CN101703762A - 一种人白介素-32在治疗或预防a型流感病毒感染药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种人白介素-32在制备治疗或预防A型流感病毒感染药物中的应用，利用分子生物学方法克隆和构建了IL-32各个剪接异构体IL-32(α，β，γ，δ，ε，和ζ)的克隆，并且分别转染MDCK细胞，申请人发现过表达了白介素-32的所有亚型的MDCK细胞对A型流感病毒的抵抗力都增强了。不同的IL-32亚型显示出了不同的对A型流感病毒复制的抑制效果，其中IL-32γ抗A型流感病毒的效果最显著，并且只有IL-32γ是分泌型的。人白介素-32是宿主免疫反应中非常重要的抗病毒基因，申请人第一次提出人白介素-32具有非常有效的抗A型流感病毒的功能，同时揭示人白介素-32具有开发抗A型流感病毒有效预防和治疗的应用前景。

Description

一种人白介素-32在治疗或预防A型流感病毒感染药物中的应用

技术领域

本发明涉及分子克隆、A型流感病毒滴度和病毒效价检测技术领域，更具体涉及一种人白介素-32在治疗或预防A型流感病毒感染药物中的应用。

背景技术

典型的A型流感病毒粒子呈球型，直径为80～120nm，平均为100nm。从家禽分离的A型流感病毒，有些毒株主要为球形，而有些毒株为多形性，有的呈长丝状，有的为奇形怪状的颗粒。A型流感病毒的多形性在病毒遗传学研究中可作为一种遗传标志，但初分离的多形态的病毒粒子，经过鸡胚或细胞培养物连续传代后主要变为球形。A型流感病毒的囊膜由纤突、双层类脂膜和基质蛋白构成。囊膜表面的纤突呈放射状排列，纤突可分为两类，一类呈棒状，由血凝素(HA)分子的三聚体构成，另一种呈蘑菇状，由神经氨酸酶(NA)的四聚体构成。HA和NA是病毒的两种主要保护性抗原。HA在病毒吸附及穿膜过程中起关键作用，刺激机体产生的中和抗体可中和病毒的感染，从而可以阻止禽流感的发生，HA在感染过程中可被水解为两条肽链HA1和HA2，是感染细胞的先决条件。NA刺激机体产生的抗体虽然不能中和病毒的感染，但可使病毒的释放量减少，进而使禽流感发生的严重程度大大降低。HA变异率高，是病毒发生抗原变异的主要原因，具有亚型特异性；NA具有比HA基因变异速度慢的特点。基质蛋白是病毒粒子内的主要蛋白成分，其形成的基质膜紧贴在类脂双层内面包围着核衣壳，，是维持病毒形态的结构蛋白。A型流感病毒的核衣壳呈螺旋对称，分为大小不同的8个片段，核酸外被螺旋排列的壳粒，主要由核蛋白构成。

A型流感病毒的复制是一个高度有序的过程，从病毒感染宿主开始到释放子代病毒，完成这一周期约需5～6小时。首先病毒粒子经表面的HA糖蛋白介导，与宿主细胞表面受体结合，通过膜融合或细胞内吞作用使病毒进入胞浆并脱壳。在核内，病毒RNA1～6合成6个单顺反子mRNA，转译为PB2，PB1，PA，NP，HA和NA，病毒RNA7～8的互补RNA经拼接各产生两个mRNA，转译合成M1，M2和NS1，NS2，其中NP和NS1含量最高，高浓度NP触发病毒RNA(负链)的合成，新合成的病毒RNA在核内与NP组成复合体，进而组装病毒核衣壳，又可作为转录第二代mRNA的模板。HA和NA在内质网合成，经高尔基体修饰，随后移植于细胞膜中。M1移行至布满HA和NA的细胞质膜下面，经过与HA、NA或M2的相互作用，发出芽生的信号。NA使子代病毒从细胞膜上释放出来，避免子代病毒在膜上聚集，病毒成熟的最后一步是HA靠宿主的蛋白酶裂解为HA1和HA2，使病毒粒子有感染性。关于子代病毒装配过程中有选择性的只包装8个不同RNA片段而不出差错，至今仍是一个谜。

白介素32(IL-32)，之前被称为自然杀伤细胞转录因子4(NK4).白介素32主要表达于自然杀伤细胞、T细胞、上皮细胞和血单核细胞.白介素32的六种转录本现在已被发现.IL-32在先天性免疫和获得性免疫当中发挥了重要的作用.IL-32和许多其它先天性免疫因子的协同作用已经得到了很好的证实.它不仅仅可以通过激活炎症因子来刺激宿主的免疫反应，同时也能够通过分化单核细胞成为巨噬细胞来直接影响特殊的免疫反应.蛋白酶PR3和PR3激活的IL-32能够在Wegener肉芽肿病中把先天性免疫和自身免疫联系起来.另外，IL-32还具有抗艾滋病的功能.IL-32具有6种不同的剪接异构体，并且这些亚型各自的功能目前并不清楚.

