo P450 santaleno oxidasa o bergamoteno sintasa y/o una citocromo P450 reductasa. También se dan a conocer plantas transgénicas que contienen cualquier vector proporcionado en la presente memoria. Opcionalmente, la planta transgénica es una planta de tabaco.

En la presente memoria se proporcionan métodos para producir un polipéptido de citocromo P450, mediante: la introducción de una molécula de ácido nucleico proporcionada en la presente memoria que codifica un polipéptido de citocromo P450 o cualquier vector proporcionado en la presente memoria que codifica un polipéptido de citocromo P450 en una célula; el cultivo de la célula en condiciones adecuadas para la expresión del polipéptido de citocromo P450 codificado por el ácido nucleico o el vector; y, opcionalmente, el aislamiento del polipéptido de citocromo P450.

En la presente memoria se proporcionan métodos para producir un polipéptido de citocromo P450 reductasa, mediante: la introducción de una molécula de ácido nucleico proporcionada en la presente memoria que codifica un polipéptido de citocromo P450 reductasa o cualquier vector proporcionado en la presente memoria que codifica un polipéptido de citocromo P450 reductasa en una célula; el cultivo de la célula en condiciones adecuadas para la expresión del polipéptido de citocromo P450 reductasa codificado por el ácido nucleico o el vector; y, opcionalmente, el aislamiento del polipéptido de citocromo P450 reductasa.

En la presente memoria se proporcionan métodos para la producción de un santalol, bergamotol y/o mezclas de los mismos, mediante: (a) poner en contacto un santaleno y/o un bergamoteno con una citocromo P450 santaleno oxidasa o bergamoteno oxidasa en condiciones adecuadas para la formación de un santalol, bergamotol y/o mezclas de los mismos; y (b) opcionalmente aislar el santalol, bergamotol y/o mezclas de los mismos. El paso (a) se puede efectuar in vitro o in vivo. Por ejemplo, el paso (a) se efectúa in vivo en una célula transformada con una molécula de ácido nucleico o un vector que codifica un polipéptido de citocromo P450 santaleno oxidasa o bergamoteno oxidasa, de manera que se expresa el polipéptido de citocromo P450 santaleno oxidasa o bergamoteno oxidasa codificado por la molécula de ácido nucleico o vector; y el polipéptido de citocromo P450 santaleno oxidasa o bergamoteno oxidasa cataliza la formación de santalol y/o bergamotol a partir de santaleno y/o bergamoteno.

En la presente memoria se proporciona una célula hospedadora que contiene una molécula de ácido nucleico que codifica un citocromo P450 o polipéptido de citocromo P450 proporcionados en la presente memoria. La molécula de ácido nucleico y el polipéptido de citocromo P450 son heterólogos para la célula. En algunos ejemplos, la célula hospedadora además contiene un ácido nucleico que codifica una sintasa que produce un sustrato terpénico de un citocromo P450. En algunos ejemplos, la sintasa es heteróloga para la célula hospedadora. En ejemplos concretos, la terpeno sintasa es una santaleno sintasa, como una terpeno sintasa que cataliza la formación de santaleno y/o bergamoteno. Por ejemplo, la terpeno sintasa tiene una secuencia aminoacídica establecida en cualquiera de las s Ec . N.° ID.:17, 52 y 53 o una secuencia aminoacídica que es idéntica en al menos un 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% a cualquiera de las SEC. N.° ID.:17, 52 y 53. En algunos ejemplos, la célula hospedadora es una célula procariota o una célula eucariota que se selecciona de entre una célula de bacteria, levadura, insecto, planta o mamífero. Opcionalmente, la célula hospedadora es una célula de levadura que es una célula del género Saccharomyces o una célula del género Pichia. Por ejemplo, la célula hospedadora es una célula de Saccharomyces cerevisiae. Como otra posibilidad, la célula hospedadora es una célula de Escherichia coli. En algunos ejemplos, la célula hospedadora produce un pirofosfato acíclico precursor de terpenos, como el farnesil difosfato. En ejemplos concretos, la célula hospedadora produce farnesil difosfato de manera natural o está modificada para producir más farnesil difosfato en comparación con una célula que no está modificada. En la presente memoria también se proporciona un método para producir un santalol, bergamotol y/o mezclas de los mismos, incluyendo dicho método los pasos de cultivar cualquiera de las células hospedadoras proporcionadas en la presente memoria en condiciones adecuadas para la formación de un santalol, bergamotol y/o mezclas de los mismos; y opcionalmente aislar el santalol, bergamotol y/o mezclas de los mismos.

En la presente memoria se proporcionan métodos para la producción de un santalol, bergamotol y/o mezclas de los mismos, mediante: (a) poner en contacto un pirofosfato acíclico precursor de terpenos con una santaleno sintasa en condiciones adecuadas para la formación de un santaleno y/o bergamoteno; (b) poner en contacto el santaleno y/o bergamoteno resultantes con una citocromo P450 santaleno oxidasa o bergamoteno oxidasa en condiciones adecuadas para la formación de un santalol, bergamotol y/o una mezcla de los mismos para producir un santalol, bergamotol o una mezcla de los mismos; y (c) opcionalmente aislar el santaleno y bergamoteno producidos en el paso (a) o el santalol, bergamotol y/o mezclas de los mismos producidos en el paso (b). Opcionalmente, el paso (a) y/o el paso (b) se llevan a cabo in vitro o in vivo. Por ejemplo, el paso (a) se lleva a cabo in vivo en una célula transformada con una molécula de ácido nucleico que codifica una santaleno sintasa, de manera que se expresa la santaleno sintasa codificada por la molécula de ácido nucleico; y la santaleno sintasa cataliza la formación de santaleno y bergamoteno a partir del pirofosfato acíclico precursor de terpenos; y/o el paso (b) se lleva a cabo in vivo en una célula transformada con una molécula de ácido nucleico o un vector que codifica un polipéptido de citocromo P450 santaleno oxidasa o bergamoteno oxidasa, de manera que se expresa el polipéptido de citocromo P450 santaleno oxidasa o bergamoteno oxidasa codificado por la molécula de ácido nucleico o vector; y el polipéptido de citocromo P450 santaleno oxidasa o bergamoteno oxidasa cataliza la formación de santalol y/o bergamotol a partir de santaleno y/o bergamoteno. En dichos ejemplos, el pirofosfato acíclico precursor de terpenos puede ser un farnesil pirofosfato.

En cualquiera de los métodos proporcionados en la presente memoria, la célula puede ser una célula procariota o una célula eucariota que se selecciona de entre una célula de bacteria, levadura, insecto, planta o mamífero. Opcionalmente, la célula es una célula de levadura que es una célula del género Saccharomyces o una célula del género Pichia, como una célula de Saccharomyces cerevisiae. En algunos ejemplos, la célula está modificada para producir más FPP en comparación con una célula que no está modificada. En algunos ejemplos de los métodos, la célula está modificada para producir una santaleno sintasa. Por ejemplo, la célula está modificada para producir una santaleno sintasa que tiene una secuencia aminoacídica establecida en las SEC. N.° ID.:17, 52 o 53 o una sintasa que tiene una identidad de secuencia de al menos un 80%, 85%, 90%, 95% con la misma.

En algunos de los métodos dados a conocer el santaleno o bergamoteno es un a-santaleno, p-santaleno, epi-psantaleno o a-frans-bergamoteno. En algunos ejemplos, el santalol o bergamotol es un a-santalol, p-santalol, epi-psantalol o a-frans-bergamotol. En algunos ejemplos, el santalol o bergamotol es un (E)-a-santalol, (Z)-a-santalol, (E)-p-santalol, (Z)-p-santalol, (E)-epi-p-santalol, (Z)-epi-p-santalol, (Z)-a-frans-bergamotol o (E)-a-frans-bergamotol. En ejemplos adicionales de los métodos dados a conocer, el santaleno, bergamoteno, santalol, bergamotol o mezclas de los mismos se aíslan mediante extracción con un disolvente orgánico y/o cromatografía en columna.

En algunos ejemplos de los métodos proporcionados, el santaleno y/o bergamoteno se ponen en contacto con una citocromo P450 santaleno oxidasa que es: un polipéptido de citocromo P450 santaleno oxidasa proporcionado en la presente memoria; un polipéptido de citocromo P450 santaleno oxidasa proporcionado en la presente memoria codificado por cualquier molécula de ácido nucleico proporcionada en la presente memoria; una molécula de ácido nucleico proporcionada en la presente memoria que codifica una citocromo P450 santaleno oxidasa; o un vector proporcionado en la presente memoria que codifica una citocromo P450 santaleno oxidasa, de manera que se produce santalol y/o bergamotol.

En algunos ejemplos de los métodos proporcionados, el bergamoteno se pone en contacto con una citocromo P450 bergamoteno oxidasa que es: un polipéptido de citocromo P450 bergamoteno oxidasa proporcionado en la presente memoria; un polipéptido de citocromo P450 bergamoteno oxidasa proporcionado en la presente memoria codificado por cualquier molécula de ácido nucleico proporcionada en la presente memoria; una molécula de ácido nucleico proporcionada en la presente memoria que codifica una citocromo P450 bergamoteno oxidasa; o un vector proporcionado en la presente memoria que codifica una citocromo P450 bergamoteno oxidasa, de manera que se produce bergamotol.

En la presente memoria también se proporcionan métodos para la producción de un santalol, bergamotol y/o mezclas de los mismos. Cada uno de los pasos (a) y (b) se pueden efectuar simultánea o secuencialmente. Por ejemplo, los pasos (a) y (b) se efectúan simultáneamente con una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de fusión que contiene una santaleno sintasa y una citocromo P450 santaleno oxidasa o bergamoteno oxidasa; o un polipéptido de fusión que contiene una santaleno sintasa y una citocromo P450 santaleno oxidasa o bergamoteno oxidasa. En algunos ejemplos, el santaleno y/o bergamoteno se ponen en contacto con una molécula de ácido nucleico proporcionada en la presente memoria que codifica un polipéptido de fusión; o un polipéptido de fusión codificado por una molécula de ácido nucleico proporcionada en la presente memoria.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Todas las figuras que no estén dentro del alcance de las reivindicaciones se proporcionan únicamente a título de referencia.

FIGURA 1. En la Figura 1 se muestran las estructuras químicas del (Z)-a-santalol (1), (E)-a-santalol (9), (Z)-p-santalol (2), (E)-p-santalol (10), (E)-epi-p-santalol (3), (Z)-epi-p-santalol (11), (Z)-a-frans-bergamotol (4), (E)-a-frans-bergamotol (12), a-santaleno (5), p-santaleno (6), epi-p-santaleno (7) y a-frans-bergamoteno (8).

FIGURAS 2A-2B. En las Figuras 2A-2B se muestra el alineamiento de la santaleno oxidasa establecida en la SEC. N.° ID.:7 con la bergamoteno oxidasa establecida en las SEC. N.° ID.:6, 8 y 9. Un «*» significa que los restos alineados son idénticos, un «:» significa que los restos alineados no son idénticos, pero son similares y contienen restos aminoacídicos conservados en la posición alineada, y un «.» significa que los restos alineados son similares y contienen restos aminoacídicos semiconservados en la posición alineada.

FIGURAS 3A-3C. En las Figuras 3A-3C se muestra el alineamiento de las citocromo P450 reductasas de Sanfalum album establecidas en las SEC. N.° ID.:12 y 13 con las citocromo P450 reductasas de Arabidopsis fhaliana establecidas en las SEC. N.° ID.:46 y 58. Un «*» significa que los restos alineados son idénticos, un «:» significa que los restos alineados no son idénticos, pero son similares y contienen restos aminoacídicos conservados en la posición alineada, y un «.» significa que los restos alineados son similares y contienen restos aminoacídicos semiconservados en la posición alineada.

FIGURA 4. En la Figura 4 se muestra la filogenia obtenida por el método de «neighbour-joining» de las secuencias aminoacídicas predichas de SaCYP76F38vl (SaCYP76-G5), SaCYP76F39v1 (SaCYP76-G10), SaCYP76F37v1 (SaCYP76-G11) y SaCYP76F38v2 (SaCYP76-G12) y enzimas de citocromo P450 para el metabolismo de terpenoides, según se describe en el Ejemplo 4.

FIGURAS 5A-5B. En las Figuras 5A-5B se muestra el alineamiento de la santaleno oxidasa establecida en la SEC. N.° ID.:7 y la bergamoteno oxidasa establecida en la SEC. N.° ID.:6 con el citocromo P450BM-3 establecido en la SEC. N.° ID.:66. Un «*» significa que los restos alineados son idénticos, un «:» significa que los restos alineados no son idénticos, pero son similares y contienen restos aminoacídicos conservados en la posición alineada, y un «.» significa que los restos alineados son similares y contienen restos aminoacídicos semiconservados en la posición alineada.

FIGURAS 6A-6D. En las Figuras 6A-6D se muestra el cromatograma de GC-MS de productos extraídos de ensayos in vivo con SaCYP76F38v1 (SaCYP76-G5) (Figura 6A), SaCYP76F37v1 (SaCYP76-G11) (Figura 6B), SaCYP76F38v2 (SaCYP76-G12) (Figura 6C) y un vector vacío (Figura 6D) según se describe en el Ejemplo 10. Los picos se identifican en la Tabla 13.

FIGURA 7. En la Figura 7 se muestra el cromatograma de corriente iónica total del extracto de aceite de S. album. Los picos se identifican en la Tabla 13.

FIGURAS 8A-8C. En las Figuras 8A-8C se muestra el cromatograma de GC-MS del aceite nativo de S. album (Figura 8A) y de productos extraídos de los ensayos in vivo con SaCYP76F39v1 (SaCYP76-G10) (Figura 8B) y el vector vacío (Figura 8C) según se describe en el Ejemplo 10. Los picos se identifican en la Tabla 11. FIGURAS 9A-9B. En las Figuras 9A-9B se muestra el cromatograma de GC-MS del aceite nativo de S. album (Figura 9A) y de productos extraídos de los ensayos in vitro con SaCYP76F39v1 (SaCYP76-G10) (Figura 9B) según se describe en el Ejemplo 11. Los picos se identifican en la Tabla 11.

FIGURA 10. En la Figura 10 se muestra la filogenia obtenida por el método de «neighbour-joining» de las secuencias aminoacídicas de los CYP76F de S. album y un citocromo P450 modificador de terpenos relacionados, según se describe en el Ejemplo 4. Los CYP76F destacados indican los que son de clado I (marcado con I) y de clado II (marcado con II).

FIGURAS 11A-11B. En las Figuras 11A-11B se muestra el análisis por GC-MS (cromatogramas de iones seleccionados) de productos formados in vivo en células de levadura que expresaban SaSSY, SaCPR2 y SaCYP76F39v1 (SaCYP76-G10) (Figura 11A) y un vector vacío (Figura 11B). Los picos se identifican en la Tabla 12. Los picos marcados con el símbolo (*) corresponden al farnesol, que también se produce en las células de levadura sin SaCYP76F. Los picos en la Figura 11A marcados con el símbolo (#) representan modificaciones in vivo en levaduras de santaloles (véanse las Figuras 12A y 12B).

FIGURAS 12A-12B. En las Figuras 12A-12B se muestra el análisis por GC-MS (cromatogramas de iones seleccionados) de sesquiterpenoles en una muestra de aceite de sándalo natural antes (Figura 12A) y después (Figura 12B) de la incubación toda la noche con células de levadura, que no contenían un gen del SaCYP76F. Los picos en la Figura 12B marcados con el símbolo (#) representan modificaciones in vivo en levaduras de santaloles independientemente de SaCYP76F. Los picos se identifican en la Tabla 12.

FIGURAS 13A-13D. En las Figuras 13A-13D se muestra el análisis por GC-MS (cromatogramas de iones seleccionados) de los compuestos formados in vivo en células de levadura que expresaban SaSSy, SaCPR2 y SaCYP76F39v2 (SaCYP76-G15) (Figura 13A), SaCYP76F40 (SaCYP76-G16) (Figura 13B), SaCYP76F41 (SaCYP76-G17) (Figura 13C) o SaCYP76F42 (SaCYP76-G13) (Figura 13D). Los picos se identifican en la Tabla 12. Los picos marcados con el símbolo (*) corresponden al farnesol que se produce en células de levadura sin SaCYP76F. Los picos marcados con el símbolo (#) representan modificaciones in vivo en levaduras de santaloles independientemente de SaCYP76F.

FIGURAS 14A-14E. En las Figuras 14A-14D se muestra el análisis por GC-MS (cromatogramas de iones seleccionados) de los compuestos formados in vivo en células de levadura que expresaban SaSSy, SaCPR2 y SaCYP76F38v1 (SaCYP76-G5) (Figura 14A), SaCYP76F38v2 (SaCYP76-G12) (Figura 14B), SaCYP76F37v1 (SaCYP76-G11) (Figura 14C), SaCYP76F37v2 (SaCYP76-G14) (Figura 14D) o SaCYP76F43 (SaCYP76-G18) (Figura 14E). Los picos se identifican en la Tabla 12. Los picos marcados con el símbolo (*) corresponden al farnesol que se produce en células de levadura sin SaCYP76F. Los picos marcados con el símbolo (#) representan modificaciones in vivo en levaduras de santaloles independientemente de SaCYP76F.

FIGURAS 15A-15C. En la Figura 15A se muestra el análisis por GC-MS (cromatogramas de iones seleccionados) de los productos formados in vitro con SaCYP76F39v1 (SaCYP76-G10) y una mezcla de los sesquiterpenos a-, p- y epi-p-santaleno y a-trans-bergamoteno (Figura 15A). En la Figura 15B se muestra el análisis por GC-MS (cromatogramas de iones seleccionados) de aceite de S. album auténtico. En la Figura 15C se muestra el análisis por GC-MS (cromatogramas de iones seleccionados) de los ensayos de control realizados con microsomas aislados de células de levadura transformadas con un vector vacío. Los picos se identifican en la Tabla 12.

FIGURAS 16A-16E. En las Figuras 16A-16E se muestra el análisis por GC-MS (cromatogramas de iones seleccionados) de los productos formados in vitro con una mezcla de sesquiterpenos de a-, p- y epi-psantaleno y a-trans-bergamotenos como sustrato y SaCYP76F39v2 (SaCYp76-G15) (Figura 16A); SaCYP76F40 (SaCYP76-G16) (Figura 16B); SaCYP76F41 (SaCYP76-G17) (Figura 16C); SaCYP76F42 (SaCYP76-G13) (Figura 16D) codificadas por ADNc de SaCYP76F de clado I; o un vector vacío como control (Figura 16E). Los picos se identifican en la Tabla 12.

FIGURAS 17A-17E. En las Figuras 17A-17E se muestra el análisis por GC-MS (cromatogramas de iones seleccionados) de los productos formados in vitro con una mezcla de sesquiterpenos de a-, p- y epi-p-santaleno y a-trans-bergamotenos como sustrato y SaCYP76F38v1 (SaCYP76-G5) (Figura 17A); SaCYP76F38v2 (SaCYP76-G12) (Figura 17B); SaCYP76F37v1 (SaCYP76-G11) (Figura 17C); SaCYP76F37v2 (SaCYP76-G14) (Figura 17D) codificadas por ADNc de SaCYP76F de ciado II; o un vector vacío como control (Figura 17E). Los picos se identifican en la Tabla 12.

FIGURA 18. En la Figura 18 se muestran los espectros de absorción diferencial de CO reducido de los microsomas aislados que contenían proteínas de CYP76F de S. album. Se muestran los espectros de absorción diferencial de CO de fracciones de microsomas de S. cerevisiae que contenían un citocromo P450 o un vector vacío. La concentración de proteínas de SaCYP76F se obtiene a partir de un coeficiente de extinción de 91 000 M'1cirr1.

FIGURAS 19A-19D. En las Figuras 19A-19D se muestra el análisis por GC-MS (cromatogramas de iones seleccionados) de una mezcla de sesquiterpenos producida con una cepa de levadura recombinante que expresaba SaSSy (Figura 19A) y fracciones separadas por TLC (Figuras 19B-19D). Las fracciones y mezcla de sesquiterpenos se prepararon según se describe en el Ejemplo 9. Los picos corresponden a: a-santaleno, pico 1; a-exo-bergamoteno, pico 2; epi-p-santaleno, pico 3; y p-santaleno, pico 4.

FIGURAS 20A-20G. En las Figuras 20A-20G se muestra el análisis por GC-MS (cromatogramas de iones seleccionados) de productos formados in vitro con SaCYP76F39v1 (SaCYP76-G10) o SaCYP76F37v1 (SaCYP76-G11) con sustratos parcialmente purificados. En las Figuras 20A-20C se muestran los perfiles de productos en ensayos con SaCYP76F39v1 (SaCYP76-G10) usando a-santaleno (Figura 20A), a-exobergamoteno (Figura 20B) o epi-p-santaleno y p-santaleno (Figura 20C) como sustratos. En las Figuras 20D-20F se muestran los perfiles de productos en ensayos con SaCYP76F37v1 (SaCYP76-G11) usando asantaleno (Figura 20D), a-exo-bergamoteno (Figura 20E) o epi-p-santaleno y p-santaleno (Figura 20F) como sustratos. En la Figura 20G se muestra el cromatograma de iones seleccionados del aceite de Santalum album auténtico. Los picos se identifican en la Tabla 12.

FIGURAS 21A-21C. En las Figuras 21A-21C se muestra el alineamiento de citocromos P450 de S. album establecidos en las SEC. N.° ID.:6-9 y 73-78. Las flechas horizontales indican la región de prolina (a), el motivo estructural de unión al oxígeno (b) y el motivo estructural de unión al hemo (c). Los cuadros indican los sitios de reconocimiento del sustrato (SRS) originalmente descritos por Gotoh (1992) J Biol Chem 267:83-90. Un «*» significa que los restos alineados son idénticos, un «:» significa que los restos alineados no son idénticos, pero son similares y contienen restos aminoacídicos conservados en la posición alineada, y un «.» significa que los restos alineados son similares y contienen restos aminoacídicos semiconservados en la posición alineada.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

Índice

A. Definiciones

B. Perspectiva general

1. Biosíntesis de terpenoides

a. Santaloles

b. Bergamotoles

2. Enzimas de citocromo P450

a. Estructura

b. Actividad

3. Citocromo P450 reductasas

a. Estructura

b. Actividad

C. Polipéptidos de citocromo P450 y moléculas de ácido nucleico que los codifican

1. Polipéptidos de citocromo P450 santaleno oxidasa Polipéptidos modificados de citocromo P450 santaleno oxidasa

2. Polipéptidos de citocromo P450 bergamoteno oxidasa Polipéptidos modificados de citocromo P450 bergamoteno oxidasa

3. Modificaciones adicionales

a. Polipéptidos truncados

b. Polipéptidos con actividades o propiedades alteradas

c. Intercambios de dominios

d. Proteínas de fusión

D. Polipéptidos de citocromo P450 reductasa y moléculas de ácido nucleico que los codifican

1. Polipéptidos de citocromo P450 reductasa

2. Polipéptidos modificados de citocromo P450 reductasa

3. Modificaciones adicionales

a. Polipéptidos truncados

b. Polipéptidos con actividades o propiedades alteradas

c. Intercambios de dominios

d. Proteínas de fusión

E. Métodos para producir polipéptidos modificados de citocromo P450 y citocromo P450 reductasa y moléculas de ácido nucleico que los codifican

F. Expresión de polipéptidos de citocromo P450 y citocromo P450 reductasa y moléculas de ácido nucleico que los codifican

1. Aislamiento de ácido nucleico que codifica polipéptidos de citocromo P450 y citocromo P450 reductasa de Santalum album

2. Generación de ácidos nucleicos modificados

3. Vectores y células

4. Sistemas de expresión

a. Células procariotas

b. Células de levadura

c. Plantas y células vegetales

d. Insectos y células de insectos

e. Células de mamífero

f. Ejemplos de células hospedadoras

5. Purificación

6. Proteínas de fusión

G. Métodos para producir terpenoides y métodos para detectar dichos productos y la actividad de los polipéptidos de citocromo P450 y citocromo P450 reductasa

1. Síntesis de santaloles y bergamotoles

a. Oxidación de santalenos y bergamotenos

b. Transformación de pirofosfatos acíclicos precursores de terpenos

2. Métodos para la producción

a. Ejemplos de células

b. Cultivo de células

c. Aislamiento y ensayos de detección e identificación

3. Producción de aceite de sándalo

4. Ensayos para detectar la actividad enzimática de polipéptidos de citocromo P450 y citocromo P450 reductasa

a. Métodos para determinar la actividad de polipéptidos de citocromo P450

b. Métodos para determinar la actividad de polipéptidos de citocromo P450 reductasa H. Ejemplos

A. DEFINICIONES

A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente memoria tienen el mismo significado que un experto en la materia a la que pertenecen las invenciones entiende comúnmente.

En el caso de que exista una pluralidad de definiciones para los términos utilizados en la presente memoria, las definiciones que se aporten en esta sección prevalecerán. Cuando se hace referencia a una URL u otro identificador o dirección, se entiende que dichos identificadores pueden cambiar y que la información concreta en Internet puede aparecer y desaparecer, pero que se puede encontrar información equivalente buscando en Internet. La referencia a la misma es una prueba de la disponibilidad y la difusión al público de dicha información.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, un pirofosfato acíclico precursor de terpenos es cualquier pirofosfato acíclico que es un precursor en la producción de al menos un terpeno, incluidos, entre otros, el farnesil pirofosfato (FPP), el geranil pirofosfato (GPP) y el geranilgeranil pirofosfato (GGPP). Los pirofosfatos acíclicos precursores de terpenos son, por lo tanto, sustratos para las terpeno sintasas.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, un terpeno es un hidrocarburo insaturado formado por unidades de isopreno (C5H8), y que tiene la fórmula general C5xH8x, como C10H16. La referencia a un terpeno incluye terpenos acíclicos, monocíclicos y policíclicos. Los terpenos incluyen, entre otros, los monoterpenos, que contienen 10 átomos de carbono; los sesquiterpenos, que contienen 15 átomos de carbono; los diterpenos, que contienen 20 átomos de carbono, y los triterpenos, que contienen 30 átomos de carbono. La referencia a un terpeno también incluye estereoisómeros del terpeno.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, un terpenoide es un terpeno con modificaciones químicas. En un ejemplo, un terpenoide es un terpeno cuya estructura química se ha modificado mediante la adición de un grupo hidroxilo, como en el caso de un santalol o un bergamotol. La referencia a un terpenoide incluye terpenoides policíclicos, monocíclicos y acíclicos, incluidos monoterpenoides, sesquiterpenoides y diterpenoides. La referencia a un terpenoide también incluye los estereoisómeros del terpenoide.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, una terpeno sintasa es un polipéptido con la capacidad de catalizar la formación de uno o más terpenos a partir de un pirofosfato precursor de terpenos. En algunos ejemplos, una terpeno sintasa cataliza la formación de uno o más terpenos a partir de un pirofosfato acíclico precursor de terpenos, por ejemplo, FPP, GPP o GGPP, incluidos, entre otras, la santaleno sintasa. En otros ejemplos, una terpeno sintasa cataliza la formación de uno o más terpenos a partir de un pirofosfato acíclico precursor de terpenos, incluidas, entre otros, la santaleno sintasa.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, «citocromo P450», «citocromo P450 oxidasa», «polipéptido de citocromo P450», «polipéptido de citocromo P450 oxidasa» o «CYP» es un polipéptido con la capacidad de catalizar la monooxigenación de cualquier terpeno precursor, incluidos monoterpenos, sesquiterpenos y diterpenos. Un citocromo P450 puede catalizar la monooxigenación de un terpeno o una mezcla de terpenos, lo que da lugar a la producción de uno o más terpenoides.

A efectos de la presente memoria, las citocromo P450 oxidasas proporcionadas en la presente memoria son enzimas con actividad de citocromo P450 oxidasa y tienen una identidad de secuencia igual, superior o aproximadamente superior al 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, cuando se alinea con la secuencia de la citocromo P450 oxidasa establecida en la SEC. N.° ID.:50. La referencia a una citocromo P450 oxidasa incluye cualquier polipéptido de citocromo P450 oxidasa, incluidos, entre otros, un polipéptido producido por recombinación, un polipéptido producido mediante síntesis y un polipéptido de citocromo P450 oxidasa extraído o aislado de células o materia vegetal, incluidos, entre otros, duramen de un árbol de sándalo. Entre los ejemplos de polipéptidos de citocromo P450 oxidasa se incluyen los que se han aislado de Santalum album. La referencia a una citocromo P450 oxidasa incluye la citocromo P450 oxidasa de cualquier género o especie, e incluye variantes alélicas o de especies, variantes codificadas por variantes de empalme y otras variantes de las mismas, incluidos polipéptidos que tienen una identidad de secuencia de al menos o aproximadamente al menos un 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o más, con la citocromo P450 oxidasa establecida en la SEC. N.° ID.:50 cuando se alinean con esta. La citocromo P450 oxidasa también incluye fragmentos con actividad catalítica de la misma que conservan actividad de citocromo P450 oxidasa.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, «citocromo P450 santaleno oxidasa» o «polipéptido de citocromo P450 santaleno oxidasa» es un polipéptido con la capacidad de catalizar la formación de un santalol a partir de un santaleno, por ejemplo, con la capacidad de catalizar la monooxigenación o hidroxilación de un santaleno. Un polipéptido de citocromo P450 santaleno oxidasa puede producir un santalol o una mezcla de santaloles a partir de un santaleno o una mezcla de santalenos. Un polipéptido de citocromo P450 santaleno oxidasa también tiene la capacidad de catalizar la formación de un bergamotol a partir de un bergamoteno. Por ejemplo, una citocromo P450 santaleno oxidasa cataliza la formación de a-santalol a partir de a-santaleno, p-santalol a partir de p-santateno, ep/-p-santalol a partir de ep/-p-santaleno y/o Z-a-trans-bergamotol o E-a-trans-bergamotol a partir de a-trans-bergamoteno.

A efectos de la presente memoria, las citocromo P450 santaleno oxidasas proporcionadas en la presente memoria son enzimas con actividad de citocromo P450 santaleno oxidasa y tienen una identidad de secuencia igual, superior o aproximadamente superior al 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, cuando se alinea con la secuencia de la citocromo P450 santaleno oxidasa establecida en las SEC. N.° ID.:7, 74, 75, 76 o 77. La referencia a una citocromo P450 santaleno oxidasa incluye cualquier polipéptido de citocromo P450 santaleno oxidasa, incluidos, entre otros, un polipéptido producido por recombinación, un polipéptido producido mediante síntesis y un polipéptido de citocromo p450 santaleno oxidasa extraído o aislado de células o materia vegetal, incluidos, entre otros, duramen de un árbol de sándalo. Entre los ejemplos de polipéptidos de citocromo P450 santaleno oxidasa se incluyen los que se han aislado de Santalum album. La referencia a una citocromo P450 santaleno oxidasa incluye la citocromo P450 santaleno oxidasa de cualquier género o especie, e incluye variantes alélicas o de especies, variantes codificadas por variantes de empalme y otras variantes de las mismas, incluidos polipéptidos que tienen una identidad de secuencia de al menos o aproximadamente al menos un 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o más, con la citocromo P450 santaleno oxidasa establecida en las SEC. N.° ID.:7, 74, 75, 76 o 77 cuando se alinean con esta. La citocromo P450 santaleno oxidasa también incluye fragmentos con actividad catalítica de la misma que conservan actividad de citocromo P450 santaleno oxidasa.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, «actividad de citocromo P450 santaleno oxidasa» o «actividad de santaleno oxidasa» hace referencia a la capacidad de catalizar la formación de uno o más santaloles a partir de uno o más santalenos. Es decir, las citocromo P450 santaleno oxidasas catalizan la monooxigenación o hidroxilación de santalenos. Las citocromo P450 santaleno oxidasas también catalizan la hidroxilación del bergamoteno. Por ejemplo, las citocromo P450 santaleno oxidasas catalizan la formación de a-santalol a partir de a-santaleno, p-santalol a partir de p-santateno, ep/-p-santalol a partir de ep/-p-santaleno y/o Z-a-trans-bergamotol a partir de a-trans-bergamoteno. Los métodos para evaluar la formación de santalol o bergamotol a partir de una reacción de un santaleno o bergamoteno son bien conocidos en la técnica y se describen en la presente memoria. La producción de un santalol o bergamotol se puede evaluar mediante métodos como, por ejemplo, cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS) (véanse los ejemplos más abajo). Un citocromo P450 presenta actividad de citocromo P450 santaleno oxidasa o la capacidad de catalizar la formación de santaloles o bergamotol a partir de santalenos y bergamoteno si la cantidad producida de santaloles y bergamotol en la reacción es de al menos o aproximadamente al menos un 0,5%, 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, o más, de la cantidad total de terpenoides producidos en la reacción.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, «citocromo P450 bergamoteno oxidasa» o «polipéptido de citocromo P450 bergamoteno oxidasa» es un polipéptido con la capacidad de catalizar la monooxigenación o hidroxilación de un bergamoteno. Por ejemplo, una citocromo P450 bergamoteno oxidasa cataliza la formación de Z-a-frans-bergamotol o E-a-frans-bergamotol a partir de a-frans-bergamoteno.

A efectos de la presente memoria, las citocromo P450 bergamoteno oxidasas proporcionadas en la presente memoria son enzimas con actividad de citocromo P450 bergamoteno oxidasa y poseen una identidad de secuencia igual, superior o aproximadamente superior al 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% , cuando se alinean con la secuencia de la citocromo P450 bergamoteno oxidasa establecida en las SEC. N.° ID.:6, 8, 9 o 73. La referencia a una citocromo P450 bergamoteno oxidasa incluye cualquier polipéptido de citocromo P450 bergamoteno oxidasa, incluidos, entre otros, un polipéptido producido por recombinación, un polipéptido producido mediante síntesis y un polipéptido de citocromo P450 bergamoteno oxidasa extraído o aislado de células o materia vegetal, incluidos, entre otros, duramen de un árbol de sándalo. Entre los ejemplos de polipéptidos de citocromo P450 bergamoteno oxidasa se incluyen los que se han aislado de Sanfalum album. La referencia a una citocromo P450 bergamoteno oxidasa incluye la citocromo P450 bergamoteno oxidasa de cualquier género o especie, e incluye variantes alélicas o de especies, variantes codificadas por variantes de empalme y otras variantes de la misma, incluidos polipéptidos que tienen una identidad de secuencia de al menos o aproximadamente al menos un 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o más, con la citocromo P450 bergamoteno oxidasa establecida en las SEC. N.° ID.:6, 8, 9 o 73 cuando se alinea con esta. La citocromo P450 bergamoteno oxidasa también incluye fragmentos con actividad catalítica de la misma que conservan actividad de citocromo P450 bergamoteno oxidasa.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, «actividad de citocromo P450 bergamoteno oxidasa» o «actividad de bergamoteno oxidasa» hace referencia a la capacidad de catalizar la formación de bergamotoles a partir de bergamotenos. Es decir, las citocromo P450 bergamoteno oxidasas catalizan la monooxigenación o hidroxilación del bergamoteno. Por ejemplo, las citocromo P450 bergamoteno oxidasas catalizan la formación de Z-a-frans-bergamotol a partir de a-frans-bergamoteno. Los métodos para evaluar la formación de bergamotol a partir de una reacción de un bergamoteno son bien conocidos en la técnica y se describen en la presente memoria. La producción de un bergamotol se puede evaluar mediante métodos como, por ejemplo, cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS) (véanse los ejemplos más abajo). Un citocromo P450 presenta actividad de citocromo P450 bergamoteno oxidasa o la capacidad de catalizar la formación de bergamotol a partir de bergamoteno si la cantidad producida de bergamotol en la reacción es de al menos o aproximadamente al menos un 0,5%, 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, o más, de la cantidad total producida de terpenoides en la reacción.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, el a-santalol es un sesquiterpenoide que tiene la siguiente estructura, o isómeros o estereoisómeros del mismo:

Tal y como se utiliza en la presente memoria, el p-santalol es un sesquiterpenoide que tiene la siguiente estructura, o isómeros o estereoisómeros del mismo:

Tal y como se utiliza en la presente memoria, el ep/'-p-santalol es un sesquiterpenoide que tiene la siguiente estructura, o isómeros o estereoisómeros del mismo:

Tal y como se utiliza en la presente memoria, el Z-a-frans-bergamotol o Z-a-exo-bergamotol es un sesquiterpenoide que tiene la siguiente estructura, o isómeros o estereoisómeros del mismo:

Tal y como se utiliza en la presente memoria, el E-a-frans-bergamotol o E-a-exo-bergamotol es un sesquiterpenoide que tiene la siguiente estructura, o isómeros o estereoisómeros del mismo:

Tal y como se utiliza en la presente memoria, el a-santaleno es un sesquiterpeno que tiene la siguiente estructura, o isómeros o estereoisómeros del mismo:

Tal y como se utiliza en la presente memoria, el p-santaleno es un sesquiterpeno que tiene la siguiente estructura, o isómeros o estereoisómeros del mismo:

Tal y como se utiliza en la presente memoria, el ep/-p-santaleno es un sesquiterpeno que tiene la siguiente estructura, o isómeros o estereoisómeros del mismo:

Tal y como se utiliza en la presente memoria, el a-frans-bergamoteno o a-exo-bergamoteno es un sesquiterpeno que tiene la siguiente estructura, o isómeros o estereoisómeros del mismo:

Tal y como se utiliza en la presente memoria, «citocromo P450 reductasa» o «CPR» es un polipéptido con la capacidad de catalizar la transferencia de dos electrones del NADPH a un aceptor de electrones, como un citocromo P450. A efectos de la presente memoria, las citocromo P450 reductasas proporcionadas en la presente memoria son enzimas con actividad de citocromo P450 reductasa y tienen una identidad de secuencia igual, superior o aproximadamente superior al 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, cuando se alinean con la secuencia de la citocromo P450 reductasa establecida en las SEC. N.° ID.:12 o 13. La referencia a una citocromo P450 reductasa incluye cualquier polipéptido de citocromo P450 reductasa, incluidos, entre otros, un polipéptido producido por recombinación, un polipéptido producido mediante síntesis y un polipéptido de citocromo P450 reductasa extraído o aislado de células o materia vegetal, incluidos, entre otros, duramen de un árbol de sándalo. Entre los ejemplos de polipéptidos de citocromo P450 reductasa se incluyen los que se han aislado de Santalum album. La referencia a una citocromo P450 reductasa incluye la citocromo P450 reductasa de cualquier género o especie, e incluye variantes alélicas o de especies, variantes codificadas por variantes de empalme y otras variantes de la misma, incluidos polipéptidos que tienen una identidad de secuencia de al menos o aproximadamente al menos un 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o más, con la citocromo P450 reductasa establecida en las SEC. N.° ID.:12 o 13 cuando se alinea con esta. La citocromo P450 reductasa también incluye fragmentos con actividad catalítica de la misma que conservan actividad de citocromo P450 reductasa.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, «actividad de citocromo P450 reductasa» hace referencia a la capacidad de catalizar la transferencia de dos electrones del NADPH a un aceptor de electrones, como un citocromo P450. Los métodos para evaluar la actividad de citocromo P450 reductasa son bien conocidos en la técnica y se describen en la presente memoria. Por ejemplo, la actividad de citocromo P450 reductasa se puede determinar mediante reducción de un aceptor artificial de electrones, como el citocromo c.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, «sin mutaciones» o «nativo/a» con referencia a un citocromo P450 o una citocromo P450 reductasa hace referencia a un polipéptido de citocromo P450 o un polipéptido de citocromo P450 reductasa codificados por un gen del citocromo P450 o un gen de la citocromo P450 reductasa nativos o de origen natural, incluidas las variantes alélicas, que están presentes en un organismo, incluida una planta, en la naturaleza. La referencia a un citocromo P450 o citocromo P450 reductasa sin mutaciones sin referencia a una especie tiene por objeto abarcar cualquier especie de un citocromo P450 o una citocromo P450 reductasa sin mutaciones.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, «variantes de especies» hace referencia a variantes en polipéptidos entre diferentes especies, incluidas diferentes especies de sándalo, como Santalum album, Santalum australocaledonicum, Santalum spicatum y Santalum murrayanum. Por lo general, las variantes de especies comparten una identidad de secuencia de al menos o aproximadamente al menos un 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o más. Los restos correspondientes entre las variantes de especies se pueden determinar mediante comparación, por lo general, uno por uno con la misma secuencia de referencia, y alineamiento de cada secuencia con la secuencia de referencia para maximizar el número de nucleótidos o restos aminoacídicos que coinciden. A la posición de interés a continuación se le da el número asignado en la molécula de referencia de ácido nucleico o polipéptido. El alineamiento se puede efectuar manual o visualmente, en particular, cuando la identidad de secuencia es superior al 80%. Para determinar la identidad de secuencia entre una pluralidad de variantes, los alineamientos se efectúan uno por uno frente al mismo polipéptido de referencia.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, una variante alélica o variación alélica hace referencia a cualquiera de dos o más formas alternativas de un gen que ocupa el mismo locus del cromosoma. La variación alélica se produce de manera natural por medio de mutaciones, y puede dar lugar a polimorfismo fenotípico en las poblaciones. Las mutaciones genéticas pueden ser sinónimas (sin cambios en el polipéptido codificado) o pueden codificar polipéptidos que tienen una secuencia aminoacídica alterada. El término «variante alélica» en la presente memoria también se usa para indicar una proteína codificada por una variante alélica de un gen. Normalmente, la forma de referencia del gen codifica una forma sin mutaciones y/o una forma predominante de un polipéptido de una población o un único miembro de referencia de una especie. Normalmente, las variantes alélicas, que incluyen variantes entre especies normalmente, tienen una identidad de aminoácidos de al menos un 80%, 90%, o más, con una forma sin mutaciones y/o predominante de la misma especie; el grado de identidad depende del gen y de si la comparación se hace entre especies o dentro de una misma especie. Por lo general, las variantes alélicas dentro de la misma especie tienen una identidad de aproximadamente al menos un 80%, 85%, 90% o 95% o superior con una forma predominante y/o sin mutaciones, incluida una identidad del 96%, 97%, 98%, 99% o superior con una forma predominante y/o sin mutaciones de un polipéptido. En la presente memoria, por lo general, la referencia a una variante alélica hace referencia a variaciones en proteínas entre miembros de la misma especie.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, una variante de empalme hace referencia a una variante producida por el procesamiento diferencial de un transcrito primario de ADN genómico que da lugar a más de un tipo de ARNm.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, un «citocromo P450 modificado» o «polipéptido modificado de citocromo P450» o «CYP modificado» hace referencia a un polipéptido de citocromo P450 que tiene una o más diferencias de aminoácidos con respecto a un polipéptido de citocromo P450 sin mutaciones o que no está modificado. Las diferencias de uno o más aminoácidos pueden ser mutaciones de aminoácidos, como uno o más reemplazos (sustituciones), inserciones o deleciones de aminoácidos, o pueden ser inserciones o deleciones o reemplazos de dominios enteros, o porciones de los mismos, y cualquier combinación de los mismos. La modificación se puede efectuar mediante cualquier protocolo para mutaciones, incluidos los métodos de barajado de genes. Normalmente, un polipéptido modificado de citocromo P450 tiene una o más modificaciones en la secuencia primaria en comparación con un polipéptido de citocromo P450 que no está modificado. Por ejemplo, un polipéptido modificado de citocromo P450 proporcionado en la presente memoria puede tener al menos 1, 5, 10, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25,

26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, o más, diferencias de aminoácidos en comparación con un polipéptido de citocromo P450 que no está modificado. Normalmente, el polipéptido modificado de citocromo P450 tendrá 1, 2, 3, 4,

5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 reemplazos de aminoácidos, pero puede incluir más, en particular cuando se intercambian dominios o porciones de los mismos. Se contempla cualquier modificación, siempre que el polipéptido resultante tenga como mínimo una actividad de citocromo P450 asociada al citocromo P450 sin mutaciones, como, por ejemplo, actividad catalítica, actividad de monooxigenasa, y/o la capacidad de catalizar la formación de un terpenoide a partir de un terpeno. Por lo general, el polipéptido de citocromo P450 resultante tendrá una identidad de secuencia de al menos un 50% con el polipéptido de citocromo P450 sin mutaciones proporcionado en la presente memoria.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, una «citocromo P450 santaleno oxidasa modificada» o «polipéptido modificado de citocromo P450 santaleno oxidasa» hace referencia a un polipéptido de citocromo P450 santaleno oxidasa que tiene una o más diferencias de aminoácidos con respecto a un polipéptido de citocromo P450 santaleno oxidasa sin mutaciones o que no está modificado. Las diferencias de uno o más aminoácidos pueden ser mutaciones de aminoácidos, como uno o más reemplazos (sustituciones), inserciones o deleciones de aminoácidos, o pueden ser inserciones o deleciones o reemplazos de dominios enteros, o porciones de los mismos, y cualquier combinación de los mismos. La modificación se puede efectuar mediante cualquier protocolo para mutaciones, incluidos los métodos de barajado de genes. Normalmente, un polipéptido modificado de citocromo P450 santaleno oxidasa tiene una o más modificaciones en la secuencia primaria en comparación con un polipéptido de citocromo P450 santaleno oxidasa que no está modificado. Por ejemplo, un polipéptido modificado de citocromo P450 santaleno oxidasa proporcionado en la presente memoria puede tener al menos 1, 5, 10, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32,

33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63,

64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, o más, diferencias de aminoácidos en comparación con un polipéptido de citocromo P450 santaleno oxidasa que no está modificado. Normalmente, el polipéptido modificado de citocromo P450 santaleno oxidasa tendrá

1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 reemplazos de aminoácidos, pero puede incluir más, en particular cuando se intercambian dominios o porciones de los mismos. Se contempla cualquier modificación, siempre que el polipéptido resultante tenga como mínimo una actividad de citocromo P450 santaleno oxidasa asociada a la citocromo P450 santaleno oxidasa sin mutaciones, como, por ejemplo, actividad catalítica, la capacidad de catalizar la formación de santaloles o bergamotoles a partir de santalenos o bergamotenos. Por lo general, el polipéptido resultante de citocromo P450 santaleno oxidasa tendrá una identidad de secuencia de al menos un 50% con el polipéptido de citocromo P450 santaleno oxidasa sin mutaciones proporcionado en la presente memoria.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, una «citocromo P450 bergamoteno oxidasa modificada» o «polipéptido modificado de citocromo P450 bergamoteno oxidasa» hace referencia a un polipéptido de citocromo P450 bergamoteno oxidasa que tiene una o más diferencias de aminoácidos en comparación con un polipéptido de citocromo P450 bergamoteno oxidasa sin mutaciones o que no está modificado. Las diferencias de uno o más aminoácidos pueden ser mutaciones de aminoácidos, como uno o más reemplazos (sustituciones), inserciones o deleciones de aminoácidos, o pueden ser inserciones o deleciones o reemplazos de dominios enteros, o porciones de los mismos, y cualquier combinación de los mismos. La modificación se puede efectuar mediante cualquier protocolo para mutaciones, incluidos los métodos de barajado de genes. Normalmente, un polipéptido modificado de citocromo P450 bergamoteno oxidasa tiene una o más modificaciones en la secuencia primaria en comparación con un polipéptido de citocromo P450 bergamoteno oxidasa que no está modificado. Por ejemplo, un polipéptido modificado de citocromo P450 bergamoteno oxidasa proporcionado en la presente memoria puede tener al menos 1, 5, 10, 15,

16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55,

56, 57, 58, 59, 60, 61,62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, o más, diferencias de aminoácidos en comparación con un polipéptido de citocromo P450 que no está modificado. Normalmente, el polipéptido modificado de citocromo P450 bergamoteno oxidasa tendrá 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 reemplazos de aminoácidos, pero puede incluir más, en particular cuando se intercambian dominios o porciones de los mismos. Se contempla cualquier modificación, siempre que el polipéptido resultante tenga como mínimo una actividad de citocromo P450 bergamoteno oxidasa asociada al polipéptido de citocromo P450 bergamoteno oxidasa sin mutaciones, como, por ejemplo, actividad catalítica, la capacidad de catalizar la formación de bergamotoles a partir de bergamotenos. Por lo general, el polipéptido resultante de citocromo P450 bergamoteno oxidasa tendrá una identidad de secuencia de al menos un 50% con el polipéptido de citocromo P450 bergamoteno oxidasa sin mutaciones proporcionado en la presente memoria.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, una «citocromo P450 reductasa modificada» o «CPR modificada» hace referencia a un polipéptido de citocromo P450 que tiene una o más diferencias de aminoácidos en comparación con un polipéptido de citocromo P450 reductasa sin mutaciones o que no está modificado. Las diferencias de uno o más aminoácidos pueden ser mutaciones de aminoácidos, como uno o más reemplazos (sustituciones), inserciones o deleciones de aminoácidos, o pueden ser inserciones o deleciones o reemplazos de dominios enteros, o porciones de los mismos, y cualquier combinación de los mismos. La modificación se puede efectuar mediante cualquier protocolo para mutaciones, incluidos los métodos de barajado de genes. Normalmente, un polipéptido modificado de citocromo P450 reductasa tiene una o más modificaciones en la secuencia primaria en comparación con un polipéptido de citocromo P450 bergamoteno oxidasa que no está modificado. Por ejemplo, un polipéptido modificado de citocromo P450 reductasa proporcionado en la presente memoria puede tener al menos 1, 5, 10, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, o más, diferencias de aminoácidos en comparación con un polipéptido de citocromo P450 reductasa que no está modificado. Normalmente, el polipéptido modificado de citocromo P450 reductasa tendrá 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 reemplazos de aminoácidos, pero puede incluir más, en particular cuando se intercambian dominios o porciones de los mismos. Se contempla cualquier modificación, siempre que el polipéptido resultante tenga como mínimo una actividad de citocromo P450 reductasa asociada a la citocromo P450 reductasa sin mutaciones, como, por ejemplo, actividad catalítica, la capacidad de transferir dos electrones a un aceptor de electrones, como un citocromo P450. Por lo general, el polipéptido de citocromo P450 reductasa resultante tendrá una identidad de secuencia de al menos un 50% con el polipéptido de citocromo P450 reductasa sin mutaciones proporcionado en la presente memoria.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, restos correspondientes hace referencia a restos que están presentes en los loci alineados. Los polipéptidos relacionados o variantes se alinean mediante cualquier método conocido por los expertos en la materia. Dichos métodos suelen maximizar las coincidencias, e incluyen métodos como los alineamientos manuales y los producidos por numerosos programas de alineamiento disponibles (por ejemplo, BLASTP) y otros conocidos por los expertos en la materia. Al alinear las secuencias de polipéptidos, un experto en la materia puede identificar los restos correspondientes, utilizando como guía restos aminoacídicos conservados e idénticos. Las posiciones correspondientes también se pueden basar en alineamientos de la estructura, por ejemplo, utilizando alineamientos simulados por ordenador de la estructura de la proteína. Por ejemplo, los restos correspondientes entre una citocromo P450 santaleno oxidasa sintasa y una citocromo P450 bergamoteno oxidasa sintasa se muestran en las Figuras 2A-2B y 21A-21C y los restos correspondientes entre las citocromo P450 reductasas de Arabidopsis thaliana y las citocromo P450 reductasas de Santalum album se muestran en la Figura 3A-3C.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, dominio o región (normalmente una secuencia de tres o más, generalmente 5 o 7 o más aminoácidos) hace referencia a una porción de una molécula, como una proteína o los ácidos nucleicos codificantes, que tiene una estructura y/o función diferenciada con respecto a otras porciones de la molécula y es identificable. Una proteína puede tener uno o más dominios diferenciados. Por ejemplo, un dominio se puede identificar, definir o distinguir por la homología de su secuencia con miembros análogos de la familia, como otras terpeno sintasas. Un dominio puede ser una secuencia aminoacídica lineal o una secuencia aminoacídica no lineal. Muchos polipéptidos contienen una pluralidad de dominios. Dichos dominios son conocidos y los expertos en la materia los pueden identificar. A modo de ejemplo en la presente memoria, se proporcionan definiciones, pero se entiende que está sobradamente dentro de las habilidades del experto en la materia reconocer dominios concretos por su nombre. Si es necesario, se puede emplear un software adecuado para identificar dominios. Por ejemplo, como se ha comentado más arriba, los dominios correspondientes en diferentes citocromos P450 o citocromo P450 reductasas se pueden identificar mediante alineamientos de secuencias, como, por ejemplo, utilizando herramientas y algoritmos bien conocidos en la técnica (por ejemplo, BLASTP).

Tal y como se utiliza en la presente memoria, un dominio funcional hace referencia a aquellas porciones de un polipéptido que se reconocen en virtud de una actividad funcional, como la actividad catalítica. Un dominio funcional se puede distinguir por su función, como su actividad catalítica, o su capacidad de interactuar con una biomolécula, como la unión a un sustrato o la unión a un metal. En algunos ejemplos, un dominio puede presentar de forma independiente una función o propiedad biológica tal que el dominio, de manera independiente o fusionado con otra molécula, puede realizar una actividad, como, por ejemplo, actividad catalítica o unión a un sustrato.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, un dominio estructural hace referencia a aquellas porciones de una cadena polipeptídica que pueden formar una estructura plegada independientemente en una proteína compuesta por uno o más motivos estructurales.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, «heterólogo» con respecto a una secuencia aminoacídica o una secuencia nucleotídica hace referencia a porciones de una secuencia que no están presentes en el polipéptido nativo ni son codificadas por un polinucleótido. Por ejemplo, una porción de aminoácidos de un polipéptido, como un dominio o región, o una porción de los mismos, para una citocromo P450 santaleno oxidasa sintasa es heteróloga para la misma si dichos aminoácidos no están presentes en una citocromo P450 santaleno oxidasa sintasa nativa o sin mutaciones (por ejemplo, según lo establecido en la SEC. N.° ID.:7), ni es codificada por el polinucleótido que la codifica. Los polipéptidos que contienen dichos aminoácidos heterólogos o los polinucleótidos que los codifican se denominan «polipéptidos quiméricos» o «polinucleótidos quiméricos», respectivamente.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, la frase «una propiedad del citocromo P450 modificado ha mejorado en comparación con el primer citocromo P450» hace referencia a un cambio deseable en una propiedad de un citocromo P450 modificado en comparación con un citocromo P450 que no contiene la modificación o modificaciones. Normalmente, la propiedad o propiedades se mejoran de tal manera que la cantidad producida de un terpenoide deseado en la reacción de un sustrato terpénico con la citocromo P450 sintasa modificada se ha incrementado en comparación con la cantidad producida del terpenoide deseado en la reacción de un sustrato con una citocromo P450 sintasa que no está modificada de esta manera. Entre los ejemplos de propiedades que se pueden mejorar en una citocromo P450 sintasa modificada se incluyen, por ejemplo, la producción de terpenoides, la actividad catalítica, la distribución de los productos, la especificidad frente al sustrato, la regioselectividad y la estereoselectividad. Una o más de las propiedades se pueden evaluar mediante métodos bien conocidos en la técnica para determinar si la propiedad ha sido mejorada (es decir, ha sido alterada para ser más deseable para la producción de un terpenoide o terpenoides deseados).

Tal y como se utiliza en la presente memoria, la producción de terpenoides (también denominado rendimiento de terpenoides) hace referencia a la cantidad producida (en peso o peso/volumen) de terpenoide en la reacción de un terpeno con un citocromo P450. La referencia a la producción total de terpenoides hace referencia a la cantidad total producida de todos los terpenoides en la reacción, mientras que la referencia a la producción de terpenoides concretos hace referencia a la cantidad producida de un terpenoide concreto (por ejemplo, p-santalol y a-santalol) en la reacción.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, una producción mejorada de terpenoides hace referencia a un aumento en la cantidad total de terpenoide (es decir, una producción mejorada de terpenoides totales) o un aumento en la cantidad concreta producida de terpenoide en la reacción de un terpeno con un citocromo P450 modificado en comparación con la cantidad producida en la reacción del mismo terpeno con un citocromo P450 que no está modificado de esta manera. La cantidad producida de terpenoide (total o específico) en la reacción de un terpeno con un citocromo P450 puede aumentar en al menos o aproximadamente al menos un 1%, 3%, 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, o más, en comparación con la cantidad producida de terpenoide en la reacción del mismo terpeno en las mismas condiciones con un citocromo P450 que no está modificado de esta manera.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, la especificidad frente al sustrato hace referencia a la preferencia de un citocromo P450 por un sustrato de interés, como un terpeno (por ejemplo, p-santaleno, a-santaleno, ep/-p-santaleno o a-trans-bergamoteno), con respecto a otro. La especificidad frente al sustrato se puede evaluar mediante métodos bien conocidos en la técnica, como los que calculan la Kcat/Km. Por ejemplo, la especificidad frente al sustrato se puede evaluar comparando la kcat/Km relativa, que es un indicador de la eficiencia catalítica de la enzima frente a diversos sustratos (por ejemplo, p-santateno, a-santaleno, ep/-p-santaleno o a-trans-bergamoteno).

Tal y como se utiliza en la presente memoria, especificidad alterada frente al sustrato hace referencia a un cambio en la especificidad frente al sustrato de un polipéptido modificado de citocromo P450 (como un polipéptido modificado de citocromo P450 santaleno oxidasa o un polipéptido de citocromo P450 bergamoteno oxidasa) en comparación con un citocromo P450 que no está modificado de esta manera (como, por ejemplo, una citocromo P450 santaleno oxidasa o citocromo P450 bergamoteno oxidasa sin mutaciones). La especificidad (por ejemplo, kcat/Km) de un polipéptido modificado de citocromo P450 frente a un sustrato, como p-santateno, a-santaleno, ep/-p-santaleno o a-trans-bergamoteno, se puede alterar en al menos o aproximadamente al menos un 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, o más, en comparación con la especificidad de un citocromo P450 de partida por el mismo sustrato.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, «especificidad mejorada frente al sustrato» hace referencia a un cambio o una alteración en la especificidad frente al sustrato a una especificidad más deseada. Por ejemplo, una especificidad mejorada frente al sustrato puede incluir un aumento en la especificidad de un polipéptido modificado de citocromo P450 frente a un sustrato de interés, como p-santateno, a-santaleno, ep/-p-santaleno o a-frans-bergamoteno. La especificidad (por ejemplo, kcat/Km) de un polipéptido modificado de citocromo P450 frente a un sustrato, como psantateno, a-santaleno, ep/-p-santaleno o a-frans-bergamoteno, se puede aumentar en al menos o aproximadamente un 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, o más, en comparación con la especificidad de un citocromo P450 que no está modificado de esta manera.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, «distribución de los productos» hace referencia a las cantidades relativas producidas de diferentes terpenoides en la reacción entre un terpeno, como el p-santaleno, y un citocromo P450, incluidos los polipéptidos de citocromo P450 proporcionados en la presente memoria. La cantidad producida de un terpenoide se puede representar en forma de porcentaje de los productos totales producidos por el citocromo P450. Por ejemplo, la distribución de los productos obtenida en la reacción del p-santaleno con una citocromo P450 santaleno oxidasa puede ser de un 90% (peso/volumen) de p-santalol y un 10% (peso/volumen) de otros compuestos. Los métodos para evaluar el tipo y la cantidad de un terpenoide en una solución son bien conocidos en la técnica y se describen en la presente memoria, e incluyen, por ejemplo, la cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS) (véanse ejemplos a continuación).

Tal y como se utiliza en la presente memoria, una «distribución de los productos» alterada hace referencia a un cambio en la cantidad relativa producida de terpenoides individuales en la reacción entre un terpeno, como el p-santateno, y un citocromo P450, como la citocromo P450 santaleno oxidasa. Normalmente, el cambio se evalúa determinando la cantidad relativa producida de terpenoides individuales a partir del terpeno con un primer citocromo P450 (por ejemplo, un citocromo P450 sin mutaciones) y a continuación comparándola con la cantidad relativa producida de terpenoides individuales con un segundo citocromo P450 (por ejemplo, un citocromo P450 modificado). Se considera que tiene lugar una distribución alterada del producto si la cantidad relativa de uno o más terpenoides aumenta o disminuye en al menos o aproximadamente al menos un 0,5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o más.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, una distribución mejorada de los productos hace referencia a un cambio en la distribución de los productos que es más deseable, es decir, que contiene cantidades relativas más deseables de terpenoides. Por ejemplo, una distribución mejorada de los productos puede contener una mayor cantidad de un terpenoide deseado y/o una menor cantidad de un terpenoide menos deseado. En una distribución mejorada de la producción, la cantidad de terpenoide deseado puede aumentar en al menos o aproximadamente al menos un 0,5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o más. En una distribución mejorada de la producción, la cantidad de un terpenoide no deseado puede disminuir en al menos o aproximadamente al menos un 0,5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o más.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, los ácidos nucleicos o las moléculas de ácido nucleico incluyen el ADN, el ARN y análogos de los mismos, incluidos ácidos nucleicos peptídicos (ANP) y mezclas de los mismos. Los ácidos nucleicos pueden ser monocatenarios o bicatenarios. Al referirse a las sondas o cebadores, que están opcionalmente marcados, como con un marcador detectable, como un marcador fluorescente o radioactivo, se contemplan moléculas monocatenarias. Dichas moléculas suelen tener una longitud tal que su blanco es estadísticamente único o tiene un bajo número de copias (normalmente menos de 5, por lo general menos de 3) para sondear o cebar una biblioteca. Por lo general, una sonda o cebador contiene al menos 14, 16 o 30 nucleótidos contiguos de una secuencia complementaria o idéntica a un gen de interés. Las sondas y los cebadores pueden ser ácidos nucleicos de 10, 20, 30, 50, 100 o más nucleótidos.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, el término polinucleótido significa un polímero monocatenario o bicatenario de bases desoxirribonucleotídicas o ribonucleotídicas leído desde el extremo 5' al extremo 3'. Los polinucleótidos incluyen el ARN y el ADN, y se pueden aislar de fuentes naturales, sintetizar in vitro o producir a partir de una combinación de moléculas sintéticas y de origen natural. La longitud de una molécula polinucleotídica se indica en la presente memoria en términos de nucleótidos (abreviado como «nt») o pares de bases (abreviado como «pb»). Cuando el contexto lo permite, el término nucleótido se utiliza para moléculas monocatenarias y bicatenarias. Cuando el término se aplica a moléculas bicatenarias se utiliza para denotar la longitud total y se entenderá que equivale al término «pares de bases». Los expertos en la materia reconocerán que las dos hebras de un polinucleótido bicatenario pueden diferir ligeramente en longitud y que sus extremos pueden ser escalonados; por lo tanto, no todos los nucleótidos de una molécula polinucleotídica bicatenaria pueden estar emparejados. Dichos extremos no emparejados, por lo general, no tendrán más de 20 nucleótidos.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, el ácido nucleico heterólogo es un ácido nucleico que normalmente no es producido in vivo por la célula en la que se expresa o que es producido por la célula, pero está en un locus diferente o se expresa de forma distinta o que media o codifica mediadores que alteran la expresión del ácido nucleico endógeno, como el ADN, afectando a la transcripción, la traducción u otros procesos bioquímicos regulables. El ácido nucleico heterólogo por lo general no es endógeno para la célula en la que se introduce, sino que se ha obtenido a partir de otra célula o se ha producido mediante síntesis. El ácido nucleico heterólogo puede ser endógeno, pero es un ácido nucleico que se expresa a partir de un locus diferente o que está alterado en su expresión. Por lo general, aunque no necesariamente, dicho ácido nucleico codifica ARN y proteínas que normalmente no son producidas por la célula o de la misma manera en la célula en la que se expresa. El ácido nucleico heterólogo, como el ADN, también se puede denominar ácido nucleico foráneo, como el ADN. Así, el ácido nucleico heterólogo o ácido nucleico foráneo incluye una molécula de ácido nucleico que no está presente en la orientación o posición exactas de la molécula de ácido nucleico homóloga, como el ADN, en un genoma. También puede hacer referencia a una molécula de ácido nucleico de otro organismo o especie (es decir, exógena).

Cualquier ácido nucleico, como el ADN, que un experto en la materia reconocería o consideraría heterólogo o foráneo para la célula en la que se expresa el ácido nucleico se abarca en la presente memoria mediante el término «ácido nucleico heterólogo»; el término «ácido nucleico heterólogo» incluye ácido nucleico añadido de forma exógena que también se expresa de forma endógena. Entre los ejemplos de ácido nucleico heterólogo se incluyen, entre otros, un ácido nucleico que codifica proteínas marcadoras rastreables, como una proteína que confiere resistencia a fármacos, un ácido nucleico que codifica sustancias con eficacia terapéutica, como agentes anticancerígenos, enzimas y hormonas, y un ácido nucleico, como el ADN, que codifica otros tipos de proteínas, como anticuerpos. Los anticuerpos que están codificados por el ácido nucleico heterólogo pueden ser secretados o expresados en la superficie de la célula en la que se ha introducido el ácido nucleico heterólogo.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, un péptido hace referencia a un polipéptido de 2 a 40 aminoácidos.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, los aminoácidos que están presentes en las diversas secuencias aminoacídicas proporcionadas en la presente memoria se identifican según sus abreviaturas conocidas, de tres letras o de una letra (Tabla 1). Los nucleótidos que están presentes en los diversos fragmentos de ácidos nucleicos se designan con las denominaciones estándar de una sola letra utilizadas habitualmente en la técnica.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, un «aminoácido» es un compuesto orgánico que contiene un grupo amino y un grupo ácido carboxílico. Un polipéptido contiene dos o más aminoácidos. A efectos de la presente memoria, los aminoácidos incluyen los veinte aminoácidos de origen natural, aminoácidos sintéticos y aminoácidos análogos (es decir, aminoácidos en los que el carbono en a tiene una cadena lateral).

De acuerdo con la nomenclatura estándar para polipéptidos descrita en J. Biol. Chem. 243: 3557-3559 (1968), y adoptada conforme a la norma 37 C.F.R. §§ 1.821-1.822, las abreviaturas de los restos aminoacídicos se muestran en la Tabla 1:

Tabla 1 - Tabla de correspondencia

Todas las secuencias de restos aminoacídicos representadas en la presente memoria mediante fórmulas tienen una orientación de izquierda a derecha en la dirección convencional del extremo aminoterminal al extremo carboxiterminal. Además, el término «resto aminoacídico» se define ampliamente para incluir los aminoácidos enumerados en la Tabla de Correspondencia (Tabla 1) y los aminoácidos modificados e inusuales, como los mencionados en 37 C.F.R. §§ 1.821-1.822, e incorporados en la presente memoria a modo de referencia. Además, un guion al principio o al final de una secuencia de restos aminoacídicos indica un enlace peptídico a otra secuencia de uno o más restos aminoacídicos, a un grupo aminoterminal, como NH2, o a un grupo carboxiterminal, como COOH.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, los «aminoácidos de origen natural» se refieren a los 20 ^-aminoácidos que están presentes en los polipéptidos.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, «aminoácido sintético» hace referencia a un compuesto orgánico que contiene un grupo amino y un grupo ácido carboxílico, y que no es uno de los aminoácidos naturales enumerados en la Tabla 1. Entre los aminoácidos que no son de origen natural se incluyen, por ejemplo, aminoácidos o análogos de aminoácidos distintos de los 20 aminoácidos naturales e incluyen, entre otros, estereoisómeros D de los aminoácidos. Los ejemplos de aminoácidos sintéticos son conocidos por los expertos en la materia y se pueden incluir en un polipéptido de citocromo P450 o polipéptido de citocromo P450 reductasa modificados proporcionados en la presente memoria.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, la modificación hace referencia a la modificación de la secuencia aminoacídica primaria de un polipéptido o una secuencia nucleotídica en una molécula de ácido nucleico e incluye deleciones, inserciones, así como reemplazos y reordenamientos, de aminoácidos y nucleótidos, respectivamente. Para los fines de la presente memoria, los reemplazos (o sustituciones), las deleciones y/o las inserciones de aminoácidos se pueden realizar en cualquiera de los citocromos P450 o citocromo P450 reductasas proporcionados en la presente memoria. Las modificaciones se pueden realizar haciendo reemplazos conservadores de aminoácidos y también sustituciones no conservadoras de aminoácidos, así como mediante inserciones, intercambios de dominios y otros cambios en la secuencia primaria. Por ejemplo, se pueden realizar reemplazos de aminoácidos que alteren de forma deseable o ventajosa las propiedades del citocromo P450 o la citocromo P450 reductasa. Por ejemplo, se pueden hacer reemplazos de aminoácidos a la citocromo P450 santaleno oxidasa de manera que la citocromo P450 santaleno oxidasa modificada resultante pueda producir más p-santalol a partir de una mezcla de santalenos y bergamotenos en comparación con una citocromo P450 santaleno oxidasa que no está modificada. Por ejemplo, se pueden hacer reemplazos de aminoácidos a la citocromo P450 bergamoteno oxidasa de manera que la citocromo P450 bergamoteno oxidasa modificada resultante pueda producir más bergamotol a partir de una mezcla de santalenos y bergamotenos en comparación con una citocromo P450 bergamoteno oxidasa que no está modificada. Las modificaciones también pueden incluir modificaciones postraduccionales u otros cambios en la molécula que pueden ocurrir debido a la conjugación o conexión, directa o indirectamente, a otro resto, pero cuando se contemplan dichas modificaciones, se hace referencia a estas como modificaciones postraduccionales o conjugados u otro término parecido según proceda. Los métodos para modificar un polipéptido son habituales para los expertos en la materia, y se pueden llevar a cabo mediante métodos convencionales, como mutaciones dirigidas al sitio, métodos de amplificación y métodos de barajado de genes.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, entre los reemplazos o sustituciones de aminoácidos contemplados se incluyen, entre otros, sustituciones conservadoras, incluidas, entre otras, las establecidas en la Tabla 2. Las sustituciones conservadoras de aminoácidos adecuadas son conocidas por los expertos en la materia y se pueden realizar por lo general sin alterar la conformación ni la actividad del polipéptido. Los expertos en la materia reconocen que, en general, las sustituciones de aminoácidos individuales en regiones no esenciales de un polipéptido no alteran sustancialmente la actividad biológica (véase, por ejemplo, Watson et al. Molecular Biology of the Gene, 4a edición, 1987, The Benjamin/Cummings Pub. co., pág. 224). Las sustituciones conservadoras de aminoácidos se realizan, por ejemplo, de acuerdo con las establecidas en la Tabla 2 a continuación:

TABLA 2

También se contemplan otras sustituciones conservadoras, que se pueden determinar empíricamente o de acuerdo con sustituciones conservadoras conocidas.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, un constructo de ADN es una molécula de ADN circular o lineal, monocatenaria o bicatenaria, que contiene segmentos de ADN combinados y yuxtapuestos de una manera que no se encuentra en la naturaleza. Los constructos de ADN existen como consecuencia de la manipulación por personas, y se incluyen clones y otras copias de moléculas manipuladas.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, un segmento de ADN es una porción de una molécula de ADN más grande que tiene atributos especificados. Por ejemplo, un segmento de ADN que codifica un polipéptido especificado es una porción de una molécula de ADN más larga, como un plásmido o un fragmento de plásmido, que, cuando se lee en la dirección de 5' a 3', codifica la secuencia aminoacídica del polipéptido especificado.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, el término «secuencia primaria» hace referencia a la secuencia de restos aminoacídicos en un polipéptido.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, la «similitud» entre dos proteínas o ácidos nucleicos hace referencia al grado de analogía entre la secuencia aminoacídica de las proteínas o las secuencias nucleotídicas de los ácidos nucleicos. La similitud puede basarse en el grado de identidad y/u homología de las secuencias de restos y de los restos que contienen. Los métodos para evaluar el grado de similitud entre proteínas o ácidos nucleicos son conocidos por los expertos en la materia. Por ejemplo, en un método de evaluación de la similitud entre secuencias, dos secuencias aminoacídicas o nucleotídicas se alinean de manera que se obtiene un grado máximo de identidad entre las secuencias. El término «identidad» hace referencia al grado de invariabilidad de las secuencias aminoacídicas o nucleotídicas. El alineamiento de las secuencias aminoacídicas, y en cierta medida, de las secuencias nucleotídicas, también puede tener en cuenta las diferencias conservadoras y/o las sustituciones frecuentes en los aminoácidos (o nucleótidos). Las diferencias conservadoras son las que mantienen las propiedades fisicoquímicas de los restos implicados. Los alineamientos pueden ser globales (alineamiento de las secuencias comparadas a lo largo de toda la longitud de las secuencias e incluyendo todos los restos) o locales (alineamiento de una porción de las secuencias que incluye solo la región o las regiones más similares).

Tal y como se utiliza en la presente memoria, con la expresión «en una posición correspondiente a» o cuando se afirma que las posiciones de nucleótidos o aminoácidos «corresponden a» posiciones de nucleótidos o aminoácidos en una secuencia dada a conocer, como se establece en el listado de secuencias, se hace referencia a posiciones de nucleótidos o aminoácidos identificadas al hacer el alineamiento con la secuencia dada a conocer para maximizar la identidad mediante un algoritmo de alineamiento estándar, como el algoritmo GAP. A los efectos de la presente memoria, la secuencia de una citocromo P450 santaleno oxidasa se alinea con la secuencia aminoacídica establecida en la SEC. N.° ID.:7. A los efectos de la presente memoria, la secuencia de una citocromo P450 bergamoteno oxidasa se alinea con la secuencia aminoacídica establecida en cualquiera de las SEC. N.° ID.:6, 8 o 9, y en particular, la SEC. N.° ID.:6. Al alinear las secuencias, un experto en la materia puede identificar los restos correspondientes, por ejemplo, utilizando como guía restos aminoacídicos conservados e idénticos. En general, para identificar las posiciones correspondientes, las secuencias aminoacídicas se alinean de forma que se obtenga la coincidencia de mayor orden (véase, por ejemplo, Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, Nueva York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, Nueva York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M. y Griffin, H.G., eds, Humana Press, Nueva Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; y Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M Stockton Press, Nueva York, 1991; Carrillo et al. (1988) SIAM J Applied Math 48:1073). En las Figuras 2A-2B, 3A-3C, 5A-5B y 21A-21C se muestran ejemplos de alineamientos y se identifican ejemplos de restos correspondientes para el reemplazo.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, la «identidad de secuencia» hace referencia al número de aminoácidos o bases nucleotídicas similares o idénticos en una comparación entre un polipéptido o polinucleótido experimental y uno de referencia. La identidad de secuencia se puede determinar mediante alineamiento de las secuencias de un ácido nucleico o una proteína para identificar regiones de similitud o identidad. A los efectos de la presente memoria, la identidad de secuencia por lo general se determina mediante alineamiento para identificar restos idénticos. El alineamiento puede ser local o global. Entre las secuencias comparadas se pueden identificar coincidencias, discrepancias y brechas. Las brechas son aminoácidos o nucleótidos nulos que se introducen entre los restos de las secuencias alineadas de manera que caracteres idénticos o similares están alineados. Por lo general, puede haber brechas internas y terminales. La identidad de secuencia se puede determinar teniendo en cuenta las brechas como el número de restos idénticos/longitud de la secuencia más corta * 100. Cuando se utilizan penalizaciones para las brechas, la identidad de secuencia se puede determinar sin penalizar las brechas en los extremos (por ejemplo, las brechas terminales no se penalizan). Como otra posibilidad, la identidad de secuencia se puede determinar sin tener en cuenta las brechas como el número de posiciones idénticas/longitud de la secuencia total alineada * 100.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, un «alineamiento global» es un alineamiento que alinea dos secuencias de principio a fin, alineando cada letra de cada secuencia una sola vez. Se produce un alineamiento, independientemente de si existe o no similitud o identidad entre las secuencias. Por ejemplo, una identidad de secuencia del 50% basada en un «alineamiento global» significa que, en un alineamiento de la secuencia completa de dos secuencias comparadas, cada una de ellas de 100 nucleótidos, el 50% de los restos son iguales. Se entiende que el alineamiento global también se puede utilizar para determinar la identidad de secuencia incluso cuando la longitud de las secuencias alineadas no es la misma. A menos que se seleccione la opción «sin penalización para las brechas terminales», a la hora de determinar la identidad de secuencia se tendrán en cuenta las diferencias en los extremos terminales de las secuencias. Por lo general, un alineamiento global se utiliza en secuencias que comparten una similitud significativa en la mayor parte de su longitud. Algunos ejemplos de algoritmos para realizar un alineamiento global incluyen el algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman et al. (1970) J. Mol. Biol. 48: 443). Algunos ejemplos de programas para realizar alineamientos globales son de acceso público e incluyen la Herramienta de Alineamiento Global de Secuencias disponible en el sitio web del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) (ncbi.nlm.nih.gov/), y el programa disponible en deepc2.psi.iastate.edu/aat/align/align.html.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, un «alineamiento local» es un alineamiento que alinea dos secuencias, pero solo alinea aquellas porciones de las secuencias que comparten similitud o identidad. Por lo tanto, un alineamiento local determina si los subsegmentos de una secuencia están presentes en otra secuencia. Si no hay similitud, no se obtendrá ningún alineamiento. Entre los algoritmos de alineamiento local se encuentran BLAST o el algoritmo de Smith-Waterman (Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)). Por ejemplo, una identidad de secuencia del 50% basada en un «alineamiento local» significa que, en un alineamiento de la secuencia completa de dos secuencias comparadas de cualquier longitud, una región de similitud o identidad de 100 nucleótidos tiene el 50% de los restos que son los mismos en la región de similitud o identidad.

A los efectos de la presente memoria, la identidad de secuencia se puede determinar mediante programas con algoritmos de alineamiento estándar utilizados con penalizaciones por defecto para las brechas establecidas por cada proveedor o de manera manual. Los parámetros por defecto del programa GAP pueden incluir: (1) una matriz de comparación unaria (que contiene un valor de 1 para identidades y de 0 para no identidades) y la matriz de comparación ponderada de Gribskov et al. (1986) Nucl. Acids Res. 14:6745, según lo descrito por Schwartz y Dayhoff, eds., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, págs. 353-358 (1979); (2) una penalización de 3,0 por cada brecha y una penalización adicional de 0,10 por cada símbolo en cada brecha; y (3) ninguna penalización para las brechas terminales. El hecho de que dos moléculas de ácido nucleico tengan secuencias nucleotídicas o que cualquiera dos polipéptidos tengan secuencias aminoacídicas que sean «idénticas» en al menos un 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99%, u otras variaciones similares que reciten una identidad porcentual, se puede determinar mediante algoritmos informáticos conocidos basados en el alineamiento local o global (véase, por ejemplo, wikipedia.org/wiki/Sequence_alignment_software, que proporciona enlaces a docenas de bases de datos y programas de alineamiento conocidos y de acceso público). Por lo general, a efectos de la presente memoria, la identidad de secuencia se determina mediante algoritmos informáticos basados en el alineamiento global, como la herramienta Needleman-Wunsch Global Sequence Alignment, disponible en NCBI/BLAST (blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD=Web&Page_TYPE=BlastHome); LAlign (William Pearson implementa el algoritmo de Huang y Miller (Adv. Appl. Math. (1991) 12:337-357)); y el programa de Xiaoqui Huang disponible en deepc2.psi.iastate.edu/aat/align/align.html. Por lo general, al comparar las secuencias nucleotídicas en la presente memoria, se utiliza un alineamiento con penalización para las brechas terminales. El alineamiento local también se puede utilizar cuando las secuencias que se comparan tienen sustancialmente la misma longitud.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, el término «identidad» representa una comparación entre un polipéptido o polinucleótido experimental y uno de referencia. En un ejemplo no limitativo, la expresión «idéntico en al menos un 90% a» hace referencia a identidades porcentuales del 90 al 100% con respecto a los polipéptidos de referencia. La identidad a un nivel del 90% o más es indicativa del hecho de que, suponiendo a efectos de ejemplificación que se comparan un polipéptido experimental y un polipéptido de referencia de 100 aminoácidos, no más de un 10% (es decir, 10 de 100) de los aminoácidos en el polipéptido experimental son distintos a los de los polipéptidos de referencia. Se pueden hacer comparaciones similares entre un polinucleótido experimental y uno de referencia. Dichas diferencias se pueden representar como mutaciones puntuales distribuidas aleatoriamente a lo largo de toda la longitud de una secuencia aminoacídica o se pueden agrupar en una o más ubicaciones de longitud variable hasta el máximo permitido, por ejemplo, diferencia de 10/100 aminoácidos (una identidad de aproximadamente un 90%). Las diferencias también se pueden deber a deleciones o truncamientos de restos aminoacídicos. Las diferencias se definen como sustituciones, inserciones o deleciones de ácidos nucleicos o aminoácidos. Dependiendo de la longitud de las secuencias comparadas, a nivel de homologías o identidades por encima de aproximadamente un 85-90%, el resultado puede ser de manera razonable independiente del programa y de los parámetros de brecha establecidos; dichos niveles elevados de identidad se pueden evaluar fácilmente, a menudo sin necesitar un software.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, los términos «sustancialmente idéntico» o «similar» varían según el contexto, tal y como lo entienden los expertos en la materia, pero dichos expertos pueden evaluarlo.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, una secuencia alineada hace referencia al uso de homología (similitud y/o identidad) para alinear posiciones correspondientes en una secuencia de nucleótidos o de aminoácidos. Normalmente, se alinean dos o más secuencias que presentan una identidad de un 50% o aproximadamente un 50%, o más, entre ellas. Un conjunto alineado de secuencias hace referencia a 2 o más secuencias que están alineadas en posiciones correspondientes y puede incluir el alineamiento de secuencias obtenidas a partir de ARN, como marcadores de secuencias expresadas (EST) y otros ADNc, alineadas con la secuencia de ADN genómico.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, «sustancialmente puro» significa lo suficientemente homogéneo para que parezca no tener impurezas fácilmente detectables mediante análisis por métodos convencionales, como la cromatografía en capa fina (TLC), la electroforesis en gel y la cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC), utilizados por los expertos en la materia para evaluar dicha pureza, o lo suficientemente puro como para que una purificación adicional no altere de manera detectable las propiedades físicas y químicas, como la actividad biológica o enzimática, de la sustancia. Los expertos en la materia conocen los métodos de purificación de los compuestos para producir compuestos que sustancialmente son químicamente puros. Sin embargo, un compuesto que sustancialmente es químicamente puro puede ser una mezcla de estereoisómeros o de isómeros. En dichos casos, una purificación adicional podría aumentar la actividad específica del compuesto.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, el polipéptido o la proteína aislados o purificados, o la porción con actividad biológica de los mismos, sustancialmente no contienen material celular ni otras proteínas contaminantes procedentes de la célula o del tejido a partir de los que se obtiene la proteína, o sustancialmente no contienen precursores químicos ni otros compuestos químicos cuando se sintetizan por medios químicos. Se puede determinar que los preparados sustancialmente no contienen ningún residuo si parece que no contienen impurezas que se detecten con facilidad según lo determinado por métodos analíticos estándar, como la cromatografía en capa fina (TLC), la electroforesis en gel y la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), utilizados por los expertos en la materia para evaluar dicha pureza, o están lo suficientemente puros como para que una purificación adicional no altere de forma detectable las propiedades físicas y químicas, como la actividad proteolítica y la actividad biológica, de la sustancia. Los expertos en la materia conocen los métodos de purificación de los compuestos para producir compuestos que sustancialmente son químicamente puros. Sin embargo, un compuesto que sustancialmente es químicamente puro puede ser una mezcla de estereoisómeros. En dichos casos, una purificación adicional podría aumentar la actividad específica del compuesto.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, «sustancialmente sin material celular» incluye preparados de citocromos P450, citocromo P450 reductasas, productos terpénicos o productos terpenoídicos en los que el citocromo P450, la citocromo P450 reductasa, el producto terpénico o el producto terpenoide se separan de los componentes celulares de las células a partir de las cuales se aíslan o se producen. En una realización, el término «sustancialmente sin material celular» incluye preparados de citocromos P450, citocromo P450 reductasas, productos terpénicos o terpenoídicos que tienen menos de aproximadamente o menos de un 30%, 20%, 10%, 5%, o menos, (en peso seco) de enzimas que no forman parte del citocromo P450, citocromo P450 reductasas, productos terpénicos o terpenoídicos, incluido el medio de cultivo celular. Cuando el citocromo P450 o la citocromo P450 reductasa se producen por recombinación, sustancialmente tampoco contienen medio de cultivo, es decir, el medio de cultivo representa menos de, aproximadamente o un 20%, 10% o 5% del volumen del preparado de citocromo P450 o citocromo P450 reductasa.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, el término «sustancialmente sin precursores químicos u otros compuestos químicos» incluye preparados de proteínas de citocromo P450 o citocromo P450 reductasa en los que la proteína se separa de los precursores químicos u otros compuestos químicos que se utilizan en la síntesis de la proteína. El término incluye preparados de proteínas de citocromo P450 o citocromo P450 reductasa que tienen menos de aproximadamente o menos de un 30% (en peso seco), 20%, 10%, 5%, o menos, de precursores químicos o componentes o compuestos químicos distintos a las sintasas.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, «sintético», con referencia a, por ejemplo, una molécula sintética de ácido nucleico o un gen sintético o un péptido sintético hace referencia a una molécula de ácido nucleico o una molécula polipeptídica que se producen mediante métodos recombinantes y/o mediante métodos de síntesis química.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, la producción por métodos recombinantes mediante el uso de métodos de ADN recombinantes hace referencia al uso de métodos bien conocidos de biología molecular para expresar proteínas codificadas por ADN clonado.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, vector (o plásmido) hace referencia a elementos discretos de ADN que se utilizan para introducir un ácido nucleico heterólogo en las células para la expresión o replicación de los mismos. Los vectores se suelen mantener episómicos, pero se pueden diseñar para efectuar la integración de un gen, o una porción del mismo, en un cromosoma del genoma. También se contemplan vectores que son cromosomas artificiales, como cromosomas artificiales bacterianos, cromosomas artificiales de levadura y cromosomas artificiales de mamíferos. La selección y el uso de dichos vehículos son bien conocidos por los expertos en la materia.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, la expresión hace referencia al proceso por el cual el ácido nucleico se transcribe a ARNm y se traduce a péptidos, polipéptidos o proteínas. Si el ácido nucleico se deriva de ADN genómico, la expresión puede, si se selecciona un organismo o célula hospedadora eucariota adecuados, incluir el procesamiento, como el empalme del ARNm.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, un vector de expresión incluye vectores con la capacidad de expresar ADN que está operativamente conectado a secuencias reguladoras, como regiones promotoras, que tienen la capacidad de efectuar la expresión de dichos fragmentos de ADN. Dichos segmentos adicionales pueden incluir secuencias promotoras y terminadoras, y opcionalmente pueden incluir uno o más orígenes de replicación, uno o más marcadores de selección, un potenciador, una señal de poliadenilación y similares. Los vectores de expresión por lo general se obtienen a partir de ADN plasmídico o vírico, o pueden contener elementos de ambos. Por lo tanto, un vector de expresión hace referencia a un constructo de ARN o ADN recombinante, como un plásmido, un fago, un virus recombinante u otro vector que, al introducirlo en una célula hospedadora adecuada, da lugar a la expresión del ADN clonado. Los vectores de expresión adecuados son bien conocidos por los expertos en la materia e incluyen los que son replicables en células eucariotas y/o procariotas y los que se mantienen episómicos o los que se integran en el genoma de la célula hospedadora.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, el término «vector» también incluye «vectores de virus» o «vectores víricos». Los vectores víricos son virus genomanipulados que están operativamente conectados a genes exógenos para transferir (como vehículos o lanzaderas) los genes exógenos al interior de las células. Entre los vectores víricos se incluyen, entre otros, vectores adenovíricos, vectores retrovíricos y vectores para el virus de la variolovacuna.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, operablemente u operativamente conectado cuando se hace referencia a segmentos de ADN significa que los segmentos están dispuestos de modo que funcionan de manera concertada para sus fines previstos, por ejemplo, la transcripción se inicia en dirección 3' del promotor y en dirección 5' de cualquiera de las secuencias transcritas. El promotor normalmente es el dominio al que se unen los mecanismos de transcripción para iniciar la transcripción y tiene lugar a través del segmento codificador hacia el terminador.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, una «proteína quimérica» o «proteína de fusión» hace referencia a un polipéptido operativamente conectado a un polipéptido diferente. Por ejemplo, un polipéptido codificado por una secuencia nucleotídica que contiene una secuencia codificante de una molécula de ácido nucleico y la secuencia codificante de otra molécula de ácido nucleico en la cual las secuencias codificantes están en el mismo marco de lectura de manera que cuando el constructo de fusión se transcribe y se traduce en una célula hospedadora, se produce la proteína que contiene las dos proteínas. Las dos moléculas pueden estar en posiciones adyacentes en el constructo o estar separadas por un polipéptido conector que contiene 1, 2, 3, o más, pero normalmente menos de 10, 9, 8, 7 o 6, aminoácidos. La proteína producida codificada mediante un constructo de fusión se denomina polipéptido de fusión. Una proteína de fusión o quimérica proporcionada en la presente memoria puede incluir uno o más polipéptidos de santaleno sintasa, o una porción de los mismos, y/o uno o más polipéptidos de citocromo P450, o una porción de los mismos, y/o uno o más polipéptidos de citocromo P450 reductasa y/o uno o más polipéptidos de otro tipo, para cualquiera o cualesquiera de las señales de control de la transcripción/traducción, secuencias señal, un marcaje para localización, un marcaje para purificación, una proteína para identificación, parte de un dominio de una inmunoglobulina G y/o un agente de orientación. Un polipéptido de citocromo P450 o polipéptido de citocromo P450 reductasa quiméricos también incluyen aquellos que tienen sus dominios o regiones endógenas del polipéptido intercambiados con otro polipéptido. Estas proteínas quiméricas o de fusión incluyen las producidas por medios recombinantes como proteínas de fusión, las producidas por medios químicos, como por acoplamiento químico, por ejemplo, acoplamiento a grupos sulfhidrilo, y las producidas mediante cualquier otro método por el que al menos un polipéptido (es decir, citocromo P450 o citocromo P450 reductasa), o una porción del mismo, está conectado directa o indirectamente por medio de un conector o conectores a otro polipéptido.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, el término «evaluar o determinar» incluye la determinación cuantitativa y cualitativa en el sentido de obtener un valor absoluto para la actividad de un producto, y también de obtener un índice, proporción, porcentaje, elemento visual u otro valor indicativo del nivel de actividad. La evaluación puede ser directa o indirecta.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, la mención de que un polipéptido «consiste esencialmente» en una secuencia aminoacídica mencionada significa que solo está presente la porción mencionada, o un fragmento de la misma, del polipéptido de secuencia completa. El polipéptido opcionalmente puede incluir, y por lo general, incluirá aminoácidos adicionales de otra fuente o se puede introducir en otro polipéptido.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, las formas en singular «un», «uno», «una», «el» y «la» incluyen las referencias al plural a menos que el contenido claramente indique lo contrario. Así, por ejemplo, la referencia a un polipéptido que comprende «un reemplazo de aminoácidos» incluye a polipéptidos con un reemplazo de aminoácidos o con una pluralidad de reemplazos de aminoácidos.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, los intervalos y las cantidades se pueden expresar como «aproximadamente» un valor particular o como intervalo. El término «aproximadamente» también incluye la cantidad exacta. Por lo tanto, «aproximadamente del 5%» significa «aproximadamente del 5%» y también «5%».

Tal y como se utiliza en la presente memoria, «opcional» u «opcionalmente» significan que el suceso o circunstancia descritos posteriormente ocurren o no, y que la descripción incluye casos en los que el suceso o circunstancia ocurren y casos en los que no. Por ejemplo, un paso opcional de aislar un terpeno significa que el terpeno se aísla o no se aísla, o, un paso opcional de aislar un terpenoide significa que el terpenoide se aísla o no se aísla.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, las abreviaturas para cualquier grupo protector, aminoácidos y otros compuestos son, a menos que se indique lo contrario, acordes con su uso común, abreviaturas reconocidas, o la Comisión de Nomenclatura Bioquímica de la IUPAC-IUB (véase, (1972) Biochem. 11:1726).

Para una mayor claridad de la descripción, y no de manera limitante, la descripción detallada se divide en las subsecciones que se indican a continuación.

B. Perspectiva general

En la presente memoria se proporcionan enzimas de citocromo P450 de Santalum album, y variantes y formas modificadas de las mismas, para la producción de santaloles y otros sesquiterpenoides. Dichos citocromos P450 catalizan la producción biosintética de santaloles o bergamotoles a partir de santalenos y bergamotenos, los cuales se pueden generar por biosíntesis a partir de farnesil pirofosfato mediante la enzima santaleno sintasa (véase la patente WO 2011/000026 y Jones et al. (2011) J Biol Chem 286:17445-17454. En la presente memoria también se proporcionan citocromo P450 reductasas de Santalum album, y variantes y formas modificadas de las mismas. En la presente memoria también se proporcionan métodos para sintetizar santaloles y otros sesquiterpenoides a partir de farnesil difosfato y/o santalenos y bergamoteno. Las enzimas proporcionadas de citocromo P450 hacen posible la producción de productos valiosos, incluidos santaloles y bergamotoles, en cantidades útiles desde un punto de vista comercial y de una manera rentable y energéticamente eficiente. El alcance de la invención está delimitado por las reivindicaciones. Toda la información dada a conocer que no esté dentro del alcance de las reivindicaciones se proporciona únicamente a título de referencia.

1. Biosíntesis de terpenoides

Los terpenos son una clase amplia y diversa de compuestos orgánicos que se producen en una variedad de plantas a partir de pirofosfatos acíclicos precursores de isoprenos, como el geranil pirofosfato (GPP), el farnesil pirofosfato (FPP) y el geranilgeranil pirofosfato (GGPP). Los terpenos se nombran atendiendo al número de unidades de isopreno (CsHa) que contienen. Por ejemplo, los monoterpenos se forman a partir de GPP y contienen 10 átomos de carbono, los sesquiterpenos se forman a partir de FPP y contienen 15 átomos de carbono y los diterpenos se forman a partir de GGPP y contienen 20 átomos de carbono. Los terpenos cuya estructura química se ha modificado se denominan terpenoides o isoprenoides. Los terpenos y terpenoides son los principales constituyentes de los aceites esenciales de plantas y se usan ampliamente como saborizantes para alimentos, fragancias en perfumería y en medicina convencional y alternativa.

Los santaloles y el bergamotol son sesquiterpenoides que se encuentran en las plantas, incluido el duramen de especies de Santalum, incluidas el Santalum album (sándalo de la India, sándalo blanco, Chandana), el Santalum austrncaledonicum (sándalo australiano) y el Santalum spicatum. El bergamotol también se puede encontrar en plantas como las orquídeas. Los santaloles y el bergamotol son los productos de oxidación de los santalenos y el bergamoteno, respectivamente. En S. album, aproximadamente un 90% del aceite esencial se compone de los alcoholes sesquiterpénicos (Z)-a-, (Z)-p- y (Z)-epi-p-santalol y (Z)-a-exo-bergamotol. Los a- y p-santaloles son los principales contribuyentes a la fragancia del aceite de sándalo. El (Z)-a-santalol y el (Z)-p-santalol son los componentes mayoritarios del aceite de S. album auténtico.

Los enzimas de P450 proporcionados en la presente memoria se pueden emplear para producir los alcoholes sesquiterpénicos importantes para la fragancia del aceite de sándalo. Los santalenos y el bergamoteno se sintetizan mediante biosíntesis a partir del FPP (pirofosfato acíclico precursor) mediante la santaleno sintasa (terpeno sintasa) (véase la patente WO 2011/000026 y Jones et al. (2011) J Biol Chem 286:17445-17454). Se sabe que la santaleno sintasa produce una mezcla de santalenos (es decir, a-, p-, epi-p-santaleno y a-exo-bergamoteno). Algunos ejemplos de santaleno sintasas son la santaleno sintasa de Santalum album (SaSSY) establecida en la SEC. N.° ID.:16 y que codifica la secuencia aminoacídica establecida en la SEC. N.° ID.:17; la santaleno sintasa de Santalum austrncaledonicium (SauSSY, códigos de accesión de Genbank HQ343277 o AD087001) establecida en la SEC. N.° ID.:59 y que codifica la secuencia aminoacídica establecida en la SEC. N.° ID.:52; o la santaleno sintasa de Santalum spicatum (SspiSSy, códigos de accesión de Genbank HQ343278 o AD087002) establecida en la SEC. N.° ID.:60 y que codifica la secuencia aminoacídica establecida en la SEC. N.° ID.:53.

Se observó que los polipéptidos de citocromo P450 oxidasa proporcionados en la presente memoria catalizan la formación de uno o más de lo siguiente: a-santalol a partir de a-santaleno, p-santalol a partir de p-santaleno, epi-psantalol a partir de epi-p-santaleno y/o a-trans-bergamotol a partir de a-trans-bergamoteno. La hidroxilación o monooxigenación de sustratos terpénicos por la citocromo P450 oxidasa por lo general se lleva a cabo en presencia de una citocromo reductasa. Por ejemplo, las citocromo reductasas de Santalum album (SaCPR) proporcionadas en la presente memoria se incluyen en la biosíntesis para suministrar electrones del NADPH al citocromo P450. Por lo tanto, las rutas para la biosíntesis de santaloles y bergamotoles, incluidos los componentes del aceite de sándalo, se pueden modificar metabólicamente en células hospedadoras mediante la transformación del ácido nucleico que codifica una citocromo P450 oxidasa y una citocromo P450 reductasa proporcionadas en la presente memoria en combinación con una molécula de ácido nucleico que codifica una santaleno sintasa.

a. Santaloles

En particular, entre los santaloles responsables de la fragancia del aceite de sándalo se incluyen los a-santaloles (1 y 9), los p-santaloles (2 y 10) y los ep/-p-santaloles (3 y 11) (véase la Figura 1). El (Z)-a-santalol (Z-a-santalol; (Z)-5-(1R,2S,6S)-2,3-dimetiltriciclol[2.2.1.026]heptan-3-il)-2-metilpent-2-en-1-ol; 1) y el (E)-a-santalol ((E)-5-((1R,2S,6S)-2,3-dimetiltriciclo[2.2.1.02,6]heptan-3-il)-2-metilpent-2-en-1-ol; 9) se biosintetizan por oxidación del sesquiterpeno asantaleno 5 (véase la Figura 1). El (Z)-p-santalol (Z-p-santalol; el (Z)-2-metil-5-[(1S,2R,4R)-2-metil-3-metilenbiciclo[2.2.1]heptan-2-il]pent-2-en-1-ol; 2) y el (E)-p-santalol ((E)-2-metil-5-((1S,2R,4R)-2-metil-3-metilenbiciclo[2.2.1]heptan-2-il)pent-2-en-1-ol; 10) se biosintetizan por oxidación del sesquiterpeno p-santaleno 6 (véase la Figura 1). El (E)-ep/-p-santalol ((E)-2-metil-5-[(1R,2R,4S)-2-metil-3-metilenbiciclo[2.2.1]heptan-2-il)pent-2-en-1-ol; 3) y el (Z)-ep/-p-santalol ((Z)-2-metil-5-((1R,2R,4S)-2-metil-3-metilenbiciclo[2.2.1]heptan-2-il)pent-2-en-1-ol; 11) se biosintetizan por oxidación del sesquiterpeno ep/-p-santaleno 7 (véase la Figura 1).

(Z)-a-santalol (Z)-p-santalol (E)-epi-p-santalol

^{( E ) - u - s a n t a l o l}(E)-B-santalol ^{( Z ) - e p i - p - s a n t a l o l}

b. Bergamotol

El (Z)-a-frans-bergamotol ((Z)-a-exo-bergamotol; cis-a-frans-bergamotol; (2Z)-5-[(1S,5S,6R)-2,6-dimetilbiciclo[3.3.1]hept-2-en-6-il]-2-metil-2-penten-1-ol; 4) y el (E)-a-frans-bergamotol ((E)-a-exo-bergamotol; (E)-5-((1S,5S,6R)-2,6-dimetilbiciclo[3.1.1]hept-2-en-6-il)-2-metilpent-2-en-1-ol; 12) son sesquiterpenoides que se encuentran en el aceite de sándalo que se biosintetizan por oxidación del sesquiterpeno a-frans-bergamoteno 8 (véase la Figura 1).

2. Enzimas de citocromo P450

Los citocromos P450 (CYP) son una superfamilia de hemoproteínas, o proteínas de hemo-tiolato, que catalizan inserciones singulares de oxígeno en un abanico diverso de sustratos hidrófobos, a menudo con una elevada regioselectividad y estereoselectividad. Los citocromos P450 son proteínas muy comunes que participan en el metabolismo de un amplio abanico de compuestos. Como tales, los P450 están muy extendidos en la naturaleza y participan en procesos como la detoxificación de xenobióticos, el catabolismo de fuentes de carbono inusuales y la biosíntesis de metabolitos secundarios. Los CYP destacan por su especificidad frente a un amplio abanico de sustratos y el uso de oxígeno sin necesidad de fosforilar la adenosina difosfato (ADP). Pueden intervenir en monooxigenaciones, hidroxilaciones en heteroátomos de nitrógeno y azufre, epoxidaciones, deshalogenaciones, desaminaciones y desalquilaciones. Entre las reacciones concretas catalizadas por CYP se incluyen la desmetilación, la hidroxilación, la epoxidación, la oxidación en el nitrógeno, la sulfooxidación, las desalquilaciones en el nitrógeno, el azufre y el oxígeno, la desulfatación, la desaminación y la reducción de grupos azo, nitro y N-óxido.

Normalmente, los citocromos P450 son monooxigenasas, e incorporan un átomo de oxígeno en un sustrato. En general, las monooxigenaciones requieren una o dos proteínas adicionales para transferir electrones del NAD(P)H al hierro del hemo y los CYP se ubican en grupos o clases dependiendo de cuál es la otra molécula que interviene en la transferencia de electrones. Los CYP de clase I, comunes en sistemas de P450 de bacterias y mitocondrias eucarióticas, usan una reductasa que contiene FAD y una redoxina de hierro-azufre o ferrodoxina. La reductasa que contiene FAD transfiere electrones del NAD(P)H a la ferrodoxina, que a su vez reduce el CYP. Los citocromos P450 de clase II son los CYP más comunes en eucariotas y plantas, y también incluyen sistemas de P450 de microsomas y bacterias. Los CYP de clase II usan una NADPH:citocromo P450 reductasa (o citocromo P450 reductasa) para transferir electrones del NAD(P)H a un citocromo P450. Existen numerosas otras clases que sacan partido de otras cadenas de transferencia de electrones.

Los citocromos P450 se nombran con una nomenclatura sistemática que incluye la partícula principal CYP seguida por un número que designa la familia, una letra que designa la subfamilia y un número que representa el gen individual, por ejemplo, CYP76-G5. Las familias comparten una identidad de secuencia aminoacídica superior al 40% y las subfamilias comparten una identidad de secuencia aminoacídica superior al 55%.