IL-32在多种人类和其他哺乳动物细胞系都可诱导产生IFN-γ刺激人上皮Wish细胞，在细胞裂解液里以时间依赖性方式诱导IL-32的产生，46h后减少；IL-18和IL-1β刺激A549-Rβ(转染IL-18Rβ的人肺癌A549细胞系)，在其裂解液里也以时间依赖性方式诱导IL-32的产生，在未刺激的A549-Rβ里则不能检测到IL-32的合成，在A549-WT(未转染IL-18Rβ的人肺癌A549细胞系)里只有IL-1β能诱导IL-32的产生，类似于IL-1β诱导这种细胞系产生IL-6和IL-8，且IFN-γ能诱导A549-WT裂解液产生IL-32；IL-12与IL-18合用能刺激人NK细胞产生IL-32，这两种细胞因子表现协同作用；用丝裂原ConA刺激人外周血单个核细胞(PBMC)，60h后在其上清和裂解液里都能检测到IL-32产生，且裂解液比上清含更多的IL-32，但是用LPS刺激人PBMC则不能检测到IL-32的产生。IL-2活化的NK细胞或丝裂原刺激的T细胞也能产生IL-32。IL-32能在E.coli和3种不同来源的哺乳动物细胞(人上皮293T细胞系的衍生物Aniou65、Cos7-S和Cos7-T)里产生rIL-32。哺乳动物细胞上清里rIL-32β最大量为1ng/ml，IL-32α低于100pg/ml。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种人白介素-32在制备治疗或预防A型流感病毒感染药物中的应用，利用分子生物学方法克隆和构建了IL-32各个剪接异构体IL-32(α，β，γ，δ，ε，和ζ)基因的克隆，并且分别转染MDCK细胞。申请人发现只有IL-32γ是分泌型的，过表达了白介素-32的所有亚型的MDCK细胞对A型流感病毒的抵抗力都增强了，其中IL-32γ作用最为明显。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：

一.IL-32各个剪接异构体基因的克隆和构建和转染

白介素32的基因组结构和其在染色体上的定位已经被分析。利用NCBI的基因数据库中比对发现白介素32在人染色体16p13.3上，含有8个小外显子，跨长约5kb，外显子1-外显子8长分别为762-935bp、1223-1266bp、2817-2855bp、2994-3053bp、3424-3450bp、3620-3679bp、4430-4549bp和4721-4995bp，第2个外显子含有1个ATG起始密码子。由于mRNA的可变剪接，白介素32有六种转录本：IL-32α、IL-32β、IL-32γ、IL-32δ、IL-32ε、和IL-32ζ(见附图1)。据此设计的IL-32各种亚型的克隆质粒构建的引物如下(酶切位点为EcoRI和HindIII)：

5’-CAGCGAATTCAATGTGCTTCCCGAAGG-3’(sense primer for isoform α，β，γ，andε)；

5’-CAGCGAATTCAATGAAGAAGCTGAAGG-3’(sense primer for isoform δ)；

5’-CAGCGAATTCAATGCAAAATGCAGAAT-3’(sense primer for isoformζ)；

5’-GTCGAAGCTTTCATTTTGAGGATTGGG-3’(antisense primer for all isoforms).

申请人把构建好的6种IL-32亚型过表达质粒(IL-32α、IL-32β、IL-32γ、IL-32δ、IL-32ε、和IL-32ζ)经过测序确认后，转染进MDCK，48小时之后用ELISA检测培养基上清中的IL-32表达量.结果表明，只有过表达IL-32γ的细胞培养上清中表达量大大高于阴性对照，由此证明6种亚型当中，只有IL-32γ可以分泌到细胞外.(见附图2)

二.血凝效价法测IL-32对A型流感病毒滴度的影响

IL-32降低A型流感病毒的滴度。首先，申请人检测了分别过表达不同IL-32亚型之后的MDCK细胞对A型流感病毒感染的抵抗能力。转染48小时后，使用A型流感病毒感染MDCK细胞，在不同的时间点收集细胞培养基上清，用于HA试验检测病毒滴度。申请人发现IL-32均可以抑制病毒的滴度，抑制能力的强弱为IL-32γ＞IL-32ζ＞IL-32β＞IL-32α＞IL-32δ＞IL-32e。其中IL-32γ抑制效果最显著；IL-32ζ，IL-32β和IL-32α次之；IL-32δ和IL-32ε仅仅有微弱的抑制作用。(见附图3)