Las familias de genes de citocromos P450 de plantas son muy grandes. Por ejemplo, un examen de la secuencia del genoma total muestra al menos 272 genes predichos de citocromo P450 en Arabidopsis y al menos 455 genes únicos de citocromo P450 en el arroz (véase, por ejemplo, Nelson et al. (2004) Plant Physiol. 135(2):756-772). Los CYP de plantas se pueden localizar en el retículo endoplásmico (RE) y los cloroplastos. En las plantas, los CYP incluyen un amplio abanico de hidroxilasas, epoxidasas, peroxidasas y oxigenasas que mayormente realizan monooxigenaciones de clase II. Los P450 de plantas intervienen en rutas bioquímicas que incluyen, por ejemplo, la síntesis de productos vegetales como los fenilpropanoides, los alcaloides, los terpenoides, los lípidos, los glucósidos cianógenos y los glucosinolatos (véase, por ejemplo, Chapple (1998) Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 49:311-343).

a. Estructura

Aunque la conservación de las secuencias entre los citocromos P450 es relativamente baja, su topografía general y plegamiento de la estructura están sumamente conservados. Solo hay 3 restos absolutamente conservados entre todos los CYP, a saber, el ácido glutámico y la arginina del motivo estructural ExxR (SEC. N.° ID.:54) y la cisteína de unión al hemo. Los nódulos estructurales conservados son importantes para la estructura y la función, y las regiones variables que participan en el reconocimiento del sustrato determinan las propiedades individuales (véase, por ejemplo, Werck-Reichhart y Feyereisen (2000) Genome Biology 1(6)3000.1-3000.9, Sirim et al. (2010) BMC Structural Biology 10:34 and Baudry et al. (2006) Prot Eng Design & Selection 19:343-353).

Los citocromos P450 normalmente contienen hélices a, denominadas A a L, y láminas p plegadas, denominadas 1 a 5, contenidas en un dominio p que está asociado al reconocimiento del sustrato y está compuesto predominantemente de láminas p y un dominio a que contiene el centro catalítico y se compone predominantemente de hélices a. Las regiones estructurales son como se indica a continuación, del extremo aminoterminal al extremo carboxiterminal: hélice A, hebra p 1-1, hebra p 1-2, hélice B, hebra p 1-5, hélice B', hélice C, hélice C', hélice D, hebra p 3-1, hélice E, hélice F, hélice G, hélice H, hebra p 5-1, hebra p 5-2, hélice I, hélice J, hélice J', hélice K, hebra p 1-4, hebra p 2-1, hebra p 2-2, hebra p 1-3, hélice K', hélice K'', dominio heme, hélice L, hebra p 3-3, hebra p 4-1, hebra p 4-2 y hebra p 3-2 (véase, por ejemplo, Werck-Reichhart y Feyereisen (2000) Genome Biology 1(6)3000.1-3000.9).

Los citocromos P450 se anclan al retículo endoplásmico (ER) o cloroplasto en plantas por medio de una hélice transmembranaria cercana al extremo aminoterminal de la proteína (Chapple (1998) Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 49:311-343). La hélice transmembranaria normalmente va seguida por una región de bisagra que contiene una serie de restos aminoacídicos básicos y una región rica en prolina que contiene la secuencia consenso (P/I)PGPx(G/P)xP (SEC. N.° ID.:55). Esta región de bisagra permite la orientación óptima de la enzima en relación con la membrana. La eliminación de la región de bisagra con prolina dio lugar a una pérdida completa de actividad (Szczesna-Skorupa et al. (1993) Arch Biochem Biofis 304:170-175) y la mutación de restos de prolina a alanina alteró la estructura a fin de eliminar la incorporación del hemo (Yamazaki et al. (1993) J Biochem 114:652-657).

La región principal del CYP conservada se compone de un resorte denominado “meandro”, un haz de cuatro hélices (hélices D, E, I y L), hélices J y K, y dos conjuntos de láminas p (Werck-Reichhart and Feyereisen (2000) Genome Biology 1(6)3000.1-3000.9). La región principal contiene el bucle de unión al hemo que contiene la secuencia consenso GRRx-CP(A/G) (SEC. N.° ID.:56) del P450 ubicada en la cara proximal del hemo justo antes de la hélice L, con una cisteína absolutamente conservada que actúa como quinto ligando para el hierro del hemo. El sitio activo para la catálisis es la hierro-protoporfirina IX (hemo) y el tiolato del resto de cisteína conservado es el quinto ligando; el sitio de coordinación final puede unirse al oxígeno molecular y activarlo (Groves et al., 1995 en citocromo P450: Structure, Mechanism, and Biochemistry (Ed: Ortiz de Montellano) Plenum Press, New York, NY, págs. 3-48). La región principal también contiene la parte central de la hélice I que contiene la cavidad de unión que contiene treonina para la molécula de oxígeno requerida en la catálisis que tiene una secuencia consenso (A/G)Gx(D/E)T(T/S) (SEC. N.° ID.:57) que también corresponde al surco de transferencia de protones. Finalmente, la región principal contiene el motivo estructural absolutamente conservado ExxR (SEC. N.° ID.:54) en la hélice K en el lado proximal del hemo (véase, por ejemplo, Werck-Reichhart y Feyereisen (2000) Genome Biology 1(6)3000.1-3000.9). La cara proximal de la enzima participa en el reconocimiento de la otra molécula que interviene en la redox y la transferencia de electrones al sitio activo. Los protones fluyen hacia el interior del canal del sitio activo desde la cara distal. El canal de acceso del sustrato está situado en estrecho contacto con la membrana entre el bucle F-G, la hélice A y las hebras p 1-1 y 1-2.

Los sitios de reconocimiento del sustrato (SRS) en el citocromo P450 son diversos e incluyen el SRS1, la región de bucle entre las hélices B y C; el SRS2, el extremo carboxiloterminal de la hélice F; el SRS3, parte del bucle FG y el extremo aminoterminal de la hélice G; el SRS4, la hélice I que contiene el SRS4 que se extiende por encima del anillo de pirrol B en el sitio activo; el SRS5, el bucle entre la hélice K y la hebra 4 de la lámina p 1; y el SRS6, el giro p en la lámina p 4.

b. Función

Los citocromos P450 catalizan la oxidación regioespecífica y estereospecífica de hidrocarburos no activados a temperaturas fisiológicas. Los citocromos P450 activan el oxígeno molecular mediante un centro de hierro hemo y el uso de una lanzadera de electrones para reacciones redox que sustenta la reacción de oxidación. La reacción general para la hidroxilación mediante el sistema de citocromo P450 es,

RH NADPH H+ O2 ^ ROH NADP+ H2O,

donde R representa un compuesto que es un sustrato. Como se señala, normalmente, los citocromos P450 son monooxigenasas, que catalizan la inserción de uno de los átomos del oxígeno molecular en un sustrato, mientras que el segundo oxígeno se reduce para dar agua. La catálisis conlleva: 1) la unión al sustrato; 2) la reducción con un electrón del complejo a un estado ferroso; 3) la unión del oxígeno molecular para dar el complejo superóxido; y 4) una segunda reducción que da lugar a una forma de oxígeno activado de corta vida. El oxígeno activado ataca al sustrato, lo que normalmente da lugar a la monooxigenación del sustrato. Otras reacciones catalizadas por CYP incluyen la desalquilación, deshidratación, deshidrogenación, isomerización, dimerización, ruptura de enlaces carbono-carbono y reducción.

3. Citocromo P450 reductasa

Las citocromo P450 reductasas (NADPH:citocromo P450 reductasa; NADPH-citocromo P450 oxidorreductasa; NADPH:ferrihemoproteína oxidorreductasa; NADPH:P450 oxidorreductasa; CPR; CYPOR; EC 1.6.2.4) son enzimas con múltiples dominios de la familia de la diflavina reductasa necesarias para la transferencia de electrones del NAD(P)H a los citocromos P450, hemo oxigenasas, citocromo b5 y escualeno epoxidasas (Louerat-Orieu et al (1998) Eur J Biochem 258:1040-1049). Se sabe que las plantas contienen múltiples isoformas de citocromo P450 reductasas (véase, Ro et al. (2002) Plant Physiology 130:1837-1851; Mizutani y Ohta (1998) Plant Physiology 116:357-367). Por lo general, al menos una CPR se expresa constitutivamente y las otras CPR se potencian mediante agresiones ambientales, como la luz UV y la infección con microorganismos patógenos. Además, las citocromo P450 reductasas vegetales se pueden localizar en el RE o en el cloroplasto, estando la ubicación determinada por la enzima de citocromo P450 correspondiente asociada.

a. Estructura

Las citocromo P450 reductasas comparten una homología de secuencia aminoacídica (de aproximadamente un 30% hasta aproximadamente un 90%) entre distintas especies, incluidas bacterias, levaduras, hongos, plantas, peces, insectos y mamíferos (Louerat-Orieu et al (1998) Eur J Biochem 258:1040-1049). Las citocromo p450 reductasas contienen dos dominios funcionales, un dominio a-helicoidal único aminoterminal hidrófobo de anclaje a la membrana (aminoácidos 1-95 de SEC. N.° ID.:12) y un dominio catalítico carboxiterminal hidrófilo (aminoácidos 96-704 de SEC. N.° ID.:12) (Wang et al. (1997) Proc Natl Acad Sci EE. UU. 94:8111-8416). El dominio aminoterminal contiene un dominio hidrófobo de anclaje a la membrana (aminoácidos 40-60 de la SEC. N.° ID.:12) que ancla la proteína a una membrana, por ejemplo, al RE o al cloroplasto en plantas, de esta manera garantizando que la CPR y el CYP estén relacionados en el espacio para hacer posible la transferencia de electrones. El dominio aminoterminal no es necesario para la actividad, ya que el dominio carboxiterminal soluble por sí solo tiene la capacidad de transferir electrones al citocromo c u otro aceptor de electrones. El dominio soluble carboxiterminal contiene dos dominios estructurales: un dominio aminoterminal del mononucleótido de flavina (FMN) (aminoácidos de 101-244 SEC. N.° ID.:12) y un dominio carboxiterminal del dinucleótido de flavina y adenina (FAD) (aminoácidos 301-704 de SEC. N.° ID.:12) (Dym y Eisenberg (2001) Protein Science 10:1712-1728). El dominio del FMN es homólogo a la flavodoxina, lo que permite la unión al cofactor flavínico FMN. El dominio del FAD contiene dominios de unión para el cofactor flavínico fAd y para el NADPH, y adicionalmente contiene los restos necesarios para la actividad catalítica. Los dominios del FMN y el FAD están unidos por un dominio conector (aminoácidos 245-300 de la SEC. N.° ID.:12) que es responsable de la orientación relativa de los dominios del FMN y el FAD que garantice el alineamiento correcto de los dos cofactores flavínicos necesario para una transferencia de electrones eficiente.

El dominio aminoterminal del FMN tiene una estructura p antiparalela, mientras que el subdominio carboxiterminal del NAD(P) tiene la tipología típica de pliegues de unión a dinucleótidos de piridina. El dominio del FMN contiene una lámina p de cinco hebras flanqueada por cinco hélices a, con el FMN posicionado en el lado carboxiterminal de la lámina p. El núcleo del dominio de unión al FAD es un barril p antiparalelo aplastado y el dominio de unión al NADP(H) es una lámina p paralela de cinco hebras flanqueada por hélices a. El dominio conector se compone principalmente de hélices a. Las regiones estructurales son las siguientes, del extremo aminoterminal al extremo carboxiterminal: hélice a A; hebra p 1; hélice a B; hebra p 2; hélice a C; hebra p 3; hélice a D; hebra p 4; hélice a E; hebra p 5; hélice a F; hebra p 6; hebra p 7; hebra p 8, hebra p 9; hebra p 10; hélice a G; hebra p 11; hebra p 12; hebra p l2 '; hélice a H; hélice a I; hélice a J; hélice a K; hélice a M; hebra p 13; hebra p 14; hebra p 15; hélice a N; hebra p 16; hebra p 16'; hebra p 17; hélice a O; hebra p 18; hélice a P; hebra p 10; hélice a Q; hélice a R; hebra p 20; hélice a S; hélice a T; y hebra p 21.

Las citocromo P450 reductasas contienen dominios conservados de unión al cofactor y al sustrato, incluidas regiones de unión al FMN, FAD y NADPH y sitios de unión al citocromo c y al citocromo P450. Los sitios de unión al P450 y el citocromo c contienen los aminoácidos 232-240 de la SEC. N.° ID.:12. El dominio del FMN contiene regiones de unión para el FMN pirofosfato (aminoácidos 98-119 de la SEC. N.° ID.:12) y el anillo de isoaloxazina del FMN (aminoácidos 161-214 de la SEC. N.° ID.:12). El dominio del FAD contiene regiones de unión para el FAD pirofosfato (aminoácidos 317-353 de la SEC. N.° ID.:12) y el anillo de isoaloxazina del FAD (aminoácidos 482-505 de la SEC. N.° ID.:12). La cavidad de unión al FAD incluye los aminoácidos 344, 482, 484, 485, 500-502, 516-519 y 704 de la SEC. N.° ID.:12 y el motivo de unión al FAD incluye los aminoácidos 482, 484 y 485 de la SEC. N.° ID.:12. El dominio del FAD también contiene regiones de unión para la NADPH ribosa y el pirofosfato (aminoácidos 555-576 de la SEC. N.° ID.:12) y la NADPH nicotinamida (aminoácidos 651-668 de la SEC. N.° ID.:12). La cavidad de unión del NADPH incluye los restos aminoacídicos 324, 502, 204, 560, 561, 595, 595, 624, 625, 630, 632, 634, 659, 663 y 666 de la SEC. N.° ID.:12. Los restos aminoacídicos Ser485, Cys657, Asp702 y Trp704 de la SEC. N.° ID.:12 son los restos catalíticos que intervienen en la transferencia de hidruros (Hubbard et al. (2001) J Biol Chem 276:29163-29170). Los restos aminoacídicos 516, 519 y 522 de la SEC. N.° ID.:12 forman parte del motivo de unión al fosfato (Dym y Eisenberg (2001) Protein Science 10:1712-1728). El motivo estructural pap está formado por los restos aminoacídicos 557, 560-563 y 565 de la SEC. N.° ID.:12 (Dym y Eisenberg (2001) Protein Science 10:1712-1728).

b. Función

Las citocromo P450 reductasas lanzan dos electrones del NAD(P)H al citocromo P450 mediante los cofactores flavínicos FAD y FMN. El FAD recibe un anión hidruro del NAD(P)H (donador de dos electrones) y pasa los electrones uno por uno al FMN. El FMN a continuación dona los electrones al citocromo P450. El citocromo P450 usa los electrones, según se describe más arriba, para la hidroxilación de diversos sustratos.

C. Polipéptidos de citocromo P450 y moléculas de ácido nucleico que codifican los polipéptidos de citocromo P450.

En la presente memoria se proporcionan polipéptidos de citocromo P450, incluidos polipéptidos de citocromo P450 santaleno oxidasa y polipéptidos de citocromo P450 bergamoteno oxidasa. En la presente memoria también se proporcionan moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de los polipéptidos de citocromo P450 proporcionados en la presente memoria. Los polipéptidos de citocromo P450 santaleno oxidasa proporcionados en la presente memoria catalizan la formación de a-santalol, p-santalol o ep/-p-santalol a partir de a-santaleno, p-santaleno o ep/-p-santaleno, respectivamente, incluida la producción de p-santalol a partir de p-santaleno. Los polipéptidos de citocromo P450 santaleno oxidasa proporcionados en la presente memoria también tiene la capacidad de catalizar la formación de a-trans-bergamotol a partir de a-trans-bergamoteno. En algunos ejemplos, las moléculas de ácido nucleico que codifican los polipéptidos de citocromo P450 santaleno oxidasa son las mismas o sustancialmente las mismas que las aisladas del árbol de sándalo (Santalum album). En otro ejemplo, las moléculas de ácido nucleico y los polipéptidos codificados de citocromo P450 santaleno oxidasa son variantes de los aislados del árbol de sándalo (Santalum album). Los polipéptidos de citocromo P450 bergamoteno oxidasa proporcionados en la presente memoria catalizan la formación de a-trans-bergamotol a partir de a-trans-bergamoteno. En algunos ejemplos, las moléculas de ácido nucleico que codifican los polipéptidos de citocromo P450 bergamoteno oxidasa son las mismas que las aisladas del árbol de sándalo (Santalum album). En otros ejemplos, las moléculas de ácido nucleico y los polipéptidos codificados de citocromo P450 bergamoteno oxidasa son variantes de los aislados del árbol de sándalo (Santalum album).

En la presente memoria también se proporcionan polipéptidos modificados de citocromo P450 y moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de los polipéptidos modificados de citocromo P450 proporcionados en la presente memoria. Las modificaciones se pueden hacer en cualquier región de un polipéptido de citocromo P450, incluidos un polipéptido de citocromo P450 santaleno oxidasa o un polipéptido de citocromo P450 bergamoteno oxidasa, siempre que el polipéptido modificado de citocromo P450 resultante como mínimo conserve la actividad catalítica del polipéptido de citocromo P450 que no está modificado. Por ejemplo, las modificaciones se pueden hacer a un polipéptido de citocromo P450 santaleno oxidasa siempre que el polipéptido modificado de citocromo P450 santaleno oxidasa resultante conserve actividad de citocromo P450 santaleno oxidasa (es decir, la capacidad de catalizar la hidroxilación de un santaleno, a saber, a-santaleno, p-santaleno o ep/-p-santaleno). En otro ejemplo, las modificaciones se pueden hacer a un polipéptido de citocromo P450 bergamoteno oxidasa siempre que el polipéptido modificado de citocromo P450 bergamoteno oxidasa resultante conserve actividad de citocromo P450 bergamoteno oxidasa (es decir, la capacidad de catalizar la hidroxilación de un bergamoteno, en concreto, el a-frans-bergamoteno).

Las modificaciones pueden incluir, entre otras, la optimización de codones de los ácidos nucleicos y/o cambios que dan lugar a una modificación de un solo aminoácido en el polipéptido codificado, como reemplazos (sustituciones), inserciones o deleciones de un solo aminoácido o múltiples aminoácidos, o modificaciones de múltiples aminoácidos, como reemplazos, inserciones o deleciones de múltiples aminoácidos, incluidos intercambios de regiones o dominios del polipéptido. En algunos ejemplos, se intercambian regiones o dominios enteros o parciales, como cualquier región o dominio descritos en la presente memoria más abajo, con los dominios o regiones correspondientes, o porciones de los mismos, de otro polipéptido de citocromo P450. Los ejemplos de modificaciones son reemplazos de aminoácidos, incluidos reemplazos de un solo aminoácido o de múltiples aminoácidos. Por ejemplo, los polipéptidos modificados de citocromo P450 proporcionados en la presente memoria pueden contener al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, o más, posiciones modificadas en comparación con el polipéptido de citocromo P450 que no contiene la modificación.

En la presente memoria se proporcionan polipéptidos de citocromo P450 de la familia de CYP76. En la presente memoria se proporciona un polipéptido de citocromo P450 de CYP76 que tiene una secuencia aminoacídica establecida en la SEC. N.° ID.:50. En la presente memoria también se proporcionan polipéptidos de citocromo P450 que presentan una identidad de secuencia aminoacídica de al menos un 60% con un polipéptido de citocromo P450 establecido en la SEC. N.° ID.:50. Por ejemplo, los polipéptidos de citocromo P450 proporcionados en la presente memoria pueden presentar una identidad de secuencia aminoacídica de al menos o aproximadamente al menos un 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con un polipéptido de citocromo P450 establecido en la SEC. N.° ID.:50, siempre que el polipéptido de citocromo P450 resultante como mínimo conserve actividad de citocromo P450 monooxigenasa (es decir, la capacidad de catalizar la hidroxilación o monooxigenación de un terpeno). En la presente memoria también se proporcionan polipéptidos modificados de citocromo P450 de la familia de CYP76. En particular, los polipéptidos modificados de citocromo P450 proporcionados en la presente memoria contienen sustituciones o reemplazos, adiciones o deleciones de aminoácidos, truncamientos o combinaciones de los mismos con respecto al polipéptido de citocromo P450 que tiene una secuencia aminoacídica establecida en la SEC. N.° ID.:50. Está dentro de las competencias de un experto en la materia efectuar dichas modificaciones en polipéptidos de citocromo P450 o cualquier variante de los mismos y evaluar cada uno de ellos en términos de la actividad de citocromo P450 descrita en la presente memoria, como actividad de monooxigenasa.

En la presente memoria también se proporcionan moléculas de ácido nucleico de CYP76 que tiene una secuencia aminoacídica establecida en la SEC. N.° ID.:1, o degeneraciones de la misma, que codifican un polipéptido de citocromo P450 que tiene una secuencia aminoacídica establecida en la SEC. N.° ID.:50. La molécula de ácido nucleico de CYP76 establecida en la SEC. N.° ID.:1 se puede usar para diseñar cebadores que se usan para identificar y/o clonar proteínas de CYP adicionales. En la presente memoria también se proporcionan moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido de citocromo P450 que tiene una identidad de secuencia de al menos un 85% con una secuencia nucleotídica establecida en la SEC. N.° ID.:1. Por ejemplo, la moléculas de ácido nucleico proporcionadas en la presente memoria pueden presentar una identidad de secuencia de al menos o aproximadamente al menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99%, o más, con una secuencia nucleotídica establecida en la SEC. N.° ID.:1, siempre que el polipéptido codificado de citocromo P450 como mínimo conserve actividad de citocromo P450 monooxigenasa (es decir, la capacidad de catalizar la hidroxilación de un terpeno). En la presente memoria también se proporcionan secuencias degeneradas de la secuencia establecida en la SEC. N.° ID.:1 que codifican un polipéptido de citocromo P450 que tiene una secuencia aminoacídica establecida en la SEC. N.° ID.:50. La identidad porcentual la puede determinar un experto en la materia mediante programas de alineamiento estándar.

En la presente memoria se proporcionan los polipéptidos de citocromo P450 SaCYP76F39v1 (CYP76-G10), SaCYP76F42 (CYP76-G13), SaCYP76F39v2 (CYP76-G15), SaCYP76F40 (CYP76-G16) y SaCYP76F41 (CYP76-G17). En la presente memoria se proporcionan polipéptidos de citocromo P450 santaleno oxidasa que tienen una secuencia aminoacídica establecida en las SEC. N.° ID.:7, 74, 75, 76 o 77. En la presente memoria también se proporcionan polipéptidos de citocromo P450 santaleno oxidasa que presentan una identidad de secuencia aminoacídica de al menos un 60% con un polipéptido de citocromo P450 santaleno oxidasa establecido en cualquiera de las SEC. N.° ID.:7, 74, 75, 76 o 77. Por ejemplo, los polipéptidos de citocromo P450 santaleno oxidasa proporcionados en la presente memoria pueden presentar una identidad de secuencia aminoacídica de al menos o aproximadamente al menos un 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con un polipéptido de citocromo P450 santaleno oxidasa establecido en las SEC. N.° ID.:7, 73, 74, 75 o 76, siempre que los polipéptidos resultantes de citocromo P450 santaleno oxidasa como mínimo conserven la actividad de citocromo P450 santaleno oxidasa (es decir, la capacidad de catalizar la hidroxilación de un santaleno, a saber a-santaleno, p-santaleno o epi-p-santaleno). La identidad porcentual la puede determinar un experto en la materia mediante programas de alineamiento estándar.

En la presente memoria se proporcionan los polipéptidos de citocromo P450 SaCYP76F38v1 (CYP76-G5), SaCYP76F37v1 (CYP76-G11), SaCYP76F38v2 (CYP76-G12) y SaCYP76F37v2 (CYP76-G14). En la presente memoria se proporcionan polipéptidos de citocromo P450 bergamoteno oxidasa que tienen una secuencia aminoacídica establecida en las SEC. N.° ID.:6, 8, 9 o 73. En la presente memoria también se proporcionan polipéptidos de citocromo P450 bergamoteno oxidasa que presentan una identidad de secuencia aminoacídica de al menos un 60% con un polipéptido de citocromo P450 bergamoteno oxidasa establecido en las SEC. N.° ID.:6, 8, 9 o 73. Por ejemplo, los polipéptidos de citocromo P450 bergamoteno oxidasa proporcionados en la presente memoria pueden presentar una identidad de secuencia aminoacídica de al menos o aproximadamente al menos un 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con un polipéptido de citocromo P450 bergamoteno oxidasa establecido en las SEC. N.° ID.:6, 8, 9 o 73, siempre que el polipéptido de citocromo P450 bergamoteno oxidasa resultante como mínimo conserve actividad de citocromo P450 bergamoteno oxidasa (es decir, la capacidad de catalizar la hidroxilación de un bergamoteno). La identidad porcentual la puede determinar un experto en la materia mediante programas de alineamiento estándar.

En la presente memoria también se proporciona el polipéptido de citocromo P450 SaCYP76F43 (CYP76-G18). En la presente memoria se proporciona un polipéptido de citocromo P450 que tiene una secuencia aminoacídica establecida en la SEC. N.° ID.:78. En la presente memoria también se proporcionan polipéptidos de citocromo P450 que presentan una identidad de secuencia aminoacídica de al menos un 60% con un polipéptido de citocromo P450 establecido en la SEC. N.° ID.:78. Por ejemplo, los polipéptidos de citocromo P450 proporcionados en la presente memoria pueden presentar una identidad de secuencia aminoacídica de al menos o aproximadamente al menos un 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con un polipéptido de citocromo P450 establecido en la SEC. N.° ID.:78, siempre que el polipéptido de citocromo P450 resultante como mínimo conserve actividad de citocromo P450 monooxigenasa (es decir, la capacidad de catalizar la hidroxilación o monooxigenación de un terpeno). En particular, los polipéptidos modificados de citocromo P450 proporcionados en la presente memoria contienen sustituciones o reemplazos, adiciones o deleciones de aminoácidos, truncamientos o combinaciones de los mismos con respecto al polipéptido de citocromo P450 que tiene una secuencia aminoacídica establecida en la SEC. N.° ID.:78. Está dentro de las competencias de un experto en la materia efectuar dichas modificaciones en polipéptidos de citocromo P450 o cualquier variante de los mismos y evaluar cada uno de ellos en términos de la actividad de citocromo P450 descrita en la presente memoria, como actividad de monooxigenasa.

Asimismo, en algunos ejemplos, en la presente memoria se proporcionan fragmentos con actividad catalítica de polipéptidos de citocromo P450. En algunos ejemplos, los fragmentos activos de los polipéptidos de citocromo P450, incluidos los polipéptidos de citocromo P450 santaleno oxidasa o citocromo P450 bergamoteno oxidasa, están modificados según se describe más arriba. Dichos fragmentos conservan una o más propiedades de un polipéptido de citocromo P450 de secuencia completa, incluidos polipéptidos de secuencia completa de santaleno oxidasa o citocromo P450 bergamoteno oxidasa. Normalmente, los fragmentos activos presentan actividad de citocromo P450 santaleno oxidasa o citocromo P450 bergamoteno oxidasa (es decir, catalizan la formación de santaloles y bergamotoles, respectivamente).

Los citocromos P450 proporcionados en la presente memoria, incluidos los polipéptidos de citocromo P450 santaleno oxidasa o citocromo P450 bergamoteno oxidasa proporcionados en la presente memoria, pueden contener otras modificaciones, por ejemplo, modificaciones que no están en la secuencia primaria del polipéptido, incluidas modificaciones postraduccionales. Por ejemplo, la modificación descrita en la presente memoria puede ser una citocromo P450 santaleno oxidasa o citocromo P450 bergamoteno oxidasa que sea un polipéptido de fusión o polipéptido quimérico, incluidos híbridos de distintos polipéptidos de citocromo P450 santaleno oxidasa o citocromo P450 bergamoteno oxidasa o distintas citocromo P450 monooxigenasas (por ejemplo, contienen uno o más dominios o regiones de otras citocromo P450 monooxigenasas) y también polipéptidos sintéticos de citocromo P450 santaleno oxidasa o citocromo P450 bergamoteno oxidasa preparados por recombinación o sintetizados o construidos mediante otros métodos conocidos en la técnica que están basados en la secuencia de polipéptidos conocidos.

Los polipéptidos de citocromo P450 santaleno oxidasa o polipéptidos de citocromo P450 bergamoteno oxidasa proporcionados en la presente memoria se pueden usar para catalizar la producción de santaloles y bergamotoles, respectivamente. Normalmente, los polipéptidos de citocromo P450 santaleno oxidasa proporcionados en la presente memoria catalizan la formación de santaloles a partir de santalenos, por ejemplo, catalizan la hidroxilación de santalenos. En algunos ejemplos, las citocromo P450 santaleno oxidasas también catalizan la formación de bergamotoles a partir de bergamotenos. Normalmente, los polipéptidos de citocromo P450 bergamoteno oxidasa proporcionados en la presente memoria catalizan la formación de bergamotol a partir de bergamoteno, por ejemplo, catalizan la hidroxilación de bergamoteno. Las reacciones se pueden realizar in vivo, como en una célula hospedadora en la que se ha introducido un ácido nucleico. Al menos uno de los polipéptidos será heterólogo para el hospedador. Las reacciones también se pueden realizar in vitro poniendo en contacto la enzima con el sustrato adecuado en condiciones adecuadas.

En la presente memoria también se proporcionan moléculas de ácido nucleico que codifican una santaleno sintasa y una citocromo P450 santaleno oxidasa. En la presente memoria también se proporcionan moléculas de ácido nucleico que codifican una santaleno sintasa y una citocromo P450 bergamoteno oxidasa. En dichos ejemplos, la expresión de la molécula de ácido nucleico en un hospedador adecuado, por ejemplo, una célula bacteriana o de levadura, da lugar a la expresión de santaleno sintasa y citocromo P450 oxidasa. Dichas células se pueden usar para producir las santaleno sintasas y las citocromo P450 oxidasas y/o para llevar a cabo reacciones in vivo para producir santaloles y bergamotoles. Por ejemplo, los santaloles y bergamotoles se pueden generar en una célula hospedadora a partir de farnesil difosfato (FPP), en particular una célula de levadura que sobreproduce FPP, un precursor acíclico de terpenos. En algunos ejemplos, una molécula de ácido nucleico que codifica una farnesil difosfato sintasa, como una farnesil difosfato sintasa de Santalum album, también se puede expresar en el hospedador adecuado, por ejemplo, una célula bacteriana o de levadura, lo que da lugar a la sobreexpresión de FPP.

En la presente memoria también se proporcionan moléculas de ácido nucleico que codifican una santaleno sintasa, un polipéptido de citocromo P450 y un polipéptido de citocromo P450 reductasa. Por ejemplo, en la presente memoria se proporcionan moléculas de ácido nucleico que codifican una santaleno sintasa, un polipéptido de citocromo P450 santaleno oxidasa y un polipéptido de citocromo P450 reductasa. En otro ejemplo, en la presente memoria se proporcionan moléculas de ácido nucleico que codifican una santaleno sintasa, un polipéptido de citocromo P450 bergamoteno oxidasa y un polipéptido de citocromo P450 reductasa. Las moléculas de ácido nucleico pueden estar en el mismo vector o plásmido, o en vectores o plásmidos distintos. En dichos ejemplos, la expresión de la molécula de ácido nucleico en un hospedador adecuado, por ejemplo, una célula bacteriana o de levadura, da lugar a la expresión de santaleno sintasa y citocromo P450 oxidasa. Dichas células se pueden usar para producir las santaleno sintasas y las citocromo P450 oxidasas y/o para llevar a cabo reacciones in vivo para producir santaloles y bergamotoles. Por ejemplo, los santaloles y bergamotoles se pueden generar en una célula hospedadora a partir de farnesil difosfato (FPP), en particular una célula de levadura que sobreproduce FPP, un precursor acíclico de terpenos.

1. Polipéptidos de citocromo P450 santaleno oxidasa

En la presente memoria se proporcionan polipéptidos de citocromo P450 santaleno oxidasa. En la presente memoria también se proporcionan moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de los polipéptidos de citocromo P450 santaleno oxidasa proporcionados en la presente memoria. Los polipéptidos de citocromo P450 santaleno oxidasa proporcionados en la presente memoria catalizan la formación de terpenoides presentes en aceite de sándalo, incluidos a-santaloles, p-santaloles, epi-p-santaloles y a-trans-bergamotoles. Los polipéptidos de citocromo P450 santaleno oxidasa proporcionados en la presente memoria catalizan la formación de santaloles a partir de santalenos. En algunos ejemplos, los polipéptidos de citocromo P450 santaleno oxidasa proporcionados en la presente memoria también catalizan la formación de bergamotoles a partir de bergamoteno. Por ejemplo, los polipéptidos de citocromo P450 santaleno oxidasa catalizan la formación de a-santalol a partir de a-santaleno, p-santalol a partir de p-santaleno y/o epi-p-santalol a partir de epi-p-santaleno (por ejemplo, los polipéptidos de citocromo P450 santaleno oxidasa catalizan la hidroxilación de a-santaleno, p-santaleno y/o epi-p-santaleno). En un ejemplo concreto, los polipéptidos de citocromo P450 santaleno oxidasa catalizan la formación de (E)-a-santalol a partir de a-santaleno, (Z)-a-santalol a partir de a-santaleno, (E)-p-santalol a partir de p-santaleno, (Z)-p-santalol a partir de p-santaleno, (E)-epi-p-santalol a partir de epi-p-santaleno y/o (Z)-epi-p-santalol a partir de epi-p-santaleno. En algunos ejemplos, los polipéptidos de citocromo P450 santaleno oxidasa proporcionados en la presente memoria también catalizan la formación de (Z)-atrans-bergamotol y/o (E)-a-trans-bergamotol a partir de a-trans-bergamoteno. En un ejemplo concreto, los polipéptidos de citocromo P450 santaleno oxidasa proporcionados en la presente memoria catalizan la formación de (E)-a-santalol, (Z)-a-santalol, (E)-p-santalol, (Z)-p-santalol, (E)-epi-p-santalol, (Z)-epi-p-santalol, (Z)-a-trans-bergamotol y/o (E)-atrans-bergamotol. En particular, los polipéptidos de citocromo P450 santaleno oxidasa producen los estereoisómeros (Z) y (E) de a- y p-santalol en proporciones de aproximadamente 1:5 y 1:4, respectivamente. Los polipéptidos de citocromo P450 santaleno oxidasa presentan una gran especificidad frente al sustrato, con preferencia por el asantaleno o el p-santaleno. En algunos ejemplos, los polipéptidos de citocromo P450 santaleno oxidasa también transforman el sustrato a-bisabolol.

En algunos ejemplos, los polipéptidos de citocromo P450 santaleno oxidasa proporcionados en la presente memoria catalizan la formación de terpenoides presentes en el aceite de sándalo, incluidos el a-santalol, p-santalol, epi-psantalol y a-trans-bergamotol, a partir de los productos de reacción terpénicos del precursor acíclico (farnesil pirofosfato) y una santaleno sintasa. Por ejemplo, los polipéptidos de citocromo P450 santaleno oxidasa proporcionados en la presente memoria catalizan la formación de (E)-a-santalol, (Z)-a-santalol, (E)-p-santalol, (Z)-psantalol, (E)-epi-p-santalol, (Z)-epi-p-santalol, (Z)-a-trans-bergamotol y/o (E)-a-trans-bergamotol a partir de los productos de reacción terpénicos del FPP (precursor acíclico) y una santaleno sintasa, como la santaleno sintasa de Santalum album (SaSSY; SEC. N.° ID.:l6). Los polipéptidos de citocromo P450 santaleno oxidasa catalizan la formación de (E)-a-santalol, (Z)-a-santalol, (E)-p-santalol, (Z)-p-santalol, (E)-epi-p-santalol, (Z)-epi-p-santalol, (Z)-a-trans-bergamotol y/o (E)-a-trans-bergamotol en distintas proporciones a los del aceite de sándalo auténtico (véanse el Ejemplo 11 y la Figura 15A y 15B). Por ejemplo, los principales productos formados con SaCYP76F39v1 (SaCYP76-G10) fueron el (E)-a-santalol y el (E)-p-santalol, mientras que los principales compuestos del aceite de sándalo son el (Z)-a-santalol y el (Z)-p-santalol (véanse las Figuras 15A y 15B).

Por ejemplo, en la presente memoria se proporcionan polipéptidos de citocromo P450 santaleno oxidasa que tienen una secuencia aminoacídica establecida en cualquiera de las SEC. N.° ID.:7, 74, 75, 76 y 77. En la presente memoria también se proporcionan polipéptidos de citocromo P450 santaleno oxidasa que presentan una identidad de secuencia aminoacídica de al menos un 60% con un polipéptido de citocromo P450 santaleno oxidasa que tiene una secuencia aminoacídica establecida en cualquiera de las SEC. N.° ID.:7, 74, 75, 76 y 77. Por ejemplo, los polipéptidos de citocromo P450 santaleno oxidasa proporcionados en la presente memoria pueden presentar una identidad de secuencia aminoacídica de al menos o aproximadamente al menos un 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99%, o más, con un polipéptido de citocromo P450 santaleno oxidasa establecido en cualquiera de las SEC. N.° ID.:7, 74, 75, 76 y 77, siempre que los polipéptidos de citocromo P450 santaleno oxidasa presenten actividad de citocromo P450 santaleno oxidasa (es decir, catalizan la formación de santaloles a partir de santalenos y/o bergamotoles a partir de bergamoteno). La identidad porcentual la puede determinar un experto en la materia mediante programas de alineamiento estándar.

En la presente memoria se proporcionan citocromo P450 santaleno oxidasas denominadas SaCYP76F39v1 (CYP76-G10), SaCYP76F39v2 (CYP76-G15), SaCYP76F40 (CYP76-G16), SaCYP76F41 (CYP76-G17) y SaCYP76F42 (CYP76-G13) que tienen una secuencia aminoacídica establecida en las SEC. N.° ID.:7, 74, 75, 76 y 77, respectivamente. En la presente memoria también se proporcionan fragmentos activos de polipéptidos de citocromo P450 santaleno oxidasa que tienen una secuencia aminoacídica establecida en cualquiera de las SEC. N.° ID.:7, 74, 75, 76 y 77. Dichos fragmentos conservan una o más propiedades de un polipéptido de citocromo P450 santaleno oxidasa. Normalmente, los fragmentos activos presentan actividad de citocromo P450 santaleno oxidasa (es decir, la capacidad de catalizar la formación de santaloles a partir de santalenos).

En la presente memoria también se proporcionan moléculas de ácido nucleico que tienen una secuencia aminoacídica establecida en cualquiera de las SEC. N.° ID.:3, 68, 69, 70 y 71, o degeneraciones de las mismas, que codifican un polipéptido de citocromo P450 santaleno oxidasa que tiene una secuencia aminoacídica establecida en las SEC. N.° ID.:7, 74, 75, 76 y 77, respectivamente. En la presente memoria también se proporcionan moléculas de ácido nucleico que codifican polipéptidos de citocromo P450 santaleno oxidasa que tienen una identidad de secuencia de al menos un 85% con una secuencia nucleotídica establecida en cualquiera de las SEC. N.° ID.:3, 68, 69, 70 y 71. Por ejemplo, la moléculas de ácido nucleico proporcionadas en la presente memoria pueden presentar una identidad de secuencia de al menos o aproximadamente al menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 95%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99%, o más, con una secuencia nucleotídica establecida en cualquiera de las SEC. N.° ID.:3, 68, 69, 70 y 71, siempre que los polipéptidos codificados de citocromo P450 santaleno oxidasa presenten actividad de citocromo P450 santaleno oxidasa (es decir, la capacidad de catalizar la formación de santaloles a partir de santalenos). En la presente memoria también se proporcionan secuencias degeneradas de la secuencia establecida en cualquiera de las SEC. N.° ID.:3, 68, 69, 70 y 71 que codifican polipéptidos de citocromo P450 santaleno oxidasa que tienen una secuencia aminoacídica establecida en las SEC. N.° ID.:7, 74, 75, 76 y 77, respectivamente. La identidad porcentual la puede determinar un experto en la materia mediante programas de alineamiento estándar.

En algunos ejemplos, las moléculas de ácido nucleico que codifican los polipéptidos de citocromo P450 santaleno oxidasa se aíslan del árbol de sándalo (Santalum album). En otros ejemplos, las moléculas de ácido nucleico y los polipéptidos codificados de citocromo P450 santaleno oxidasa son variantes de los aislados del árbol de sándalo (Santalum album).

En un ejemplo concreto, el polipéptido de SaCYP76F39v1 (CYP76-G10) que tiene una secuencia aminoacídica establecida en la SEC. N.° ID.:7 catalizó la formación de (E)-a-santalol, (Z)-a-santalol, (E)-p-santalol, (Z)-p-santalol, (E)-epi-p-santalol, (Z)-epi-p-santalol, (Z)-a-trans-bergamotol y (E)-a-trans-bergamotol en ensayos in vivo en levadura que expresaba una santaleno sintasa (véase el Ejemplo 10.B.2) y en ensayos in vitro con una mezcla de a-santaleno, a-trans-bergamoteno, epi-p-santaleno y p-santaleno como sustratos (véase el Ejemplo 11.B.2.a.ii). En ensayos in vivo, los productos mayoritarios fueron el (E)-p-santalol, el (E)-a-santalol y el (Z)-p-santalol (véase la Figura 11A). En ensayos in vitro, los productos mayoritarios fueron el (E)-p-santalol y el (E)-a-santalol (véase la Figura 15A). En otros ejemplos más, en ensayos in vitro con a-santaleno, a-trans-bergamoteno o epi-p-santaleno y p-santaleno, el polipéptido SaCYP76F39v1 (CYP76-G10) catalizó la formación de (Z)- y (E)-a-santalol, (Z)- y (E)-a-trans-bergamotol, y (Z)- y (E)-epi-p-santalol y (Z)- y (E)-p-santalol, respectivamente (véanse el Ejemplo 11.C. y las Figuras 20A-20C). Las propiedades cinéticas del polipéptido SaCYP76F39v1 (CYP76-G10) con a- y p-santaleno como sustratos se describen en el Ejemplo 12 más abajo.

En otro ejemplo, el polipéptido SaCYP76F39v2 (CYP76-G15) que tiene una secuencia aminoacídica establecida en la SEC. N.° ID.:74 catalizó la formación de (E)-a-santalol, (Z)-a-santalol, (E)-p-santalol, (Z)-p-santalol, (E)-epi-p-santalol, (Z)-epi-p-santalol, (Z)-a-trans-bergamotol y (E)-a-trans-bergamotol en ensayos in vivo en levadura que expresaba una santaleno sintasa (véanse el Ejemplo 10.B.3 y la Figura 13A). En ensayos in vitro con una mezcla de a-santaleno, atrans-bergamoteno, epi-p-santaleno y p-santaleno como sustrato, el polipéptido de SaCYP76F39v2 (CYP76-G15) catalizó la formación de (E)-a-santalol, (Z)-a-santalol, (E)-p-santalol, (Z)-p-santalol, (Ei-epi-p-santalol, (Z)-epi-psantalol, (Z)-a-trans-bergamotol y (E)-a-trans-bergamotol (véanse el Ejemplo 11.B.3.b y la Figura 16A), siendo el (E)a-santalol y el (E)-p-santalol los productos mayoritarios.

En otro ejemplo, el polipéptido de SaCYP76F40 (CYP76-G16) que tiene una secuencia aminoacídica establecida en la SEC. N.° ID.:75 catalizó la formación de (E)-a-santalol, (Z)-a-santalol, (E)-p-santalol, (Z)-p-santalol, (E)-epi-psantalol, (Z)-a-trans-bergamotol y (E)-a-trans-bergamotol en ensayos in vivo en levadura que expresaba una santaleno sintasa (véanse el Ejemplo 10.B.3 y la Figura 13B). En ensayos in vitro con una mezcla de a-santaleno, a-trans-bergamoteno, epi-p-santaleno y p-santaleno como sustratos, el polipéptido de SaCYP76F40 (CYP76-G16) catalizó la formación de (E)-a-santalol, (E)-p-santalol, (Z)-p-santalol, (Z)-a-trans-bergamotol y (E)-a-trans-bergamotol (véanse el Ejemplo 11.B.3.b y la Figura 16B), siendo el (E)-a-trans-bergamotol y el (E)-p-santalol los productos mayoritarios.

En otro ejemplo, el polipéptido de SaCYP76F41 (CYP76-G17) que tiene una secuencia aminoacídica establecida en la SEC. N.° ID.:76 catalizó la formación de (E)-a-santalol, (Z)-a-santalol, (E)-p-santalol, (Z)-p-santalol, (E)-epi-psantalol, (Z)-epi-p-santalol y (E)-a-trans-bergamotol en ensayos in vivo en levadura que expresaba una santaleno sintasa (véanse el Ejemplo 10.B.3 y la Figura 13C). En ensayos in vitro con una mezcla de a-santaleno, a-trans-bergamoteno, epi-p-santaleno y p-santaleno como sustratos, el polipéptido de SaCYP76F41 (CYP76-G17) catalizó la formación de (E)-a-santalol, (Z)-a-santalol, (E)-p-santalol, (Z)-p-santalol, (E)-epi-p-santalol, (Z)-epi-p-santalol, (Z)-atrans-bergamotol y (E)-a-trans-bergamotol (véanse el Ejemplo 11.B.3.b y la Figura 16C), siendo el (E)-a-santalol el producto mayoritario.

En otro ejemplo, el polipéptido de SaCYP76F42 (CYP76-G13) que tiene una secuencia aminoacídica establecida en la SEC. N.° lD.:77 catalizó la formación de (Z)-a-santalol, (Z)-p-santalol, (E)-epi-p-santalol y (E)-a-trans-bergamotol en ensayos in vivo en levadura que expresaba una santaleno sintasa (véanse el Ejemplo 10.B.3 y la Figura 13D). En ensayos in vitro con una mezcla de a-santaleno, a-trans-bergamoteno, epi-p-santaleno y p-santaleno como sustratos, el polipéptido de SaCYP76F42 (CYP76-G13) catalizó la formación de (E)-a-santalol, (Z)-a-santalol, (E)-p-santalol, (Z)-p-santalol, (E)-epi-p-santalol, (Z)-epi-p-santalol, (Z)-a-trans-bergamotol y (E)-a-trans-bergamotol (véanse el Ejemplo 11.B.3.b y la Figura 16D), siendo el (E)-a-trans-bergamotol el producto mayoritario.

Polipéptidos modificados de citocromo P450 santaleno oxidasa

En la presente memoria también se proporcionan polipéptidos modificados de citocromo P450 santaleno oxidasa. Las modificaciones, que normalmente son inserciones, deleciones y/o sustituciones de aminoácidos, se pueden efectuar en cualquier región de un polipéptido de citocromo P450 santaleno oxidasa siempre que los polipéptidos modificados de citocromo P450 santaleno oxidasa resultantes como mínimo conserven la actividad de citocromo P450 santaleno oxidasa. Por ejemplo, las modificaciones se pueden hacer en cualquier región de una citocromo P450 santaleno oxidasa siempre que la citocromo P450 santaleno oxidasa modificada resultante como mínimo conserve actividad de citocromo P450 santaleno oxidasa (es decir, la capacidad de catalizar la formación de santaloles a partir de santalenos).

Las modificaciones pueden ser de un solo aminoácido, como reemplazos (sustituciones), inserciones o deleciones de un solo aminoácido, o modificaciones de múltiples aminoácidos, como reemplazos, inserciones o deleciones de múltiples aminoácidos. En algunos ejemplos, se intercambian regiones o dominios enteros o parciales, como cualquier región o dominio descritos en la presente memoria más abajo, con los dominios o regiones correspondientes, o porciones de los mismos, de otro polipéptido de citocromo P450. Los ejemplos de modificaciones son reemplazos de aminoácidos, incluidos reemplazos de un solo aminoácido o de múltiples aminoácidos. Por ejemplo, los polipéptidos modificado de citocromo P450 santaleno oxidasa proporcionados en la presente memoria pueden contener al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, o más, posiciones modificadas en comparación con el polipéptido de citocromo P450 santaleno oxidasa que no contiene la modificación. Por ejemplo, las modificaciones descritas en la presente memoria pueden estar en un polipéptido de citocromo P450 santaleno oxidasa que tiene una secuencia aminoacídica establecida en cualquiera de las SEC. N.° ID.:7, 74, 75, 76 y 77 o cualquier variante de las mismas, incluidos cualquiera que tenga una identidad de secuencia de al menos un 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% con un polipéptido de citocromo P450 santaleno oxidasa establecido en cualquiera de las SEC. N.° ID.:7, 74, 75, 76 o 77. Sobre la base de esta descripción, está dentro de las competencias de un experto en la materia generar un polipéptido de citocromo P450 santaleno oxidasa que contenga una cualquiera o más de las mutaciones descritas, y evaluar la actividad de cada uno en términos de la actividad de citocromo P450 santaleno oxidasa descrita en la presente memoria.

Asimismo, en algunos ejemplos, en la presente memoria se proporcionan fragmentos activos modificados de polipéptidos de citocromo P450 santaleno oxidasa, que contienen cualquiera de las modificaciones proporcionadas en la presente memoria. Dichos fragmentos conservan una o más propiedades de una citocromo P450 santaleno oxidasa. Normalmente, los polipéptidos de citocromo P450 santaleno oxidasa presentan actividad de santaleno oxidasa (es decir, la capacidad de hidrolizar santaleno y/o bergamoteno).

Las modificaciones en una citocromo P450 santaleno oxidasa también se pueden realizar en un polipéptido de citocromo P450 santaleno oxidasa que también contenga otras modificaciones, incluidas modificaciones de la secuencia primaria y modificaciones fuera de la secuencia primaria del polipéptido. Por ejemplo, la modificación descrita en la presente memoria puede estar en un polipéptido de citocromo P450 santaleno oxidasa que sea un polipéptido de fusión o un polipéptido quimérico, incluidos híbridos de distintos polipéptidos de citocromo P450 santaleno oxidasa con distintos polipéptidos de citocromo P450 (por ejemplo, contienen uno o más dominios o regiones de otros citocromos P450) y también polipéptidos sintéticos de citocromo P450 santaleno oxidasa preparados por recombinación o sintetizados o construidos mediante otros métodos conocidos en la técnica que están basados en la secuencia de polipéptidos conocidos.

En algunos ejemplos, las modificaciones son reemplazos de aminoácido. En ejemplos adicionales, los polipéptidos modificados de citocromo P450 santaleno oxidasa proporcionados en la presente memoria contienen una o más modificaciones en un dominio. Tal y como se describe en otra parte de la presente memoria, las modificaciones en un dominio o dominio estructural se pueden efectuar por reemplazo de restos heterólogos correspondientes de otro polipéptido de citocromo P450.

Para conservar la actividad de citocromo P450 santaleno oxidasa, las modificaciones normalmente no se hacen en las posiciones necesarias para que haya actividad de citocromo P450 santaleno oxidasa, es decir, en el centro catalítico o en restos conservados. Por ejemplo, generalmente no se hacen modificaciones en una posición correspondiente a la Glu367, Arg370, Gly445, Arg446, Arg447, Ile448, Cys449, Pro450 o Gly451 con respecto a una secuencia aminoacídica establecida en cualquiera de las SEC. N.° ID.:7, 74, 75, 76 o 77.

Los polipéptidos modificados de citocromo P450 santaleno oxidasa pueden contener dos o más modificaciones, incluidos reemplazos o sustituciones, inserciones o deleciones de aminoácidos, truncamientos o combinaciones de los mismos. Por lo general, un experto en la materia puede combinar las múltiples modificaciones proporcionadas en la presente memoria siempre que el polipéptido modificado de citocromo P450 santaleno oxidasa conserve actividad de citocromo P450 santaleno oxidasa.

En la presente memoria también se proporcionan moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de los polipéptidos modificados de citocromo P450 santaleno oxidasa proporcionados en la presente memoria. En ejemplos particulares, en la secuencia nucleotídica se pueden optimizar los codones, por ejemplo, para aumentar los niveles de expresión de la secuencia codificada. El uso particular de los codones depende del organismo hospedador en el que se expresa el polipéptido modificado. Un experto en la materia está familiarizado con los codones óptimos para la expresión en bacterias o levaduras, incluidas, por ejemplo, E. coli o Saccharomyces cerevisiae. Por ejemplo, la información sobre el uso de los codones está disponible en la base de datos de uso de codones en kazusa.or.jp.codon (véase una descripción de la base de datos en Richmond (2000) Genome Biology, 1:241). Véase también, Forsburg (2004) Yeast, 10:1045-1047; Brown et al. (1991) Nucleic Acids Research, 19:4298; Sharp et al. (1988) Nucleic Acids Research, 12:8207-8211; Sharp et al. (1991) Yeast, 657-78. En ejemplos de la presente memoria, en las secuencias nucleotídicas proporcionadas en la presente memoria se han optimizado los codones basándose en el uso de codones en Saccharomyces cerevisiae.

Los polipéptidos modificados y las moléculas de ácido nucleico codificantes que se proporcionan en la presente memoria se pueden producir mediante técnicas estándar de ADN recombinante conocidas por los expertos en la materia. Se puede emplear cualquier método conocido en la técnica para efectuar la mutación de uno o más aminoácidos en una proteína de interés. Los métodos incluyen mutagénesis estándar aleatoria o dirigida al sitio de moléculas de ácido nucleico codificantes, o métodos de síntesis de polipéptidos en fase sólida. Por ejemplo, según se describe en la presente memoria, las moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido de citocromo P450 santaleno oxidasa se pueden someter a mutagénesis, como mutagénesis aleatoria del ácido nucleico codificante, mediante PCR propensa a errores, mutagénesis dirigida al sitio, PCR de superposición, barajado de genes u otros métodos de recombinación. El ácido nucleico que codifica los polipéptidos se puede a continuación introducir en una célula hospedadora para ser expresado heterólogamente. Por lo tanto, en la presente memoria también se proporcionan moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de los polipéptidos modificados proporcionados en la presente memoria. En algunos ejemplos, los polipéptidos modificados de citocromo P450 santaleno oxidasa se producen mediante síntesis, como, por ejemplo, mediante síntesis de péptidos en fase sólida o en solución.

2. Polipéptidos de citocromo P450 santaleno oxidasa

En la presente memoria se proporcionan polipéptidos de citocromo P450 bergamoteno oxidasa. En la presente memoria también se proporcionan moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de los polipéptidos de citocromo P450 bergamoteno oxidasa proporcionados en la presente memoria. Los polipéptidos de citocromo P450 bergamoteno oxidasa proporcionados en la presente memoria catalizan la formación de bergamotoles a partir de bergamotenos. Normalmente, los polipéptidos de citocromo P450 bergamoteno oxidasa catalizan la formación de (Z)-a-trans-bergamotol y (E)-a-trans-bergamotol a partir de a-trans-bergamoteno (por ejemplo, los polipéptidos de citocromo P450 bergamoteno oxidasa catalizan la hidroxilación del a-trans-bergamoteno). En ejemplos concretos, los polipéptidos de citocromo P450 bergamoteno oxidasa catalizan la formación de (E)-a-trans-bergamotol a partir de a frans-bergamoteno. En algunos ejemplos, los polipéptidos de citocromo P450 bergamoteno oxidasa de manera adicional catalizan la formación de pequeñas cantidades de (E)-a-santalol y (E)-p-santalol. Los polipéptidos de citocromo P450 bergamoteno oxidasa presentan una estrecha especificidad frente al sustrato, con preferencia por el a-santaleno o el p-santaleno. En algunos ejemplos, los polipéptidos de citocromo P450 bergamoteno oxidasa también transforman el sustrato frans-nerolidol.

Por ejemplo, en la presente memoria se proporcionan polipéptidos de citocromo P450 bergamoteno oxidasa que tienen una secuencia aminoacídica establecida en cualquiera de las SEC. N.° ID.:6, 8, 9 y 73. En la presente memoria también se proporcionan polipéptidos de citocromo P450 bergamoteno oxidasa que presentan una identidad de secuencia aminoacídica de al menos un 60% con un polipéptido de citocromo P450 bergamoteno oxidasa que tiene una secuencia aminoacídica establecida en cualquiera de las SEC. N.° ID.:6, 8, 9 y 73. Por ejemplo, los polipéptidos de citocromo P450 bergamoteno oxidasa proporcionados en la presente memoria pueden presentar una identidad de secuencia aminoacídica de al menos o aproximadamente al menos un 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con un polipéptido de citocromo P450 bergamoteno oxidasa establecido en cualquiera de las SEC. N.° ID.:6, 8, 9 y 73, siempre que los polipéptidos de citocromo P450 bergamoteno oxidasa presenten actividad de citocromo P450 bergamoteno oxidasa (es decir, catalizan la formación de bergamotoles a partir de bergamotenos). La identidad porcentual la puede determinar un experto en la materia mediante programas de alineamiento estándar.

En la presente memoria se proporcionan citocromo P450 bergamoteno oxidasas, designadas como SaCYP76F38v1 (CYP76-G5), SaCYP76F37v1 (CYP76-G11), SaCYP76F38v2 (CYP76-G11) y SaCYP76F37v2 (CYP76-G14), que tienen una secuencia aminoacídica establecida en las SEC. N.° ID.:6, 8, 9 y 73, respectivamente. En la presente memoria también se proporcionan fragmentos activos de polipéptidos de citocromo P450 bergamoteno oxidasa que tienen una secuencia aminoacídica establecida en cualquiera de las SEC. N.° ID.:6, 8, 9 y 73. Dichos fragmentos conservan una o más propiedades de un polipéptido de citocromo P450 bergamoteno oxidasa. Normalmente, los fragmentos activos presentan actividad de citocromo P450 bergamoteno oxidasa (es decir, la capacidad de catalizar la hidroxilación de bergamotenos a partir de bergamotoles).

En ejemplos concretos, las citocromo P450 bergamoteno oxidasas proporcionadas en la presente memoria que tienen una secuencia aminoacídica establecida en las SEC. N.° ID.:6, 8, 9 y 73 catalizan la formación de (E)-a-fransbergamotol, (E)-a-santalol y (E)-p-santalol en ensayos in vitro con una mezcla de a-santaleno, a-frans-bergamoteno, epi-p-santaleno y p-santaleno como sustratos. En dichos ejemplos, el (E)-a-frans-bergamotol fue el producto mayoritario, y el (E)-a-santalol y (E)-p-santalol fueron los productos minoritarios (véanse el Ejemplo 11.B.3.b y las Figuras 17A-17D). En otro ejemplo, en ensayos in vitro con a-santaleno, a-frans-bergamoteno o ep/-p-santaleno y psantaleno, la citocromo P450 bergamoteno oxidasa proporcionada en la presente memoria que tiene una secuencia aminoacídica establecida en la SEC. N.° ID.:8 catalizó la formación de (E)-a-santalol, (E)-a-frans-bergamotol o (E)-psantalol, respectivamente (véanse el Ejemplo 11.C y las Figuras 20D-20F). En otros ejemplos más, las citocromo P450 bergamoteno oxidasas proporcionadas en la presente memoria que tienen una secuencia aminoacídica establecida en las SEC. N.° ID.:6, 8, 9 y 73 catalizó la formación de (E)-a-frans-bergamotol en ensayos in vivo en levadura que expresaba santaleno sintasa (véanse el Ejemplo 10.C.2 y las Figuras 14A-14D). Las propiedades cinéticas del polipéptido SaCYP76F37v1 (SaCYP76-G11) con a- y p-santaleno como sustratos se describen en el Ejemplo 12 más abajo.

En la presente memoria también se proporcionan moléculas de ácido nucleico que tienen una secuencia aminoacídica establecida en cualquiera de las SEC. N.° ID.:2, 4, 5 y 67, o degeneraciones de las mismas, que codifican un polipéptido de citocromo P450 bergamoteno oxidasa que tiene una secuencia aminoacídica establecida en las SEC. N.° ID.:6, 8, 9 y 73, respectivamente. En la presente memoria también se proporcionan moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido de citocromo P450 bergamoteno oxidasa que tiene una identidad de secuencia de al menos un 85% con una secuencia nucleotídica establecida en cualquiera de las SEC. N.° ID.:2, 4, 5 y 67. Por ejemplo, las moléculas de ácido nucleico proporcionadas en la presente memoria pueden presentar una identidad de secuencia de al menos o aproximadamente al menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 95%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99%, o más, con una secuencia nucleotídica establecida en cualquiera de las SEC. N.° ID.:2, 4, 5 y 67, siempre que el polipéptido codificado de citocromo P450 bergamoteno oxidasa presente actividad de citocromo P450 bergamoteno oxidasa (es decir, la capacidad de catalizar la formación de bergamotoles a partir de bergamoteno). En la presente memoria también se proporcionan secuencias degeneradas de la secuencia establecida en cualquiera de las SEC. N.° ID.:2, 4, 5 y 67 que codifican un polipéptido de citocromo P450 bergamoteno oxidasa que tiene una secuencia aminoacídica establecida en las SEC. N.° ID.:6, 8, 9 y 73, respectivamente. La identidad porcentual la puede determinar un experto en la materia mediante programas de alineamiento estándar.

En algunos ejemplos, las moléculas de ácido nucleico que codifican los polipéptidos de citocromo P450 bergamoteno oxidasa se aíslan del árbol de sándalo (Sanfalum album). En otros ejemplos, las moléculas de ácido nucleico y los polipéptidos codificados de citocromo P450 bergamoteno oxidasa son variantes de los aislados del árbol de sándalo (Sanfalum album).

Polipéptidos modificados de citocromo P450 bergamoteno oxidasa

En la presente memoria se proporcionan polipéptidos modificados de citocromo P450 bergamoteno oxidasa. Las

modificaciones, que normalmente son inserciones, deleciones y/o sustituciones de aminoácidos, se pueden efectuar

en cualquier región de un polipéptido de citocromo P450 bergamoteno oxidasa siempre que los polipéptidos

modificados de citocromo P450 bergamoteno oxidasa resultantes como mínimo conserven la actividad de citocromo

P450 bergamoteno oxidasa. Por ejemplo, las modificaciones se pueden hacer en cualquier región de una citocromo

P450 bergamoteno oxidasa siempre que la citocromo P450 bergamoteno oxidasa modificada resultante como mínimo

conserve actividad de citocromo P450 bergamoteno oxidasa (es decir, la capacidad de catalizar la formación de un

bergamotol a partir de un bergamoteno).

Las modificaciones pueden ser de un solo aminoácido, como reemplazos (sustituciones), inserciones o deleciones de

un solo aminoácido, o modificaciones de múltiples aminoácidos, como reemplazos, inserciones o deleciones de

múltiples aminoácidos. En algunos ejemplos, se intercambian regiones o dominios enteros o parciales, como cualquier

región o dominio descritos en la presente memoria más abajo, con los dominios o regiones correspondientes, o

porciones de los mismos, de otro polipéptido de citocromo P450 bergamoteno oxidasa. Los ejemplos de

modificaciones son reemplazos de aminoácidos, incluidos reemplazos de un solo aminoácido o de múltiples

aminoácidos. Por ejemplo, los polipéptidos modificados de citocromo P450 bergamoteno oxidasa proporcionados en

la presente memoria pueden contener al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40

46, 47, 48, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 84, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, o más, posiciones modificadas en comparación con el polipéptido de citocromo

P450 que no contiene la modificación. Por ejemplo, la modificaciones descritas en la presente memoria pueden estar

en un polipéptido de citocromo P450 bergamoteno oxidasa que tiene una secuencia aminoacídica establecida en

cualquiera de las SEC. N.° ID.:6, 8, 9 o 73 o cualquier variante de las mismas, incluidos cualquiera que tenga una

identidad de secuencia de al menos un 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%,

97%, 98%, o 99% con un polipéptido de citocromo P450 bergamoteno oxidasa establecido en cualquiera de las SEC.

N.° ID.:6, 8, 9 y 73. Sobre la base de esta descripción, está dentro de las competencias de un experto en la materia

generar un polipéptido de citocromo P450 bergamoteno oxidasa que contenga una cualquiera o más de las mutaciones

descritas, y evaluar la actividad de cada uno en términos de la actividad de citocromo P450 bergamoteno oxidasa

descrita en la presente memoria.

Asimismo, en algunos ejemplos, en la presente memoria se proporcionan fragmentos activos modificados de

polipéptidos de citocromo P450 bergamoteno oxidasa, que contienen cualquiera de las modificaciones proporcionadas

en la presente memoria. Dichos fragmentos conservan una o más propiedades de una citocromo P450 bergamoteno

oxidasa. Normalmente, los polipéptidos modificados de citocromo P450 bergamoteno oxidasa presentan actividad de

bergamoteno oxidasa (es decir, la capacidad de hidrolizar el bergamoteno).

Las modificaciones en un polipéptido de citocromo P450 bergamoteno oxidasa que también contiene otras

modificaciones, incluidas modificaciones de la secuencia primaria y modificaciones fuera de la secuencia primaria del

polipéptido. Por ejemplo, las modificaciones descritas en la presente memoria pueden estar en un polipéptido de

citocromo P450 bergamoteno oxidasa que sea un polipéptido de fusión o un polipéptido quimérico, incluidos híbridos

de distintos polipéptidos de citocromo P450 bergamoteno oxidasa con distintos polipéptidos de citocromo P450 (por

ejemplo, contienen uno o más dominios o regiones de otros citocromos P450) y también polipéptidos sintéticos de

citocromo P450 bergamoteno oxidasa preparados por recombinación o sintetizados o construidos mediante otros

métodos conocidos en la técnica que están basados en la secuencia de polipéptidos conocidos.

En algunos ejemplos, las modificaciones son reemplazos de aminoácidos. En ejemplos adicionales, los polipéptidos

modificados de citocromo P450 bergamoteno oxidasa proporcionados en la presente memoria contienen una o más

modificaciones en un dominio. Tal y como se describe en otra parte de la presente memoria, las modificaciones en un

dominio o dominio estructural se pueden efectuar por reemplazo de restos heterólogos correspondientes de otro

polipéptido de citocromo P450.

Para conservar la actividad de citocromo P450 bergamoteno oxidasa, las modificaciones normalmente no se hacen

en las posiciones necesarias para que haya actividad de citocromo P450, es decir, en el centro catalítico o en restos

conservados. Por ejemplo, generalmente no se hacen modificaciones en una posición correspondiente a la Glu367,

Arg370, Gly445, Arg446, Arg447, Ile448, Cys449, Pro450 o Gly451 con respecto a una secuencia aminoacídica

establecida en las SEC. N.° ID.:6, 8, 9 o 73.

Los polipéptidos modificados de citocromo P450 bergamoteno oxidasa pueden contener dos o más modificaciones,

incluidos reemplazos o sustituciones, inserciones o deleciones de aminoácidos, truncamientos o combinaciones de

los mismos. Por lo general, un experto en la materia puede combinar las múltiples modificaciones proporcionadas en

la presente memoria siempre que el polipéptido modificado de citocromo P450 bergamoteno oxidasa conserve

actividad de citocromo P450 bergamoteno oxidasa.

En la presente memoria también se proporcionan moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de los polipéptidos modificados de citocromo P450 bergamoteno oxidasa proporcionados en la presente memoria. En ejemplos particulares, en la secuencia nucleotídica se pueden optimizar los codones, por ejemplo, para aumentar los niveles de expresión de la secuencia codificada. El uso particular de los codones depende del organismo hospedador en el que se expresa el polipéptido modificado. Un experto en la materia está familiarizado con los codones óptimos para la expresión en bacterias o levaduras, incluidas, por ejemplo, E. coli o Saccharomyces cerevisiae. Por ejemplo, la información sobre el uso de los codones está disponible en la base de datos de uso de codones en kazusa.or.jp.codon (véase una descripción de la base de datos en Richmond (2000) Genome Biology, 1:241). Véase también, Forsburg (2004) Yeast, 10:1045-1047; Brown et al. (1991) Nucleic Acids Research, 19:4298; Sharp et al. (1988) Nucleic Acids Research, 12:8207-8211; Sharp et al. (1991) Yeast, 657-78. En ejemplos de la presente memoria, en las secuencias nucleotídicas proporcionadas en la presente memoria se han optimizado los codones basándose en el uso de codones en Saccharomyces cerevisiae.

Los polipéptidos modificados y las moléculas de ácido nucleico codificantes que se proporcionan en la presente memoria se pueden producir mediante técnicas estándar de ADN recombinante conocidas por los expertos en la materia. Se puede emplear cualquier método conocido en la técnica para efectuar la mutación de uno o más aminoácidos en una proteína de interés. Los métodos incluyen mutagénesis estándar aleatoria o dirigida al sitio de moléculas de ácido nucleico codificantes, o métodos de síntesis de polipéptidos en fase sólida. Por ejemplo, según se describe en la presente memoria, las moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido de citocromo P450 bergamoteno oxidasa se pueden someter a mutagénesis, como mutagénesis aleatoria del ácido nucleico codificante, mediante PCR propensa a errores, mutagénesis dirigida al sitio, PCR de superposición, barajado de genes u otros métodos de recombinación. El ácido nucleico que codifica los polipéptidos se puede a continuación introducir en una célula hospedadora para ser expresado heterólogamente. Por lo tanto, en la presente memoria también se proporcionan moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de los polipéptidos modificados proporcionados en la presente memoria. En algunos ejemplos, los polipéptidos modificados de citocromo P450 bergamoteno oxidasa se producen mediante síntesis, como, por ejemplo, mediante síntesis de péptidos en fase sólida o en solución.

3. Modificaciones adicionales

En la presente memoria se proporcionan polipéptidos de citocromo P450, incluidos polipéptidos de citocromo P450 santaleno oxidasa y citocromo P450 bergamoteno oxidasa, que contienen modificaciones adicionales. Por ejemplo, entre los polipéptidos modificados de citocromo P450 se incluyen, por ejemplo, polipéptidos truncados de citocromo P450, polipéptidos de citocromo P450 que tienen actividades o propiedades alteradas, polipéptidos quiméricos de citocromo p450, polipéptidos de citocromo P450 que contienen intercambios de dominio, proteínas de fusión de citocromo P450, o polipéptidos de citocromo P450 que tienen cualquier modificación descrita en otra parte de la presente memoria.

a. Polipéptidos truncados

En la presente memoria también se proporcionan polipéptidos de citocromo P450 truncados. Los polipéptidos truncados de citocromo P450 pueden estar truncados en el extremo aminoterminal o en el extremo carboxiterminal, siempre que los polipéptidos truncados de citocromo P450 conserven la actividad catalítica de un citocromo P450, como actividad de citocromo P450 santaleno oxidasa o de citocromo P450 bergamoteno oxidasa. Normalmente, los polipéptidos truncados de citocromo P450 santaleno oxidasa presentan actividad de santaleno oxidasa (es decir, la capacidad de catalizar la hidroxilación de un santaleno, en concreto, a-santaleno, p-santaleno o epi-p-santaleno). Normalmente, los polipéptidos truncados de citocromo P450 bergamoteno oxidasa presentan actividad de bergamoteno oxidasa (es decir, la capacidad de catalizar la hidroxilación de un bergamoteno). En algunos ejemplos, los polipéptidos de citocromo P450, incluidos los polipéptidos de citocromo P450 santaleno oxidasa y citocromo P450 bergamoteno oxidasa, están truncados en el extremo carboxiterminal. En otros ejemplos, los polipéptidos de citocromo P450, incluidos los polipéptidos de citocromo P450 santaleno oxidasa y citocromo P450 bergamoteno oxidasa, están truncados en el extremo aminoterminal.

En algunos ejemplos, los polipéptidos de citocromo P450, incluidos los polipéptidos de citocromo P450 santaleno oxidasa y citocromo P450 bergamoteno oxidasa, están truncados en el extremo aminoterminal, extremo carboxiterminal o ambos extremos de un polipéptido de citocromo P450 proporcionados en la presente memoria, como el truncamiento de una secuencia aminoacídica establecida en cualquiera de las SEC. N.° ID.:6-9. En otros ejemplos, cualquiera de los polipéptidos modificados de citocromo P450 proporcionados en la presente memoria están truncados. Los polipéptidos modificados de citocromo P450 pueden estar truncados en el extremo aminoterminal, en el extremo carboxiterminal o en ambos extremos. Por ejemplo, cualquier polipéptido de citocromo P450 proporcionado en la presente memoria puede estar truncado en o alrededor de o al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 1920, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, o más, restos aminoacídicos en el extremo aminoterminal, siempre que el polipéptido de citocromo P450 conserve la actividad de citocromo P450. En otros ejemplos, cualquier polipéptido de citocromo P450 proporcionado en la presente memoria puede estar truncado en o alrededor de o al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, o más, restos aminoacídicos en el extremo carboxiterminal, siempre que el polipéptido de citocromo P450 conserve la actividad de citocromo P450.

b. Polipéptidos con actividades o propiedades alteradas

Los polipéptidos modificados de citocromo P450 proporcionados en la presente memoria también pueden presentar cambios en las actividades y/o propiedades. Los polipéptidos modificados de citocromo P450 pueden presentar, por ejemplo, propiedades mejoradas, como una mayor actividad catalítica, una mayor selectividad, una mayor especificidad frente al sustrato, una mayor afinidad por el sustrato, una mayor estabilidad y/o un mayor nivel de expresión en una célula hospedadora, y propiedades alteradas, como una distribución alterada de los productos y una especificidad alterada frente al sustrato. Dichas actividades mejoradas o alteradas pueden dar lugar a una mayor producción de santaloles y/o bergamotoles.

En algunos ejemplos, los polipéptidos modificados de citocromo P450 presentan una especificidad alterada frente al sustrato. Por ejemplo, la especificidad frente al sustrato de un polipéptido modificado de citocromo P450 se puede alterar en al menos o aproximadamente al menos un 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, o más, en comparación con el polipéptido de citocromo P450 que no está modificado. Por ejemplo, un polipéptido modificado de citocromo P450 santaleno oxidasa o citocromo P450 bergamoteno oxidasa puede catalizar la monooxigenación de un sustrato terpénico que no sea un santaleno o bergamoteno. En dichos ejemplos, los polipéptidos modificados de citocromo P450 catalizan la formación de terpenoides que no son santaloles ni bergamotoles a partir de cualquier sustrato terpénico adecuado. Por ejemplo, los polipéptidos modificados de citocromo P450 pueden producir uno o más monoterpenoides, sesquiterpenoides o diterpenoides distintos que no sean santaloles ni bergamotoles.

En algunos ejemplos, los polipéptidos modificados de citocromo P450 dan lugar a una distribución alterada de los productos terpenoídicos. En algunos ejemplos, la distribución alterada de los productos se traduce en una mayor cantidad de un producto terpenoídico deseado, por lo que la distribución de los productos ha mejorado en comparación con la distribución de los productos del citocromo p450 que no está modificado. En otros ejemplos, la distribución alterada de los productos se traduce en una menor cantidad de un producto terpenoídico deseado, por lo que la distribución de los productos del citocromo P450 modificado es peor en comparación con la del citocromo P450 que no está modificado. En un ejemplo, la citocromo P450 santaleno oxidasa modificada produce una proporción distinta de productos terpenoídicos en comparación con la citocromo P450 santaleno oxidasa que no está modificada. Por ejemplo, la cantidad producida de un terpenoide por el citocromo P450 modificado puede aumentar o disminuir en al menos o aproximadamente al menos un 0,5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, o más, en comparación con la cantidad producida de un terpenoide distinto por el citocromo P450 que no está modificado. Por ejemplo, la cantidad producida de un terpenoide, como, por ejemplo, un p-santalol, por la citocromo P450 santaleno oxidasa modificada puede aumentar en al menos o aproximadamente al menos un 0,5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, o más, en comparación con la cantidad producida de un terpenoide distinto, como, por ejemplo, un a-santalol, por la citocromo P450 santaleno oxidasa que no está modificada. En algunos ejemplos, las citocromo P450 santaleno oxidasas modificadas producen más p-santalol que cualquier otro compuesto terpenoídico. En otro ejemplo, la citocromo P450 bergamoteno oxidasa modificada produce una proporción distinta de productos terpenoídicos en comparación con la citocromo P450 bergamoteno oxidasa que no está modificada. Por ejemplo, la cantidad producida de un terpenoide, como, por ejemplo, un a-frans-bergamotol, por la citocromo P450 bergamoteno oxidasa modificada puede aumentar en al menos o aproximadamente al menos un 0,5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, o más, en comparación con la cantidad producida de un terpenoide distinto por la citocromo P450 bergamoteno oxidasa que no está modificada.

En algunos ejemplos, el polipéptido modificado de citocromo P450 presenta una actividad similar, aumentada y/o mejorada en comparación con el polipéptido de citocromo P450 que no está modificado. Por ejemplo, un polipéptido modificado de citocromo P450 presenta una mayor producción de terpenoides en comparación con un polipéptido de citocromo P450 que no está modificado. Esta mayor producción de terpenoides puede ser un aumento en la cantidad total producida de terpenoides por el polipéptido modificado de citocromo P450 o puede ser un aumento en la cantidad producida de un terpenoide concreto por el polipéptido modificado de citocromo P450. Por ejemplo, la producción total de terpenoides de un polipéptido modificado de citocromo P450 puede aumentar en al menos o aproximadamente al menos un 1%, 3%, 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, o más, en comparación con un polipéptido de citocromo P450 que no está modificado. En algunos ejemplos, la producción de terpenoides totales de un polipéptido modificado de citocromo P450 es al menos o aproximadamente 1,2 veces, 1,5 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces, 10 veces, 11 veces, 12 veces, 13 veces, 14 veces, 15 veces, 16 veces, 17 veces, 18 veces, 19 veces, 20 veces o más la de un polipéptido de citocromo P450 que no está modificado. En otro ejemplo, la producción de un terpenoide concreto por un polipéptido modificado de citocromo P450 ha aumentado en al menos o aproximadamente al menos un 1%, 3%, 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, o más, en comparación con un polipéptido de citocromo P450 que no está modificado. En algunos ejemplos, un polipéptido modificado de citocromo P450 produce al menos o aproximadamente 1,2 veces, 1,5 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces, 10 veces, 11 veces, 12 veces, 13 veces, 14 veces, 15 veces, 16 veces, 17 veces, 18 veces, 19 veces, 20 veces o más de un terpenoide concreto en comparación con un polipéptido de citocromo P450 que no está modificado.

En algunos ejemplos, el polipéptido modificado de citocromo P450 presenta una mejor especificidad frente al sustrato en comparación con el polipéptido de citocromo P450 que no está modificado. La especificidad frente al sustrato de un polipéptido modificado de citocromo P450 puede aumentar en al menos o aproximadamente al menos un 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, o más, en comparación con la especificidad frente al sustrato del polipéptido de citocromo P450 que no está modificado. Por ejemplo, el polipéptido modificado de citocromo P450 puede presentar una mayor especificidad frente al sustrato terpénico, como un santaleno, en comparación con un terpeno distinto, como un bergamoteno. En dichos ejemplos, la mayor especificidad frente a un santaleno se traduce en una mayor producción de santaloles y una menor producción de un bergamotol.

En algunos ejemplos, el polipéptido modificado de citocromo P450, como un polipéptido modificado de citocromo P450 santaleno oxidasa, presenta una actividad de santaleno oxidasa similar o aumentada o mejorada en comparación con el polipéptido de citocromo P450 santaleno oxidasa que no está modificado. Por ejemplo, el polipéptido modificado de citocromo P450 santaleno oxidasa puede presentar una especificidad o selectividad aumentada en la oxidación del asantaleno, p-santaleno y/o ep/-p-santaleno en comparación con el polipéptido de citocromo P450 santaleno oxidasa que no está modificado. En algunos casos de dichos ejemplos, la citocromo P450 santaleno oxidasa modificada monooxigena de manera selectiva el p-santaleno en comparación con la citocromo P450 santaleno oxidasa que no está modificada. En otros ejemplos, el polipéptido modificado de citocromo P450 santaleno oxidasa presenta una menor selectividad en la oxidación del bergamoteno en comparación con la citocromo P450 santaleno oxidasa que no está modificada. Por ejemplo, la citocromo P450 santaleno oxidasa modificada presenta una menor actividad en la oxidación del bergamoteno de al menos o aproximadamente al menos un 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, o más, en comparación con la citocromo P450 santaleno oxidasa que no está modificada.

En algunos ejemplos, el polipéptido modificado de citocromo P450, como un polipéptido modificado de citocromo P450 bergamoteno oxidasa, presenta una actividad de bergamoteno oxidasa similar o aumentada o mejorada en comparación con el polipéptido de citocromo P450 bergamoteno oxidasa que no está modificado. Por ejemplo, el polipéptido modificado de citocromo P450 bergamoteno oxidasa puede presentar una especificidad o selectividad aumentadas en la oxidación del a-frans-bergamoteno en comparación con la citocromo P450 bergamoteno oxidasa que no está modificada.

c. Intercambios de dominios

En la presente memoria se proporcionan polipéptidos modificados de citocromo P450 que son polipéptidos quiméricos que contienen un intercambio (deleción e inserción) por deleción de restos aminoacídicos de uno o más dominios o regiones en los mismos, o porciones de los mismos, e inserción de una secuencia heteróloga de aminoácidos. En algunos ejemplos, la secuencia heteróloga es una secuencia aleatorizada de aminoácidos. En otros ejemplos, la secuencia heteróloga es una secuencia aminoacídica contigua para el dominio o región correspondientes, o una porción de los mismos, de otro citocromo P450. La secuencia heteróloga que se reemplaza o introduce por lo general incluye al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 o más aminoácidos. En ejemplos en los que la secuencia heteróloga es de un dominio correspondiente, o una porción del mismo, de otro citocromo P450, la secuencia heteróloga por lo general incluye al menos un 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o más aminoácidos contiguos del dominio o región o porción correspondientes. En dicho ejemplo, los restos adyacentes al dominio o región correspondientes heterólogos, o una porción de los mismos, también se pueden incluir en un polipéptido modificado de citocromo P450 que se proporciona en la presente memoria.

En un ejemplo de mutantes por intercambio proporcionado en la presente memoria, al menos un dominio o región, o una porción de los mismos, de un polipéptido de citocromo P450 está reemplazado por una secuencia aminoacídica contigua para el dominio o región correspondientes, o porciones de los mismos, de otro polipéptido de citocromo P450. En algunos ejemplos, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más dominios o regiones, o porciones de los mismos, se reemplazan con una secuencia aminoacídica contigua para el dominio o región correspondientes, o porciones de los mismos, de otro polipéptido de citocromo P450.

Cualquier dominio o región, o una porción de los mismos, de un polipéptido de citocromo P450 se puede reemplazar con una secuencia aminoacídica heteróloga, como una secuencia heteróloga del dominio o región correspondientes de otro citocromo P450. Un dominio o región puede ser un dominio estructural o un dominio funcional. Un experto en la materia está familiarizado con los dominios o regiones en los citocromos P450. Los dominios funcionales incluyen, por ejemplo, el dominio catalítico o una porción del mismo. Un dominio estructural puede incluir la totalidad o una porción de hélice A, hebra p 1-1, hebra p 1-2, hélice B, hebra p 1-5, hélice B', hélice C, hélice C', hélice D, hebra p 3 1, hélice E, hélice F, hélice G, hélice H, hebra p 5-1, hebra p 5-2, hélice I, hélice J, hélice J', hélice K, hebra p 1-4, hebra p 2-1, hebra p 2-2, hebra p 1-3, hélice K', hélice K'', dominio hemo, hélice L, hebra p 3-3, hebra p 4-1, hebra p 4-2 y hebra p 3-2. Un experto en la materia está familiarizado con varios citocromos p450 y puede identificar los dominios o regiones correspondientes, o porciones de aminoácidos de los mismos.

Normalmente, los polipéptidos modificados de citocromo P450 resultantes presentan actividad de citocromo P450 monooxigenasa y la capacidad de producir santaloles y/o bergamotoles a partir de santalenos y bergamotenos. Por ejemplo, los polipéptidos modificados de citocromo P450 santaleno oxidasa presentan una producción de santalol a partir de santaleno de un 50% a un 5000%, como de un 50% a un 120%, de un 100% a un 500% o de un 110% a un 250% en comparación con la citocromo P450 santaleno oxidasa que no contienen la modificación (por ejemplo, el reemplazo de aminoácidos o el intercambio de restos aminoacídicos de un dominio o región) y/o en comparación con la citocromo P450 santaleno oxidasa sin mutaciones establecida en las SEC. N.° ID.:7, 74, 75, 76 o 77. Normalmente, los polipéptidos modificados de citocromo P450 santaleno oxidasa presentan una mayor producción de santalol a partir de santaleno en comparación con la citocromo P450 santaleno oxidasa que no contiene la modificación, como en comparación con la citocromo P450 santaleno oxidasa establecida en las SEC. N.° ID.:7, 74, 75, 76 o 77. Por ejemplo, los polipéptidos modificados de citocromo P450 santaleno oxidasa pueden producir santaloles a partir de santalenos en una cantidad de al menos o de aproximadamente de 101%, 102%, 103%, 104%, 105%, 106%, 107%, 108%, 109%, 110%, 115%, 120%, 125%, 130%, 135%, 140%, 145%, 150%, 160%, 170%, 180%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 500%, 1500%, 2000%, 3000%, 4000%, 5000% de la cantidad producida de santaloles a partir de santalenos por la citocromo P450 santaleno oxidasa sintasa sin mutaciones que no contiene la modificación en las mismas condiciones. Por ejemplo, la producción de santalol aumenta en al menos 1,2 veces, 1,5 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces, 10 veces, 11 veces, 12 veces, 13 veces, 14 veces, 15 veces, 16 veces, 17 veces, 18 veces, 19 veces, 20 veces o más.

En otro ejemplo, los polipéptidos modificados de citocromo P450 bergamoteno oxidasa presentan una producción de bergamotol a partir de bergamoteno de un 50% a un 5000%, como de un 50% a un 120%, de un 100% a un 500% o de un 110% a un 250% en comparación con la citocromo P450 bergamoteno oxidasa que no contiene la modificación (por ejemplo, el reemplazo de aminoácidos o el intercambio de restos aminoacídicos de un dominio o región) y/o en comparación con la citocromo P450 bergamoteno oxidasa sin mutaciones establecida en las SEC. N.° ID.:6, 8, 9 o 73. Normalmente, los polipéptidos modificados de citocromo P450 bergamoteno oxidasa presentan una mayor producción de bergamotol a partir de bergamoteno en comparación con la citocromo P450 bergamoteno oxidasa que no contiene la modificación, como en comparación con la citocromo P450 bergamoteno oxidasa establecida en las SEC. N.° ID.:6, 8, 9 o 73. Por ejemplo, los polipéptidos modificado de citocromo P450 bergamoteno oxidasa pueden producir bergamotol a partir de bergamoteno en una cantidad de al menos o de aproximadamente un 101%, 102%, 103%, 104%, 105%, 106%, 107%, 108%, 109%, 110%, 115%, 120%, 125%, 130%, 135%, 140%, 145%, 150%, 160%, 170%, 180%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 500%, 1500%, 2000%, 3000%, 4000%, 5000% de la cantidad producida de bergamotol a partir de bergamoteno por la citocromo P450 bergamoteno oxidasa sintasa sin mutaciones que no contiene la modificación en las mismas condiciones. Por ejemplo, la producción de bergamotol aumenta en al menos 1,2 veces, 1,5 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces, 10 veces, 11 veces, 12 veces, 13 veces, 14 veces, 15 veces, 16 veces, 17 veces, 18 veces, 19 veces, 20 veces o más.

En ejemplos concretos de la presente memoria, los polipéptidos modificados de citocromo P450 proporcionados en la presente memoria son mutantes por intercambio de manera que la totalidad o una porción de uno o más dominios estructurales se reemplaza con un dominio estructural correspondiente de otro polipéptido de citocromo P450. En la Tabla 3 más abajo se identifican dominios estructurales de la citocromo P450 santaleno oxidasa (SEC. N.° ID.:7) y la citocromo P450 bergamoteno oxidasa (SEC. N.° ID.:6) sobre la base de un alineamiento de los polipéptidos de citocromo P450 con el citocromo P450BM-3, un P450 de microsomas de clase II (SEC. N.° ID.:66; núm. de acceso 2HPD; Ravichandran et al. (1993) Science 261:731-736; véanse también las Figuras 5A-5B). Por lo tanto, el dominio correspondiente se puede identificar en otros polipéptidos de citocromo P450.

Para reemplazar la totalidad o una porción contigua de un dominio o un citocromo P450 con la totalidad o una porción contigua del dominio correspondiente de un segundo citocromo P450 (véanse las patentes de EE. UU. n.° 5.824.774, 6.072.045, 7.186.891 y 8.106.260, y la patente publicada de EE.UU. n^ 20110081703) se puede utilizar cualquier método conocido en la técnica para generar polipéptidos quiméricos. Además, se pueden emplear métodos de barajado de genes para generar polipéptidos quiméricos y/o polipéptidos con intercambios de dominios o regiones.

Por ejemplo, los dominios o regiones correspondientes de dos citocromos P450 cualquiera se pueden intercambiar mediante cualquier método recombinante adecuado conocido en la técnica, o mediante síntesis in vitro. Un ejemplo de método recombinante es un método de PCR de superposición de dos etapas, como el descrito en la presente memoria. En dichos métodos, se pueden emplear cebadores que introducen mutaciones en una pluralidad de posiciones de codones en los ácidos nucleicos que codifican el dominio de interés, o una porción del mismo, en el primer citocromo P450. Las mutaciones juntas forman la región heteróloga (es decir, la región correspondiente del segundo citocromo P450). Como otra posibilidad, por ejemplo, se pueden utilizar aminoácidos aleatorizados para reemplazar dominios o regiones concretas. Se entiende que los errores en el cebador, los errores de PCR y/u otros errores en los métodos de clonación o recombinación pueden dar lugar a errores tales que la región o el dominio intercambiados o reemplazados resultantes no presenten una secuencia aminoacídica que sea idéntica a la región correspondiente de la segunda citocromo P450 reductasa.

En un ejemplo de método con PCR, en la primera etapa de la PCR se utiliza (i) un cebador en dirección 3' que se hibrida en dirección 3' de la región que se está reemplazando con un cebador mutágeno que incluye aproximadamente quince nucleótidos (o un número efectivo para efectuar la hibridación, como 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 20, 25 nucleótidos o más) de secuencia homóloga a cada lado del dominio o región a intercambiar o aleatorizar que flanquean la región que se ha de importar al gen de interés, y (ii) un cebador en dirección 5' que se hibrida en dirección 5' de la región que se está reemplazando junto con un cebador mutágeno de la hebra opuesta que también incluye aproximadamente quince nucleótidos (o un número efectivo para efectuar la hibridación, como 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 20, 25 nucleótidos o más) de secuencia homóloga a cada lado del dominio o región a intercambiar o aleatorizar que flanquean la región a importar al gen de interés. Si se realiza un reemplazo en el que un dominio o región de un primer gen del citocromo P450 se reemplaza con el dominio o región correspondiente de un segundo citocromo P450, los nucleótidos en los cebadores mutágenos que hay entre las regiones que flanquean el primer citocromo P450 contienen codones para la región correspondiente del segundo citocromo P450. En los casos en que los aminoácidos de un dominio o región se vayan a aleatorizar, los nucleótidos de los cebadores mutágenos que hay entre las regiones que flanquean el primer citocromo P450 contienen nucleótidos aleatorios. A continuación, se realiza una PCR de superposición para unir los dos fragmentos, utilizando el oligonucleótido en dirección 5' y dirección 3'. El producto resultante de la PCR se puede a continuación clonar en cualquier vector adecuado para la expresión del citocromo P450 modificado.

Además, cualquiera de los polipéptidos modificados de citocromo P450 que contengan mutaciones por intercambio en la presente memoria pueden contener uno o más reemplazos de aminoácidos adicionales, según se describe más arriba en la presente memoria.

d. Variantes adicionales

Los polipéptidos de citocromo P450 proporcionados en la presente memoria se pueden modificar mediante cualquier método conocido por un experto en la materia para generar variantes de proteínas, incluidos, entre otros, el barajado de ADN o genes, la PCR propensa a errores, la PCR de superposición u otros métodos de recombinación. En un ejemplo, las moléculas de ácido nucleico que codifican cualquier polipéptido de citocromo P450 o polipéptido de citocromo P450 variante proporcionados en la presente memoria se pueden modificar mediante barajado de genes.

El barajado de genes conlleva uno o más ciclos de fragmentación aleatoria y reensamblaje de al menos dos secuencias nucleotídicas, seguido de un cribado para seleccionar las secuencias nucleotídicas que codifican polipéptidos con las propiedades deseadas. La recombinación se puede realizar in vitro (véase Stemmer et al. (1994) Proc Natl Acad Sci USA 91:10747-10751; Stemmer et al. (1994) Nature 370:389-391; Cramieri et al. (1998) Nature 391:288-291; patente de EE. UU. n.° 5.605.793, 5.811.238, 5.830.721, 5.834.252 y 5.837.458) o in vivo (véase la publicación de patente internacional n^ WO199707205). Las moléculas de ácido nucleico que codifican los polipéptidos se pueden a continuación introducir en una célula hospedadora para ser expresadas heterólogamente y evaluar su actividad de citocromo P450 mediante cualquier método descrito en el apartado G más abajo.

e. Proteínas quiméricas o de fusión

Entre las moléculas de ácido nucleico proporcionadas en la presente memoria se incluyen moléculas de ácido nucleico quiméricas o de fusión que contienen una santaleno sintasa y un polipéptido de citocromo P450. Por ejemplo, en la presente memoria se proporcionan moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido de fusión que tiene la capacidad de catalizar la formación de un santalol, como un a-santalol, p-santalol o epi-p-santalol, a partir de FPP que contiene cualquier santaleno sintasa y polipéptido de citocromo P450 santaleno oxidasa proporcionados en la presente memoria. Por ejemplo, en la presente memoria se proporcionan moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido de fusión que contiene una santaleno sintasa establecida en cualquiera de las SEC. N.° Id .:17, 52 o 53 y un polipéptido de citocromo P450 santaleno oxidasa establecido en las SEC. N.° ID.:7, 74, 75, 76 o 77. En la presente memoria también se proporcionan polipéptidos de fusión que contienen una santaleno sintasa establecida en cualquiera de las SEC. N.° ID.:17, 52 o 53 y un polipéptido de citocromo P450 santaleno oxidasa establecido en las SEC. N.° ID.:7, 74, 75, 76 o 77. En la presente memoria también se proporcionan moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido de fusión que tiene la capacidad de catalizar la formación de un bergamotol, como un a-trans-bergamotol, a partir de FPP que contiene cualquier polipéptido de santaleno sintasa y citocromo P450 santaleno bergamoteno proporcionado en la presente memoria. Por ejemplo, en la presente memoria se proporcionan moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido de fusión que contiene una santaleno sintasa establecida en cualquiera de las SEC. N.° ID.:17, 52 o 53 y un polipéptido de citocromo P450 bergamoteno oxidasa establecido en cualquiera de las SEC. N.° ID.:6, 8, 9 o 73. En la presente memoria también se proporcionan polipéptidos de fusión que contienen una santaleno sintasa establecida en cualquiera de las SEC. N.° ID.:17, 52 o 53 y un polipéptido de citocromo P450 bergamoteno oxidasa establecido en cualquiera de las SEC. N.° ID.:6, 8, 9 o 73. Los polipéptidos de fusión pueden estar conectados de manera directa o por medio de un conector.

Entre las moléculas de ácido nucleico proporcionadas en la presente memoria se incluyen moléculas de ácido nucleico quiméricas o de fusión que contienen un polipéptido de citocromo P450 y una citocromo P450 reductasa. Por ejemplo, en la presente memoria se proporcionan moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido de fusión que contiene un polipéptido de citocromo P450 santaleno oxidasa establecido en cualquiera de las SEC. N.° ID.:7, 74, 75, 76 o 77 y una citocromo P450 reductasa establecida en cualquiera de las SEC. N.° ID.:12-15. En la presente memoria también se proporcionan polipéptidos de fusión que contienen un polipéptido de citocromo P450 santaleno oxidasa establecido en cualquiera de las SEC. N.° ID.:7, 74, 75, 76 o 77 y una citocromo P450 reductasa establecida en cualquiera de las SEC. N.° ID.:12-15. En otro ejemplo, en la presente memoria se proporcionan moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido de fusión que contiene un polipéptido de citocromo P450 bergamoteno oxidasa establecido en cualquiera de las SEC. N.° ID.:6, 8, 9 o 73 y una citocromo P450 reductasa establecida en cualquiera de las SEC. N.° ID.:12-15. En la presente memoria también se proporcionan polipéptidos de fusión que contienen un polipéptido de citocromo P450 bergamoteno oxidasa establecido en cualquiera de las SEC. N.° ID.:6, 8, 9 o 73 y una citocromo P450 reductasa establecida en cualquiera de las SEC. N.° ID.:12-15. Los polipéptidos de fusión pueden estar conectados de manera directa o por medio de un conector.

Entre las moléculas de ácido nucleico proporcionadas en la presente memoria se incluyen moléculas de ácido nucleico quiméricas o de fusión que contienen una santaleno sintasa, un polipéptido de citocromo P450 y una citocromo P450 reductasa. Por ejemplo, en la presente memoria se proporcionan moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido de fusión que contiene una santaleno sintasa establecida en cualquiera de las SEC. N.° ID.:17, 52 o 53, un polipéptido de citocromo P450 santaleno oxidasa establecido en cualquiera de las SEC. N.° ID.:7, 74, 75, 76 o 77 y una citocromo P450 reductasa establecida en cualquiera de las SEC. N.° ID.:12-15. En la presente memoria también se proporcionan polipéptidos de fusión que contienen una santaleno sintasa establecida en cualquiera de las SEC. N.° ID.:17, 52 o 53, un polipéptido de citocromo P450 santaleno oxidasa establecido en cualquiera de las SEC. N.° ID.:7, 74, 75, 76 o 77 y una citocromo P450 reductasa establecida en cualquiera de las SEC. N.° ID.:12-15. En otro ejemplo, en la presente memoria se proporcionan moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido de fusión que contiene una santaleno sintasa establecida en cualquiera de las SEC. N.° ID.:17, 52 o 53, un polipéptido de citocromo P450 bergamoteno oxidasa establecido en cualquiera de las SEC. N.° ID.:6, 8, 9 o 73 y una citocromo P450 reductasa establecida en cualquiera de las SEC. N.° ID.:12-15. En la presente memoria también se proporcionan polipéptidos de fusión que contienen una santaleno sintasa establecida en cualquiera de las SEC. N.° iD.:17, 52 o 53, un polipéptido de citocromo P450 bergamoteno oxidasa establecido en cualquiera de las SEC. N.° ID.:6, 8, 9 o 73 y una citocromo P450 reductasa establecida en cualquiera de las SEC. N.° ID.:12-15. Los polipéptidos de fusión pueden estar conectados de manera directa o por medio de un conector.

En otro ejemplo, en la presente memoria se proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica una santaleno sintasa, un citocromo P450 y/o una citocromo P450 reductasa, de manera que, cuando se expresan en una célula hospedadora, una célula hospedadora bacteriana o de levadura, se expresa una santaleno sintasa, un citocromo P450 y/o una citocromo P450 reductasa. En un ejemplo, en la presente memoria se proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica una santaleno sintasa y una citocromo P450 santaleno oxidasa. En otro ejemplo, en la presente memoria se proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica una santaleno sintasa y una citocromo P450 bergamoteno oxidasa. En otro ejemplo más, en la presente memoria se proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica una santaleno sintasa, una citocromo P450 santaleno oxidasa y una citocromo P450 reductasa. En otro ejemplo, en la presente memoria se proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica una santaleno sintasa, una citocromo P450 bergamoteno oxidasa y una citocromo P450 reductasa. Además, cuando la célula hospedadora

tiene la capacidad de producir FPP, los polipéptidos codificados catalizan la producción de santaloles y/o bergamotoles.

Entre otros ejemplos de proteínas de fusión se incluyen, entre otros, fusiones de una secuencia señal, un marcaje

para localización, por ejemplo, un marcaje de His6 o un marcaje de myc, o un marcaje para purificación, por ejemplo, una fusión de GST, una fusión de GFP o una fusión de CBP, y una secuencia para dirigir la secreción de proteínas y/o la asociación con la membrana.

D. Polipéptidos de citocromo P450 reductasa y moléculas de ácido nucleico que los codifican

En la presente memoria se proporcionan polipéptidos de citocromo P450 reductasa. En la presente memoria también

se proporcionan moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de los polipéptidos de citocromo P450 reductasa proporcionados en la presente memoria. Los polipéptidos de citocromo P450 reductasa proporcionados en la presente memoria transfieren dos electrones del NADPH a un citocromo P450. En algunos ejemplos, las moléculas de ácido nucleico que codifican los polipéptidos de citocromo P450 reductasa son las mismas que las aisladas del árbol de sándalo (Santalum album). En otros ejemplos, las moléculas de ácido nucleico y los polipéptidos codificados de citocromo P450 reductasa son variantes de los aislados del árbol de sándalo (Santalum album).

En la presente memoria también se proporcionan polipéptidos de citocromo P450 reductasa modificados y moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de los polipéptidos modificados de citocromo P450 reductasa proporcionados en la presente memoria. Las modificaciones se pueden efectuar en cualquier región de un polipéptido de citocromo P450 reductasa siempre que el polipéptido de citocromo P450 reductasa como mínimo conserve la actividad catalítica de CPR del polipéptido de citocromo P450 reductasa que no está modificado. Por ejemplo, se pueden hacer modificaciones a un polipéptido de citocromo P450 reductasa siempre que el polipéptido de citocromo

P450 reductasa conserve actividad de CPR (es decir, la capacidad de transferir dos electrones del NADPH a un citocromo P450).

Las modificaciones pueden incluir la optimización de codones de los ácidos nucleicos y/o cambios que dan lugar a una modificación de un solo aminoácido en el polipéptido codificado, como reemplazos (sustituciones), inserciones o deleciones de un solo aminoácido, o modificaciones de múltiples aminoácidos, como reemplazos, inserciones o deleciones de múltiples aminoácidos, incluidos intercambios de regiones o dominios del polipéptido. En algunos ejemplos, se intercambian regiones o dominios enteros o parciales, como cualquier región o dominio descritos en la presente memoria, con los dominios o regiones correspondientes, o porciones de los mismos, de otro polipéptido de citocromo P450 reductasa. Los ejemplos de modificaciones son reemplazos de aminoácidos, incluidos reemplazos de un solo aminoácido o de múltiples aminoácidos. Por ejemplo, los polipéptidos modificados de citocromo P450 reductasa proporcionados en la presente memoria pueden contener al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 1 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 45, 46, 47, 48, 49,

50, 51, 52,

53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 7 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, o más, posiciones modificadas en comparaci con el polipéptido de citocromo P450 reductasa que no contiene la modificación.

En la presente memoria se proporcionan polipéptidos de citocromo P450 reductasa que tienen una secuencia aminoacídica establecida en las SEC. N.° ID.:12 o 13. En la presente memoria también se proporcionan polipéptidos de citocromo P450 reductasa que presentan una identidad de secuencia aminoacídica de al menos un 60% con un polipéptido de citocromo P450 reductasa establecido en las SEC. N.° ID.:12 o 13. Por ejemplo, los polipéptidos de citocromo P450 reductasa proporcionados en la presente memoria pueden presentar una identidad de secuencia aminoacídica de al menos o aproximadamente al menos un 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%,

87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con un polipéptido de citocromo P450 reductasa establecido en las SEC. N.° ID.:12 o 13, siempre que el polipéptido de citocromo P450 reductasa resultante como mínimo conserve actividad de CPR (es decir, la capacidad de transferir dos electrones del NADPH a un citocromo P450). La identidad porcentual la puede determinar un experto en la materia mediante programas de alineamiento estándar.