三.荧光定量PCR检测IL-32对A型流感病毒三种RNA表达水平的影响

IL-32抑制A型流感病毒复制过程中3种类型RNA的水平。为了进一步在复制水平证实IL-32对A型流感病毒复制的影响，申请人检测了A型流感病毒复制过程中的3种RNA的表达水平(mRNA，cRNA和vRNA)。转染48小时后，使用A型流感病毒感染MDCK细胞，感染后3小时收集细胞，逆转录并进行荧光定量PCR试验。实验结果表明，IL-32各种亚型均对A型流感病毒的mRNA，cRNA和vRNA有不同程度的抑制作用，其中IL-32γ的抑制效果最显著，且所有亚型的抑制效果与血凝效价试验基本吻合。(见附图4)

本发明的应用前景有以下几个方面：

本发明通过分子生物学技术得IL-32的各个剪接异构体真核克隆，并在人源真核细胞系实验中发现IL-32具有有效的抗A型流感病毒作用，以此依据为预防和治疗A型流感病毒的药物研究提供一种新的方法和方向，即利用人体自身免疫基因IL-32开发的药物在制备预防和治疗A型流感病毒的药物中的应用。具体应用前景有以下几个方面：一，以IL-32为靶基因，开发能调控该基因表达的药物，通过增强人体自身的免疫能力从而达到对抗A型流感病毒的目的；二，利用IL-32的真核表达克隆在酵母中或制备转基因动物大量表达IL-32，纯化后作为药物直接应用于抗A型流感病毒的预防和治疗中；三，随着基因治疗技术的兴起，利用该基因直接开发抗A型流感病毒的药物在基因疗法中的应用。本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

一.本发明的应用前景之一是利用人IL-32的基因表达产物制备蛋白注射药物用于治疗A型流感病毒感染，该药物中的有效成分是IL-32蛋白，是人体自身的免疫因子，避免了其他抗A型流感病毒药物的毒副作用。

在细胞毒性试验中，中请人转染了IL-32的七种剪接异构体质粒，在细胞中过表达后，细胞内的各种IL-32蛋白亚型含量超出细胞内源性IL-32水平10倍以上，申请人发现六种IL-32亚型对细胞活力均无显著性影响，由此申请人确认从细胞水平上讲IL-32没有毒副作用。(见附图5)

二.如将该基因作为治疗A型流感病毒药物开发的靶基因，其原理是寻找能特异性地诱导IL-32基因大量表达的药物用于治疗A型流感病毒感染，这与传统的中医理验有异曲同工之妙，即通过改善人体自身的免疫能力从而达到抵抗疾病的目的。本发明旨在以IL-32基因作为靶位点，与传统中医相比又具有明确的目标性。

附图说明

图1IL-32六种转录本的基因组组成模式图。

图2转染IL-32的六种剪接异构体真核表达质粒后，分别用elisa法检测细胞上清中IL-32的含量，只有IL-32γ分泌到上清中。

图3IL-32的六种剪接异构体均能降低A型流感病毒感染细胞之后的滴度，其中IL-32γ的效果最为明显。

图4荧光定量PCR方法检测IL-32各种亚型均对A型流感病毒的mRNA(A图)，cRNA(B图)和vRNA(C图)有不同程度的抑制作用，其中IL-32γ的效果最为明显。

图5MTT法检测IL-32各种亚型对细胞活力影响，数据显示IL-32各种亚型对细胞活力没有显著性影响。

具体实施方式

实施例1：

质粒的构建及鉴定

提取Jurkat细胞的mRNA后逆转录PCR得到cDNA，以它为模版用各个间接异构体的克隆引物扩增出的目的片段。载体Pcmv-Tag2A(Sigma公司)经MluI和HindIII双酶切后，纯化回收，16℃水浴连接过夜。电穿孔转化到大肠杆菌DH5α(中国典型培养物保藏中心-武汉大学保藏中心，普通大肠杆菌)中，涂布到氨苄霉素抗性的LB培养板上，37℃培养12-16h，挑选单克隆进行PCR及酶切鉴定，挑选2个克隆进行测序，鉴定目的片段的序列及编码框是否正确。

A.DNA片段的回收，玻璃奶(glass-milk)法

1.取PCR产物，加入1/10体积10Xloading buffer，在含有0.5μg/ml溴化乙锭的琼脂糖凝胶中电泳分离酶切片段。

2.当待回收片段与其它片段完全分离后，用无菌刀片切下含目的DNA带的凝胶。

3.转移凝胶至Eppendorf管中，加入3倍体积的凝胶缓冲液(6M NaCl，50mM Tris-Cl，pH 8.0，10mM EDTA)，50℃保温20min。