Asimismo, en algunos ejemplos, en la presente memoria se proporcionan fragmentos con actividad catalítica de polipéptidos de citocromo P450 reductasa. En algunos ejemplos, los fragmentos activos de polipéptidos de citocromo

P450 reductasa están modificados según se describe más arriba. Dichos fragmentos conservan una o más propiedades de un polipéptido de citocromo P450 reductasa de secuencia completa. Normalmente, los fragmentos activos presentan actividad de CPR (es decir, la capacidad de transferir dos electrones del NADPH a un citocromo P450).

Los polipéptidos de citocromo P450 reductasa proporcionados en la presente memoria pueden contener otras modificaciones, por ejemplo, modificaciones que no están en la secuencia primaria del polipéptido, incluidas modificaciones postraduccionales. Por ejemplo, la modificación descrita en la presente memoria puede ser un polipéptido de citocromo P450 reductasa que sea un polipéptido de fusión o un polipéptido quimérico, incluidos híbridos de distintos polipéptidos de citocromo P450 reductasa (por ejemplo, contienen uno o más dominios o regiones de otro polipéptido de citocromo P450 reductasa) y también polipéptidos sintéticos de citocromo P450 reductasa preparados por recombinación o sintetizados o construidos mediante otros métodos conocidos en la técnica que están basados en la secuencia de polipéptidos conocidos.

Los polipéptidos de citocromo P450 reductasa proporcionados en la presente memoria se pueden usar para transferir dos electrones del NADPH a un citocromo p450. Las reacciones se pueden realizar in vivo, como en una célula hospedadora en la que se ha introducido un ácido nucleico. Al menos uno de los polipéptidos será heterólogo para el hospedador. Las reacciones también se pueden realizar in vitro poniendo en contacto la enzima con el sustrato adecuado en condiciones adecuadas.

En la presente memoria también se proporcionan moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido de citocromo P450 y un polipéptido de citocromo P450 reductasa. Por ejemplo, en la presente memoria se proporcionan moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido de citocromo P450 santaleno oxidasa y un polipéptido de citocromo P450 reductasa. En otro ejemplo, las moléculas de ácido nucleico codifican un polipéptido de citocromo P450 bergamoteno sintasa y un polipéptido de citocromo P450 reductasa. En la presente memoria también se proporcionan moléculas de ácido nucleico que codifican una santaleno sintasa, un polipéptido de citocromo P450 y un polipéptido de citocromo P450 reductasa. Por ejemplo, en la presente memoria se proporcionan moléculas de ácido nucleico que codifican una santaleno sintasa, un polipéptido de citocromo P450 santaleno oxidasa y un polipéptido de citocromo P450 reductasa. En otro ejemplo, en la presente memoria se proporcionan moléculas de ácido nucleico que codifican una santaleno sintasa, un polipéptido de citocromo P450 bergamoteno oxidasa y un polipéptido de citocromo P450 reductasa. Las moléculas de ácido nucleico pueden estar en el mismo vector o plásmido, o en vectores o plásmidos distintos. En dichos ejemplos, la expresión de la molécula o moléculas de ácido nucleico en un hospedador adecuado, por ejemplo, una célula de levadura o bacteria, da lugar a la expresión de la citocromo P450 oxidasa y la citocromo P450 reductasa, o da lugar a la expresión de santaleno sintasa, la citocromo P450 oxidasa y la citocromo P450 reductasa, dependiendo de las moléculas de ácido nucleico incluidas. Dichas células se pueden usar para producir las santaleno sintasas, las citocromo P450 oxidasas y las citocromo P450 reductasas y/o para realizar reacciones in vivo para producir santaloles y bergamotoles. Por ejemplo, los santaloles y bergamotoles se pueden generar en una célula hospedadora a partir de farnesil difosfato (FPP), en particular una célula de levadura que sobreproduce FPP, un precursor acíclico de terpenos. En algunos ejemplos, una molécula de ácido nucleico que codifica una farnesil difosfato sintasa, como una farnesil difosfato sintasa de Santalum album, también se puede expresar en el hospedador adecuado, por ejemplo, una célula bacteriana o de levadura, lo que da lugar a la sobreexpresión de FPP.

1. Polipéptidos de citocromo P450 reductasa

En la presente memoria se proporcionan polipéptidos de citocromo P450 reductasa. En la presente memoria también se proporcionan moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de los polipéptidos de citocromo P450 reductasa proporcionados en la presente memoria. Los polipéptidos de citocromo P450 reductasa proporcionados en la presente memoria presentan actividad de CPR. Normalmente, los polipéptidos de citocromo p450 reductasa proporcionados en la presente memoria tienen la capacidad de transferir dos electrones del NADPH a un citocromo p450.

Por ejemplo, en la presente memoria se proporcionan polipéptidos de citocromo P450 reductasa que tienen una secuencia aminoacídica establecida en las s Ec . N.° ID.:12 o 13. En la presente memoria también se proporcionan polipéptidos de citocromo P450 reductasa que presentan una identidad de secuencia aminoacídica de al menos un 60% con un polipéptido de citocromo P450 reductasa que tiene una secuencia aminoacídica establecida en las SEC. N.° ID.:12 o 13. Por ejemplo, los polipéptidos de citocromo P450 reductasa proporcionados en la presente memoria pueden presentar una identidad de secuencia aminoacídica de al menos o aproximadamente al menos un 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99%, o más, con un polipéptido de citocromo P450 reductasa establecido en las SEC. N.° ID.:12 o 13, siempre que los polipéptidos de citocromo P450 reductasa presenten actividad de citocromo P450 reductasa (es decir, transferir dos electrones del NADPH a un citocromo P450). La identidad porcentual la puede determinar un experto en la materia mediante programas de alineamiento estándar.

En la presente memoria también se proporcionan fragmentos activos de polipéptidos de citocromo P450 reductasa que tienen una secuencia aminoacídica establecida en las SEC. N.° ID.:12 o 13. Por ejemplo, en la presente memoria se proporcionan polipéptidos truncados de citocromo P450 reductasa que tienen una secuencia aminoacídica establecida en las SEC. N.° ID.:14 o 15. Dichos fragmentos conservan una o más propiedades de un polipéptido de citocromo P450 reductasa. Normalmente, los fragmentos activos presentan actividad de citocromo p450 reductasa (es decir, transferir dos electrones del NADPH a una citocromo P450).

En la presente memoria también se proporcionan moléculas de ácido nucleico que tienen una secuencia aminoacídica establecida en las SEC. N.° ID.:10 o 11, o degeneraciones de las mismas, que codifican un polipéptido de citocromo P450 reductasa que tiene una secuencia aminoacídica establecida en las SEC. N.° ID.:12 o 13, respectivamente. En la presente memoria también se proporcionan moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido de citocromo P450 reductasa que tiene una identidad de secuencia de al menos un 85% con una secuencia nucleotídica establecida en las SEC. N.° ID.:10 o 11. Por ejemplo, las moléculas de ácido nucleico proporcionadas en la presente memoria pueden presentar una identidad de secuencia de al menos o aproximadamente al menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 95%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99%, o más, con una secuencia nucleotídica establecida en las SEC. N.° ID.:10 o 11, siempre que el polipéptido codificado de citocromo P450 reductasa presente actividad de citocromo P450 reductasa (es decir, la capacidad de transferir dos electrones del NADPH a un citocromo P450). En la presente memoria también se proporcionan secuencias degeneradas de las secuencias establecidas en la SEC. N.° ID.:10 o 11 que codifican un polipéptido de citocromo P450 reductasa que tiene una secuencia aminoacídica establecida en las SEC. N.° ID.:12 o 13, respectivamente. La identidad porcentual la puede determinar un experto en la materia mediante programas de alineamiento estándar.

En algunos ejemplos, las moléculas de ácido nucleico que codifican los polipéptidos de citocromo P450 reductasa se aíslan del árbol de sándalo (Santalum album). En otros ejemplos, las moléculas de ácido nucleico y los polipéptidos codificados de citocromo P450 reductasa son variantes de los aislados del árbol de sándalo (Santalum album).

2 . Polipéptidos modificados de citocromo P450 reductasa

En la presente memoria se proporcionan polipéptidos modificados de citocromo P450 reductasa. Las modificaciones se pueden hacer en cualquier región de un polipéptido de citocromo P450 reductasa siempre que los polipéptidos de citocromo P450 reductasa modificados resultantes como mínimo conserven la actividad de citocromo P450 reductasa (por ejemplo, la capacidad de transferir dos electrones del NADPH a un citocromo P450).

Las modificaciones pueden ser de un solo aminoácido, como reemplazos (sustituciones), inserciones o deleciones de un solo aminoácido, o modificaciones de múltiples aminoácidos, como reemplazos, inserciones o deleciones de múltiples aminoácidos. En algunos ejemplos, se intercambian regiones o dominios enteros o parciales, como cualquier región o dominio descritos en la presente memoria más abajo, con los dominios o regiones correspondientes, o porciones de los mismos, de otro polipéptido de citocromo P450 reductasa. Los ejemplos de modificaciones son reemplazos de aminoácidos, incluidos reemplazos de un solo aminoácido o de múltiples aminoácidos. Por ejemplo, los polipéptidos modificados de citocromo P450 reductasa proporcionados en la presente memoria pueden contener al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, o más, posiciones modificadas en comparación con el polipéptido de citocromo P450 reductasa que no contiene la modificación.

Las modificaciones descritas en la presente memoria pueden estar en cualquier polipéptido de citocromo P450 reductasa. Por ejemplo, las modificaciones descritas en la presente memoria pueden estar en una citocromo P450 reductasa que tiene una secuencia aminoacídica establecida en cualquiera de las SEC. N.° ID.:12-15 o cualquier variante de las mismas, incluidas cualquiera que tenga una identidad de secuencia de al menos un 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% con una citocromo P450 reductasa que tiene una secuencia aminoacídica establecida en cualquiera de las SEC. N.° ID.:12-15.

En particular, los polipéptidos modificados de citocromo P450 reductasa proporcionados en la presente memoria contienen sustituciones o reemplazos, adiciones o deleciones de aminoácidos, truncamientos o combinaciones de los mismos con referencia al polipéptido de citocromo P450 reductasa que tiene una secuencia aminoacídica establecida en la SEC. N.° ID.:12. Está dentro de las competencias de un experto en la materia hacer dichas modificaciones en los polipéptidos de citocromo P450 reductasa, como cualquiera de los establecidos en las SEC. N.° ID.:12-15 o cualquier variante de los mismos. Sobre la base de esta descripción, está dentro de las competencias de un experto en la materia generar un polipéptido de citocromo P450 reductasa que contenga una cualquiera o más de las mutaciones descritas, y evaluar la actividad de cada uno en términos de la actividad de citocromo P450 reductasa descrita en la presente memoria, como la capacidad de transferir dos electrones del NADPH al citocromo P450.

Además, en algunos ejemplos, en la presente memoria se proporcionan fragmentos activos modificados de polipéptidos de citocromo P450 reductasa que contienen cualquiera de las modificaciones proporcionadas en la presente memoria. Dichos fragmentos conservan una o más propiedades de una citocromo P450 reductasa, como la capacidad de transferir dos electrones del NADPH al citocromo P450. Las modificaciones en un polipéptido de citocromo P450 reductasa también se pueden realizar en un polipéptido de citocromo P450 reductasa que también contenga otras modificaciones, incluidas modificaciones de la secuencia primaria y modificaciones fuera de la secuencia primaria del polipéptido. Por ejemplo, la modificación descrita en la presente memoria puede estar en un polipéptido de citocromo P450 reductasa que sea un polipéptido de fusión o un polipéptido quimérico con distintos polipéptidos de citocromo P450 reductasa (por ejemplo, contiene uno o más dominios o regiones de otras citocromo P450 reductasas) y también polipéptidos sintéticos de citocromo P450 reductasa preparados por recombinación o sintetizados o construidos mediante otros métodos conocidos en la técnica que están basados en la secuencia de polipéptidos conocidos.

En algunos ejemplos, las modificaciones son reemplazos de aminoácidos. En ejemplos adicionales, los polipéptidos modificados de citocromo P450 reductasa proporcionados en la presente memoria contienen una o más modificaciones en un dominio. Por ejemplo, las modificaciones en un dominio o dominio estructural se pueden efectuar por reemplazo de restos heterólogos correspondientes de otro polipéptido de citocromo P450 reductasa.

Para conservar la actividad de citocromo P450 reductasa, las modificaciones normalmente no se hacen en las posiciones necesarias para que haya actividad de citocromo P450 reductasa, es decir, en el centro catalítico o en restos conservados. Por ejemplo, generalmente no se realizan modificaciones en una posición correspondiente a la Ser485, Cys657, Asp702 y Trp704 con referencia a una secuencia aminoacídica establecida en la SEC. N.° ID.:12.

Los polipéptidos modificados de citocromo P450 reductasa proporcionados en la presente memoria pueden contener dos o más modificaciones, incluidos reemplazos o sustituciones, inserciones o deleciones de aminoácidos, truncamientos o combinaciones de los mismos. Por lo general, un experto en la materia puede combinar múltiples modificaciones proporcionadas en la presente memoria siempre que el polipéptido modificado de citocromo P450 reductasa conserve actividad de citocromo P450 reductasa.

En la presente memoria también se proporcionan moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de los polipéptidos modificados de citocromo P450 reductasa proporcionados en la presente memoria. En ejemplos particulares, en la secuencia nucleotídica se pueden optimizar los codones, por ejemplo, para aumentar los niveles de expresión de la secuencia codificada. El uso particular de los codones depende del organismo hospedador en el que se expresa el polipéptido modificado. Un experto en la materia está familiarizado con los codones óptimos para la expresión en bacterias o levaduras, incluidas, por ejemplo, E. coli o Saccharomyces cerevisiae. Por ejemplo, la información sobre el uso de los codones está disponible en la base de datos de uso de codones disponible en, por ejemplo, kazusa.or.jp.codon (véase una descripción de la base de datos en, por ejemplo, Richmond (2000) Genome Biology, 1:241). Véase también, Forsburg (2004) Yeast, 10:1045-1047; Brown et al. (1991) Nucleic Acids Research, 19:4298; Sharp et al. (1988) Nucleic Acids Research, 12:8207-8211; Sharp et al. (1991) Yeast, 657-78. En ejemplos de la presente memoria, en las secuencias nucleotídicas proporcionadas en la presente memoria se han optimizado los codones basándose en el uso de codones en Saccharomyces cerevisiae.

Los polipéptidos modificados y las moléculas de ácido nucleico codificantes proporcionados en la presente memoria se pueden producir mediante técnicas estándar de ADN recombinantes conocidas por los expertos en la materia. Se puede emplear cualquier método conocido en la técnica para efectuar la mutación de uno o más aminoácidos en una proteína de interés. Los métodos incluyen mutagénesis estándar aleatoria o dirigida al sitio de moléculas de ácido nucleico codificantes, o métodos de síntesis de polipéptidos en fase sólida. Por ejemplo, según se describe en la presente memoria, las moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido de citocromo P450 reductasa se pueden someter a mutagénesis, como mutagénesis aleatoria del ácido nucleico codificante, mediante PCR propensa a errores, mutagénesis dirigida al sitio, PCR de superposición, barajado de genes u otros métodos de recombinación. El ácido nucleico que codifica los polipéptidos se puede a continuación introducir en una célula hospedadora para ser expresado heterólogamente. Por lo tanto, en la presente memoria también se proporcionan moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de los polipéptidos modificados proporcionados en la presente memoria. En algunos ejemplos, los polipéptidos modificados de citocromo P450 reductasa se producen mediante síntesis, como, por ejemplo, mediante síntesis de péptidos en fase sólida o en solución.

3. Modificaciones adicionales

En la presente memoria se proporcionan polipéptidos de citocromo P450 reductasa que contienen modificaciones adicionales. Por ejemplo, entre los polipéptidos modificados de citocromo P450 reductasa se incluyen, por ejemplo, polipéptidos truncados de citocromo P450 reductasa, polipéptidos de citocromo P450 reductasa que tienen actividades o propiedades alteradas, polipéptidos quiméricos de citocromo P450 reductasa, polipéptidos de citocromo P450 reductasa que contienen intercambios de dominio, proteínas de fusión de citocromo P450 reductasa o polipéptidos de citocromo P450 reductasa que tienen cualquier modificación descrita en otra parte de la presente memoria.

a. Polipéptidos truncados

En la presente memoria también se proporcionan polipéptidos truncados de citocromo P450 reductasa. Los polipéptidos truncados de citocromo P450 reductasa pueden estar truncados en el extremo aminoterminal o en el extremo carboxiterminal, siempre que los polipéptidos truncados de citocromo P450 reductasa conserven la actividad catalítica de una citocromo P450 reductasa, como actividad de citocromo P450 reductasa. Normalmente, los polipéptidos truncados de citocromo P450 reductasa presentan actividad de citocromo P450 reductasa (es decir, la capacidad de transferir dos electrones del NADPH al citocromo P450). En algunos ejemplos, los polipéptidos de citocromo P450 reductasa están truncados en el extremo carboxiterminal. En otros ejemplos, los polipéptidos de citocromo P450 reductasa están truncados en el extremo aminoterminal.

En algunos ejemplos, los polipéptidos de citocromo P450 reductasa están truncados en el extremo aminoterminal, el extremo carboxiterminal o en ambos extremos de un polipéptido de citocromo P450 reductasa proporcionado en la presente memoria, como el truncamiento de una secuencia aminoacídica establecida en cualquiera de las SEC. N.° ID.:12 o 13. En otros ejemplos, cualquiera de los polipéptidos modificados de citocromo P450 reductasa proporcionados en la presente memoria están truncados. Los polipéptidos modificados de citocromo P450 reductasa pueden estar truncados en el extremo aminoterminal, en el extremo carboxiterminal, o en ambos extremos. Por ejemplo, cualquier polipéptido de citocromo P450 reductasa proporcionado en la presente memoria puede estar truncado en o alrededor de o al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 1920, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61,62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, o más, restos aminoacídicos en el extremo aminoterminal, siempre que el polipéptido de citocromo P450 reductasa conserve la actividad de citocromo P450 reductasa. En otros ejemplos, cualquier polipéptido de citocromo P450 reductasa proporcionado en la presente memoria puede estar truncado en o alrededor de o al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, o más, restos aminoacídicos en el extremo carboxiterminal, siempre que el polipéptido de citocromo P450 reductasa conserve la actividad de citocromo P450 reductasa. En algunos ejemplos, las citocromo P450 reductasas pueden estar truncadas mediante digestión con esteapsina o tripsina pancreáticas, lo que escinde el anclaje hidrófobo aminoterminal.

Por ejemplo, en la presente memoria se proporcionan polipéptidos truncados de citocromo P450 reductasa que tienen una secuencia aminoacídica establecida en las SEC. N.° lD.:14 o 15. En la presente memoria también se proporcionan polipéptidos truncados de citocromo P450 reductasa que tienen una secuencia aminoacídica con una identidad de secuencia aminoacídica de al menos o aproximadamente al menos un 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con una citocromo P450 reductasa truncada que tiene una secuencia aminoacídica establecida en las SEC. N.° ID.:14 o 15, siempre que el polipéptido de citocromo P450 reductasa resultante como mínimo conserve actividad de citocromo P450 reductasa (es decir, la capacidad de transferir dos electrones del NADPH al citocromo P450). En la presente memoria también se proporcionan moléculas de ácido nucleico que tienen una secuencia nucleotídica establecida en las SEC. N.° ID.:63 o 64 que codifican los polipéptidos truncados de citocromo P450 reductasa que tienen una secuencia aminoacídica establecida en las SEC. N.° lD.:14 o 15, respectivamente.

b. Polipéptidos con actividades o propiedades alteradas

Los polipéptidos modificados de citocromo P450 reductasa proporcionados en la presente memoria también pueden presentar cambios en las actividades y/o propiedades. Los polipéptidos modificados de citocromo P450 reductasa pueden presentar, por ejemplo, propiedades mejoradas, como una mayor actividad catalítica, una mayor estabilidad y/o una mayor expresión en una célula hospedadora. En otros ejemplos, el polipéptido modificado de citocromo P450 reductasa presenta una actividad similar, aumentada y/o mejorada en comparación con el polipéptido de citocromo P450 reductasa que no está modificado.

c. Intercambios de dominios

En la presente memoria se proporcionan polipéptidos modificados de citocromo P450 reductasa que son polipéptidos quiméricos que contienen un intercambio (deleción e inserción) por deleción de restos aminoacídicos de uno o más dominios o regiones en los mismos, o porciones de los mismos, e inserción de una secuencia heteróloga de aminoácidos. En algunos ejemplos, la secuencia heteróloga es una secuencia aleatorizada de aminoácidos. En otros ejemplos, la secuencia heteróloga es una secuencia aminoacídica contigua para el dominio o región correspondientes, o una porción de los mismos, de otra citocromo P450 reductasa. La secuencia heteróloga que se reemplaza o introduce por lo general incluye al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 o más aminoácidos. En ejemplos en los que la secuencia heteróloga es de un dominio correspondiente, o una porción del mismo, de otra citocromo P450 reductasa, la secuencia heteróloga por lo general incluye al menos un 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o más aminoácidos contiguos del dominio o región o porción correspondientes. En dicho ejemplo, los restos adyacentes al dominio o región correspondientes heterólogos, o una porción de los mismos, también se pueden incluir en un polipéptido modificado de citocromo P450 reductasa proporcionado en la presente memoria.

En un ejemplo de mutantes por intercambio proporcionado en la presente memoria, al menos un dominio o región, o una porción de los mismos, de un polipéptido de citocromo P450 reductasa está reemplazado con una secuencia aminoacídica contigua para el dominio o región correspondientes, o porciones de los mismos, de otro polipéptido de citocromo P450. En algunos ejemplos, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más dominios o regiones, o porciones de los mismos, se reemplazan con una secuencia aminoacídica contigua para el dominio o región correspondientes, o porciones de los mismos, de otro polipéptido de citocromo P450 reductasa.

Cualquier dominio o región, o una porción de los mismos, de un polipéptido de citocromo P450 reductasa se puede reemplazar con una secuencia aminoacídica heteróloga, como una secuencia heteróloga del dominio o región correspondientes de otra citocromo P450 reductasa. Un dominio o región puede ser un dominio estructural o un dominio funcional. Un experto en la materia está familiarizado con los dominios o regiones en las citocromo P450 reductasas. Los dominios funcionales incluyen, por ejemplo, el dominio catalítico o una porción del mismo. Un dominio estructural puede incluir la totalidad o una porción de hélice a A; hebra p 1; hélice a B; hebra p 2; hélice a C; hebra p 3; hélice a D; hebra p 4; hélice a E; hebra p 5; hélice a F; hebra p 6; hebra p 7; hebra p 8, hebra p 9; hebra p 10; hélice a G; hebra p 11; hebra p 12; hebra p 12'; hélice a H; hélice a I; hélice a J; hélice a K; hélice a M; hebra p 13; hebra p 14; hebra p 15; hélice a N; hebra p 16; hebra p 16'; hebra p 17; hélice a O; hebra p 18; hélice a P; hebra p 10; hélice a Q; hélice a R; hebra p 20; hélice a S; hélice a T; y hebra p 21. Un experto en la materia está familiarizado con varios citocromos P450 y puede identificar los dominios o regiones correspondientes, o porciones de aminoácidos de los mismos. Normalmente, los polipéptidos modificados de citocromo P450 reductasa resultantes presentan actividad de citocromo P450 reductasa.

Para reemplazar la totalidad o una porción contigua de un dominio o una citocromo P450 reductasa con la totalidad o una porción contigua del dominio correspondiente de una segunda citocromo P450 reductasa (véanse las patentes de EE. UU. n.° 5.824.774, 6.072.045, 7.186.891 y 8.106.260, y la patente publicada de EE. UU. n.° 20110081703) se puede utilizar cualquier método conocido en la técnica para generar polipéptidos quiméricos. Además, se pueden emplear métodos de barajado de genes para generar polipéptidos quiméricos y/o polipéptidos con intercambios de dominios o regiones.

Por ejemplo, los dominios o regiones correspondientes de dos citocromo P450 reductasas cualquiera se pueden intercambiar mediante cualquier método recombinante adecuado conocido en la técnica, o mediante síntesis in vitro. Un ejemplo de método recombinante es un método de PCR de superposición de dos etapas, como el descrito en la presente memoria. En dichos métodos, se pueden emplear cebadores que introducen mutaciones en una pluralidad de posiciones de codones en los ácidos nucleicos que codifican el dominio de interés, o una porción del mismo, en la primera citocromo P450 reductasa; las mutaciones forman conjuntamente la región heteróloga (es decir, la región correspondiente de la segunda citocromo P450 reductasa). Como otra posibilidad, por ejemplo, se pueden utilizar aminoácidos aleatorizados para reemplazar dominios o regiones concretas. Se entiende que los errores en el cebador, los errores de PCR y/u otros errores en los métodos de clonación o recombinación pueden dar lugar a errores tales que la región o el dominio intercambiados o reemplazados resultantes no presenten una secuencia aminoacídica que sea idéntica a la región correspondiente de la segunda citocromo P450 reductasa sintasa.

En un ejemplo de método con PCR, en la primera etapa de la PCR se utiliza (i) un cebador en dirección 3' que se hibrida en dirección 3' de la región que se está reemplazando con un cebador mutágeno que incluye aproximadamente quince nucleótidos (o un número eficaz para efectuar la hibridación, como 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 20, 25 nucleótidos o más) de secuencia homóloga a cada lado del dominio o región a intercambiar o aleatorizar que flanquean la región que se ha de importar al gen de interés, y (ii) un cebador en dirección 5' que se hibrida en dirección 5' de la región que se está reemplazando junto con un cebador mutágeno de la hebra opuesta que también incluye aproximadamente quince nucleótidos (o un número eficaz para efectuar la hibridación, como 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 20, 25 nucleótidos o más) de secuencia homóloga a cada lado del dominio o región a intercambiar o aleatorizar que flanquean la región que se ha de importar al gen de interés. Si se realiza un reemplazo en el que un dominio o región de un primer gen de la citocromo P450 reductasa se reemplaza con el correspondiente dominio o región de una segunda citocromo P450 reductasa, los nucleótidos en los cebadores mutágenos que hay entre las regiones que flanquean la primera citocromo P450 reductasa contienen codones para la región correspondiente de la segunda citocromo P450 reductasa. En los casos en que los aminoácidos de un dominio o región deben ser aleatorizados, los nucleótidos de los cebadores mutágenos que hay entre las regiones que flanquean la primera citocromo P450 reductasa contienen nucleótidos aleatorios. A continuación, se realiza una p Cr de superposición para unir los dos fragmentos, utilizando el oligonucleótido en dirección 5' y dirección 3'. El producto resultante de la PCR se puede a continuación clonar en cualquier vector adecuado para la expresión de la citocromo P450 reductasa modificada.

Además, cualquiera de los polipéptidos modificados de citocromo P450 reductasa que contengan mutaciones por intercambio en la presente memoria pueden contener uno o más reemplazos de aminoácidos adicionales, según se describe en la presente memoria.

d. Variantes adicionales

Los polipéptidos de citocromo P450 reductasa proporcionados en la presente memoria se pueden modificar mediante cualquier método conocido por un experto en la materia para generar variantes de proteínas, incluidos, entre otros, el barajado de ADN o de genes, la PCR propensa a errores, la PCR de superposición u otros métodos de recombinación. En un ejemplo, las moléculas de ácido nucleico que codifican cualquier polipéptido de citocromo P450 reductasa o polipéptido de citocromo P450 reductasa variante proporcionados en la presente memoria se pueden modificar mediante barajado de genes. El barajado de genes conlleva uno o más ciclos de fragmentación aleatoria y reensamblaje de al menos dos secuencias nucleotídicas, seguido de un cribado para seleccionar las secuencias nucleotídicas que codifican polipéptidos con las propiedades deseadas. La recombinación se puede realizar in vitro (véase Stemmer et al. (1994) Proc Natl Acad Sci USA 91:10747-10751; Stemmer et al. (1994) Nature 370:389-391; Cramieri et al. (1998) Nature 391:288-291; patente de EE. UU. n.° 5.605.793, 5.811.238, 5.830.721, 5.834.252 y 5.837.458) o in vivo (véase la publicación de patente internacional n.oWO199707205). Las moléculas de ácido nucleico que codifican los polipéptidos se pueden a continuación introducir en una célula hospedadora para ser expresadas heterólogamente y evaluar su actividad de citocromo P450 reductasa mediante cualquier método descrito en el apartado G más abajo.

e. Proteínas quiméricas o de fusión

Las moléculas de ácido nucleico proporcionadas en la presente memoria incluyen moléculas de ácido nucleico quiméricas o de fusión que contienen un polipéptido de citocromo P450 y un polipéptido de citocromo P450 reductasa. Por ejemplo, en la presente memoria se proporcionan moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido de fusión que tiene la capacidad de catalizar la formación de un santalol o bergamotol, como un a-santalol, p-santalol, epi-p-santalol o Z-a-trans-bergamotol, a partir de santalenos o bergamoteno y que contiene cualquier polipéptido de citocromo P450 y cualquier polipéptido de citocromo P450 reductasa proporcionados en la presente memoria. Por ejemplo, en la presente memoria se proporcionan moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido de fusión que contiene un polipéptido de citocromo P450 establecido en cualquiera de las SEC. N.° ID.:6-9 y un polipéptido de citocromo P450 reductasa establecido en cualquiera de las SEC. N.° ID.:12-15. En la presente memoria también se proporcionan polipéptidos de fusión que contienen un polipéptido de citocromo P450 establecido en cualquiera de las SEC. N.° ID.:6-9 y un polipéptido de citocromo P450 reductasa establecido en cualquiera de las SEC. N.° ID.:12-15. Los polipéptidos de fusión pueden estar conectados de manera directa o por medio de un conector.

Entre las moléculas de ácido nucleico proporcionadas en la presente memoria se incluyen moléculas de ácido nucleico quiméricas o de fusión que contienen una santaleno sintasa, un polipéptido de citocromo P450 y una citocromo P450 reductasa. Por ejemplo, en la presente memoria se proporcionan moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido de fusión que contiene una santaleno sintasa establecida en cualquiera de las SEC. N.° ID.:17, 52 o 53, un polipéptido de citocromo P450 santaleno oxidasa establecido en la SEC. N.° ID.:7 y una citocromo P450 reductasa establecida en cualquiera de las SEC. N.° ID.:12-15. En la presente memoria también se proporcionan polipéptidos de fusión que contienen una santaleno sintasa establecida en cualquiera de las SEC. N.° lD.:17, 52 o 53, un polipéptido de citocromo P450 santaleno oxidasa establecido en la SEC. N.° ID.:7 y una citocromo P450 reductasa establecida en cualquiera de las SEC. N.° ID.:12-15. En otro ejemplo, en la presente memoria se proporcionan moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido de fusión que contiene una santaleno sintasa establecida en cualquiera de las SEC. N.° ID.:17, 52 o 53, un polipéptido de citocromo P450 bergamoteno oxidasa establecido en cualquiera de las SEC. N.° ID.:6, 8 o 9 y una citocromo P450 reductasa establecida en cualquiera de las SEC. N.° ID.:12-15. En la presente memoria también se proporcionan polipéptidos de fusión que contienen una santaleno sintasa establecida en cualquiera de las SEC. N.° ID.:17, 52 o 53, un polipéptido de citocromo P450 bergamoteno oxidasa establecido en cualquiera de las SEC. N.° ID.:6, 8 o 9 y una citocromo P450 reductasa establecida en cualquiera de las SEC. N.° ID.:12-15. Los polipéptidos de fusión pueden estar conectados de manera directa o por medio de un conector.

En otro ejemplo, en la presente memoria se proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica una santaleno sintasa, un citocromo P450 y/o una citocromo P450 reductasa, de manera que, cuando se expresan en una célula hospedadora, una célula hospedadora bacteriana o de levadura, se expresa una santaleno sintasa, un citocromo P450 y/o una citocromo P450 reductasa. En otro ejemplo, en la presente memoria se proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica una santaleno sintasa, una citocromo P450 santaleno oxidasa y una citocromo P450 reductasa. En otro ejemplo, en la presente memoria se proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica una santaleno sintasa, una citocromo P450 bergamoteno oxidasa y una citocromo P450 reductasa. Además, cuando la célula hospedadora tiene la capacidad de producir FPP, los polipéptidos codificados catalizan la producción de santaloles y/o bergamotoles.

Entre otros ejemplos de proteínas de fusión se incluyen, entre otros, fusiones de una secuencia señal, un marcaje, como para localización, por ejemplo, un marcaje de His6 o un marcaje de myc, o un marcaje para purificación, por ejemplo, una fusión de GST, una fusión de GFP o una fusión de CBP, y una secuencia para dirigir la secreción de proteínas y/o la asociación con la membrana.

E. Métodos para producir polipéptidos modificados de citocromo P450 y citocromo P450 reductasa y moléculas de ácido nucleico que los codifican

Se proporcionan métodos para producir polipéptidos modificados de citocromo P450 y citocromo P450 reductasa, incluidos polipéptidos de santaleno oxidasa y bergamoteno oxidasa. Los métodos se pueden usar para generar citocromos P450 y citocromo P450 reductasas con las propiedades deseadas, incluidas, entre otras, una mayor actividad catalítica, una mayor selectividad, una mayor especificidad frente al sustrato, una mayor afinidad por el sustrato, una mayor estabilidad, una mayor expresión en una célula hospedadora, distribución alterada de los productos y/o especificidad alterada frente al sustrato. Los citocromos P450 y citocromo P450 reductasas modificados se pueden producir mediante cualquier método conocido en la técnica y, opcionalmente, se pueden cribar para seleccionar los que posean las propiedades deseadas. En ejemplos concretos, los citocromos P450 y citocromo P450 reductasas modificados que poseen propiedades deseadas se generan por mutación conforme a los ejemplos de métodos aportados en la presente memoria. Por lo tanto, en la presente memoria se proporcionan citocromo P450 reductasas y citocromos P450 modificados, así como moléculas de ácido nucleico que codifican las citocromo P450 reductasas y los citocromos P450 modificados que son producidos mediante los métodos descritos en la presente memoria.

Algunos ejemplos de los métodos proporcionados en la presente memoria son aquellos en los que las citocromo P450 reductasas y citocromos P450 modificados son producidos mediante reemplazo de uno o más dominios o regiones endógenos de un primer citocromo P450 o citocromo P450 reductasa con el dominio o dominios o región o regiones correspondientes de un segundo citocromo P450 o citocromo P450 reductasa (es decir, dominios o regiones heterólogos). En ejemplos adicionales, dos o más regiones o dominios endógenos de un primer citocromo P450 o citocromo P450 reductasa son reemplazados con el dominio o dominios o región o regiones heterólogos correspondientes de otros dos o más citocromos P450 o citocromo P450 reductasas, como un segundo, tercer, cuarto, quinto, sexto, séptimo, octavo, noveno o décimo citocromo P450 o citocromo P450 reductasa. Por lo tanto, el citocromo P450 o la citocromo P450 reductasa modificados resultantes pueden incluir dominios o regiones heterólogos de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o más citocromos P450 o citocromo P450 reductasas distintos. En ejemplos adicionales, los métodos también o en su lugar incluyen el reemplazo de uno o más dominios o regiones de un primer citocromo P450 o citocromo P450 reductasa sintasa con restos aminoacídicos aleatorizados.

En los métodos proporcionados en la presente memoria se puede usar cualquier citocromo P450 o citocromo P450 reductasa. El primer citocromo P450 o citocromo P450 reductasa (es decir, el citocromo P450 o citocromo P450 reductasa que se van a modificar) pueden ser de la misma clase o de una clase distinta al segundo (o tercer, cuarto, quinto, etc.) citocromo P450 o citocromo P450 reductasa (es decir, el citocromo P450 o citocromos P450 o la citocromo P450 reductasa o citocromo P450 reductasas a partir de los cuales se obtiene el dominio o dominios o región o regiones heterólogos).

En la práctica de los métodos proporcionados en la presente memoria, la totalidad o una porción contigua de un dominio endógeno de un primer citocromo P450 o citocromo P450 reductasa se pueden reemplazar con la totalidad o una porción contigua del dominio heterólogo correspondiente de un segundo citocromo P450 o citocromo P450 reductasa. Por ejemplo, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más aminoácidos contiguos de un dominio o región en un primer citocromo P450 o citocromo P450 reductasa se pueden reemplazar con 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más aminoácidos contiguos de la región correspondiente de un segundo citocromo P450 o citocromo P450 reductasa. En algunos ejemplos, uno o más restos aminoacídicos adyacentes al dominio endógeno del primer citocromo P450 o citocromo P450 reductasa también son reemplazados, y/o uno o más restos aminoacídicos adyacentes al dominio heterólogo también se usan en el reemplazo. Además, los métodos proporcionados en la presente memoria también incluyen métodos en los que la totalidad o una porción contigua de un primer dominio y la totalidad o una porción contigua de un segundo dominio adyacente se reemplazan con los dominios (o porciones de los mismos) correspondientes de otro citocromo P450 o citocromo P450 reductasa.

Los dominios o regiones que se pueden reemplazar incluyen dominios funcionales o dominios estructurales. Entre los ejemplos de dominios o regiones que se pueden reemplazar en un citocromo P450 mediante los métodos descritos en la presente memoria se incluyen, entre otros, dominios o regiones estructurales correspondientes a la hélice A, hebra p 1-1, hebra p 1-2, hélice B, hebra p 1-5, hélice B', hélice C, hélice C', hélice D, hebra p 3-1, hélice E, hélice F, hélice G, hélice H, hebra p 5-1, hebra p 5-2, hélice I, hélice J, hélice J', hélice K, hebra p 1-4, hebra p 2-1, hebra p 2 2, hebra p 1-3, hélice K', hélice K'', dominio hemo, hélice L, hebra p 3-3, hebra p 4-1, hebra p 4-2 y hebra p 3-2. Uno o más de estos dominios o regiones, o una porción de los mismos, se pueden reemplazar con un dominio correspondiente de otro citocromo P450 mediante los métodos proporcionados en la presente memoria. Estos dominios son regiones que se pueden identificar en cualquier citocromo P450 mediante métodos bien conocidos en la técnica, como, por ejemplo, alineamiento mediante métodos conocidos por los expertos en la materia (véanse, por ejemplo, las Figuras 5A-5B). Dichos métodos suelen maximizar las coincidencias, e incluyen métodos como el uso de alineamientos manuales y el uso de los numerosos programas de alineamiento disponibles (por ejemplo, BLASTP) y otros conocidos por los expertos en la materia. Mediante el alineamiento de las secuencias del citocromo P450 establecido en la SEC. N.° ID.:50, y cualquier otro citocromo P450, cualquiera de los dominios o regiones mencionados más arriba se pueden identificar en cualquier citocromo P450.

Entre los ejemplos de dominios o regiones que se pueden reemplazar en una citocromo P450 reductasa mediante los métodos descritos en la presente memoria se incluyen, entre otros, dominios o regiones estructurales correspondientes a la hélice a A; hebra p 1; hélice a B; hebra p 2; hélice a C; hebra p 3; hélice a D; hebra p 4; hélice a E; hebra p 5; hélice a F; hebra p 6; hebra p 7; hebra p 8, hebra p 9; hebra p 10; hélice a G; hebra p 11; hebra p 12; hebra p 12'; hélice a H; hélice a I; hélice a J; hélice a K; hélice a M; hebra p 13; hebra p 14; hebra p 15; hélice a N; hebra p 16; hebra p 16'; hebra p 17; hélice a O; hebra p 18; hélice a P; hebra p 10; hélice a Q; hélice a R; hebra p 20; hélice a S; hélice a T; y hebra p 21. Estos dominios son regiones que se pueden identificar en cualquier citocromo P450 mediante métodos bien conocidos en la técnica, como, por ejemplo, alineamiento mediante métodos conocidos por los expertos en la materia (véanse, por ejemplo, las Figuras 3A-3C). Dichos métodos suelen maximizar las coincidencias, e incluyen métodos como el uso de alineamientos manuales y el uso de los numerosos programas de alineamiento disponibles (por ejemplo, BLASTP) y otros conocidos por los expertos en la materia. Mediante el alineamiento de las secuencias de la citocromo P450 reductasa establecida en la SEC. N.° ID.:12, y cualquier otra citocromo P450 reductasa, cualquiera de los dominios o regiones mencionados más arriba se pueden identificar en cualquier citocromo P450 reductasa.

En los métodos proporcionados en la presente memoria, la totalidad o una porción contigua de un dominio endógeno de un primer citocromo P450 o citocromo P450 reductasa se pueden reemplazar con la totalidad o una porción contigua del dominio heterólogo correspondiente de un segundo citocromo P450 o citocromo P450 reductasa mediante un método recombinante adecuado conocido en la técnica según se describe más arriba en los Apartados C.4.c y D.3.c.

F. Expresión de polipéptidos de citocromo P450 y citocromo P450 reductasa y moléculas de ácido nucleico que los codifican

Los polipéptidos de citocromo P450 y citocromo P450 reductasa y fragmentos activos de los mismos, incluidos los polipéptidos de citocromo P450 santaleno oxidasa y citocromo P450 bergamoteno oxidasa, se pueden obtener mediante métodos bien conocidos en la técnica para la generación y expresión de proteínas recombinantes. Dichos polipéptidos de citocromo P450 santaleno oxidasa se pueden usar para producir santaloles a partir de santalenos en una célula hospedadora en la cual la citocromo P450 santaleno oxidasa se expresa o in vitro tras la purificación del polipéptido de citocromo P450 santaleno oxidasa. Dichos polipéptidos de citocromo P450 bergamoteno oxidasa se pueden usar para producir bergamotoles a partir de bergamotenos en una célula hospedadora en la cual se expresa la citocromo P450 bergamoteno oxidasa o in vitro tras la purificación del polipéptido de citocromo P450 bergamoteno oxidasa. Dichos polipéptidos de citocromo P450 santaleno oxidasa y citocromo P450 bergamoteno oxidasa se pueden usar para producir santaloles o bergamotoles a partir de un pirofosfato acíclico precursor adecuado, como el FPP, en una célula hospedadora en la cual se expresa una santaleno sintasa y el citocromo P450. Para obtener el ácido nucleico que codifica un citocromo P450, como una citocromo P450 santaleno oxidasa o una citocromo P450 bergamoteno oxidasa, o una citocromo P450 reductasa, se puede utilizar cualquier método conocido por los expertos en la materia para la identificación de ácidos nucleicos que codifican los genes deseados. Por ejemplo, el ácido nucleico que codifica polipéptidos de citocromo P450 o polipéptidos de citocromo P450 reductasa sin mutaciones o que no están modificados se puede obtener mediante métodos bien conocidos a partir de una fuente vegetal, como Santalum album. Los polipéptidos de citocromo P450 o los polipéptidos de citocromo P450 reductasa modificados a continuación se pueden genomanipular mediante cualquier método conocido en la técnica para introducir mutaciones en polipéptidos de citocromo P450 o polipéptidos de citocromo P450 reductasa sin mutaciones o que no están modificados, incluido cualquier método descrito en la presente memoria, como mutagénesis aleatoria del ácido nucleico codificante mediante PCR propensa a errores, mutagénesis dirigida al sitio, PCR con superposición u otros métodos recombinantes. Los ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos se pueden a continuación introducir en una célula hospedadora para ser expresados heterólogamente.

En algunos ejemplos, los polipéptidos de citocromo P450 o polipéptidos de citocromo P450 reductasa proporcionados en la presente memoria, incluidos polipéptidos de citocromo p450 santaleno oxidasa y citocromo P450 bergamoteno oxidasa, se producen mediante síntesis, como, por ejemplo, mediante síntesis de péptidos en fase sólida o en solución.

Los ácidos nucleicos que codifican citocromos P450 o citocromo P450 reductasas, como una citocromo P450 santaleno oxidasa y citocromo P450 bergamoteno oxidasa, se pueden clonar o aislar mediante cualquier método disponible conocido en la técnica para clonar y aislar moléculas de ácido nucleico. Entre dichos métodos se incluye la amplificación por PCR de ácidos nucleicos y el cribado de bibliotecas, incluido el cribado por hibridación de ácidos nucleicos. En algunos ejemplos, se pueden utilizar métodos de amplificación de ácidos nucleicos para aislar moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido de citocromo P450 o citocromo P450 reductasa, incluidos, por ejemplo, métodos de reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Como material de partida se puede utilizar un material que contenga ácidos nucleicos a partir del cual se pueda aislar una molécula de ácido nucleico que codifique citocromo P450 o citocromo P450 reductasa. Por ejemplo, se pueden usar preparados de ADN y ARNm de las especies de Santalum, incluidas, entre otras, Santalum album, para obtener genes de citocromo P450 o citocromo P450 reductasa. También se pueden usar bibliotecas de ácidos nucleicos como fuente de material de partida. Los cebadores se pueden diseñar para amplificar una molécula que codifica un citocromo P450 o una citocromo P450 reductasa, como una molécula que codifica un citocromo P450 santaleno oxidasa, una citocromo P450 bergamoteno oxidasa o una citocromo P450 reductasa. Por ejemplo, los cebadores se pueden diseñar basándose en secuencias nucleotídicas conocidas que codifican un citocromo P450 como el establecido en las SEC. N.° ID.:22-25. En otro ejemplo, los cebadores se pueden diseñar basándose en secuencias nucleotídicas conocidas que codifican una citocromo P450 reductasa como la establecida en las SEC. N.° ID.:40-41. Las moléculas de ácido nucleico generadas mediante amplificación se pueden secuenciar y confirmar si codifican un polipéptido de citocromo P450 o citocromo P450 reductasa. Las moléculas de ácido nucleico proporcionadas en la presente memoria se pueden usar para identificar moléculas análogas de ácido nucleico en otras especies.

Se pueden juntar secuencias nucleotídicas adicionales a una molécula de ácido nucleico que codifica un citocromo P450 o una citocromo P450 reductasa, incluidas secuencias conectoras que contengan sitios para endonucleasas de restricción con el fin de clonar el gen sintético en un vector, por ejemplo, un vector para la expresión de proteínas o un vector diseñado para la amplificación de las secuencias de ADN que codifican el núcleo de la proteína. Además, las secuencias nucleotídicas adicionales que especifican elementos de ADN funcionales se pueden conectar operativamente a una molécula de ácido nucleico que codifica un citocromo P450 o una citocromo P450 reductasa. Además, el ácido nucleico que codifica otras porciones o dominios también se puede incluir de manera que la sintasa resultante sea una proteína de fusión. Por ejemplo, ácidos nucleicos que codifican otras enzimas, como la FPP sintasa o la santaleno sintasa, o marcajes para purificación de proteínas, como los marcajes de His o Flag.

2. Generación de un ácido nucleico modificado

El ácido nucleico que codifica un citocromo P450 o una citocromo P450 reductasa, como polipéptidos modificados de citocromo P450 santaleno oxidasa, polipéptidos modificados de citocromo P450 bergamoteno oxidasa o polipéptidos modificados de citocromo P450 reductasa, se pueden preparar o generar mediante cualquier método conocido en la técnica para efectuar una mutación. Entre los métodos para la modificación se incluyen la mutagénesis racional y/o aleatoria estándar de moléculas de ácido nucleico codificantes (utilizando, por ejemplo, la PCR propensa a errores, la mutagénesis por saturación aleatoria dirigida al sitio, el barajado de ADN o la mutagénesis racional dirigida al sitio, como, por ejemplo, kits de mutagénesis (por ejemplo, QuikChange disponible en Stratagene)). Además, para generar ácidos nucleicos que codifican polipéptidos que contienen aminoácidos heterólogos se pueden utilizar técnicas de rutina de ADN recombinante. Por ejemplo, el ácido nucleico que codifica polipéptidos quiméricos o polipéptidos que contienen una secuencia aminoacídica heteróloga se puede generar mediante un método de PCR de dos pasos, según se describe más arriba, y/o mediante enzimas de restricción y métodos de clonación para la subclonación de rutina de los componentes que son polipéptidos quiméricos deseados.

Una vez generadas, las moléculas de ácido nucleico se pueden expresar en células para generar polipéptidos modificados de citocromo P450 o citocromo P450 reductasa mediante cualquier método conocido en la técnica. Los polipéptidos modificados de citocromo P450 o citocromo P450 reductasa, como polipéptidos modificados de citocromo P450 santaleno oxidasa, polipéptidos modificados de citocromo P450 bergamoteno oxidasa o polipéptidos modificados de citocromo P450 reductasa, a continuación, se pueden evaluar mediante cribado para encontrar una propiedad o actividad deseada, por ejemplo, la capacidad de producir un terpenoide a partir de un sustrato terpénico. En ejemplos particulares, los polipéptidos modificados de citocromo P450 o citocromo P450 reductasa con propiedades deseadas se generan por mutación y se criban atendiendo a una propiedad de acuerdo con los ejemplos aportados en la presente memoria. Normalmente, en los casos en que se genera un polipéptido modificado de citocromo P450 santaleno oxidasa, los polipéptidos modificados de citocromo P450 santaleno oxidasa producen un santalol a partir de un santaleno. Normalmente, en los casos en que se genera un polipéptido modificado de citocromo P450 bergamoteno oxidasa, los polipéptidos modificados de citocromo P450 bergamoteno oxidasa producen un bergamotol a partir de un bergamoteno.

3. Vectores y células

Para la expresión recombinante de uno o más de los polipéptidos de citocromo P450 o citocromo P450 reductasa proporcionados en la presente memoria, incluidos polipéptidos de citocromo P450 santaleno oxidasa, citocromo P450 bergamoteno oxidasa o citocromo P450 reductasa, el ácido nucleico que contiene toda o una porción de la secuencia nucleotídica que codifica la sintasa se puede introducir en un vector de expresión adecuado, es decir, un vector que contiene los elementos necesarios para la transcripción y la traducción de la secuencia codificante de la proteína introducida. Dependiendo del sistema de expresión utilizado, las señales de transcripción y traducción necesarias también las puede suministrar el promotor nativo para un gen del citocromo P450 o la citocromo P450 reductasa, y/o sus regiones flanqueantes. Por lo tanto, en la presente memoria también se proporcionan vectores que contienen ácido nucleico que codifica cualquier polipéptido de citocromo P450 o citocromo P450 reductasa proporcionados en la presente memoria. Entre los ejemplos de vectores se incluyen, entre otros, pESC-LEU, pESC-LEU2d y pYEDP60.

También se proporcionan células, incluidas células procariotas y eucariotas, que contienen los vectores. También se proporcionan células hospedadoras que contienen moléculas de ácido nucleico que codifican los polipéptidos de citocromo P450 proporcionados en la presente memoria, incluidas citocromo P450 santaleno oxidasas, citocromo P450 bergamoteno oxidasas y citocromo P450 reductasas. Dichas células y células hospedadoras incluyen células bacterianas, células de levadura, células fúngicas, Archea, células vegetales, células de insectos y células animales. En ejemplos concretos, la células o células hospedadoras son células de levadura, como células de Saccharomyces cerevisiae o Pichia pastoris. En ejemplos concretos, las células o células hospedadoras son células de Saccharomyces cerevisiae que expresan un pirofosfato acíclico precursor de terpenos, como el farnesil difosfato (FPP). En algunos ejemplos, la células o células hospedadoras que contienen un citocromo P450 proporcionado en la presente memoria se pueden modificar para que produzcan más FPP que una célula que no está modificada.

Las células se usan para producir un polipéptido de citocromo P450 o citocromo P450 reductasa, como polipéptidos de citocromo P450 santaleno oxidasa, citocromo P450 bergamoteno oxidasa o citocromo P450 reductasa, mediante crecimiento de las células descritas más arriba en condiciones en las que el citocromo P450 o la citocromo P450 reductasa codificados son expresados por la célula. En algunos ejemplos, el polipéptido de citocromo P450, como un polipéptido de citocromo P450 santaleno oxidasa, citocromo P450 bergamoteno oxidasa o citocromo P450 reductasa, es heterólogo para la célula. En algunos casos, el citocromo P450 y/o las citocromo P450 reductasas expresados se purifican. En otros casos, los citocromos P450 y las citocromo P450 reductasas expresados transforman uno o más santalenos o bergamotenos en uno o más santaloles o bergamotoles en la célula hospedadora. En algunos ejemplos, una santaleno sintasa, una citocromo P450 santaleno oxidasa y una citocromo P450 reductasa se expresan de manera que el pirofosfato acíclico precursor de terpenos (FPP) se transforma en santalol. En otros ejemplos, una santaleno sintasa, una citocromo P450 bergamoteno oxidasa y una citocromo P450 reductasa se expresan de manera que el pirofosfato acíclico precursor de terpenos (FPP) se transforma en bergamotol.

Para construir vectores de expresión que contengan un gen quimérico que contenga señales de control de la transcripción/traducción adecuadas y secuencias codificantes de proteínas, se puede utilizar cualquier método conocido por los expertos en la materia para la inserción de fragmentos de ADN en un vector. Estos métodos pueden incluir técnicas de síntesis y de ADN recombinante in vitro y técnicas recombinantes in vivo (recombinación genética). La expresión de secuencias nucleotídicas que codifican un polipéptido de citocromo P450 o citocromo P450 reductasa o un polipéptido modificado de citocromo P450 o citocromo P450 reductasa, o dominios, derivados, fragmentos u homólogos de los mismos, puede estar regulada por una segunda secuencia nucleotídica de manera que los genes, o fragmentos de los mismos, se expresen en un hospedador transformado con la molécula o moléculas de ADN recombinante. Por ejemplo, la expresión de las proteínas se puede controlar mediante cualquier promotor/potenciador conocido en la técnica. En una realización, el promotor no es nativo para los genes que codifican una proteína de citocromo P450 o citocromo P450 reductasa. Entre los promotores que se pueden utilizar se incluyen, entre otros, promotores procariotas, de levadura, de mamíferos y vegetales. El tipo de promotor depende del sistema de expresión utilizado, que se describe con más detalle más abajo.

En una realización específica, se utiliza un vector que contiene un promotor operablemente conectado a ácidos nucleicos que codifican un polipéptido de citocromo p450 o citocromo P450 reductasa, o un polipéptido modificado de citocromo P450 o citocromo P450 reductasa, o un dominio, fragmento, derivado u homólogo de los mismos, uno o más orígenes de replicación y, opcionalmente, uno o más marcadores de selección (por ejemplo, un gen de resistencia a antibióticos). Se describen vectores y sistemas para la expresión de polipéptidos de citocromo P450 o citocromo P450 reductasa.

4. Sistemas de expresión

Los polipéptidos de citocromo P450 o citocromo P450 reductasa, incluidos los polipéptidos de citocromo P450 santaleno oxidasa, citocromo P450 bergamoteno oxidasa o citocromo P450 reductasa (modificados y sin modificar), se pueden producir mediante cualquier método conocido en la técnica para la producción de proteínas, incluidos métodos in vitro e in vivo como, por ejemplo, la introducción de moléculas de ácido nucleico que codifican el citocromo P450 o la citocromo P450 reductasa (por ejemplo, citocromo P450 santaleno oxidasa, citocromo P450 bergamoteno oxidasa o citocromo P450 reductasa) en una célula hospedadora o planta hospedadora para la producción o expresión in vivo a partir de moléculas de ácido nucleico que codifican el citocromo P450 o las citocromo P405 reductasas (por ejemplo, citocromo P450 santaleno oxidasa, citocromo P450 bergamoteno oxidasa o citocromo P450 reductasa) in vitro. Los polipéptidos de citocromo P450 o citocromo P450 reductasa, como la citocromo P450 santaleno oxidasa, la citocromo P450 bergamoteno oxidasa o la citocromo P450 reductasa, y los polipéptidos modificados de citocromo P450 santaleno oxidasa, citocromo P450 bergamoteno oxidasa o citocromo P450 reductasa se pueden expresar en cualquier organismo adecuado para producir las formas y cantidades necesarias de un polipéptido de sintasa. Entre los hospedadores de expresión se incluyen organismos procariotas y eucariotas, como E. coli, levadura, plantas, células de insectos, células de mamíferos, incluidas líneas celulares humanas y animales transgénicos no humanos. Los hospedadores de expresión pueden diferir en sus niveles de producción de proteínas, así como en los tipos de modificaciones postraduccionales que hay presentes en las proteínas expresadas. La elección del hospedador de expresión se puede hacer en función de estos y otros factores, como las consideraciones normativas y de seguridad, los costes de producción y la necesidad y los métodos de purificación.

La expresión en hospedadores eucariotas puede incluir la expresión en levaduras, como las del género Saccharomyces (por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae) y del género Pichia (por ejemplo, Pichia pastoris), células de insectos, como células de Drosophila y células de lepidopteran, plantas y células vegetales, como las de cítricos, tabaco, maíz, arroz, algas y lemna. Las células eucariotas para la expresión también incluyen líneas celulares de mamíferos, como células de ovario de hámster chino (CHO) o células de riñón de hámster bebé (BHK). Los hospedadores de expresión eucariotas también incluyen la producción en animales transgénicos no humanos, por ejemplo, incluida la producción en suero, leche y huevos.

Se dispone de muchos vectores de expresión, que los expertos en la materia conocen, para la expresión de un citocromo P450 o una citocromo P450 reductasa, como la citocromo P450 santaleno oxidasa, la citocromo P450 bergamoteno oxidasa o la citocromo P450 reductasa. Ejemplos de vectores de expresión son los que codifican una santaleno sintasa y una FPP sintasa, incluidos los vectores descritos en el Ejemplo 7. La elección del vector de expresión está influida por la elección del sistema de expresión del hospedador. Dicha selección se encuentra dentro de las competencias del experto en la materia. Por lo general, los vectores de expresión pueden incluir promotores y opcionalmente potenciadores de la transcripción, señales de traducción, y señales de terminación de la transcripción y la traducción. Los vectores de expresión que se utilizan para la transformación estable suelen tener un marcador de selección que permite la selección y el mantenimiento de las células transformadas. En algunos casos, se puede utilizar un origen de replicación para amplificar el número de copias de los vectores en las células.

Los polipéptidos de citocromo P450 o citocromo P450 reductasa, incluidos los polipéptidos de citocromo P450 santaleno oxidasa, citocromo P450 bergamoteno oxidasa o citocromo P450 reductasa y los polipéptidos modificados de citocromo P450 santaleno oxidasa, citocromo P450 bergamoteno oxidasa o citocromo P450 reductasa, también se pueden usar o expresar como fusiones de proteínas. Por ejemplo, se puede generar una fusión para funcionalizar un polipéptido de manera adicional. Entre los ejemplos de proteínas de fusión se incluyen, entre otros, fusiones de una secuencia señal, un marcaje para localización, por ejemplo, un marcaje de His6 o un marcaje de myc, o un marcaje para purificación, por ejemplo, una fusión de GST, una fusión de GFP o una fusión de CBP, y una secuencia para dirigir la secreción de proteínas y/o la asociación a la membrana.

Los métodos de producción de polipéptidos de citocromo P450 y citocromo P450 reductasa, incluidos polipéptidos de citocromo P450 santaleno oxidasa, citocromo P450 bergamoteno oxidasa o citocromo P450 reductasa, pueden incluir la coexpresión de un pirofosfato acíclico precursor de terpenos, como el FPP, en la célula hospedadora. En algunos casos, la célula hospedadora expresa FPP de manera natural. Dicha célula se puede modificar para que exprese mayores cantidades de FPP (véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.° 6.531.303, 6.689.593, 7.838.279 y 7.842.497). En otros casos, una célula hospedadora que no produce FPP de manera natural se modifica genéticamente para que produzca FPP.

a. Células procariotas

Los procariotas, especialmente E. coli, proporcionan un sistema para producir grandes cantidades de los polipéptidos de citocromo P450 y citocromo P450 reductasa proporcionados en la presente memoria. La transformación de E. coli es una técnica sencilla y rápida bien conocida por los expertos en la materia. Entre los ejemplos de vectores de expresión para la transformación de células de E. coli se incluyen, por ejemplo, los vectores de expresión pGEM, los vectores de expresión pQE y los vectores de expresión pET (véase la patente de EE. UU. n^ 4.952.496; disponible en Novagen, Madison, Wisconsin, EE. UU.; véase también la bibliografía publicada por Novagen donde se describe el sistema). Dichos plásmidos incluyen pET 11a, que contiene el promotor T7lac, el terminador T7, el operador lac de E. coli inducible y el gen represor lac; pET 12a-c, que contiene el promotor T7, el terminador T7 y la señal de secreción ompT de E. coli; pET 15b y pET19b (Novagen, Madison, Wisconsin, EE. UU.), que contienen una secuencia líder de His-Tag™ para uso en la purificación con una columna de His y un sitio de escisión por trombina que permite la escisión después de la purificación en columna, la región del promotor T7-lac y el terminador T7; pACYC-Duet (Novagen, Madison, Wisconsin, EE. UU.; SEC. N.° ID.:45).

Los vectores de expresión para E. coli pueden contener promotores inducibles que son útiles para inducir elevados niveles de expresión de proteínas y para expresar proteínas que presentan cierta toxicidad para las células hospedadoras. Entre los ejemplos de promotores procariotas se incluyen, por ejemplo, el promotor de la p-lactamasa (Jay et al., (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 78:5543) y el promotor tac (DeBoer et al., (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 80:21-25,); véase también «Useful Proteins from Recombinant Bacteria» en Scientific American 242:79-94 (1980)). Algunos ejemplos de promotores inducibles incluyen el promotor lac, el promotor trp, el promotor tac híbrido, los promotores del ARN T7 y SP6 y el promotor APl regulado por la temperatura.

Los citocromos P450 y las citocromo P450 reductasas, incluidos los polipéptidos de citocromo P450 santaleno oxidasa, polipéptidos de citocromo P450 bergamoteno oxidasa y polipéptidos de citocromo P450 reductasa, se pueden expresar en el entorno citoplasmático de E. coli. El citoplasma es un entorno reductor y para algunas moléculas, esto puede dar lugar a la formación de cuerpos de inclusión insolubles. Se pueden utilizar agentes reductores, como el ditiotreitol y el p-mercaptoetanol, y desnaturalizantes (por ejemplo, la guanidina-HCl y la urea) para volver a solubilizar las proteínas. Un enfoque alternativo es la expresión de citocromos P450 y citocromo P450 reductasas en el espacio periplásmico de las bacterias, que proporciona un entorno oxidante, y proteínas análogas a las chaperoninas e isomerasas disulfuro, lo que da lugar a la producción de proteínas solubles. Normalmente, una secuencia líder se fusiona con la proteína que se va a expresar, lo que dirige la proteína al periplasma. A continuación, las peptidasas señal en el interior del periplasma eliminan la líder. Entre los ejemplos de secuencias líder orientadas al periplasma se incluyen la líder pelB del gen de la pectato liasa y la líder obtenida a partir del gen de la fosfatasa alcalina. En algunos casos, la expresión en el periplasma permite la fuga de la proteína expresada al medio de cultivo. La secreción de proteínas permite una purificación rápida y sencilla a partir del sobrenadante del cultivo. Las proteínas que no son secretadas se pueden obtener a partir del periplasma mediante lisis por ósmosis. De forma similar a la expresión en el citoplasma, en algunos casos las proteínas se pueden volver insolubles y se pueden utilizar desnaturalizantes y agentes reductores para facilitar la solubilización y el replegamiento. La temperatura de inducción y crecimiento también puede influir en los niveles de expresión y solubilidad. Normalmente, se utilizan temperaturas de entre 25° C y 37° C. También se pueden utilizar mutaciones para aumentar la solubilidad de las proteínas expresadas. Normalmente, las bacterias producen proteínas aglucosiladas.

b. Células de levadura

Los sistemas de levadura, como, entre otros, los del género Saccharomyces (por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae), Schizosaccharomyces pombe, Yarrowia lipolytica, Kluyveromyces lactis y Pichia pastoris se pueden usar para expresar los citocromos P450 y citocromo P450 reductasas, como polipéptidos de citocromo P450 santaleno oxidasa, polipéptidos de citocromo P450 bergamoteno oxidasa y polipéptidos de citocromo P450 reductasa y polipéptidos de citocromo P450 santaleno oxidasa, polipéptidos de citocromo P450 bergamoteno oxidasa y polipéptidos de citocromo P450 reductasa modificados, proporcionados en la presente memoria. Los sistemas de expresión en levadura también se pueden utilizar para producir terpenos cuyas reacciones son catalizadas por las sintasas. La levadura se puede transformar con vectores de replicación episómicos o mediante integración estable en los cromosomas por recombinación homóloga. En algunos ejemplos, se utilizan promotores inducibles para regular la expresión génica. Entre los ejemplos de secuencias promotoras para la expresión de polipéptidos de citocromo P450 y citocromo P450 reductasa en la levadura se incluyen, entre otros, promotores de la metalotioneína, 3-fosfoglicerato cinasa (Hitzeman et al. (1980) J. Biol. Chem. 255:2073), u otras enzimas glicolíticas (Hess et al. (1968) J. Adv. Enzyme Reg. 7:149; y Holland et al. (1978) Biochem. 17:4900), como la enolasa, la gliceraldehído fosfato deshidrogenasa, la hexocinasa, la piruvato descarboxilasa, la fosfofructocinasa, la glucosa fosfato isomerasa, la 3-fosfoglicerato mutasa, la piruvato cinasa, la triosafosfato isomerasa, la fosfoglucosa isomerasa y la glucocinasa.

Otros vectores y promotores adecuados para su uso en la expresión en levaduras se describen con más detalle en Hitzeman, EPA-73.657 o en Fleer et al. (1991) Gene, 107:285-195; y van den Berg et al. (1990) Bio/Technology, 8:135-139. Otra alternativa incluye, entre otras, el promotor ADH2 reprimible por glucosa descrito por Russell et al. (J. Biol. Chem. 258:2674, 1982) y Beier et al. (Nature 300:724, 1982), o un promotor ADH1 modificado. Los vectores lanzadera replicables en levadura y E. coli se pueden construir, por ejemplo, introduciendo secuencias de ADN de pBR322 para la selección y la replicación en E. coli (gen Ampr y origen de replicación) en los vectores de levadura descritos más arriba.

Los vectores de expresión en levaduras pueden incluir un marcador de selección, como LEU2, TRP1, HIS3 y URA3, para la selección y el mantenimiento del ADN transformado. Entre los ejemplos de vectores se incluyen pESC-Leu, pESC-Leu2D, pESC-His y pYEDP60. Las proteínas expresadas en levaduras suelen ser solubles y la coexpresión con chaperoninas, como Bip y la proteína disulfuro isomerasa, puede mejorar los niveles de expresión y la solubilidad. Adicionalmente, las proteínas expresadas en levadura pueden estar dirigidas para la secreción utilizando fusiones de péptidos señal de secreción, como la señal de secreción del factor alfa de tipo apareamiento de la levadura Saccharomyces cerevisiae y fusiones con proteínas de la superficie celular de la levadura, como el receptor de adhesión por apareamiento Aga2p de la glucoamilasa de Arxula adeninivorans. Se puede genomanipular un sitio de escisión por proteasas (por ejemplo, la proteasa Kex-2) para eliminar las secuencias fusionadas de los polipéptidos cuando salen de la ruta de secreción.

La levadura expresa de forma natural las proteínas necesarias, incluida la FPP sintasa (ERG20; que puede producir FPP) para la ruta biosintética de los isoprenoides dependiente del mevalonato. Por lo tanto, la expresión de los citocromos P450 y citocromo P450 reductasas, incluidos los polipéptidos de citocromo P450 santaleno oxidasa, polipéptidos de citocromo P450 bergamoteno oxidasa y polipéptidos de citocromo P450 reductasa proporcionados en la presente memoria, en células de levadura pueden dar lugar a la producción de sesquiterpenos, como santalenos y bergamotenos, a partir de FPP, y de santaloles y bergamotoles. Entre los ejemplos de células de levadura para la expresión de citocromos P450 y citocromo P450 reductasas, incluidos polipéptidos de citocromo P450 santaleno oxidasa, polipéptidos de citocromo P450 bergamoteno oxidasa y polipéptidos de citocromo P450 reductasa, se incluyen la levadura modificada para expresar cantidades más elevadas de FPP. Por ejemplo, las células de levadura se pueden modificar para producir menos escualeno sintasa o una escualeno sintasa menos activa (por ejemplo, mutantes de erg9; véanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. n.° 6.531.303 y 6.689.593, y la publicación de patente de EE. UU. Esto da lugar a la acumulación de FPP en la célula hospedadora en concentraciones más elevadas en comparación con las células de levadura sin mutaciones, lo que a su vez puede dar lugar a una mayor producción de sesquiterpenos y sesquiterpenoides (por ejemplo, santalenos, bergamotenos, santaloles y bergamotoles). En otro ejemplo, las células de levadura se pueden modificar para producir más FPP sintasa mediante la introducción de un gen de la FPP sintasa, como SaFPPS de Santalum album (SEC. N.° ID.:18). En algunos ejemplos, el gen nativo de la FPP en dicha levadura se puede suprimir. Otras modificaciones que permiten aumentar la producción de FPP en levadura incluyen, por ejemplo, entre otras, modificaciones que aumentan la producción de acetil-CoA, inactivan los genes que codifican enzimas que utilizan FPP y GPP como sustrato y sobreexpresan HMG-CoA reductasas, tal y como se describe en la patente de EE. UU. n.° 7.842.497. Entre los ejemplos de células de levadura modificadas se incluyen, entre otros, Yf499 (MATa, ura3-52, lys2-801, ade2-101, trp1-A63, his3-A200, leu2-A1), WAT11 (MATa, ade2-1, his3-11,-15; leu2-3,-112, ura3-1, canR, cir+; que contienen, integrado en los cromosomas, el gen ATR1 que codifica la P450 reductasa dependiente del NADPH de Arabidopsis; véase Pompon et al. (1995) Toxicol Lett 82-83:815-822; Ro et al. (2005) Proc Natl Acad Sci USA 102:8060-8065); y BY4741 (MATa, his3A1, leu2A0, met15A0, ura3A0; ATCC #201388), cepas modificadas CALI5-1 (ura3, leu2, his3, trp l, Aerg9::HIS3, HMG2cat/TRP1::rDNA, dppl, sue), ALX7-95 (ura3, his3, trp l, Aerg9::HIS3, HMG2cat/TRP1::rDNA, dppl sue), ALX11-30 (ura3, trp l, erg9def25, HMG2cat/TRP1::rDNA, dppl, sue) de Saccharomyces cerevisiae, que se conocen y se describen en una o más de las patentes de EE. UU. con número 6.531.303, 6.689.593, 7.838.279, 7.842.497 y las publicaciones de patente de EE. UU. con número 20040249219 y 20110189717.

c. Plantas y células vegetales

Para la expresión de citocromos P450 y citocromo P450 reductasas, incluidos los polipéptidos de citocromo P450 santaleno oxidasa, polipéptidos de citocromo P450 bergamoteno oxidasa y polipéptidos de citocromo P450 reductasa proporcionados en la presente memoria, se pueden usar plantas y células vegetales transgénicas. Los constructos de expresión normalmente se transfieren a plantas mediante transferencia directa del ADN, como el bombardeo con microproyectiles y la transferencia mediada por PEG a protoplastos, y con la transformación mediada por agrobacterias. Los vectores de expresión pueden incluir secuencias promotoras y potenciadoras, elementos de terminación de la transcripción y elementos de control de la traducción. Los vectores de expresión y las técnicas de transformación se suelen dividir entre hospedadores dicotiledóneos, como Arabidopsis y el tabaco, y hospedadores monocotiledóneos, como el maíz y el arroz. Entre los ejemplos de promotores vegetales utilizados para la expresión se incluyen el promotor del virus del mosaico de la coliflor, el promotor de la nopalina sintasa, el promotor de la ribosa bisfosfato carboxilasa y los promotores de la ubicuitina y UBQ3. Para facilitar la selección y el mantenimiento de las células transformadas se suelen utilizar marcadores seleccionables, como la higromicina, la fosfomanosa isomerasa y la neomicina fosfotransferasa. Las células vegetales transformadas se pueden mantener en cultivo como células, agregados (tejido de callo) o se pueden regenerar formando plantas enteras. Las células vegetales transgénicas también pueden incluir algas genomanipuladas para producir proteínas (véase, por ejemplo, Mayfield et al. (2003) Proc Natl Acad Sci EE. UU. 100:438-442). Entre las plantas transformadas se incluyen, por ejemplo, plantas seleccionadas de los géneros Nicotiana, Solanum, Sorghum, Arabidopsis, Medicago (alfalfa), Gossypium (algodón) y Brassica (colza). En algunos ejemplos, la planta pertenece a la especie Nicotiana tabacum, y se transforma con vectores que sobreexpresan un citocromo P450 y/o una citocromo p 450 reductasa, según se describe en la patente publicada de EE. UU. n.° 20090123984 y la patente de EE. UU. n.° 7.906.710.

d. Insectos y células de insectos

Para expresar citocromos P450 y citocromo P450 reductasas, incluidos los polipéptidos de citocromo P450 santaleno oxidasa, polipéptidos de citocromo P450 bergamoteno oxidasa y polipéptidos de citocromo P450 reductasa proporcionados en la presente memoria se pueden usar insectos y células de insecto, en particular, un sistema de expresión en baculovirus (véase, por ejemplo, Muneta et al. (2003) J. Vet. Med. Sci. 65(2):219-223). Las células de insectos y larvas de insectos, incluida la expresión en la hemolinfa, expresan elevadas concentraciones de proteína y poseen la capacidad de llevar a cabo la mayoría de las modificaciones postraduccionales utilizadas por las eucariotas superiores. Los baculovirus tienen un espectro de hospedadores restringido, lo que mejora la seguridad y reduce los problemas regulatorios de la expresión eucariota. Por lo general, los vectores de expresión utilizan un promotor como el promotor de la poliedrina de baculovirus para alcanzar un elevado nivel de expresión. Entre los sistemas de baculovirus comúnmente utilizados se incluyen los baculovirus, como el virus de la poliedrosis nuclear Autographa californica (AcNPV) y el virus de la poliedrosis nuclear Bombyx mori (BmNPV) y una línea celular de insecto, como Sf9 obtenida a partir de Spodoptera frugiperda (véase, por ejemplo, Mizutani y Ohta (1998) Plant Physiology 116:357-367), Pseudaletia unipuncta (A7S) y Danaus plexippus (DpN1). Para alcanzar un elevado nivel de expresión, la secuencia nucleotídica de la molécula a expresar se fusiona inmediatamente en dirección 3' del codón iniciador de la poliedrina del virus. Las señales de secreción de mamíferos se procesan con exactitud en células de insectos y se pueden utilizar para secretar la proteína expresada en el medio de cultivo. Además, las líneas celulares Pseudaletia unipuncta (A7S) y Danaus plexippus (DpN1) producen proteínas con perfiles de glucosilación similares a los de los sistemas celulares de mamíferos.

Un sistema alternativo de expresión en células de insectos es el uso de células transformadas de manera estable. Para la expresión se pueden utilizar líneas celulares, como las células Schnieder 2 (S2) y Kc (Drosophila melanogaster) y las células C7 (Aedes albopictus). Para inducir niveles elevados de expresión en presencia de inducción por metales pesados con cadmio o cobre se puede utilizar el promotor de la metalotioneína de Drosophila. Los vectores de expresión se suelen mantener mediante el uso de marcadores de selección, como la neomicina y la higromicina.

e. Expresión en células de mamíferos

Para expresar citocromos P450 y citocromo P450 reductasas, incluidos los polipéptidos de citocromo P450 santaleno oxidasa, polipéptidos de citocromo P450 bergamoteno oxidasa y polipéptidos de citocromo P450 reductasa proporcionados en la presente memoria se pueden usar sistemas de expresión en células de mamíferos, que también se pueden usar para producir terpenos cuyas reacciones son catalizadas por las sintasas. Los constructos de expresión se pueden transferir a células de mamífero mediante infección vírica, como el adenovirus, o por transferencia directa de ADN, como liposomas, fosfato de calcio, DEAE-dextran, y por medios físicos, como la electroporación y la microinyección. Los vectores de expresión para células de mamíferos suelen incluir un sitio de caperuza en el ARNm, una secuencia TATA, una secuencia de inicio de la traducción (secuencia consenso de Kozak) y elementos de poliadenilación. Dichos vectores suelen incluir potenciadores-promotores de la transcripción para alcanzar un elevado nivel de expresión, por ejemplo, el potenciador-promotor del SV40, el promotor del citomegalovirus (CMV) humano y la repetición terminal larga del virus del sarcoma de Rous (RSV). Estos promotores-potenciadores son activos en muchos tipos de células. Para la expresión también se pueden utilizar regiones de potenciadores y promotores de tejidos y tipos celulares. Entre los ejemplos de regiones de potenciadores/promotores se incluyen, entre otras, las de genes, como los de la elastasa I, la insulina, la inmunoglobulina, el virus del tumor mamario de ratón, la albúmina, la alfa-fetoproteína, la alfa-1-antitripsina, la beta-globina, la proteína básica de la mielina, la cadena ligera de la miosina 2 y el control del gen de la hormona liberadora de gonadotropina. Se pueden utilizar marcadores seleccionables para seleccionar y mantener las células con el constructo de expresión. Entre los ejemplos de genes marcadores de selección se incluyen, entre otros, la higromicina B fosfotransferasa, la adenosina desaminasa, la xantina-guanina fosforribosiltransferasa, la aminoglucósido fosfotransferasa, la dihidrofolato reductasa y la timidina cinasa. La fusión con moléculas transductoras de señales de la superficie celular, como TCR-Z y FceRI-y, puede dirigir la expresión de las proteínas en un estado activo en la superficie celular.

Se dispone de muchas líneas celulares para la expresión en mamíferos, incluidas células de ratón, rata, humano, mono, pollo y hámster. Entre los ejemplos de líneas celulares se incluyen, entre otras, las células de BHK (es decir, BHK-21), 293-F, CHO, CHO Express (CHOX; Excellgene), Balb/3T3, HeLa, MT2, NS0 de ratón (no secretor) y otras líneas celulares de mieloma, líneas celulares de hibridoma y de heterohibridoma, linfocitos, fibroblastos, células Sp2/0, COS, NIH3T3, HEK293, 293S, 293T, 2B8 y HKB. También existen líneas celulares adaptadas a medios sin suero, lo que facilita la purificación de las proteínas secretadas desde los medios de cultivo celular. Un ejemplo de ello es la línea celular EBNA-1 sin suero (Pham et al. (2003) Biotechnol. Bioeng. 84:332-42).

f. Ejemplos de células hospedadoras

Entre los ejemplos de células hospedadoras para la expresión de un polipéptido de citocromo P450 proporcionado en la presente memoria, como una citocromo p450 santaleno oxidasa, una citocromo P450 bergamoteno oxidasa o una citocromo P450 reductasa, se incluyen células procariotas y eucariotas. Por lo general, la célula hospedadora produce un pirofosfato acíclico precursor de terpenos. Por ejemplo, la célula hospedadora produce farnesil difosfato. En algunos ejemplos, la célula hospedadora puede ser una línea celular que produce FPP en la ruta biosintética de isoprenoides dependiente del mevalonato (por ejemplo, hongos, incluidas células de levadura y células animales) o la ruta biosintética de isoprenoides independiente del mevalonato (por ejemplo, bacterias y plantas superiores). En algunos ejemplos, la célula hospedadora produce farnesil difosfato de manera natural. En otros ejemplos, la célula hospedadora está modificada para producir más farnesil difosfato en comparación con una célula que no está modificada. Entre los ejemplos de células hospedadoras se incluyen las células de bacterias, de levadura, de insectos, de plantas y de mamíferos. En ejemplos concretos, la célula hospedadora es una célula de levadura. Por ejemplo, la célula de levadura es una célula del género Saccharomyces, como una célula de Saccharomyces cerevisiae. En otro ejemplo, la célula de levadura es una célula del género Pichia, como una célula de Pichia pastoris. En otros ejemplos concretos, la célula hospedadora es una célula de Escherichia coli.

En ejemplos concretos, la célula hospedadora ha sido modificada para sobreproducir FPP. Algunos ejemplos de dichas células son las células de levadura modificadas. Por ejemplo, las células de levadura que se han modificado para producir menos escualeno sintasa o una escualeno sintasa menos activa (por ejemplo, mutantes de erg9; véanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. n.° 6.531.303 y 6.689.593) son útiles en los métodos proporcionados en la presente memoria para producir labdenodiol difosfato. La reducción de la actividad de la escualeno sintasa da lugar a la acumulación de FPP en la célula hospedadora en concentraciones más elevadas en comparación con las células de levadura sin mutaciones. Entre los ejemplos de células de levadura modificadas se incluyen, entre otras, las cepas modificadas Yf499 (MATa, ura3-52, lys2-801, ade2-101, trp1-A63, his3-A200, leu2-A1), WAT11 (MATa, ade2-1, his3-11,-15; leu2-3,-112, ura3-1, canR, cir+) de Saccharomyces cerevisiae; que contienen, integrado en los cromosomas, el gen ATR1 que codifica la P450 reductasa dependiente del NADPH de Arabidopsis; véase Pompon et al. (1995) Toxicol Lett 82-83:815-822; Ro et al. (2005) Proc Natl Acad Sci USA 102:8060-8065); y BY4741 (MATa, his3A1, leu2A0, met15A0, ura3A0; ATCC #201388). El uso de dichas células hospedadoras para la expresión de un polipéptido de citocromo P450 proporcionado en la presente memoria hace posible una mayor producción del FPP precursor y, por lo tanto, hace posible una mayor producción de santalenos y bergamotenos.

En la presente memoria se proporcionan células hospedadoras que contienen cualquier polipéptido de citocromo P450, o un fragmento con actividad catalítica del mismo, proporcionado en la presente memoria. En la presente memoria se proporcionan células hospedadoras que contienen un polipéptido de citocromo P450 o un fragmento con actividad catalítica del mismo. En algunos ejemplos, la célula hospedadora contiene un polipéptido de citocromo P450, o un fragmento con actividad catalítica del mismo, que tiene una secuencia nucleotídica establecida en cualquiera de las SEC. N.° ID.:1-5 y 67-72. En otros ejemplos, la célula hospedadora contiene un polipéptido de citocromo P450, o un fragmento con actividad catalítica del mismo, que tiene una secuencia nucleotídica con una identidad de secuencia porcentual de al menos un 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% con una secuencia nucleotídica establecida en cualquiera de las SEC. N.° ID.:1-5 y 67-72. En otros ejemplos, la célula hospedadora contiene un ácido nucleico que codifica un polipéptido de citocromo P450, o un fragmento con actividad catalítica del mismo, que tiene una secuencia aminoacídica establecida en cualquiera de las SEC. N.° ID.:6-9, 50 y 73-78. En otros ejemplos más, la célula hospedadora contiene un ácido nucleico que codifica un polipéptido de citocromo P450, o un fragmento con actividad catalítica del mismo, que tiene una identidad de secuencia porcentual de al menos un 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% con una secuencia aminoacídica establecida en cualquiera de las SEC. N.° ID.:6-9, 50 y 73-78.

En la presente memoria se proporcionan células hospedadoras que contienen una citocromo P450 santaleno oxidasa o un fragmento con actividad catalítica de la misma. En algunos ejemplos, la célula hospedadora contiene una citocromo P450 santaleno oxidasa, o un fragmento con actividad catalítica de la misma, que tiene una secuencia nucleotídica establecida en cualquiera de las SEC. N.° ID.:3, 68, 69, 70 o 71. En otros ejemplos, la célula hospedadora contiene una citocromo P450 santaleno oxidasa. o un fragmento con actividad catalítica de la misma, que tiene una secuencia nucleotídica con una identidad de secuencia porcentual de al menos un 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% con una secuencia nucleotídica establecida en cualquiera de las SEC. N.° ID.:3, 68, 69, 70 o 71. En otros ejemplos, la célula hospedadora contiene un ácido nucleico que codifica una citocromo P450 santaleno oxidasa, o un fragmento con actividad catalítica de la misma, que tiene una secuencia aminoacídica establecida en cualquiera de las SEC. N.° ID.:7, 74, 75, 76 o 77. En otros ejemplos más, la célula hospedadora contiene un ácido nucleico que codifica una citocromo P450 santaleno oxidasa, o un fragmento con actividad catalítica de la misma, que tiene una identidad de secuencia porcentual de al menos un 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% con una secuencia aminoacídica establecida en cualquiera de las SEC. N.° ID.:7, 74, 75, 76 o 77.

En la presente memoria se proporcionan células hospedadoras que contienen una citocromo P450 bergamoteno oxidasa o un fragmento con actividad catalítica de la misma. En algunos ejemplos, la célula hospedadora contiene una citocromo P450 bergamoteno oxidasa, o un fragmento con actividad catalítica de la misma, que tiene una secuencia nucleotídica establecida en cualquiera de las SEC. N.° ID.:2, 4, 5 o 67. En otros ejemplos, la célula hospedadora contiene una citocromo P450 bergamoteno oxidasa, o un fragmento con actividad catalítica de la misma, que tiene una secuencia nucleotídica con una identidad de secuencia porcentual de al menos un 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% con una secuencia nucleotídica establecida en cualquiera de las SEC. N.° ID.:2, 4, 5 o 67. En otros ejemplos, la célula hospedadora contiene un ácido nucleico que codifica una citocromo P450 bergamoteno oxidasa, o un fragmento con actividad catalítica de la misma, que tiene una secuencia aminoacídica establecida en cualquiera de las SEC. N.° ID.:6, 8, 9 o 73. En otros ejemplos más, la célula hospedadora contiene un ácido nucleico que codifica una citocromo P450 bergamoteno oxidasa, o un fragmento con actividad catalítica de la misma, que tiene una identidad de secuencia porcentual de al menos un 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% con una secuencia aminoacídica establecida en cualquiera de las SEC. N.° ID.:6, 8, 9 o 73.

En algunos ejemplos, cualquiera de las células hospedadoras proporcionadas en la presente memoria que contienen un citocromo P450, o un fragmento con actividad catalítica del mismo, además pueden contener una terpeno sintasa. En la presente memoria se proporcionan células hospedadoras que contienen un citocromo P450, o un fragmento con actividad catalítica del mismo, y una terpeno sintasa. En dichos ejemplos, la terpeno sintasa puede ser una santaleno sintasa. Por ejemplo, la terpeno sintasa es una santaleno sintasa que tiene una secuencia aminoacídica establecida en cualquiera de las SEC. N.° ID.:17, 52 o 53, o una santaleno sintasa que tiene una identidad de secuencia de al menos un 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% con una secuencia aminoacídica establecida en cualquiera de las SEC. N.° ID.:17, 52 o 53, o una molécula de ácido nucleico que codifica una santaleno sintasa. La molécula de ácido nucleico codificante tiene una secuencia nucleotídica establecida en cualquiera de las SEC. N.° ID.:16, 59 o 60, o una molécula de ácido nucleico que codifica una santaleno sintasa. La molécula de ácido nucleico tiene una identidad porcentual de al menos un 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% con una secuencia nucleotídica establecida en cualquiera de las SEC. N.° ID.:16, 59 o 60.

En la presente memoria se proporcionan células hospedadoras que contienen un citocromo P450, o un fragmento con actividad catalítica del mismo, y una santaleno sintasa que tienen una secuencia aminoacídica establecida en cualquiera de las SEC. N.° ID.:17, 52 o 53, o una santaleno sintasa que tiene una identidad de secuencia de al menos un 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% con una secuencia aminoacídica establecida en cualquiera de las SEC. N.° ID.:17, 52 o 53, o una molécula de ácido nucleico que codifica una santaleno sintasa. La molécula de ácido nucleico tiene una secuencia nucleotídica establecida en cualquiera de las SEC. N.° ID.:16, 59 o 60, o una molécula de ácido nucleico que codifica una santaleno sintasa. La molécula de ácido nucleico tiene una identidad porcentual de al menos un 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% con una secuencia nucleotídica establecida en cualquiera de las SEC. N.° ID.:16, 59 o 60. En dichos ejemplos, el citocromo P450, o un fragmento con actividad catalítica del mismo, es un polipéptido de citocromo P450, o un fragmento con actividad catalítica del mismo, que tiene una secuencia nucleotídica establecida en cualquiera de las SEC. N.° ID.:1-5 y 67-72, o un polipéptido de citocromo P450, o un fragmento con actividad catalítica del mismo, que tiene una secuencia nucleotídica con una identidad de secuencia porcentual de al menos un 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% con una secuencia nucleotídica establecida en cualquiera de las SEC. N.° ID.:1-5 y 67-72, o una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de citocromo P450, o un fragmento con actividad catalítica del mismo, que tiene una secuencia aminoacídica establecida en cualquiera de las SEC. N.° ID.:6-9, 50 y 73-78, o una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de citocromo P450, o un fragmento con actividad catalítica del mismo, que tiene una identidad de secuencia porcentual de al menos un 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% con una secuencia aminoacídica establecida en cualquiera de las SEC. N.° ID.:6-9, 50 y 73-78.

En un ejemplo, en la presente memoria se proporciona una célula hospedadora que contiene un polipéptido de citocromo P450, o un fragmento con actividad catalítica del mismo, y una santaleno sintasa. En otro ejemplo, en la presente memoria se proporciona una célula hospedadora que contiene una citocromo P450 santaleno oxidasa, o un fragmento con actividad catalítica de la misma, y una santaleno sintasa. En otro ejemplo más, en la presente memoria se proporciona una célula hospedadora que contiene una citocromo P450 bergamoteno oxidasa, o un fragmento con actividad catalítica de la misma, y una santaleno sintasa.

En la presente memoria también se proporcionan células hospedadoras que contienen un citocromo P450, o un fragmento con actividad catalítica del mismo, y una terpeno sintasa que además contiene una citocromo P450 reductasa, o un fragmento con actividad catalítica de la misma. En dichos ejemplos, la terpeno sintasa puede ser una santaleno sintasa. Por ejemplo, la terpeno sintasa es una santaleno sintasa que tiene una secuencia aminoacídica establecida en cualquiera de las SEC. N.° ID.:17, 52 o 53, o una santaleno sintasa que tiene una identidad de secuencia de al menos un 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% con una secuencia aminoacídica establecida en cualquiera de las SEC. N.° ID.:17, 52 o 53, o una molécula de ácido nucleico que codifica una santaleno sintasa. La molécula de ácido nucleico tiene una secuencia nucleotídica establecida en cualquiera de las SEC. N.° ID.:16, 59 o 60, o una molécula de ácido nucleico que codifica una santaleno sintasa. La molécula de ácido nucleico tiene una identidad porcentual de al menos un 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% con una secuencia nucleotídica establecida en cualquiera de las SEC. N.° ID.:16, 59 o 60. En dichos ejemplos, la citocromo P450 reductasa, o un fragmento con actividad catalítica de la misma, es una citocromo P450 reductasa, o un fragmento con actividad catalítica de la misma, que tiene una secuencia nucleotídica establecida en cualquiera de las SEC. N.° ID.:10 o 11, o una citocromo P450 reductasa, o un fragmento con actividad catalítica de la misma, que tiene una secuencia nucleotídica con una identidad de secuencia porcentual de al menos un 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% con una secuencia nucleotídica establecida en cualquiera de las SEC. N.° ID.:10 o 11, o una molécula de ácido nucleico que codifica una citocromo P450 reductasa, o un fragmento con actividad catalítica de la misma, que tiene una secuencia aminoacídica establecida en cualquiera de las SEC. N.° ID.:12-15 o una molécula de ácido nucleico que codifica una citocromo P450 reductasa, o un fragmento con actividad catalítica de la misma, que tiene una identidad de secuencia porcentual de al menos un 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% con una secuencia aminoacídica establecida en cualquiera de las SEC. N.° ID.:12-15. En dichos ejemplos, el citocromo P450, o un fragmento con actividad catalítica del mismo, es un polipéptido de citocromo p450, o un fragmento con actividad catalítica del mismo, que tiene una secuencia nucleotídica establecida en cualquiera de las SEC. N.° ID.:1-5 y 67-72, o un polipéptido de citocromo P450, o un fragmento con actividad catalítica del mismo, que tiene una secuencia nucleotídica con una identidad de secuencia porcentual de al menos un 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% con una secuencia nucleotídica establecida en cualquiera de las SEC. N.° ID.:1-5 y 67-72, o una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de citocromo P450, o un fragmento con actividad catalítica del mismo, que tiene una secuencia aminoacídica establecida en cualquiera de las SEC. N.° ID.:6-9, 50 y 73-78, o una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de citocromo P450, o un fragmento con actividad catalítica del mismo, que tiene una identidad de secuencia porcentual de al menos un 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% con una secuencia aminoacídica establecida en cualquiera de las SEC. N.° ID.:6-9, 50 y 73-78.

En un ejemplo, en la presente memoria se proporciona una célula hospedadora que contiene un polipéptido de citocromo P450 o un fragmento con actividad catalítica del mismo, una santaleno sintasa y una citocromo P450 reductasa o un fragmento con actividad catalítica de las mismas. En otro ejemplo, en la presente memoria se proporciona una célula hospedadora que contiene una citocromo P450 santaleno oxidasa o un fragmento con actividad catalítica de la misma, una santaleno sintasa y una citocromo P450 reductasa o un fragmento con actividad catalítica de las mismas. En otro ejemplo más, en la presente memoria se proporciona una célula hospedadora que contiene una citocromo P450 bergamoteno oxidasa o un fragmento con actividad catalítica de la misma, una santaleno sintasa y una citocromo P450 reductasa o un fragmento con actividad catalítica de las mismas.

En la presente memoria se proporcionan células hospedadoras que contienen una citocromo P450 reductasa o un fragmento con actividad catalítica de la misma. En algunos ejemplos, la célula hospedadora contiene una citocromo P450 reductasa, o un fragmento con actividad catalítica de la misma, que tiene una secuencia nucleotídica establecida en cualquiera de las SEC. N.° ID.:10 o 11. En otros ejemplos, la célula hospedadora contiene una citocromo P450 reductasa, o un fragmento con actividad catalítica de la misma, que tiene una secuencia nucleotídica con una identidad de secuencia porcentual de al menos un 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% con una secuencia nucleotídica establecida en cualquiera de las SEC. N.° ID.:10 o 11. En otros ejemplos, la célula hospedadora contiene un ácido nucleico que codifica una citocromo P450 reductasa, o un fragmento con actividad catalítica de la misma, que tiene una secuencia aminoacídica establecida en cualquiera de las SEC. N.° ID.:12-15. En otros ejemplos más, la célula hospedadora contiene un ácido nucleico que codifica una citocromo P450 reductasa, o un fragmento con actividad catalítica de la misma, que tiene una identidad de secuencia porcentual de al menos un 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% con una secuencia aminoacídica establecida en cualquiera de las SEC. N.° ID.:12-15.

En algunos ejemplos, la célula hospedadora que contiene una citocromo P450 reductasa, o un fragmento con actividad catalítica de la misma, además contiene un citocromo P450, o un fragmento con actividad catalítica del mismo. Por ejemplo, en la presente memoria se proporcionan células hospedadoras que contienen una citocromo P450 reductasa, o un fragmento con actividad catalítica de la misma, y un citocromo P450, o un fragmento con actividad catalítica del mismo. En dichos ejemplos, el citocromo P450, o un fragmento con actividad catalítica del mismo, es un polipéptido de citocromo P450, o un fragmento con actividad catalítica del mismo, que tiene una secuencia nucleotídica establecida en cualquiera de las SEC. N.° ID.:1-5 y 67-72, o un polipéptido de citocromo P450, o un fragmento con actividad catalítica del mismo, que tiene una secuencia nucleotídica con una identidad de secuencia porcentual de al menos un 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% con una secuencia nucleotídica establecida en cualquiera de las SEC. N.° ID.:1-5 y 67-72, o una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de citocromo P450, o un fragmento con actividad catalítica del mismo, que tiene una secuencia aminoacídica establecida en cualquiera de las SEC. N.° ID.:6-9, 50 y 73-78, o una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de citocromo P450, o un fragmento con actividad catalítica del mismo, que tiene una identidad de secuencia porcentual de al menos un 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% con una secuencia aminoacídica establecida en cualquiera de las SEC. N.° ID.:6-9, 50 y 73-78.

En un ejemplo, en la presente memoria se proporciona una célula hospedadora que contiene un polipéptido de citocromo p 450, o un fragmento con actividad catalítica del mismo, y una citocromo P450 reductasa, o un fragmento con actividad catalítica de la misma. En otro ejemplo, en la presente memoria se proporciona una célula hospedadora que contiene una citocromo P450 santaleno oxidasa, o un fragmento con actividad catalítica de la misma, y una citocromo P450 reductasa, o un fragmento con actividad catalítica de la misma. En otro ejemplo más, en la presente memoria se proporciona una célula hospedadora que contiene una citocromo P450 bergamoteno oxidasa, o un fragmento con actividad catalítica de la misma, y una citocromo P450 reductasa, o un fragmento con actividad catalítica de la misma.

5. Purificación

Los métodos para la purificación de citocromos P450 y citocromo P450 reductasas, como polipéptidos de citocromo P450 santaleno oxidasa, polipéptidos de citocromo P450 bergamoteno oxidasa y polipéptidos de citocromo P450 reductasa, a partir de células hospedadoras depende de las células hospedadoras y sistemas de expresión seleccionados. En el caso de moléculas secretadas, las proteínas por lo general se purifican a partir de medios de cultivo después de eliminar las células. Para la expresión intracelular, las células se pueden lisar y las proteínas se pueden purificar a partir del extracto. Cuando se utilizan organismos transgénicos, como plantas y animales transgénicos, para la expresión, se pueden utilizar tejidos u órganos como material de partida para preparar un extracto de células lisadas. Adicionalmente, la producción de animales transgénicos no humanos puede incluir la producción de polipéptidos en leche o huevos, que se pueden recoger y, si es necesario, las proteínas se pueden extraer y purificar adicionalmente mediante métodos estándar en la técnica.

Los citocromos P450 y citocromo P450 reductasas, incluidos los polipéptidos de citocromo P450 santaleno oxidasa, los polipéptidos de citocromo P450 bergamoteno oxidasa y los polipéptidos de citocromo P450 reductasa, se pueden purificar mediante técnicas estándar de purificación de proteínas conocidas en la técnica, incluidas, entre otras, SDS-PAGE, cromatografía de fraccionamiento por tamaño y por exclusión de tamaño, precipitación con sulfato de amonio, cromatografía de afinidad a quelatos y cromatografía de intercambio iónico. Los constructos de expresión también se pueden genomanipular para añadir un marcaje de afinidad, como un epítopo myc, una fusión de GST o His6, y se pueden purificar por afinidad de una proteína a un anticuerpo myc, resina de glutatión y resina de Ni, respectivamente. La pureza se puede evaluar mediante cualquier método conocido en la técnica, incluida la electroforesis en gel y las técnicas de tinción y espectrofotometría.

6. Proteínas de fusión

También se proporcionan proteínas de fusión que contienen citocromos P450 y citocromo P450 reductasas, incluidos polipéptidos de citocromo P450 santaleno oxidasa, polipéptidos de citocromo P450 bergamoteno oxidasa y polipéptidos de citocromo P450 reductasa, y uno o más polipéptidos de otro tipo. La conexión de un polipéptido de citocromo P450 o citocromo P450 reductasa a otro polipéptido se puede efectuar directa o indirectamente a través de un conector. En un ejemplo, la conexión puede ser por conexión química, como, por ejemplo, a través de agentes heterobifuncionales o conexiones entre grupos tiol u otras conexiones de este tipo. La fusión también se puede realizar por medios recombinantes. La fusión de un citocromo P450 o una citocromo P450 reductasa, como un polipéptido de citocromo P450 santaleno oxidasa, polipéptido de citocromo P450 bergamoteno oxidasa y polipéptido de citocromo P450 reductasa, con otro polipéptido se puede hacer por el extremo carboxiterminal Nor del polipéptido de citocromo P450 santaleno oxidasa, el polipéptido de citocromo P450 bergamoteno oxidasa y el polipéptido de citocromo P450 reductasa.

Una proteína de fusión se puede producir mediante técnicas recombinantes estándar. Por ejemplo, los fragmentos de ADN que codifican las diferentes secuencias polipeptídicas se pueden ligar juntos en fase de acuerdo con técnicas convencionales, por ejemplo, empleando terminaciones romas o escalonadas para el ligamiento, digestión con enzimas de restricción para proporcionar terminaciones adecuadas, relleno de extremos cohesivos según sea adecuado, tratamiento con fosfatasa alcalina para evitar uniones indeseables y ligamiento enzimático. En otra realización, el gen de fusión se puede sintetizar mediante técnicas convencionales, incluidos sintetizadores de ADN automatizados. Como otra posibilidad, la amplificación por PCR de fragmentos del gen se puede llevar a cabo mediante cebadores de anclaje que dan lugar a salientes complementarios entre dos fragmentos consecutivos del gen que posteriormente se pueden hibridar y reamplificar para generar una secuencia génica quimérica (véase, por ejemplo, Ausubel et al. (eds.) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1992). Además, hay muchos vectores de expresión disponibles en el mercado que ya codifican un resto de fusión (por ejemplo, un polipéptido de GST). Un ácido nucleico que codifica un polipéptido de citocromo P450 santaleno oxidasa se puede clonar en dicho vector de expresión de manera que el resto de fusión esté conectado en fase a la proteína de citocromo P450 santaleno oxidasa. Un ácido nucleico que codifica un polipéptido de citocromo P450 bergamoteno oxidasa se puede clonar en dicho vector de expresión de manera que el resto de fusión esté conectado en fase a la proteína de citocromo P450 bergamoteno oxidasa. En algunos ejemplos, un ácido nucleico que codifica un polipéptido de citocromo P450 se puede clonar en dicho vector de expresión de manera que el citocromo P450 esté conectado en fase a un ácido nucleico que codifica un polipéptido de santaleno sintasa. Por ejemplo, un ácido nucleico que codifica un polipéptido de citocromo P450 santaleno oxidasa o bergamoteno oxidasa se puede clonar en dicho vector de expresión de manera que la citocromo P450 santaleno oxidasa o bergamoteno oxidasa esté conectada en fase a un ácido nucleico que codifica un polipéptido de santaleno sintasa. El citocromo P450 y las santaleno sintasas se pueden conectar de manera directa, sin un conector, o como otra posibilidad, se pueden conectar de manera indirecta en fase con un conector.

G. Métodos para producir terpenoides y métodos para detectar dichos productos y la actividad de los polipéptidos de citocromo P450 y citocromo P450 reductasa

Los polipéptidos de citocromo P450 proporcionados en la presente memoria se pueden usar y evaluar atendiendo a su capacidad para producir terpenoides, incluidos monoterpenoides, sesquiterpenoides y diterpenoides, a partir de cualquier sustrato terpénico adecuado, incluidos monoterpenos, sesquiterpenos y diterpenos. Normalmente, las citocromo P450 santaleno oxidasas proporcionadas en la presente memoria producen santaloles a partir de santalenos y las citocromo P450 bergamoteno oxidasas proporcionadas en la presente memoria producen bergamotoles a partir de bergamotenos. Los terpenoides se pueden producir mediante cualquier método conocido por un experto en la materia para producir terpenoides mediante catálisis con los polipéptidos de citocromo P450 proporcionados en la presente memoria. La capacidad de los polipéptidos de citocromo P450 proporcionados en la presente memoria para catalizar la formación de terpenoides a partir de sustratos terpénicos se puede evaluar mediante estos métodos. Los productos terpenoídicos se analizan por GC-MS y se pueden identificar atendiendo a las coincidencias de los perfiles de fragmentación en MS con las entradas en las bibliotecas del NIST y Wiley (por ejemplo, según se describe en el Ejemplo 6 más abajo).

Los polipéptidos de citocromo P450 reductasa proporcionados en la presente memoria se pueden usar y evaluar en términos de su capacidad para transferir dos electrones del NADPH a cualquier aceptor de electrones adecuado, incluidos los citocromos P450, el citocromo c, las hemo oxigenasas, el citocromo b5 y las escualeno epoxidasas.

Otras actividades y propiedades de los polipéptidos de citocromo P450 y citocromo P450 reductasa, como las citocromo P450 santaleno oxidasas, citocromo P450 bergamoteno oxidasas y citocromo P450 reductasas proporcionadas en la presente memoria, también se pueden evaluar mediante métodos y ensayos bien conocidos en la técnica. Además de evaluar la actividad de los polipéptidos de citocromo P450 y citocromo P450 reductasa y su capacidad de catalizar la formación de terpenoides, la cinética de la reacción, mayor especificidad frente al sustrato, alteración en el uso del sustrato y/o alteración en la distribución de los productos (en comparación con otro polipéptido de citocromo P450 y citocromo P450 reductasa) se pueden evaluar mediante métodos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, la cantidad y el tipo de terpenoides producidos a partir de santalenos o bergamotenos por los polipéptidos de santaleno oxidasa y bergamoteno oxidasa proporcionados en la presente memoria se pueden evaluar mediante métodos de cromatografía de gases (GC-MS), como los descritos en el Ejemplo 6, y mediante comparación de los perfiles de fragmentación en MS con las entradas en las bibliotecas del NISt y Wiley (véase el Ejemplo 6). Los productos también se pueden identificar mediante comparación con compuestos del aceite de sándalo auténtico.

Más abajo se proporcionan métodos para la producción de santaloles, incluidos (Z)-a-santalol, (E)-a-santalol, (Z)-psantalol, (E)-p-santalol, (Z)-epi-p-santalol y (E)-epi-p-santalol, y (E)-a-trans-bergamotol y (Z)-a-trans-bergamotol, donde la producción del santaloles y bergamotoles es catalizada por los polipéptidos de citocromo P450 y citocromo P450 reductasa proporcionados en la presente memoria. En la presente memoria también se proporcionan métodos para evaluar la actividad de los polipéptidos de citocromo P450 y citocromo P450 reductasa proporcionados en la presente memoria.

1. Síntesis de santaloles y bergamotoles

Los polipéptidos de citocromo P450 santaleno oxidasa y citocromo P450 bergamoteno oxidasa proporcionados en la presente memoria se pueden usar para catalizar la formación de santaloles y bergamotoles a partir de santalenos y bergamotenos (sustratos terpénicos). En algunos ejemplos, las citocromo p450 santaleno oxidasas se expresan en células que producen o sobreexpresan una santaleno sintasa y FPP, de manera que los santaloles se producen según se describe en otra parte de la presente memoria. En otros ejemplos, las citocromo P450 bergamoteno oxidasas se expresan en células que producen o sobreexpresan una santaleno sintasa, de manera que se producen bergamotoles según se describe en otra parte de la presente memoria. En otros ejemplos, los polipéptidos de citocromo P450 santaleno oxidasa y citocromo P450 bergamoteno oxidasa proporcionados en la presente memoria se expresan y purifican a partir de cualquier célula hospedadora adecuada, como cualquiera descrita en el Apartado E. Los polipéptidos purificados de citocromo P450 santaleno oxidasa y citocromo P450 bergamoteno oxidasa a continuación se combinan in vitro con santalenos y bergamotenos para producir santaloles y bergamotoles.

a. Oxidación de santalenos y bergamotenos

En algunos ejemplos, los polipéptidos de citocromo P450 santaleno oxidasa proporcionados en la presente memoria se encuentran sobreexpresados y se purifican según se describe en el apartado E más arriba. La citocromo P450 santaleno oxidasa a continuación se incuba con uno o más sustratos terpénicos, incluidos el a-santaleno, p-santaleno, epi-p-santaleno y/o a-trans-bergamoteno, produciéndose uno o más de a-santalol, p-santalol y epi-p-santalol, y atrans-bergamotol, como (E)-a-santalol, (Z)-a-santalol, (E)-p-santalol, (Z)-p-santalol, (E)-epi-p-santalol, (Z)-epi-psantalol, (Z)-a-trans-bergamotol y (E)-a-trans-bergamotol. Como otra posibilidad, los polipéptidos de citocromo P450 santaleno oxidasa proporcionados en la presente memoria se expresan en células hospedadoras que también producen sustratos terpénicos, incluidos el a-santaleno, p-santaleno, epi-p-santaleno y/o a-trans-bergamoteno, dan lugar a la producción de uno o más de a-santalol, p-santalol y epi-p-santalol, y a-trans-bergamotol, como (E)-a-santalol, (Z)-a-santalol, (E)-p-santalol, (Z)-p-santalol, (E)-epi-p-santalol, (Z)-epi-p-santalol, (Z)-a-trans-bergamotol y (E)-a-trans-bergamotol. La producción de santaloles y bergamotoles y la cuantificación de la cantidad de producto a continuación se determina mediante cualquier método proporcionado en la presente memoria, como cromatografía de gasesespectrometría de masas (GC-MS), cromatografía de gases-detección por ionización de llama (GC-FID) y cromatografía de líquidos- espectrometría de masas (LC-MS). Los perfiles de espectros de masas se pueden comparar con los perfiles de fragmentación en MS de las entradas en las bibliotecas del NIST y Wiley, como las descritas en el Ejemplo 6, o mediante comparación con terpenoides conocidos en el aceite de sándalo.

En otros ejemplos, los polipéptidos de citocromo P450 bergamoteno oxidasa proporcionados en la presente memoria se encuentran sobreexpresados y se purifican según se detalla en el apartado E más arriba. La citocromo P450 bergamoteno oxidasa a continuación se incuba con uno o más sustratos terpénicos, incluidos el a-santaleno, psantaleno, epi-p-santaleno y/o a-trans-bergamoteno, produciéndose uno o más de (E)-a-trans-bergamotol o (Z)-atrans-bergamotol. En algunos ejemplos, también se producen pequeñas cantidades de a-santalol, p-santalol y/o epip-santalol. Como otra posibilidad, los polipéptidos de citocromo P450 bergamoteno oxidasa proporcionados en la presente memoria se expresan en células hospedadoras que también producen sustratos terpénicos, incluidos el asantaleno, p-santaleno, epi-p-santaleno y/o a-trans-bergamoteno, dan lugar a la producción de (E)-a-trans-bergamotol o (Z)-a-trans-bergamotol. En algunos ejemplos, también se producen pequeñas cantidades de a-santalol, p-santalol y/o epi-p-santalol. La producción de bergamotoles y la cuantificación de la cantidad de producto a continuación se determina mediante cualquier método proporcionado en la presente memoria, como cromatografía de gasesespectrometría de masas (GC-MS), cromatografía de gases-detección por ionización de llama (GC-FID) y cromatografía de líquidos-espectrometría de masas (LC-MS). Los perfiles de espectros de masas se pueden comparar con los perfiles de fragmentación en MS de las entradas en las bibliotecas del NIST y Wiley, como las descritas en el Ejemplo 6, o mediante comparación con terpenoides conocidos en el aceite de sándalo.

b. Transformación de pirofosfatos acíclicos precursores de terpenos

En algunos ejemplos, los terpenoides se pueden generar mediante biosíntesis a partir de pirofosfatos acíclicos precursores de terpenos, como el geranil pirofosfato, el farnesil pirofosfato y el geranilgeranil pirofosfato, mediante expresión de una citocromo P450 monooxigenasa en una célula hospedadora que produce el pirofosfato acíclico precursor de terpenos y una terpeno sintasa. Las células hospedadoras adecuadas se describen en el Apartado E más arriba. En un ejemplo, los santaloles y bergamotoles se generan por biosíntesis mediante expresión de una citocromo P450 santaleno oxidasa en una célula hospedadora que produce FPP y santaleno sintasa (véase el Ejemplo 10). En otro ejemplo, los bergamotoles se generan por biosíntesis mediante expresión de una citocromo P450 bergamoteno oxidasa en una célula hospedadora que produce FPP y santaleno sintasa (véase el Ejemplo 10). La producción de santaloles y bergamotoles y la cuantificación de la cantidad de productos a continuación se determina mediante cualquier método proporcionado en la presente memoria, como cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS), cromatografía de gases-detección por ionización de llama (GC-FID) y cromatografía de líquidosespectrometría de masas (LC-MS). Los perfiles de espectros de masas se pueden comparar con los perfiles de fragmentación en MS de las entradas en las bibliotecas del NIST y Wiley, como las descritas en el Ejemplo 6, o mediante comparación con terpenoides conocidos en el aceite de sándalo.

En otro ejemplo, los terpenoides se pueden generar a partir de pirofosfatos acíclicos precursores de terpenos mediante: 1) incubación de un pirofosfato acíclico precursor de terpenos con una terpeno sintasa; y 2) incubación de los productos de reacción con una citocromo P450 monooxigenasa. En algunos ejemplos, los productos de reacción del pirofosfato acíclico precursor de terpenos con la terpeno sintasa se aíslan. En otros ejemplos, la citocromo P450 monooxigenasa se añade de manera directa a la primera mezcla de reacción sin purificación previa. Los dos pasos se pueden realizar simultánea o secuencialmente. Los terpenoides producidos en la reacción se pueden identificar y cuantificar mediante cualquier método proporcionado en la presente memoria, como cromatografía de gasesespectrometría de masas (GC-MS), cromatografía de gases-detección por ionización de llama (GC-FID) y cromatografía de líquidos-espectrometría de masas (LC-MS). Los perfiles de espectros de masas se pueden comparar con los perfiles de fragmentación en MS de las entradas en las bibliotecas del NIST y Wiley, como las descritas en el Ejemplo 6, o mediante comparación con terpenoides conocidos en el aceite de sándalo.

2. Métodos para la producción

a. Ejemplos de células

Los santaloles y bergamotoles se pueden producir mediante expresión de un polipéptido de citocromo P450 sintasa y/o un polipéptido de citocromo P450 reductasa proporcionados en la presente memoria en una línea celular que produce FPP en la ruta biosintética de isoprenoides dependiente del mevalonato (por ejemplo, hongos, incluidas células de levadura y células de animales) o la ruta biosintética de isoprenoides independiente del mevalonato (por ejemplo, bacterias y plantas superiores). En ejemplos concretos, los santaloles se producen mediante expresión de un polipéptido de citocromo p450 santaleno oxidasa proporcionado en la presente memoria y un polipéptido de santaleno sintasa en una línea celular que ha sido modificada para sobreproducir FPP. En otros ejemplos, los bergamotoles se producen mediante expresión de un polipéptido de citocromo P450 bergamoteno oxidasa proporcionado en la presente memoria y un polipéptido de santaleno sintasa en una línea celular que ha sido modificada para sobreproducir FPP. Algunos ejemplos de dichas células son las células de levadura modificadas. Por ejemplo, las células de levadura que se han modificado para producir menos escualeno sintasa o una escualeno sintasa menos activa (por ejemplo, mutantes de erg9; véanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. n.° 6.531.303 y 6.689.593) son útiles en los métodos proporcionados en la presente memoria para producir labdenodiol difosfato. La menor actividad de la escualeno sintasa da lugar a la acumulación de FPP en la célula hospedadora en concentraciones más elevadas en comparación con las células de levadura sin mutaciones, de manera que se obtienen mayores cantidades de santalenos y bergamotenos. Entre los ejemplos de células de levadura modificadas se incluyen, entre otras, las cepas modificadas Yf499 (MATa, ura3-52, lys2-801, ade2-101, trp1-A63, his3-A200, leu2-A1), WAT11 (MATa, ade2-1, his3-11,-15; leu2-3,-112, ura3-1, canR, cir+) de Saccharomyces cerevisiae; que contienen, integrado en los cromosomas, el gen ATR1 que codifica la P450 reductasa dependiente del NADPH de Arabidopsis; véase Pompon et al. (1995) Toxicol Lett 82-83:815-822; Ro et al. (2005) Proc Natl Acad Sci USA 102:8060-8065); y BY4741 (MATa, his3A1, leu2A0, met15A0, ura3A0; ATCC #201388).

b. Cultivo de células

En ejemplos de métodos, un citocromo P450 proporcionado en la presente memoria se expresa en una línea celular hospedadora que ha sido modificada para sobreexpresar farnesil difosfato y una santaleno sintasa, de manera que tras la expresión del citocromo P450, el farnesil difosfato se transforma en santaloles y bergamotoles. En otros ejemplos de métodos, un citocromo P450 proporcionado en la presente memoria y una santaleno sintasa se expresan en una línea celular hospedadora que ha sido modificada para sobreexpresar farnesil difosfato, de manera que, tras la expresión de ambas proteínas, el farnesil difosfato se transforma en santaloles y bergamotoles. El citocromo P450 y la santaleno sintasa se pueden expresar por separado, o juntos, en forma de una proteína de fusión que se describe en otra parte de la presente memoria. El citocromo P450 y la santaleno sintasa se pueden expresar simultáneamente o secuencialmente. La célula hospedadora se cultiva mediante cualquier método adecuado conocido en la técnica. En algunos ejemplos, como para el cribado de alto rendimiento de células que expresan diversos citocromos P450, las células que expresan el citocromo P450 se cultivan en pocillos individuales de una placa de 96 pocillos. En otros ejemplos en los que la célula hospedadora es una levadura, la célula que expresa los polipéptidos de citocromo P450, santaleno sintasa y FPP se cultiva mediante métodos de fermentación como los descritos más abajo.

Para la producción de santaloles y bergamotoles a partir de células de levadura que expresan los polipéptidos de citocromo P450 proporcionados en la presente memoria se pueden utilizar diversos métodos de fermentación. Por ejemplo, la producción a gran escala se puede realizar mediante fermentación en discontinuo o en continuo. Una fermentación en discontinuo clásica consiste en un sistema cerrado en el que la composición del medio se fija al inicio de la fermentación y no se somete a alteraciones artificiales durante la fermentación. Por lo tanto, al inicio de la fermentación, el medio se inocula con el microorganismo o microorganismos deseados, y se deja que la fermentación transcurra sin añadir más nutrientes. Normalmente, la concentración de la fuente de carbono en una fermentación en discontinuo es limitada y se controlan factores como el pH y la concentración de oxígeno. En los sistemas en discontinuo, la composición en metabolitos y biomasa del sistema cambia constantemente hasta el momento en que la fermentación se para. En los cultivos en discontinuo, normalmente las células pasan de una fase de latencia estática a una fase de elevado crecimiento logarítmico y, finalmente, a una fase estacionaria en la que la tasa de crecimiento es inferior o nula. Si no se tratan, las células en fase estacionaria con el tiempo mueren.

Una variación del sistema estándar en discontinuo es el sistema en semicontinuo, que es similar a un sistema convencional en discontinuo, con la excepción de que los nutrientes se añaden a medida que la fermentación progresa. Los sistemas en semicontinuo son útiles cuando la represión por catabolito tiende a inhibir el metabolismo de las células y cuando se desea tener cantidades limitadas de sustrato en el medio. Además, la posibilidad de alimentar con nutrientes suele dar lugar a mayores densidades celulares en los procesos de fermentación en semicontinuo en comparación con los procesos de fermentación en discontinuo. Factores como el pH, el oxígeno disuelto, las concentraciones de nutrientes y la presión parcial de los gases residuales, como el CO, suelen medirse y controlarse en las fermentaciones en semicontinuo.

La producción de santaloles o bergamotoles también se puede llevar a cabo mediante fermentación en continuo. La fermentación en continuo consiste en un sistema abierto donde un medio de fermentación definido se añade continuamente a un biorreactor y la misma cantidad de medio acondicionado se extrae simultáneamente para su procesamiento. Este sistema por lo general mantiene los cultivos a una densidad elevada y constante, y las células se encuentran principalmente en fase de crecimiento logarítmico. La fermentación en continuo permite la modulación de cualquier número de factores que afecten al crecimiento celular o a la concentración de producto final. Por ejemplo, un método mantendrá un nutriente limitante, como la fuente de carbono o de nitrógeno, a una tasa fija, y permitirá que se moderen todos los demás parámetros. En otros sistemas, varios factores que afectan al crecimiento se pueden alterar de manera continua, mientras que la concentración celular, determinada a partir de la turbidez del medio, se mantiene constante. Los sistemas en continuo tienen por objeto mantener condiciones de crecimiento en equilibrio y, por lo tanto, la pérdida de células debida a la eliminación del medio se debe compensar con la tasa de crecimiento celular en la fermentación. Los métodos para modular los nutrientes y los factores de crecimiento en los procesos de fermentación en continuo, así como las técnicas para aumentar al máximo la velocidad de formación de producto, son bien conocidos en la técnica.

Tras el cultivo celular, el medio de cultivo celular se puede recolectar para obtener los santaloles y bergamotoles producidos.

c. Aislamiento y ensayos de detección e identificación

Los santaloles y bergamotoles producidos mediante los métodos anteriores con los polipéptidos de citocromo P450 proporcionados en la presente memoria se pueden aislar y evaluar mediante cualquier método conocido en la técnica. En un ejemplo, el medio de cultivo celular se somete a extracción con un disolvente orgánico para que se produzca el reparto de cualesquiera terpenos o terpenoides producidos hacia la fase orgánica. La producción de santaloles y/o bergamotoles se puede evaluar y/o los santaloles y/o bergamotoles se pueden aislar a partir de otros productos mediante cualquier método conocido en la técnica, como, por ejemplo, cromatografía de gases o cromatografía en columna. Por ejemplo, la fase orgánica se puede analizar por GC-MS.

La cantidad de santaloles y/o bergamotoles producidos se puede determinar mediante cualquier técnica cromatográfica estándar conocida, útil para separar y analizar compuestos orgánicos. Por ejemplo, la producción de santalol y/o bergamotol se puede analizar mediante cualquier técnica cromatográfica conocida útil para la detección y la cuantificación de hidrocarburos, como santalol y/o bergamotol y otros terpenoides, incluidas, entre otras, la cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (GC-Ms ), la cromatografía de gases acoplada a un detector de ionización de llama (GC-FID), la GC-MS capilar, la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) y la cromatografía en columna. Normalmente, estas técnicas se llevan a cabo en presencia de patrones internos conocidos que se utilizan para cuantificar la cantidad producida del terpenoide. Por ejemplo, los terpenoides, incluidos los sesquiterpenos, como el santalol y/o el bergamotol, se pueden identificar mediante comparación de los tiempos de retención y los espectros de masas con los de patrones auténticos en cromatografía de gases con detección por espectrometría de masas. Entre los patrones habituales se incluyen, entre otros, santaloles y/o bergamotoles. En otros ejemplos, la cuantificación se puede lograr mediante cromatografía de gases con detección por ionización de llama a partir de curvas/rectas de calibración con cantidades conocidas de patrones auténticos y normalización con respecto al área de pico de un patrón interno. Estas técnicas cromatográficas permiten la identificación de cualquier terpeno presente en la fase orgánica, incluidos, por ejemplo, otros terpenoides producidos por los citocromos P450.

En algunos ejemplos, la cinética de la producción de santalol y/o bergamotol se puede determinar mediante ensayos con sintasas en los que se utilizan sustratos isoprenoídicos radiactivos, como 3H FPP o 14C FPP, con concentraciones variables de sintasa. Los productos se extraen en una fase orgánica y la radiactividad se mide con un contador de centelleo líquido. Las constantes cinéticas se determinan a partir de ajustes directos de la ecuación de Michaelis-Menton a los datos.

3. Producción de aceite de sándalo

Los polipéptidos de citocromo P450 santaleno oxidasa y citocromo P450 bergamoteno oxidasa proporcionados en la presente memoria se pueden usar para producir aceite de sándalo. Por ejemplo, las citocromo P450 santaleno oxidasas se pueden expresar en células que producen o sobreexpresan una santaleno sintasa, de manera que los santaloles y el bergamotol, incluidos el a-santalol, p-santalol y epi-p-santalol, y el Z-a-trans-bergamotol, se producen según se describe en otra parte de la presente memoria. Los productos terpenoídicos se pueden comparar con los encontrados en el aceite de sándalo auténtico de S. album mediante análisis por GC-MS, por ejemplo, según se describe en el Ejemplo 8.

4. Ensayos para detectar la actividad enzimática de polipéptidos de citocromo P450 y citocromo P450 reductasa

a. Métodos para determinar la actividad de polipéptidos de citocromo P450

Un experto en la materia está familiarizado con los métodos y ensayos para detectar la actividad enzimática de polipéptidos de citocromo P450. Los polipéptidos de citocromo P450 se pueden expresar en levadura o purificar a partir de fracciones de membranas de microsomas. La actividad de citocromo P450 monooxigenasa se puede determinar in vitro mediante incubación de un polipéptido de citocromo P450 con diversos sustratos monoterpénicos, sesquiterpénicos y diterpénicos, según se describe en el Ejemplo 11. Los productos de reacción, incluidos las proporciones de los productos, se pueden analizar mediante cualquier método conocido por un experto en la materia, incluidas la GC-MS, la GC-FID, la LC-MS, la comparación con patrones conocidos y la resonancia magnética nuclear (RMN) de protón y de carbono. Como otra posibilidad, la actividad se puede determinar in vivo mediante adición de sustratos terpénicos a cultivos de levadura de los citocromos P450 y la identificación de los productos según se describe más arriba. El contenido total de P450 en microsomas se puede cuantificar mediante espectroscopía de absorción diferencial de CO (véase Guengerich et al. (2009) Nat Protoc 4:1245-1251 y el Ejemplo 8).

La cinética enzimática se puede determinar in vitro en presencia de NADPH y CPR. En dichos ensayos, la CPR se incluye en cantidades limitadas, por ejemplo, 0,1 U, para la determinación de la actividad enzimática y 5 miliunidades para la determinación de las actividades relativas y los parámetros cinéticos. Los ensayos se pueden llevar a cabo en un intervalo de concentraciones del sustrato y la formación de productos se puede determinar mediante GC-MS. Añadir terpeno directamente a los cultivos de levadura.

b. Métodos para determinar la actividad de polipéptidos de citocromo P450 reductasa

Un experto en la materia está familiarizado con los métodos y ensayos para detectar la actividad enzimática de polipéptidos de citocromo P450 reductasa. En un ejemplo, la actividad de CPR se puede determinar mediante un ensayo que detecta la actividad de la C4H (cinamato 4-hidroxilasa), por ejemplo, según se describe en Ro et al. (2001) Plant Physiology 126:317-329. La C4H es una proteína de hemotiolato que cataliza la formación de p-cumarato a partir del ácido cinámico. Este ensayo se puede usar in vivo mediante expresión de la citocromo P450 reductasa en células de levadura en presencia de C4H (véase también, Ro et al. (2002) Plant Physiology 130:1837-1851). La actividad de la C4H se determina mediante detección por HPLC de la formación de ácido p-cumárico (Mizutani et al. (1993) Plant Cell Physiology 34:481-488).

A fin de evaluar la actividad de CPR in vitro, las CPR se pueden purificar a partir de fracciones de microsomas de levadura, como se describe en Pompon et al. ((1996) Methods Enzymol 272:51-64) y el Ejemplo 8 más abajo. El contenido total de P450 en microsomas se puede cuantificar mediante espectroscopía de absorción diferencial de CO (Omura and Sato (1964) J Biol Chem 239:2370-2378; Mizutani and Ohta (1998) Plant Physiology 116:357-367). El contenido de FAD y FMN se puede determinar según se describe en Faeder y Siegel (1973) Anal Biochem 53:332-336. La actividad de CPR in vitro se puede evaluar mediante diversos ensayos conocidos por los expertos en la materia. Por ejemplo, la actividad se puede determinar mediante el ensayo de C4H descrito más arriba. En otro ejemplo, la actividad se determina mediante mediciones de la reducción de un aceptor de electrones artificial, como citocromo c o ferrocianuro oxidado (Xia et al. (2011) J Biol Chem 286:16246-16260; Hamdane et al. (2009) J Biol Chem 284:11374-11384; Shen et al. (1989) J Biol Chem 264:7584-7589). La formación de citocromo c reducido se determina mediante espectrofotometría y se calcula la tasa de reducción a partir del cambio en la A550 con el coeficiente de extinción ( I = 21 mM'1 cirr1) (Imai (1976) J Biochem 80:267-276). Otro ensayo que se usa para detectar la CPR es el ensayo indicador de actividad de O-desetilasa con etoxicumarina en sistemas reconstituidos de P450 2B4 (Louerat-Orieu et al. (1998) Eur J Biochem 258:1040-1049).

El sitio de localización de la membrana subcelular, por ejemplo, si la CPR está ubicada en el RE o en el cloroplasto, de un polipéptido de citocromo P450 reductasa, se puede determinar expresando CPR con GFP fusionada a su extremo carboxiterminal en Arabidopsis bajo el control del promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (véase Ro et al. (2002) Plant Physiology 130:1837-1851). Las plántulas T1 y T2 transformadas independientemente a continuación se criban atendiendo a la presencia de GFP mediante microscopía de fluorescencia y microscopía confocal (véase Ro et al. (2002) Plant Physiology 130:1837-1851) o mediante inmunotransferencia de proteínas microsomales de plántulas. La funcionalidad de la CPR en las fusiones de GFP-CPR se puede verificar mediante el ensayo de la C4H.

G. Ejemplos

Los siguientes ejemplos se incluyen únicamente a título ilustrativo y no tienen por objeto limitar el alcance de la invención.

Ejemplo 1

Clonación y secuenciación del ADN de Santalum album

En este ejemplo, el ARN se extrajo de muestras de madera de árboles de sándalo (Santalum album) y el ADNc se generó y se secuenció.

A. Aislamiento y extracción del ARN de S. album

Se perforaron varios agujeros de 25 mm en la parte inferior del tronco de árboles maduros de Santalum album que crecían en tierras gestionadas por la Forest Products Commission de Australia occidental. Se recogieron muestras de madera de la zona de transición del duramen-albura y se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido. El ARN se extrajo de 10 g de tejido mediante un protocolo modificado de Kolosova et al., (2004) BioTechniques 36:821-824. Tras la precipitación con LiCl, el ARN se conservó a -80 °C hasta la síntesis del ADNc.

B. Generación de una biblioteca de ADNc de S. album

El ARN total de xilema de S. album (1.4 |jg) se retrotranscribió con retrotranscriptasa SuperScript III (Invitrogen) a 42 °C durante 1 hora con el kit SMART-Creator y el vector pDNR-LIB (Clontech; SEC. N.° ID.:20). La mezcla de ligamiento se introdujo por transformación mediante electroporación en 25 j l de células electrocompetentes de E. coli resistentes a fagos y secuenciadas por Sanger en el Genome Sciences Centre (Vancouver, Canadá).

C. Secuenciación de 454 Pyr y secuenciación de Sanger

Se prepararon dos bibliotecas de ADNc de núcleos de Santalum album y se secuenciaron con tecnología de Sanger, generándose 11 520 secuencias de extremos apareados. Se hizo una placa de secuenciación de 454 Titanium en ambas bibliotecas y se generaron 902 111 lecturas. El ensamblaje se efectuó con las secuencias de Sanger y de 454 con el ensamblador Newbler v2.6 (454 Life Sciences, Roche Diagnostics) aplicando parámetros por omisión. Esto generó 31 461 cóntigos (isotigos).

Ejemplo 2

Identificación de ácido nucleico que codifica polipéptidos de citocromo P450 de S. album

Los genes que codifican el citocromo P450 se identificaron mediante comparación de las secuencias ensambladas (del Ejemplo 1) frente a una serie de genes conocidos que codifican P450 de plantas de las familias de CYP76 de proteínas de P450 mediante una búsqueda con BLASTx (blast.ncbi.nlm.nih.gov; Altschul et al. (1990) J Mol Biol 215:403-410).

En la Tabla 4 más abajo se proporciona un resumen de 7 isotigos identificados en la búsqueda con BLASTx (blast.ncbi.nlm.nih.gov; Altschul et al. (1990) J Mol Biol 215:403-410), incluidos el isotigo, el valor E más bajo, la identificación del gen de la coincidencia en la base de datos de P450, la familia de CYP450 y el número de lecturas. El valor E (valor esperado) hace referencia al número de coincidencias que se prevé que haya de manera aleatoria con una puntuación dada. En general, cuánto más pequeño es el valor de E, más probable es que la coincidencia sea significativa.

Los transcritos de esta familia fueron los más abundantes en la base de datos de EST y se agrupan en cuatro grupos distintos. El grupo 1 está representado por 3 isotigos (números 1-3 en la Tabla 4) con un total de 2143 lecturas que incluyen 1,107 secuencia únicas que generan una secuencia ensamblada final de 1917 pares de bases (pb) con un marco de lectura abierto (ORF) de 1530 pb. El grupo 2 está representado por 2 isotigos (números 4-5 en la Tabla 4), tenía 228 lecturas con 140 lecturas únicas que generan una secuencia ensamblada de 1776 pb y un ORF de 1530 pb. El grupo 3 (número 6 en la Tabla 7) está representado por 11 lecturas que generan una secuencia parcial de 1200 pb. El grupo 4 (número 7 en la Tabla 7) es un singlete de 277 pb con varios codones de parada a lo largo de la secuencia.

Ejemplo 3

Aislamiento del ADNc que codifica el citocromo P450

Para el aislamiento de ADNc, se seleccionaron moléculas de ADNc del grupo 1 y el grupo 2 (números 1-5 en la Tabla más arriba) de la familia de CYP76 identificada en el Ejemplo 2.

A. Clonación de miembros de la familia de CYP76

Las moléculas de ADNc de secuencia completa se amplificaron mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con Phusion Hot Start II DNA Polymerase (Thermo Scientific) de ADNc de S. album (establecido en la SEC. N.° ID.:1) preparado según se describe en el Ejemplo 1 con cebadores específicos para el gen diseñados según el ORF del grupo 1 y el grupo 2 (establecido en la Tabla 5 más abajo). Las condiciones de PCR fueron las siguientes:

98 °C durante 3 min;

2 ciclos de: 98 °C durante 10 s, Tm -2 °C durante 20 s, 72 °C durante 30 s;

30 ciclos de: 98 °C durante 10 s, Tm durante 20 s, 72 °C durante 30 s;

Extensión final a 72 °C durante 7 min

con una Tm de 55 °C para el Isogrupo 1 y una Tm de 52 °C para el Isogrupo 2. Los productos de PCR se purificaron en gel y se clonaron en el vector pJET1.2 (Fermentas, SEC. N.° ID.:21) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se usaron células de E. coli a-Select químicamente competentes (Bioline) para la clonación y la propagación del plásmido. Todos los constructos se verificaron mediante secuenciación del ADN.

La amplificación con cebadores para el isogrupo 1 dio lugar un solo clon de ADNc, designado SaCYP76F38v1 (SaCYP76-G5). La amplificación con cebadores del isogrupo 2 dio lugar a 3 clones distintos de ADNc designados: SaCYP76F39v1 (SaCYP76-G10), SaCYP76F37v1 (SaCYP76-G11) y SaCYP76F38v2 (SaCYP76-G12). Una segunda amplificación con cebadores del isogrupo 2 produjo 6 clones de ADNc adicionales distintos, designados SaCYP76F37v2 (SaCYP76-G14), SaCYP76F39v2 (SaCYP76-G15), SaCYP76F40 (SaCYP76-G16), SaCYP76F41 (SaCYP76-G17), SaCYP76F42 (SaCYP76-G13) y SaCYP76F43 (SaCYP76-G18). Las SEC. N.° ID. de las secuencias nucleotídicas y los aminoácidos codificados se muestran en la Tabla 6 más abajo. Las secuencias aminoacídicas traducidas codificadas por las 10 moléculas de ADNc aislado comparten una identidad de entre un 93% y un 99% (véase la Tabla 7 más abajo) y una divergencia de entre un 1,0% y un 6,6%. Las distancias entre pares se calcularon con ClustalW (slow/accurate, matriz ponderada de Gonnet) (ebi.ac.uk/clustalw; European Bioinformatics Institute).

Ejemplo 4

Secuencia y análisis filogenético de proteínas de SaCYP76

En una búsqueda con BLASTx de las secuencias aminoacídicas deducidas frente a la base de datos GenBank de proteínas no redundantes (blast.ncbi.nlm.nih.gov; Altschul et al. (1990) J Mol Biol 215:403-410) se identificó un posible citocromo P450 de Vitis vinifera (código de accesión de GenBank XP_002281735; SEC. N.° ID.:26) que tiene una identidad de secuencia del 62% al 64% con los CYP de S. album y una geraniol hidroxilasa (CYP76B6) de Catharanthus roseus (código de accesión de GenBank CAC80883; Collu et al. (2001) FEBS Lett 308:215-220; SEC. N.° ID.:27) que tiene una identidad de secuencia del 54% al 55% con los CYP de S. album. El alineamiento de las secuencias aminoacídicas completas se hizo con ClustalW (ebi.ac.uk/clustalw; European Bioinformatics Institute).

Los árboles filogenéticos se construyeron con la versión 4 de MEGA (Centre for Evolutionary Medicine and Informatics; Tamura et al., 2007 Mol Biol Evol 24:1596-1599) mediante el método de «neighbor-joining» (NJ) con parámetros por omisión. Los valores de confianza de bootstrap (500 réplicas) de más del 50% se muestran en los puntos de las ramas. La filogenia obtenida por el método de «neighbour-joining» de las secuencias aminoacídicas predichas de los cuatro clones iniciales de CYP de S. album, SaCYP76F38v1 (SaCYP76-G5), SaCYP76F39v1 (SaCYP76-G10), SaCYP76F37v1 (SaCYP76-G11) y SaCYP76F38v2 (SaCYP76-G12), y enzimas de citocromo P450 para el metabolismo de terpenoides en otras especies se muestra en la Figura 4. Los genes de SaCYP76, que forman un grupo independiente en esta filogenia, son los más estrechamente relacionados con el grupo de CYP76B que incluye geraniol/nerol hidroxilasas de distintas especies. Los números de acceso de las secuencia aminoacídicas incluidas en la filogenia de la Figura 4, además de los clones de CYP76 P450 de S. album, SaCYP76F38v1 (SaCYP76-G5), SaCYP76F39v1 (SaCYP76-G10), SaCYP76F37v1 (SaCYP76-G11) y SaCYP76F38v2 (SaCYP76-G12), proporcionados en la presente memoria, incluyen: Helianthus tuberosus CYP76B1 (CAA71178; SEC. N.° ID.:28); Catharanthus roseus CYP76B6 (CAC80883; SEC. N.° ID.:27); Swertia mussotii CYP76B6 (ACZ48680; SEC. N.° ID.:29); Persea americana CYP71A1 (P24465; SEC. N.° ID.:30); Mentha x piperita CYP71A32 (Q947B7; SEC. N.° ID.:31); Artemisia annua CYP71AV1 (ABB82944; SEC. N.° ID.:32); Cichorium intybus CYP71AV8 (ADM86719; SEC. N.° ID.:33); Lactuca sativa CYP71BL1 (AEI59780; SEC. N.° ID.:34); Nicotiana tabacum CYP71D20 (Q94FM7; SEC. N.° ID.:35); Mentha xpiperita CYP71D13 (Q9XHE7; SEC. N.° ID.:36); Mentha spicata CYP71D18 (Q6WKZ1; SEC. N.° ID.:37); Catharanthus roseus CYP72A1 (Q05047; SEC. N.° ID.:38); y Oryza sativa CYP76M7 (AK105913; SEC. N.° ID.:39).

Se construyó un segundo árbol filogenético por el método de «neighbor-joining» con las 10 proteínas de CYP76F de S. album y citocromos P450 análogos modificadores de terpenos que son miembros de la familia CYP71, con PsCYP720B4 de Picea sitchensis (ADR78276; SEC. N.° ID.:79) como grupo externo. El árbol filogenético se muestra en la Figura 10. Las proteínas de CYP76F de S. album pertenecen a dos clados independientes y el grupo más cercano era el grupo de CYP76B de otras especies. Las santaleno/bergamoteno oxidasas de clado I incluían SaCYP76F39v1 (SaCYP76-G10), SaCYP76F39v2 (SaCYP76-G15), SaCYP76F40 (SaCYP76-G16), SaCYP76F41 (SaCYP76-G17) y SaCYP76F42 (SaCYP76-G13). Entre las bergamoteno oxidasas de clado II se incluyen SaCYP76F37v1 (SaCYP76-G11), SaCYP76F37v2 (SaCYP76-G14), SaCYP76F38v1 (SaCYP76-G5) y SaCYP76F38v2 (SaCYP76-G12). Los números de acceso de las secuencias aminoacídicas para otros CYP modificadores de terpenos incluidos en el árbol filogenético de la Figura 10, además de los clones de CYP76 P450 de S. album, incluyen CaCYP76B4, presunta geraniol-10-hidroxilasa de Camptotheca acuminate (AES93118; SEC. N.° ID.:80); CrCYP76B6, geraniol 10-hidroxilasa de Catharanthus roseus (Q8VWZ7; SEC. N.° ID.:81); SmCYP76B4, geraniol 10-hidroxilasa de Swertia mussotii (D1MI46; SEC. N.° ID.:82); OsCYP76M7, C11a-hidroxilasa de Oryza sativa entcassadiene (NP_001047185; SEC. N.° ID.:83); MpCYP71A32, mentofurano sintasa de Mentha x piperita (Q947B7; SEC. N.° ID.:84); PaCYP71A1, Persea americana (P24465; SEC. N.° ID.:85); C/CYP71AV8, valenceno oxidasa de Cichoriium intybus (ADM86719; SEC. N.° ID.:86); MpCYP71D13, (-)-limoneno-3-hidroxilasa de Mentha x gracilis (AY281027; SEC. N.° ID.:87); NtCYP71D20, 5-epi-aristocoleno-1,3-dihidroxilasa de Nicotiana tabacum (AF368376; SEC. N.° ID.:88); y GaCYp706B1, (+)-deltacadineno-8-hidroxilasa de Gossypium arboretum (AAK60517; SEC. N.° ID.:89).

Ejemplo 5

Citocromo P450 reductasa

Los genes que codifican la citocromo P450 reductasa se identificaron mediante comparación de las secuencias ensambladas con una serie de citocromo P450 reductasas vegetales conocidas de Arabidopsis (CAB58575.1 (SEC. N.° ID.:58) y CAB58576.1 (SEC. N.° ID.:46)). Los genes de ADNc de secuencia completa de SaCPRI y SaCPR2 se amplificaron mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con Phusion Hot Start II DNA Polymerase (Thermo Scientific) de ADNc de S. album preparado según se describe en el Ejemplo 1 con cebadores específicos para el gen diseñados según el ORF de la citocromo P450 reductasa (que se muestra en la Tabla 8).

Las condiciones de la PCR fueron las siguientes:

98 °C durante 3 min;

2 ciclos de: 98 °C durante 10 s, Tm -2 °C durante 20 s, 72 °C durante 30 s;

30 ciclos de: 98 °C durante 10 s, Tm durante 20 s, 72 °C durante 30 s;

Extensión final a 72 °C durante 7 min.

Los productos de PCR se purificaron en gel y se clonaron directamente en el vector pET28b(+) (SEC. N.° ID.:51) o primero se clonaron en el vector pJET y a continuación se subclonaron en vectores de expresión. Se usaron células de E. coli a-Select químicamente competentes (Bioline) para la clonación y la propagación del plásmido. Todos los constructos se verificaron mediante secuenciación del ADN. La amplificación por PCR dio lugar a dos clones de citocromo P450 reductasa (CPR) de S. album, designados CPR1 y CPR2, que tienen secuencias nucleotídicas establecidas en las SEC. N.° ID.:10 y 11, respectivamente, que codifican las proteínas establecidas en las SEC. N.° ID.:12 y 13. Las dos secuencias nucleotídicas de la CPR comparten una identidad de secuencia del 70% y las dos proteínas de CPR comparten una identidad de secuencia del 82%.

A continuación, se usó el programa BlastX de Internet (Altschul et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410) para comparar las secuencias identificadas con las secuencias de la base de datos de GenBank. Las secuencias de la CPR comparten una homología de secuencia del 79% con la proteína predicha similar a citocromo P450 reductasa de Vitis vinifera (número de acceso de Genbank XP_002270732; SEC. N.° ID.:42), una homología de secuencia del 78% con la citocromo P450 reductasa de Gossypium hirsutum (número de acceso de Genbank ACN54324; SEC. N.° ID.:43) y una homología de secuencia del 75% con la citocromo P450 reductasa de Artemisia annua (número de acceso de Genbank ABI98819; SEC. N.° ID.:44).

Se generaron CPR truncadas que contienen los aminoácidos 44-692 de la SEC. N.° ID.:12 (secuencia de una proteína truncada establecida en la SEC. N.° ID.:14; secuencia nucleotídica establecida en la SEC. N.° ID.:63) y los aminoácidos 61-704 de la SEC. N.° ID.:13 (secuencia de una proteína truncada establecida en la SEC. N.° ID.:15; secuencia nucleotídica establecida en la SEC. N.° ID.:64).

La actividad de SaCPR recombinante se evaluó mediante el kit de ensayo de citocromo C reductasa (NADPH) (Sigma).

Ejemplo 6

Análisis por cromatografía de gases-espectrometría de masas

Los productos de oxidación de los citocromos P450 de S. album y el aceite de S. album se analizaron mediante cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS).

A. Columna capilar SGE Solgel-Wax

El análisis por GC-MS se llevó a cabo en un sistema de GC-MS Agilent 6890A/5973N que contenía una columna capilar Sg E Solgel-Wax (30 m * 0,25 mm de d.i. * 0,25 |jm de grosor) en modo SIM (barrido: m/z 40-400; SIM: m/z 93, 94, 119, 136, 122, 202 y 204 [tiempo de residencia: 50]. Se inyectaron volúmenes de muestra de 2 j l en modo splitless pulsado a 250 °C con un caudal de helio en la columna de 1 ml/min y una presión pulsada de 50 psi durante 0,5 min con el siguiente programa: 40 °C durante 2 min, rampa de 8 °C por min hasta alcanzar los 100 °C, 15 °C per min hasta alcanzar los 250 °C, mantener durante 5 min.

Como otra posibilidad, el siguiente programa también se usó para analizar los productos de SaCYP76F39v1 (SaCYP76-G10) de S. album y aceite de S. album: se inyectaron volúmenes de muestra de 2 j l en modo splitless pulsado a 250 °C con un caudal de helio en la columna de 0,8 ml/min y una presión pulsada de 10 psi durante 0,05 min con el siguiente programa: 40 °C durante 3 min, 10 °C por min hasta alcanzar los 100 °C, 2 °C por min hasta alcanzar los 250 °C, mantener durante 10 min.

Los productos se identificaron atendiendo a la mejor coincidencia de los perfiles de fragmentación en MS con las entradas en las bibliotecas del NIST y Wiley (Wiley Registry® 9th Edition/NIST 2011; Fred W. McLafferty, John Wiley & Sons, Inc.) y mediante comparación con compuestos del aceite auténtico de S. album y los índices de Kovats.

B. Columna de sílice fundida HP5 y DB-Wax

El análisis por GC-MS se hizo en un sistema de GC-MS Agilent 7890A/5975C con ionización por impacto electrónico y barrido en modo de monitorización de iones seleccionados (SIM). Las muestras se analizaron en una columna HP5 (apolar; 30 m * 0,25 mm de d.i. * 0,25 jm de grosor) y una columna DB-Wax de sílice fundida (polar; 30 m * 0.25 mm de d.i. * 0.25 jm de grosor). En ambos casos, el inyector funcionaba en modo splitless pulsado y la temperatura del inyector se mantuvo a 250 °C. Se usó gas helio como gas portador con un caudal de 0,8 ml/min y una presión pulsada de 25 psi durante 0,5 min. Intervalo de barrido: m/z 40-500; SIM: m/z 93, 94, 105, 107, 119, 122 y 202 [tiempo de residencia: 50 ms].

El programa del horno para la columna HP5 era:

40 °C durante 3 min, rampa de 10 °C por min hasta alcanzar los 130 °C, 2 °C por min hasta alcanzar los 180 °C, 50 °C por min hasta alcanzar los 300 °C, mantener a 300 °C durante 10 min.

El programa del horno para la columna DB-Wax era:

40 °C durante 3 min, rampa de 10 °C por min hasta alcanzar los 130 °C, 2 °C por min hasta alcanzar los 200 °C, 50 °C por min hasta alcanzar los 250 °C, mantener a 250 °C durante 15 min.

Se usó el software Chemstation para la adquisición y el procesamiento de datos. Los compuestos se identificaron mediante comparación de los espectros de masas con los de muestras auténticas y con librerías de espectros de masas del NIST/EPA/NIH (v2.0), así como mediante comparación de los índices de retención con los que se indican en Valder et al. (2003) J Essent Oil Res 15:178-186 y Sciarrone et al. (2011) J Chromatogr A 1218:5374.

Ejemplo 7

Expresión en bacterias y levaduras

Los genes de la FPP sintasa, santaleno sintasa, citocromo P450 SaCYP76F38v1 (SaCYP76-G5) y citocromo P450 reductasa de S. album se clonaron en los vectores de expresión en bacterias pCDF-Duet (Novagen) y pACYC-Duet (Novagen). Los genes que codifican los citocromos CYP76F P450, la citocromo P450 reductasa, la santaleno sintasa y la farnesil difosfato sintasa de S. album de secuencia completa se clonaron en diversos vectores de expresión en levadura que hacen posible la expresión en la cepa BY4741 (MATa his3A1 leu2A0 met15A0 ura3A0; ATCC #201388) de levadura Saccharomyces cerevisiae.

A. Vectores de expresión en bacterias

Los genes que codifican la FPP sintasa (SEC. N.° ID.:18) y la santaleno sintasa (SEC. N.° ID.:16), previamente caracterizadas a partir de S. album (véase la solicitud internacional PCT W02011000026 y Jones et al. (2011) J Biol Chem 286:17445-17454), se clonaron en el vector de expresión bacteriana pCDF-Duet (Novagen, SEC. N.° ID.:65), generándose pCDF-Duet:SaFPPS:SaSSy. Los genes que codifican SaCPR (SEC. N.° ID.:11) y el gen de SaCYP76F38v1 (SaCYP76-G5) (SEC. N.° ID.:2) se clonaron en el vector de expresión bacteriana pACYC-Duet (Novagen, SEC. N.° ID.:45), generándose pACYCDuet:SaCPR:SaCYP76F38v1. Estos vectores de expresión son vectores de expresión duales que permiten la coexpresión de dos genes de interés por medio de dos sitios de clonación múltiples.

El pCDF-Duet:SaFPPS:SaSSy, que tiene un marcador de selección de resistencia a la estreptomicina, se introdujo por transformación en células C41 (DE3) de E. coli (Avidis) con competencia química. Estas células se dejaron crecer y una vez más se hicieron químicamente competentes con cloruro de calcio, y se transformaron con pACYC-Duet:SaCPR:SaCYP76F38v1, que tiene un marcador de selección de resistencia al cloranfenicol. Ambos antibióticos se usaron para seleccionar las colonias que contenían ambos vectores duales. Estas colonias se dejaron crecer durante la noche en un medio enriquecido (caldo Terrific) a 16 °C y la expresión de la proteína se inició por medio de la adición de IPTG. La expresión de la proteína de citocromo P450 se suplementó con ácido 5-aminolevulínico para favorecer la síntesis de porfirinas, que se hizo patente por un enrojecimiento del sedimento celular.

B. Generación de vectores de expresión en levadura

1. Citocromos P450 de S. album

Los ADNc de secuencia completa del CYP76F de S. album identificados en la Tabla 6 más arriba se subclonaron en el vector de expresión en levadura pYeDP60 (Cullin y Pompon (1988) Gene 65:203-217; Pompon et al. (1996) Methods Enzymol 272:51-64; Abecassis et al. (2003) Methods Mol Biol 231:165-173) mediante la técnica de clonación por excisión de uracilo (USER) de Hamann y Moller (2007) Protein Expr Purif 56:121-127. El vector pYeDP60 contiene un marcador URA. Los constructos resultantes se muestran en la Tabla 9 más abajo.

2. Farnesil difosfato sintasa y santaleno sintasa de S. album

El ADNc que codifica la santaleno sintasa (SaSSY, SEC. N.° ID.:16) y el ADNc que codifica la farnesil difosfato sintasa (SaFPPS, SEC. N.° ID.:18) se clonaron en los sitios Notl-Bgl II y BamHI-Xhol, respectivamente, de los vectores de expresión inducibles por galactosa pESC-LEU (Stratageno, SEC. N.° ID.:47) o pESC-LEU2d (véase Ro et al. (2008) BMC Biotechnology 8:83) mediante in-Fusion Cloning (Clontech) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se generaron vectores adicionales que contenían solo el gen SaSSy (SEC. N.° ID.:16). Los vectores pESC-LEU y pESC-LEU2d contienen un marcador LEU y el vector pESC-LEU2d es un vector con un número elevado de copias que contiene una deleción en el promotor Leu2. Los constructos resultantes se muestran en la Tabla 9 más abajo.

3. Citocromo P450 reductasa

El ADNc que codifica la citocromo P450 reductasa (SaCPR, SEC. N.° ID.:11), identificado en el Ejemplo 3, se clonó en los sitios EcoRi-Notl del vector pESC-HIS (Stratagene, SEC. N.° ID.:49) mediante in-Fusion Cloning (Clontech) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los constructos resultantes se muestran en la Tabla 9 más abajo.

C. Transformación y expresión en levaduras

Todos los constructos se introdujeron por transformación en la cepa BY4741 de levadura Saccharomyces cerevisiae (MATa his3A1 leu2A0 met15A0 ura3A0; núm. de ATCC 201388) mediante el método del LiCl según se describe en Gietz et al. (1992) Nucleic Acids Res 20:1425. Las levaduras transformadas se seleccionaron en placas con un medio defectivo sintético de selección adecuado y se cultivaron a 30 °C durante 48 horas.

1. Expresión de santaleno sintasa

La producción de santalenos y bergamoteno se evaluó mediante constructos que codifican la santaleno sintasa de S. album. Las células de levadura que expresaban el constructo pESC-LEU2d:SaSSY con un elevado número de copias produjeron aproximadamente el doble de cantidad de santalenos y bergamoteno, determinada por GC-MS (según se describe en el Ejemplo 6A), en comparación con las células de levadura que expresaban el constructo pESC-LEU:SaSSY. No se observaron diferencias entre las células que expresaban la santaleno sintasa en presencia o ausencia de farnesil difosfato sintasa, lo que indica que la santaleno sintasa de S. album tenía acceso al FPP producido por las enzimas de levadura para producir santalenos y bergamoteno. El constructo pESC-LEU2d:SaSSY con un elevado número de copias se utilizó para experimentos posteriores.

2. Expresión de santaleno sintasa y citocromo P450 reductasa

El constructo pESC-LEU2d:SaSSY que codifica la santaleno sintasa y el constructo pESC-His:SaCPR que codifica la citocromo P450 reductasa (SaCPR) de S. album se cointrodujeron por transformación en la cepa BY4741 de levadura. Se incluyó la SaCPR para suministrar electrones del NADPH al c Yp450.

Ejemplo 8

Preparación de microsomas

A fin de purificar las enzimas de citocromo P450 de S. album para uso en ensayos in vitro, se prepararon microsomas. Los microsomas contienen retículo endoplásmico (RE) fragmentado que contiene citocromo P450. Por lo tanto, la purificación de microsomas da lugar a un citocromo P450 concentrado y aislado. Los espectros de CO de los P450 recombinantes codificados por los CYP76F P450 de S. album se adquirieron conforme a lo descrito por Guengerich et al. (2009) Nat Protoc 4:1245-1251.

Las membranas de microsomas se prepararon a partir de cultivos de levadura de 250 ml conforme a lo descrito por Pompom et al. (1996) Methods Enzymol 2(71):51-64. En resumen, se usó un cultivo de 5 ml durante la noche para inocular 50 ml de medio defectivo sintético selectivo empezando a una DO600 de 0,2 y se cultivó a 30 °C y 170 rpm durante 24 horas. Se inoculó un volumen de 200 ml de medio YPDE (extracto de levadura al 1%, bacto-peptona al 2%, etanol al 5%, dextrosa al 2%) con 50 ml de cultivo y se incubó durante otras 24 horas a 30 °C y 170 rpm. Las células se recogieron mediante centrifugación durante 10 min a 1000 * g y se indujeron con galactosa al 2% en 250 ml de medio YP a 30 °C, 170 rpm durante 12-16 horas. Para aislar los microsomas, las células de levadura se sedimentaron mediante centrifugación a 2,000 * g durante 10 min, se lavaron una vez con 5 ml de TEK (Tris-HCl 50 mM pH 7,5, EDTA 1 mM, KCl 100 mM) y se redispersaron en solución amortiguadora de TES2 (Tris-HCl 50 mM pH 7,5, EDTA 1 mM, sorbitol 600 mM, DTT 5 mM y Pm SF 0,25 mM). Todos los pasos posteriores se llevaron a cabo a 4 °C. Las pareces de las células de levadura se lisaron mecánicamente con cuentas de vidrio lavadas con ácido (425 600 |jm, Sigma) y agitación manual vigorosa durante 3 * 30 s. El homogeneizado de células se centrifugó a 10000 * g durante 15 min seguido por ultracentrifugación del sobrenadante a 100000 * g durante 1 hora para recoger las membranas. Los microsomas se redispersaron y homogeneizaron en una solución amortiguadora que contenía solución amortiguadora de Tris-HCl 50 mM con un pH de 7,5, EDTA 1 mM y glicerol al 30% (v/v), y se usaron directamente en ensayos enzimáticos o se conservaron a -80 °C.

Los preparados de microsomas para los diez CYP76F de S. album, excepto el SaCYP76F43 (SaCYP76-G18), tenían espectros de absorción diferencial de CO característicos (véase la Figura 18). El contenido de P450 de los preparados de microsomas era de 0,2-1,6 jM . Los preparados de microsomas se evaluaron en términos de su actividad de P450 según se describe en el Ejemplo 11 más abajo.

Ejemplo 9

Generación y aislamiento de olefinas sesquiterpénicas

Las olefinas sesquiterpénicas a-santaleno, p-santaleno, ep/-p-santaleno y a-trans-bergamoteno no están disponible en el mercado, pero se pueden producir mediante expresión de la santaleno sintasa de S. album (SaSSY; SEC. N.° ID.:16) en levadura según se describe en Jones et al. (2011) J Biol Chem 286:17445-17454.

En una fermentación a escala industrial se produjo un aceite de sesquiterpenos que contenía a-santaleno, p-santaleno, ep/-p-santaleno y a-trans-bergamoteno. La mezcla se separó en placas de TLC impregnadas con nitrato de plata conforme a lo descrito por Daramwar et al. (Analyst 137:4564-4570 (2012)). Las fracciones se extrajeron de las placas de TLC mediante raspado y los sesquiterpenos se eluyeron con pentano seguido de análisis por GC-MS para determinar la pureza. Los cromatogramas de iones seleccionados se muestran en las Figuras 19A-19D para el aceite que contiene a-santaleno, p-santaleno, ep/-p-santaleno y a-frans-bergamoteno (Figura 19A), a-santaleno (pico 1, Figura 19B), a-frans-bergamoteno (pico 2, Figura 19C) y ep/-p-santaleno y p-santaleno (picos 3 y 4, Figura 19D). Los sesquiterpenos aislados se usaron en ensayos /n v/tro en el Ejemplo 11 más abajo.

Ejemplo 10

Caracterización funcional de la actividad del citocromo P450 de S. album en S. cerevisiae

La cepa hospedadora de levadura de S. cerev/s/ae que contiene santaleno sintasa y citocromo P450 reductasa activas descritas en el Ejemplo 7.C.2 se usaron para expresar los citocromos CYP76F p450 de S. album identificados en el Ejemplo 2 más arriba. La actividad se evaluó mediante análisis de la formación /n v/vo de productos de oxidación según se describe en el Apartado A más abajo. Cada uno de los CYP76F de S. album en un vector pYeDP60 se introdujeron por transformación de manera individual en la célula hospedadora de levadura que expresaba santaleno sintasa y CPR. Se generó una cepa de control que contenía el vector vacío pYeDP60.

A. Ensayos in vivo de P450 en levadura

Para los ensayos /n v/vo, la levadura se cultivó durante la noche a 30 °C en 5 ml de dextrosa al 2% y medio selectivo mínimo. Al día siguiente se inició un cultivo de 50 ml a una DO600 inicial de 0,2 y se cultivó a 30 °C con agitación a 170 rpm hasta que el cultivo alcanzó una DO600 de 0,6-0,8. La expresión de proteínas se inició mediante transferencia en medio selectivo mínimo con galactosa al 2% y se cultivó durante aproximadamente 14-16 horas. Las células de levaduras se recolectaron mediante centrifugación a 1000 * g durante 10 min y se lavaron una vez con 5 ml de ddH2O estéril. Las células se sometieron a extracción dos veces con 2 ml de hexano:acetato de etilo (85:15) utilizando aproximadamente 250 pl de cuentas de vidrio lavadas con ácido (425-600 pm, Sigma) y agitación vorticial durante 1 min. Los extractos agrupados se transfirieron a un tubo de ensayo limpio que contenía Na2SO4 anhidro y se evaporaron bajo una corriente suave de gas N2 hasta un volumen de aproximadamente 200 pl. Las muestras se transfirieron a un vial de vidrio de GC para su análisis por GC-MS (según se describe en el Ejemplo 6) o se conservaron a -80 °C.

B. P450 de Santalum album de clado I

Se evaluó la actividad /n v/vo de los P450 de S. album de clado I SaCYP76F39v1 (SaCYP76-G10), SaCYP76F39v2 (SaCYP76-G15), SaCYP76F40 (SaCYP76-G16), SaCYP76F41 (SaCYP76-G17) y SaCYP76F42 (SaCYP76-G13) mediante análisis por GC-MS según se detalla en el Ejemplo 6A o 6B.

1. SaCYP76F39v1 (SaCYP76-G10) con análisis por GC-MS según se detalla en el Ejemplo 6A

La coexpresión de santaleno sintasa y SaCYP76F39v1 (SaCYP76-G10) se tradujeron en la detección de 11 picos de productos que se identificaron como a-, p- y ep/-p-santalol y a-frans-bergamotol (véanse las Figuras 8A-8B y la Tabla 11 más abajo). Nueve (9) de los 11 productos también se detectaron en el aceite de S. album, aunque en distintas proporciones, como se muestra en la Figura 8A y 8B. Los productos se identificaron atendiendo a las coincidencias de los perfiles de fragmentación en MS con las entradas en las bibliotecas del NIST y Wiley (Wiley Registry® 9th Edition/NIST 2011; Fred W. McLafferty, John Wiley & Sons, Inc.) y mediante comparación con compuestos del aceite auténtico de S. album y los índices de Kovats (véanse la Figura 8A y la Tabla 11). Los principales componentes del aceite de S. album son el a-santalol, Z-a-frans-bergamotol, E-c/s,ep/-p-santalol y frans-p-santalol, mientras que los principales productos de SaCYP76F39v1 (SaCYP76-G10) son el c/s-a-santalol, a-santalol y frans-p-santalol. Estas diferencias se pueden deber a las distintas condiciones fisiológicas, como el pH, en que las enzimas SaSSy y SaP450 son activas en las células de levadura y en los árboles, o se pueden deber a cambios en las proporciones de productos a lo largo del tiempo. Los productos monitorizados en levadura se formaron y se acumularon a lo largo de un período de horas, mientras que el aceite extraído de árboles es posiblemente el producto de años de acumulación. También se observaron el farnesol (etiquetado con #), que se produce en levadura independientemente de la expresión de santaleno sintasa, y el ácido dodecanoico (etiquetado con *), que se extrae de la levadura, (véanse las Figuras 8B y 8C).

2. SaCYP76F39v1 (SaCYP76-G10) con análisis por GC-MS según se detalla en el Ejemplo 6B

La coexpresión de santaleno sintasa y SaCYP76F39v1 (SaCYP76-G10) dio lugar a la detección de ocho productos identificados como (Z)- y (E)-a-santalol (picos 5 y 7), (Z)- y (E)-p-santalol (picos 6 y 8), (Z)- y (E)-epi-p-santalol (picos 9 y 11) y (Z)- y (E)-a-frans-bergamotol (picos 10 y 12) (véase la Figura 11A). En la Tabla l2 a continuación se indica el número de pico, el compuesto y los índices de retención lineales correspondientes a la columna DBwax y la columna HP5. Los productos se identificaron atendiendo a la mejor coincidencia de los perfiles de fragmentación en MS con las entradas en las bibliotecas del NIST y Wiley (Wiley Registry® 9th Edition/NlST 2011; Fred W. McLafferty, John Wiley & Sons, Inc.) y mediante comparación con compuestos del aceite auténtico de S. album y los índices de Kovats. Tal y como se muestra en la figura, el pico de producto correspondiente al (Z)-a-frans-bergamotol se solapaba con el pico correspondiente al (E,E)-farnesol, que se produjo en levadura independientemente de SaCYP76F39v1 (SaCYP76-G10) (véase la Figura 11B).

Una fracción de los sesquiterpenoles producidos estaban modificados a compuestos no identificados (identificado con una almohadilla (#) en la Figura 11A). Cuando las células de levadura que no estaban transformadas se incubaron con aceite de sándalo auténtico, se identificaron los mismos compuestos no identificados, lo que implica que estos compuestos no identificados no son productos directos de SaCYP76F39v1 (SaCYP76-G10), sino que son producidos por una actividad endógena de transformación en levadura de sesquiterpenoles del sándalo (véanse las Figuras 12A-12B).

3. SaCYP76F39v2 (SaCYP76-G15), SaCYP76F40 (SaCYP76-G16), SaCYP76F41 (SaCYP76-G17) y SaCYP76F42 (SaCYP76-G13)

SaCYP76F39v2 (SaCYP76-G15), SaCYP76F40 (SaCYP76-G16), SaCYP76F41 (SaCYP76-G17) y SaCYP76F42 (SaCYP76-G13) se evaluaron en términos de su capacidad de oxidar sesquiterpenos en el ensayo in vivo descrito más arriba mediante análisis por GC-MS según se detalla en el Ejemplo 6B. La coexpresión de santaleno sintasa y SaCYP76F39v2 (SaCYP76-G15), SaCYP76F40 (SaCYP76-G16), SaCYP76F41 (SaCYP76-G17) o SaCYP76F42 (SaCYP76-G13) dieron perfiles de productos con proporciones casi idénticas a las observadas con SaCYP76F39v1 (saCYP76-G10) (véanse la Tabla 12 y las Figuras 13A-13D).

C. P450 de Santalum album de clado II

Se evaluó la actividad in vivo de los P450 de S. album de clado II SaCYP76F37v1 (SaCYP76-G11), SaCYP76F38v2 (SaCYP76-G12), SaCYP76F37v2 (SaCYP76-G14) y SaCYP76F38v1 (SaCYP76-G5) mediante análisis por GC-MS según se detalla en el Ejemplo 6A o 6B.

1. SaCYP76F38v1 (SaCYP76-G5), SaCYP76F37v1 (SaCYP76-G11) y SaCYP76F38v2 (SaCYP76-G12) con análisis por GC-MS según se describe en el Ejemplo 6A

La coexpresión de santaleno sintasa con SaCYP76F38v1 (SaCYP76-G5), SaCYP76F37v1 (SaCYP76-G11) o SaCYP76F38v2 (SaCYP76-G12) en el sistema de levadura recombinante dio lugar a productos prácticamente idénticos (véanse las Figuras 6A, 6B y 6C y la Tabla 13 más abajo). Los productos se identificaron atendiendo a las coincidencias de los perfiles de fragmentación en MS con las entradas en las bibliotecas del NIST y Wiley (Wiley Registry® 9th Edition/NIST 2011; Fred W. McLafferty, John Wiley & Sons, Inc.) y mediante comparación con compuestos del aceite auténtico de S. album y los índices de Kovats (véanse la Figura 7 y la Tabla 13). Los picos 1 y 7, que se observaron para SaCYP76F38v1 (SaCYP76-G5), SaCYP76F37v1 (SaCYP76-G11) y SaCYP76F38v2 (SaCYP76-G12), corresponden a a-trans-bergamotol, y posiblemente representa distintos isómeros. También se observaron los picos 1 y 7 para el aceite de S. album (véanse la Figura 7 y la Tabla 13). Un tercer pico (etiquetado con #) con un tiempo de retención de aproximadamente 18 minutos se identificó como farnesol, que es producido por la levadura independientemente de la expresión de santaleno sintasa y SaCYP76, como se observó por su expresión en las células de control que contienen un vector vacío (Figura 6D).

2. SaCYP76F38v1 (SaCYP76-G5), SaCYP76F37v1 (SaCYP76-G11) o SaCYP76F38v2 (SaCYP76-G12) o SaCYP76F37v2 (SaCYP76-G14)

SaCYP76F38v1 (SaCYP76-G5), SaCYP76F37v1 (SaCYP76-G11) o SaCYP76F38v2 (SaCYP76-G12) o SaCYP76F37v2 (SaCYP76-G14) se evaluaron en términos de su capacidad de oxidar sesquiterpenos en el ensayo in vivo descrito más arriba con los análisis por GC-MS descritos en el Ejemplo 6B. La coexpresión de santaleno sintasa con SaCYP76F38v1 (SaCYP76-G5), SaCYP76F37v1 (SaCYP76-G11) o SaCYP76F38v2 (SaCYP76-G12) o SaCYP76F37v2 (SaCYP76-G14) en el sistema de levadura recombinante se tradujo principalmente en E-a-trans-bergamoteno (pico 8 en la Tabla 12) con únicamente trazas de (E)-a-santalol y (E)-p-santalol (picos 7 y 12 en la Tabla 12) (véanse la Tabla 12 y las Figuras 14A-14D).

D. SaCYP76F43 (SaCYP76-G18)

SaCYP76F43 (SaCYP76-G18) se evaluó en términos de su capacidad de oxidar sesquiterpenos en el ensayo in vivo descrito más arriba mediante los análisis por GC-MS descritos en el Ejemplo 6B. No se observó actividad tras la coexpresión de la santaleno sintasa con SaCYP76F43 (SaCYP76-G18) (véase la Figura 14E).

E. SaCPR1 y SaCPR2

Para comprobar si SaCPR1 y SaCPR2, que son idénticas en un 70% en la proteína, podrían dar lugar a cambios en los perfiles de productos, ambas CPR se evaluaron según se indica en el Ejemplo 6B con los SaCYP76F representativos de clase I y clase II SaCYP76F39v1 y SaCYP76F38v1. No se observaron diferencias en los productos ni en las abundancias relativas en comparación con los descritos en los Apartados B.2. y C.2. más arriba.

Ejemplo 11

Ensayos enzimáticos in vitro

Los microsomas de levadura que contenían una citocromo P450 reductasa y un citocromo P450 de S. album, generados en el Ejemplo 8, se evaluaron en términos de su capacidad de oxidar santalenos y bergamoteno mediante A) un ensayo enzimático acoplado in vitro con los productos de reacción de SaSSy y FPP; B) una mezcla aislada de santalenos y bergamoteno como sustrato; o C) santalenos o bergamoteno individuales como sustrato.

A. Oxidación de santalenos y bergamoteno en un ensayo enzimático acoplado

Los ensayos enzimáticos acoplados con santaleno sintasa de S. album (SaSSy) expresada en bacterias (Jones et al. (2011) J Biol Chem 286:17445-17454) se iniciaron con 50 |jg de SaSSy purificada con marcaje de His6 y farnesil pirofosfato (FPP) 70 jM en solución amortiguadora de TPS (HEPES 25 mM, pH 7,5, MgCh 5 mM, DTT 1 mM) en un volumen de 450 j l . Los ensayos se incubaron durante 30 min a 30 °C seguido por la adición de 50 j l del preparado de microsomas que contenía un citocromo P450 de S. album y una citocromo P450 reductasa y NADPH 0,8 mM. La reacción se incubó durante otra hora más a 30 °C y se paró mediante extracción con 500 j l de hexano/acetato de etilo (85:15). La fase orgánica se concentró bajo una corriente suave de gas N2 hasta un volumen de aproximadamente 100 ml y se analizó por GC-MS (según se describe en el Ejemplo 6A más arriba) o se conservó a -80 °C.

1. SaCYP76F38v1 (SaCYP76-G5)

El ensayo enzimático acoplado se llevó a cabo in vitro con SaCYP76F38v1 (SaCYP76-G5) y en comparación con los resultados in vivo para verificar la utilidad del ensayo. El análisis por GC-MS de los productos de reacción obtenidos en el ensayo acoplado mostró los dos mismos picos identificados en el ensayo in vivo en el Ejemplo 8. En ambos ensayos, SaCYP76F38v1 (SaCYP76-G5) catalizó la hidroxilación de bergamoteno para dar Z-a-trans-bergamotol, pero no catalizó la oxidación de ninguno de los santalenos.

B. Oxidación de una mezcla de santalenos y bergamoteno

Se evaluó la actividad de sesquiterpeno oxidasa de los P450 de S. album utilizando una mezcla de santalenos y bergamoteno como sustratos.

1. Ensayos

Se usaron dos ensayos in vitro distintos para evaluar si los CYP76F de S. album presentaban actividad de sesquiterpeno oxidasa.

a. Ensayo in vitro 1

Los ensayos se llevaron a cabo en volúmenes de reacción de 400 j l que contenían 150 j l de solución amortiguadora de fosfato de potasio 100 mM (pH 7,5), 20 j l de NADPH 20 mM, 1 jL de mezcla de santaleno/bergamoteno 25 mM [que contenían a-santaleno, epi-p-santaleno, p-santaleno, a-bergamoteno] y un preparado de microsomas con una concentración de 80 pmol (preparado según se describe en el Ejemplo 8). Las reacciones se incubaron a 30 °C durante 1 hora y se pararon mediante la adición de 500 j l de hexano:acetato de etilo (85:15), seguido por agitación vorticial durante 30 segundos. La fase orgánica se concentró bajo una corriente suave de gas N2 hasta un volumen de aproximadamente 100 j l y se analizó por GC-MS (según se describe en el Ejemplo 6A más arriba) o se conservó a -80 °C.

b. Ensayo in vitro 2

Los ensayos se llevaron a cabo en volúmenes de reacción de 400 ml que contenían fosfato de potasio 50 mM (pH 7,5), NADPH 0,8 mM y sustrato en una concentración de 40 jM . Las reacciones enzimáticas se iniciaron añadiendo 50 jL del preparado de microsomas (preparado en el Ejemplo 8), incubado a 30 °C durante 2 horas con agitación y se paró añadiendo 500 j l de hexano. La fase orgánica se transfirió a un nuevo vial de GC y se concentró bajo una corriente suave de gas N2 hasta un volumen de aproximadamente 100 j l y se analizó por GC-MS (según se describe en el Ejemplo 6B más arriba).

2. P450 de Santalum album de clado I

Los microsomas que contenían los P450 de S. album de clado I SaCYP76F39v1 (SaCYP76-G10), SaCYP76F39v2 (SaCYP76-G15), SaCYP76F40 (SaCYP76-G16), SaCYP76F41 (SaCYP76-G17) y SaCYP76F42 (SaCYP76-G13) se evaluaron en términos de su capacidad de oxidar sesquiterpenos mediante los ensayos descritos más arriba con una mezcla de santalenos y bergamoteno como sustratos.

a. SaCYP76F39v1 (SaCYP76-G10)

La actividad in vitro de sesquiterpeno oxidasa del P450 de S. album de clado I SaCYP76F39v1 (SaCYP76-G10) se evaluó mediante los dos ensayos descritos más arriba.

i. Experimento inicial con el ensayo in vitro 1

Los microsomas que contenían SaCYP76F39v1 (SaCYP76-G10) se evaluaron en términos de su actividad mediante el ensayo descrito en el Apartado B.1.a más arriba. El análisis por GC-MS mostró ocho picos de productos distintos que se identificaron como santaloles (véase la Figura 9B, los picos corresponden a los de la Tabla 11 de arriba). Los productos se identificaron atendiendo a la mejor coincidencia de los perfiles de fragmentación en MS con las entradas en las bibliotecas del NIST y Wiley (Wiley Registry® 9th Edition/NIST 2011; Fred W. McLafferty, John Wiley & Sons, Inc.) y mediante comparación con compuestos del aceite auténtico de S. album (Figura 9A) y los índices de Kovats.

ii. Ensayo con el ensayo in vitro 2

Los microsomas que contenían SaCYP76F39v1 (SaCYP76-G10) se evaluaron en términos de su actividad mediante el ensayo descrito en el Apartado B.1.b más arriba. El análisis por GC-MS de los productos de reacción mostró que SaCYP76F39v1 (SaCYP76-G10) catalizó la hidroxilación de a-santaleno, p-santaleno, ep/-p-santaleno y a-trans-bergamoteno, produciendo 8 compuestos distintos identificados como (Z)- y (E)-a-santalol, (Z)- y (E)-p-santalol, (Z)- y (E)-ep/-p-santalol, y (Z)- y (E)-a-trans-bergamotol (véanse la Figura 15A y la Tabla 12). El perfil de productos se comparó con una muestra de aceite de sándalo auténtico (véanse la Tabla 12 y la Figura 15B), que mostró idénticos tiempos de retención y espectros de masas para los 8 compuestos, pero en distintas proporciones. SaCYP76F39v1 (SaCYP76-G10) produjo (E)-a-santalol y (Z)-a-santalol en una proporción de aproximadamente 5:1, y (E)-p-santalol y (Z)-p-santalol en una proporción de aproximadamente 4:1. Los principales productos formados con SaCYP76F39v1 (SaCYP76-G10) fueron el (E)-a-santalol y el (E)-p-santalol, mientras que los principales compuestos del aceite de sándalo son el (Z)-a-santalol y el (Z)-p-santalol. No se formó ningún producto en ausencia de NADPH o con microsomas de levadura que llevaban un vector vacío (véase la Figura 15C).

b. SaCYP76F39v2 (SaCYP76-G15), SaCYP76F40 (SaCYP76-G16), SaCYP76F41 (SaCYP76-G17) y SaCYP76F42 (SaCYP76-G13)

Los microsomas que contenían SaCYP76F39v2 (SaCYP76-G15), SaCYP76F40 (SaCYP76-G16), SaCYP76F41 (SaCYP76-G17) y SaCYP76F42 (SaCYP76-G13) se evaluaron en términos de su actividad mediante el ensayo descrito en el Apartado B.1.b más arriba. El análisis por GC-MS de los productos de reacción mostró que SaCYP76F39v2 (SaCYP76-G15), SaCYP76F40 (SaCYP76-G16), SaCYP76F41 (SaCYP76-G17) y SaCYP76F42 (SaCYP76-G13) dio lugar a perfiles de productos similares a los observados con SaCYP76F39v1 (SaCYP76-G10) (véanse la Tabla 12 y las Figuras 16A-16D). Los productos mayoritarios observados para SaCYP76F40 (SaCYP76-G16) y SaCYP76F42 (SaCYP76-G13) eran (E)-a-trans-bergamotol (o (E)-a-exo-bergamotol) y (E)-p-santalol.

3. P450 de S. album de ciado II

Se evaluó la actividad de sesquiterpeno oxidasa de los microsomas que contenían los P450 de S. album de clado II SaCYP76F37v1 (SaCYP76-G11), SaCYP76F38v2 (SaCYP76-G12), SaCYP76F37v2 (SaCYP76-G14) y SaCYP76F38v1 (SaCYP76-G5) mediante los ensayos descritos más arriba con una mezcla de santalenos y bergamoteno como sustratos.

a. SaCYP76F37v1 (SaCYP76-G11) y SaCYP76F38v2 (SaCYP76-G12)

Los microsomas que contenían SaCYP76F37v1 (SaCYP76-G11) y SaCYP76F38v2 (SaCYP76-G12) se evaluaron en términos de su actividad mediante el ensayo descrito en el Apartado B.1.a más arriba. El análisis por GC-MS de los productos de reacción mostró un pico de producto que estaba ausente en la reacción de control (microsomas que únicamente contenían vector como control). Atendiendo a la mejor coincidencia de los perfiles de fragmentación en MS con las entradas en las bibliotecas del NiST y Wiley (Wiley Registry® 9th Edition/NIST 2011; Fred W. McLafferty, John Wiley & Sons, Inc.) y mediante comparación con compuestos del aceite auténtico de S. album y los índices de Kovats, el pico de producto se identificó como Z-a-trans-bergamotol.

b. SaCYP76F37v1 (SaCYP76-G11), SaCYP76F38v2 (SaCYP76-G12), SaCYP76F37v2 (SaCYP76-G14) y SaCYP76F38v1 (SaCYP76-G5)

Los microsomas que contenían SaCYP76F37v1 (SaCYP76-G11), SaCYP76F38v2 (SaCYP76-G12), SaCYP76F37v2 (SaCYP76-G14) y SaCYP76F38v1 (SaCYP76-G5) se evaluaron en términos de su actividad mediante el ensayo descrito en el Apartado B.1.b más arriba. El análisis por GC-MS de los productos de reacción mostró que SaCYP76F37v1 (SaCYP76-G11), SaCYP76F38v2 (SaCYP76-G12), SaCYP76F37v2 (SaCYP76-G14) y SaCYP76F38v1 (SaCYP76-G5) producían tres compuestos, que se identificaron como (E)-a-trans-bergamotol (o (E)-a-exo-bergamotol), que era el producto mayoritario, y (E)-a-santalol y (E)-p-santalol, que eran los productos minoritarios (véanse la Tabla 12 y las Figuras 17A-17D).

4. SaCYP76F43 (SaCYP76-G18)

Los microsomas que contenían SaCYP76F43 (SaCYP76-G18) se evaluaron en términos de su actividad mediante el ensayo descrito en el Apartado B.1.b más arriba con una mezcla de santalenos y bergamoteno como sustrato. No se observó actividad (véase la Figura 17E) posiblemente debido a la baja expresión en levadura, como queda demostrado por el espectro de absorción diferencial de CO correspondiente (véase la Figura 18).

C. Oxidación de sesquiterpenos individuales

Los preparados de microsomas que contenían P450 candidatos se evaluaron en términos de su capacidad de oxidar sesquiterpenos individuales. Los sesquiterpenos se aislaron según se describe en el Ejemplo 9 más arriba. Se utilizaron fracciones que contenían principalmente a-santaleno, a-trans-bergamoteno o ep/-p-santaleno y p-santaleno como sustratos individuales en ensayos que contenían el P450 de clado I SaCYP76F39v1 (SaCYP76-Gl0) o el P450 de clado II SaCYP76F37v1 (SaCYP76-Gll). Los ensayos se llevaron a cabo según se describe en el Apartado B.l.b más arriba y los productos se identificaron mediante comparación con patrones auténticos (véanse la Tabla 12 y la Figura 20G).

La reacción de SaCYP76F39v1 (SaCYP76-G10) con a-santaleno produjo (Z)- y (E)-a-santalol, mientras que SaCYP76F37v1 (SaCYP76-G11) solo produjo (E)-a-santalol (véase la Figura 20a frente a la Figura 20D). Con el atrans-bergamoteno, SaCYP76F39v1 (SaCYP76-G10) produjo (Z)- y (E)-a-trans-bergamotol, mientras que con SaCYP76F37v1 (SaCYP76-G11) solo se observó la formación de (E)-a-trans-bergamotol (véase la Figura 20B frente a la Figura 20E). SaCYP76F39v1 (SaCYP76-G10) dio cuatro productos, (Z)- y (E)-ep/-p-santalol y (Z)- y (E)-p-santalol, en los ensayos con ep/-p-santaleno y p-santaleno, mientras que en ensayos con SaCYP76F37v1 (SaCYP76-G11) únicamente se detectó (E)-p-santalol (véase la Figura 20C frente a la Figura 20F). Estos resultados confirman las actividades observadas en ensayos /n v/tro con microsomas con la mezcla de santalenos y bergamoteno (Apartado B más arriba).

RESUMEN DE LOS RESULTADOS DE LOS EJEMPLOS 10 Y 11

P450 santaleno/bergamoteno oxidasas de S. album de clado I

Los P450 SaCYP76F39v1 (SaCYP76-G10), SaCYP76F39v2 (SaCYP76-G15), SaCYP76F40 (SaCYP76-G16), SaCYP76F41 (SaCYP76-G17) y SaCYP76F42 (SaCYP76-G13) de S. album de clado I catalizaron la oxidación de santalenos y bergamoteno produciendo los estereoisómeros (Z) y (E) de a-, p- y ep/-p-santaloles y bergamotoles. Las proporciones de estereoisómeros (Z) y (E) de a- y p-santalol obtenidos con los P450 eran de aproximadamente 1:5 y 1:4, respectivamente. Por lo tanto, SaCYP76F39v1 (SaCYP76-G10), SaCYP76F39v2 (SaCYP76-G15), SaCYP76F40 (SaCYP76-G16), SaCYP76F41 (SaCYP76-G17) y SaCYP76F42 (SaCYP76-G13) se identificaron como santaleno/bergamoteno oxidasas.

P450 bergamoteno oxidasas de S. album de clado II

Las P450 de S. album de clado II SaCYP76F37v1 (SaCYP76-G11), SaCYP76F38v2 (SaCYP76-G12), SaCYP76F37v2 (SaCYP76-G14) y SaCYP76F38v1 (SaCYP76-G5) principalmente catalizaron la oxidación del bergamoteno para dar bergamotol, siendo (E)-a-frans-bergamotol el producto principal, y observándose cantidades minoritarias de (E)-asantalol y (E)-p-santalol. SaCYP76F37v1 (SaCYP76-G11), SaCYP76F38v2 (SaCYP76-G12), SaCYP76F37v2 (SaCYP76-Gl4) y SaCYP76F38v1 se identificaron como bergamoteno oxidasas.

Ejemplo 12

Perfil cinético

A fin de evaluar el perfil cinético de las enzimas SaCYP76F de clado I y clado II, se realizaron ensayos cinéticos con SaCYP76F37v1 (SaCYP76-G11) y SaCYP76F39v1 (SaCYP76-G10) utilizando a-santaleno o p-santaleno como sustrato. Los ensayos se llevaron a cabo en volúmenes de reacción de 400 pl que contenían fosfato de potasio 50 mM a pH 7,5, NADPH 0,8 mM y sustrato en concentraciones de 12 a 138 pM de a-santaleno o p-santaleno. Las reacciones enzimáticas se iniciaron añadiendo, o bien SaCYP7639v1 17 pmol, o bien SaCYP7637v1 35 pmol, se incubaron a 30 °C durante 20 minutos con agitación, y se pararon añadiendo 500 pl de hexano. La fase orgánica se transfirió a un nuevo vial de GC y se concentró bajo una corriente suave de gas N2 hasta un volumen de aproximadamente 100 pl y se analizó por GC-MS (según se describe en el Ejemplo 6B más arriba). Los datos cinéticos se evaluaron mediante herramientas descritas en Hernández y Ruiz ((1998) Bioinformatics. 14:227-228).

Los valores de Km aparente, los valores de kcat y los valores de kcat/Km correspondientes a SaCYP76F39v1 (SaCYP76-G10) y SaCYP76F37v1 (SaCYP76-G11) con a-santaleno y p-santaleno se muestran en la Tabla 14 más abajo.

Ejemplo 13

Especificidad frente al sustrato

A. Especificidad frente al sustrato de las enzimas SaCYP76F de ciado I y ciado II

A fin de evaluar el abanico de sustratos utilizados por las enzimas SaCYP76F de ciado I y ciado II, se evaluaron microsomas de levadura que contenían SaCYP76F37v1 (SaCYP76-G11) y SaCYP76F39v1 (SaCYP76-G10) en términos de su capacidad de transformar diversos sesquiterpenos, incluidos los sustratos a-santaleno y p-santaleno, y 7 sesquiterpenos adicionales que se parecen a los santalenos en la cadena lateral isoprenílica acíclica, incluidos el a-curcumeno, el zingiberino, el p-bisaboleno, el p-sesquifelandreno, el a-bisabolol, el trans-p-farneseno y el trans-nerolidol. Cada uno de los sustratos se evaluaron mediante el ensayo in vitro descrito en el Ejemplo 11.B.1.b más arriba.

Los resultados se muestran en la Tabla 15 más abajo, en la que se exponen los sustratos, incluidas sus estructuras, y las actividades relativas que representan la velocidad de formación de productos con respecto a la velocidad de formación de productos por SaCYP76F39v1 (SaCYP76-G10) con p-santaleno. Tal y como se muestra en la tabla, SaCYP76F39v1 (SaCYP76-G10) y SaCYP76F37v1 (SaCYP76-G11) presentan una estrecha selectividad frente al sustrato, con una preferencia de ambos por santalenos, incluidos el a-santaleno o el p-santaleno, como sustratos. SaCYP76F39v1 (SaCYP76-G10) transforman eficientemente solo los dos santalenos y presentan una actividad baja con a-bisabolol. SaCYP76F39v1 (SaCYP76-G10) no usó a-curcumeno, zingibereno, p-bisaboleno, psesquifelandreno, trans-p-farneseno ni trans-nerolidol como sustrato. De manera similar, SaCYP76F37v1 (SaCYP76-G11) presentó actividad selectiva con los dos santalenos y trans-nerolidol.

B. Oxidación de diversos sustratos sesquiterpénicos y monoterpénicos

Los microsomas de levadura que contenían el citocromo P450 de S. album SaCYP76F38v1 (SaCYP76-G5) y citocromo P450 reductasa se evaluaron de manera directa en términos de su capacidad de oxidar distintos sustratos monoterpénicos y sesquiterpénicos, incluidos el linalool, el geraniol, el nerol, el nerolidol y el bisabolol. Las mezclas de reacción contenían fosfato de potasio 50 mM, NADPH 0,8 mM y el sustrato terpénico en una concentración de 60 a 80 |jM en un volumen total de 350 jl. Las reacciones enzimáticas se iniciaron añadiendo 50 j l del preparado de microsomas, se incubó a 30 °C durante 1 hora con agitación y se paró mediante extracción con 500 j l de hexano/acetato de etilo (85:15). La fase orgánica se concentró bajo una corriente suave de gas N2 hasta un volumen de aproximadamente 100 j l y se analizó por GC-MS según se describe en el Ejemplo 6. Los resultados se compararon con el control (vector). Los productos de reacción se identificaron atendiendo a la mejor coincidencia de los perfiles de fragmentación en m S con las entradas en las bibliotecas del NIST y Wiley (Wiley Registry® 9th Edition/NIST 2011; Fred W. McLafferty, John Wiley & Sons, Inc.).

1. SaCYP76F38v1 (SaCYP76-G5)

La reacción de SaCYP76F38v1 (SaCYP76-G5) con linalool dio lugar a dos productos: pico 1, tiempo de retención de aproximadamente 17,5 minutos y pico 2, tiempo de retención de aproximadamente 18,5 minutos. El linalool tiene un tiempo de retención de aproximadamente 10,5. Las mejores coincidencias de los perfiles de fragmentación en MS de los picos 1 y 2 corresponden al 3,8-dimetil-1,7-octadien-6-ol y el 8-hidroxilinalool, respectivamente. La reacción de SaCYP76F38v1 (SaCYP76-G5) con geraniol dio lugar a un producto con un tiempo de retención de aproximadamente 21 minutos. El geraniol tiene un tiempo de retención de aproximadamente 14 minutos. La mejor coincidencia del perfil de fragmentación en MS de este pico corresponde al trans,trans-2,6-dimetil-2,6-octadien-1,8 diol. La reacción de SaCYP76F38v1 (SaCYP76-G5) con nerol dio lugar a un producto con un tiempo de retención de aproximadamente 20,8 minutos, mientras que el nerol tiene un tiempo de retención de aproximadamente 13,4 minutos. La mejor coincidencia del perfil de fragmentación en MS de este pico corresponde al 2,6-dimetil-2,6-octadien-1,8 diol. La reacción de SaCYP76F38v1 (SaCYP76-G5) con nerolidol dio lugar a dos productos, con tiempos de retención de aproximadamente 21,3 y 22,3 minutos, mientras que el nerolidol tiene un tiempo de retención de aproximadamente 16,1 minutos. La reacción de SaCYP76F38v1 (SaCYP76-G5) con bisabolol dio lugar a un producto con un tiempo de retención de aproximadamente 25,2, mientras que bisabolol tiene un tiempo de retención de aproximadamente 17,6 minutos. Los perfiles de fragmentación en MS de productos formados por reacción de SaCYP76F38v1 (SaCYP76-G5) con nerolidol y bisabolol no coincidían con las sustancias conocidas en las bases de datos de perfiles de fragmentación en MS.

2. SaCYP76F39v1 (SaCYP76-G10)

CYP76-G10 también catalizó la hidroxilación del linalool, nerol y bisabolol in vitro. En cada caso, la formación de productos fue la misma que la obtenida mediante catálisis con CYP76-G5 descrita más arriba.

Dado que las modificaciones serán evidentes para los expertos en la materia, se pretende que esta invención esté limitada únicamente por el alcance de las reivindicaciones anexas.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una célula hospedadora, que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una citocromo P450 reductasa, o una porción con actividad catalítica de la misma, donde:

la citocromo P450 reductasa codificada, o una porción con actividad catalítica de la misma, presenta una identidad de secuencia de al menos un 80% con un polipéptido de citocromo P450 reductasa establecido en las SEC. N.° ID.:12 o 13, o una porción con actividad catalítica del mismo;

el polipéptido codificado de citocromo P450 reductasa, o un fragmento con actividad catalítica del mismo, cataliza la transferencia de dos electrones del NADPH a un aceptor de electrones; y

la molécula de ácido nucleico es heteróloga para la célula hospedadora.

2. La célula hospedadora de la reivindicación 1, donde el polipéptido codificado de citocromo P450 reductasa, o un fragmento con actividad catalítica del mismo, presenta una identidad de secuencia aminoacídica de al menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con una secuencia aminoacídica establecida en las SEC. N.° ID.:12 o 13.

3. La célula hospedadora de cualquiera de las reivindicaciones 1-2, donde el polipéptido codificado de citocromo P450 reductasa, o una porción con actividad catalítica del mismo, es un polipéptido de P450 reductasa de Santalum.

4. La célula hospedadora de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde el polipéptido codificado de citocromo P450 reductasa, o un fragmento con actividad catalítica del mismo, comprende una secuencia aminoacídica que tiene una identidad de secuencia de al menos un 95% con una secuencia aminoacídica establecida en las s Ec . N.° ID.:12 o 13.

5. La célula hospedadora de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde el polipéptido codificado de citocromo P450 reductasa, o un fragmento con actividad catalítica del mismo, comprende una secuencia aminoacídica establecida en las SEC. N.° ID.:12 o 13.

6. La célula hospedadora de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, donde el polipéptido codificado de citocromo P450 reductasa es un fragmento con actividad catalítica que comprende una secuencia aminoacídica establecida en las SEC. N.° ID.:14 o 15, o una secuencia que presenta una identidad de secuencia aminoacídica de al menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con una secuencia aminoacídica establecida en las SEC. N.° ID.:14 o 15.

7. La célula hospedadora de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, donde el aceptor de electrones es un citocromo P450, hemo oxigenasa, citocromo b¡ o escualeno epoxidasa.

8. La célula hospedadora de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, que además comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de citocromo P450 oxidasa, o una porción con actividad catalítica del mismo, donde:

el polipéptido codificado de citocromo P450 oxidasa, o un fragmento con actividad catalítica del mismo, cataliza la hidroxilación o monooxigenación de santaleno y/o bergamoteno; y

la molécula de ácido nucleico es heteróloga para la célula hospedadora.

9. La célula hospedadora de la reivindicación 8, donde el polipéptido codificado de citocromo P450 oxidasa presenta una identidad de secuencia de al menos un 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con la SEC. N.° ID.:50.

10. La célula hospedadora de la reivindicación 8 o la reivindicación 9, donde:

el polipéptido codificado de citocromo P450 oxidasa, o un fragmento con actividad catalítica del mismo, comprende una secuencia aminoacídica establecida en las SEC. N.° ID.:7, 74, 75, 76 o 77; o

el polipéptido codificado de citocromo P450 oxidasa, o un fragmento con actividad catalítica del mismo, comprende una secuencia aminoacídica que presenta una identidad de secuencia de al menos un 70% con una secuencia aminoacídica establecida en las SEC. N.° ID.:7, 74, 75, 76 o 77; y

el polipéptido codificado de citocromo P450 oxidasa, o un fragmento con actividad catalítica del mismo, cataliza la hidroxilación o monooxigenación de santaleno y/o bergamoteno.

11. La célula hospedadora de la reivindicación 10, donde el polipéptido codificado de citocromo P450 oxidasa, o un fragmento con actividad catalítica del mismo, presenta una identidad de secuencia aminoacídica de al menos un 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con una secuencia aminoacídica establecida en las SEC. N.° ID.:7, 74, 75, 76 o 77.

12. La célula hospedadora de la reivindicación 8, donde el polipéptido de citocromo P450 oxidasa, o un fragmento con actividad catalítica del mismo, comprende la secuencia aminoacídica establecida en las SEC. N.° ID.:6, 8, 9 o 73.

13. La célula hospedadora de cualquiera de las reivindicaciones 1-8, que comprende:

(a) una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de citocromo P450 oxidasa, o una porción con actividad catalítica del mismo, donde:

el polipéptido codificado de citocromo P450 oxidasa, o una porción con actividad catalítica del mismo, presenta una identidad de secuencia de al menos un 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con la SEC. N.° ID.:7; el polipéptido codificado de citocromo P450 oxidasa, o un fragmento con actividad catalítica del mismo, cataliza la hidroxilación o monooxigenación de santaleno y/o bergamoteno; y

la molécula de ácido nucleico es heteróloga para la célula hospedadora;

(b) una molécula de ácido nucleico que codifica una citocromo P450 reductasa, o una porción con actividad catalítica de la misma, donde:

la molécula de ácido nucleico es heteróloga para la célula hospedadora; y

la citocromo P450 reductasa codificada, o una porción con actividad catalítica de la misma, comprende una secuencia aminoacídica establecida en la SEC. N.° ID.:13, o una secuencia aminoacídica que tiene una identidad de secuencia de al menos un 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con un polipéptido de citocromo P450 reductasa establecido en la SEC. N.° ID.:13; y

(c) una molécula de ácido nucleico que codifica una santaleno sintasa, donde:

la molécula de ácido nucleico es heteróloga para la célula hospedadora; y

la santaleno sintasa codificada comprende la secuencia aminoacídica establecida en cualquiera de la SEC. N.° ID.:17, o una secuencia aminoacídica que es idéntica en al menos un 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% a cualquiera de la SEC. N.° ID.:17, o un fragmento con actividad catalítica del mismo.

14. Una célula hospedadora, que comprende:

el polipéptido codificado de citocromo P450 oxidasa, o una porción con actividad catalítica del mismo, presenta una identidad de secuencia de al menos un 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con la SEC. N.° ID.:50;

el polipéptido codificado de citocromo P450 oxidasa, o un fragmento con actividad catalítica del mismo, cataliza la hidroxilación o monooxigenación de santaleno y/o bergamoteno;

(b) una molécula de ácido nucleico que codifica una citocromo P450 reductasa, o una porción con actividad catalítica de la misma, donde la citocromo P450 reductasa codificada, o una porción con actividad catalítica de la misma, comprende una secuencia aminoacídica establecida en las SEC. N.° ID.:12-15, o una secuencia aminoacídica que tiene una identidad de secuencia de al menos un 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con un polipéptido de citocromo P450 reductasa establecido en las SEC. N.° ID.:12-15; y

(c) una molécula de ácido nucleico que codifica una santaleno sintasa, donde la santaleno sintasa codificada comprende la secuencia aminoacídica establecida en cualquiera de las SEC. N.° ID.:17, 52 o 53 o una secuencia aminoacídica que es idéntica en al menos un 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% a cualquiera de las SEC. N.° ID.:17, 52 o 53 o un fragmento con actividad catalítica de la misma, donde:

al menos una de las moléculas de ácido nucleico establecidas en (a) o (b) es heteróloga para la célula hospedadora.

15. La célula hospedadora de cualquiera de las reivindicaciones 1-14, que es una célula procariota o una célula eucariota.

16. La célula hospedadora de cualquiera de las reivindicaciones 1-15, que produce farnesil difosfato de manera natural o está modificada para producir más farnesil difosfato en comparación con una célula que no está modificada.

17. Una molécula de ácido nucleico que codifica una citocromo P450 reductasa, o una porción con actividad catalítica de la misma, donde:

la molécula de ácido nucleico es ADNc;

la citocromo P450 reductasa codificada, o una porción con actividad catalítica de la misma, presenta una identidad de secuencia de al menos un 80% con un polipéptido de citocromo P450 reductasa establecido en las SEC. N.° ID.:12 o 13; y

el polipéptido codificado de citocromo P450 reductasa, o un fragmento con actividad catalítica del mismo, cataliza la transferencia de dos electrones del NADPH a un aceptor de electrones.

18. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 17, donde el polipéptido codificado de citocromo P450 reductasa, o un fragmento con actividad catalítica del mismo, presenta una identidad de secuencia aminoacídica de al menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con una secuencia aminoacídica establecida en las SEC. N.° ID.:12 o 13.

19. La molécula de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 17-18, donde el polipéptido codificado de citocromo P450 reductasa, o un fragmento con actividad catalítica del mismo, comprende una secuencia aminoacídica establecida en las SEC. N.° ID.:12 o 13.

20. La molécula de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 17-19, donde el polipéptido codificado de citocromo P450 reductasa es un fragmento con actividad catalítica que comprende una secuencia aminoacídica establecida en las SEC. N.° ID.:14 o 15, o una secuencia que presenta una identidad de secuencia aminoacídica de al menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con una secuencia aminoacídica establecida en las SEC. N.° ID.:14 o 15.

21. La molécula de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 17-20, donde el aceptor de electrones es un citocromo P450, hemo oxigenasa, citocromo b¡ o escualeno epoxidasa.

22. Un polipéptido de citocromo P450 reductasa, o una porción con actividad catalítica del mismo, codificado por la molécula de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 17-21.

23. Una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión, que comprende una secuencia nucleotídica que codifica una citocromo P450 reductasa, o un fragmento con actividad catalítica de la misma, donde la citocromo P450 reductasa, o un fragmento con actividad catalítica de la misma, cataliza la transferencia de dos electrones del NADPH a la citocromo P450 oxidasa (aceptor de electrones), y al menos un polipéptido seleccionado de entre ácidos nucleicos que codifican:

a) una citocromo P450 oxidasa de Santalum album, o un fragmento con actividad catalítica de la misma, donde la citocromo P450 oxidasa, o un fragmento con actividad catalítica de la misma, cataliza la hidroxilación o monooxigenación de santaleno y/o bergamoteno; y

b) una santaleno sintasa, o un fragmento con actividad catalítica de la misma, donde la santaleno sintasa cataliza la formación de un santaleno y/o bergamoteno como sustrato terpénico del citocromo P450, donde:

la citocromo P450 oxidasa codificada, o un fragmento con actividad catalítica de la misma, comprende una secuencia aminoacídica establecida en las SEC. N.° ID.:6-9 o 73-77, o una secuencia aminoacídica que presenta una identidad de secuencia de al menos un 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con un polipéptido de citocromo P450 oxidasa establecido en las SEC. N.° ID.:6-9 o 73-77;

la santaleno sintasa, o un fragmento con actividad catalítica de la misma, comprende una secuencia aminoacídica establecida en cualquiera de las SEC. N.° ID.:17, 52 o 53 o una secuencia aminoacídica que es idéntica en al menos un 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% a cualquiera de las SEC. N.° ID.:17, 52 o 53, o un fragmento con actividad catalítica de las mismas; y la citocromo P450 reductasa, o un fragmento con actividad catalítica de la misma, comprende una secuencia aminoacídica establecida en las SEC. N.° ID.:12-15, o una secuencia aminoacídica que tiene una identidad de secuencia de al menos un 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con un polipéptido de citocromo P450 reductasa establecido en las SEC. N.° ID.:12-15.

24. Un vector, que comprende la molécula de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 17-23.

25. Una célula hospedadora, que comprende un vector de la reivindicación 24.

26. Un método para producir un polipéptido de citocromo P450 reductasa, o un fragmento con actividad catalítica del mismo, que comprende:

introducir la molécula de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 17-21 o 23 o un vector de la reivindicación 24 en una célula;

cultivar la célula en condiciones adecuadas para la expresión del polipéptido de citocromo P450 reductasa codificado por el ácido nucleico o vector; y

opcionalmente aislar el polipéptido de citocromo P450 reductasa.

27. Un método para producir un polipéptido de citocromo P450 reductasa, o un fragmento con actividad catalítica del mismo, que comprende:

cultivar las células de cualquiera de las reivindicaciones 1-5 o 25 en condiciones adecuadas para la expresión del polipéptido de citocromo P450 reductasa; y

opcionalmente aislar el polipéptido de citocromo P450 reductasa.

28. Un método para producir un santalol, bergamotol y/o mezclas de los mismos, que comprende:

(a) poner en contacto un pirofosfato acíclico precursor de terpenos con una santaleno sintasa, o un fragmento con actividad catalítica de la misma, en condiciones adecuadas para la formación de un santaleno y/o bergamoteno;

(b) poner en contacto el santaleno y/o el bergamoteno con un polipéptido de citocromo P450 oxidasa; donde los pasos (a) y (b) se efectúan simultánea o secuencialmente y el paso (b) tiene lugar en presencia de un polipéptido de citocromo P450 reductasa, o una porción con actividad catalítica del mismo, de cualquiera de las reivindicaciones 1-7; y

(c) opcionalmente aislar el santalol, bergamotol y/o mezclas de los mismos.

29. Un método para producir un santalol, bergamotol y/o mezclas de los mismos, que comprende:

(a) cultivar una célula hospedadora de cualquiera de las reivindicaciones 1-16 o 25 en condiciones adecuadas para la formación de un santalol, bergamotol y/o mezclas de los mismos; y

(b) opcionalmente aislar el santalol, bergamotol y/o mezclas de los mismos.