4.待凝胶完全融化，加入10μl玻璃奶，振荡均匀，室温(20-25℃以下相同)静置10min。

5.15000rpm离心30sec，弃上清。

6.加入1ml洗涤缓冲液(50％乙醇，0.4M NaCl，20mM Tris-Cl，pH7.5，2mM EDTA)，振荡均匀，15000rpm离心30sec，弃上清。

7.重复步骤6三次。

8.吸弃上清，加入100μl TE溶液，振荡均匀后，50℃洗脱10min。

9.15000rpm离心1min，转移上清至另一各无菌的Eppendorf管中。

10.重复步骤9一次，合并两次上清，15000rpm离心5min，完全去除玻璃奶。

11.依次用苯酚/氯仿、氯仿各抽提一次，取上清。

12.加入1μl肝糖原(glycogen)、1/5体积的10M NH4Ac(pH 5.2)和2.5倍体积预冷的无水乙醇，混匀，置-20℃1hr以上，以沉淀DNA。

13.15000rpm离心20min，吸弃上清，DNA沉淀用预冷的70％(体积比)乙醇清洗两次后，于37℃温箱内干燥。

14.加入10μl无菌双蒸水融解DNA沉淀，-20℃中保存备用。

连接

10x buffer                1ul

pGL3载体(Promega公司)/M+H         1ul

IL-32启动子PCR回收产物/M+H        3ul

T4连接酶                          0.5ul

16℃连接过夜。

B.连接产物的转化

1.在1000ml LB培养基中接入活化过夜的宿主菌大肠杆菌DH5α，37℃剧烈振摇至OD600值为0.5-1.0。

2.将菌液收集在冰预冷的离心管中，4℃，4000rpm离心15min。

3.用1000ml冰预冷的去离子水洗涤菌体沉淀，4℃，4000rpm离心15min。

4.用500ml冰预冷的去离子水洗涤菌体沉淀，4℃，4000rpm离心15min。

5.用20ml冰预冷的10％(体积比)甘油洗涤菌体沉淀，4℃，4000rpm离心15min。

6.加入2-3ml冰预冷的10％(体积比)甘油重悬菌体，调整细胞浓度在3×1010/ml左右，分装成每管40μl，保存于-70℃。

7.临用前，室温融化一小份感受态细胞，置于冰上，加入待转化的质粒DNA 1-2μl，混匀。

8.设置电穿孔仪参数为25μF，2.5kV，200Ω。

9.转移感受态细胞和DNA的混合物至0.2cm的冰预冷电转化杯中，装入电转化槽，打开电脉冲开关，产生一个4秒的脉冲。

10.迅速加入400μl LB培养基，一起转移至无菌Eppendorf管中，于37℃振摇(220rpm)，复苏1hr。

11.取100μl菌液涂布于含相应抗生素的LB平板上，至液体被完全吸收后，倒置平板，于37℃培养箱中培养过夜。将连接产物电击转入宿主菌DH5α，涂布于含氨苄青霉素(Amp)的LB平板上，于37℃温箱培养12-16hrs。

C.阳性克隆的筛选

挑取上述平板上长出的单个菌落并接种到装有灭菌的LB液体培养基(含有氨苄霉素)的试管中，置37℃摇床培养12-16小时后用碱裂解法提取质粒。

D.质粒DNA的提取和纯化

质粒DNA的小量提取

1.以无菌牙签挑取生长在抗性平板上的单菌落，接种到3ml含相应抗生素的LB培养基中，37℃，250rpm振摇培养过夜。

2.次日取出，取1.5ml培养物于Eppendorf管中，4℃，12000rpm离心30s，收集菌体沉淀，吸弃上清液，加入100μl冰预冷的溶液I(溶液I：50mM葡萄糖，25mMTris-Cl，pH8.0，10mM EDTA，pH8.0)，剧烈振荡使沉淀完全悬浮。

3.加入20μl溶液II(溶液II：0.2M NaOH，1％SDS，临用前配制)，颠倒5至7次混匀，待整个溶液澄清，冰浴静置5min。

4.加入150μl冰预冷的溶液III(溶液III：将5M KAc 60mL、HAc 11.5mL、H2O 28.5mL混匀配制成100mL)，轻微振荡均匀，冰浴10min，澄清的溶液会出现絮状沉淀。

5.4℃，12000rpm离心5min，转移上清至一个无菌的Eppendorf管中。

6.加入等体积的苯酚/氯仿(1∶1)，反复混匀，12000rpm，5min，将上清移到另一离心管中。

7.在上清中加入1/10体积的3M NaAc(pH5.2)及2.5体积的无水乙醇，-20℃放置1hr以上，以沉淀DNA。

8.12000rpm离心10min，去上清，加入1ml的70％(体积比)乙醇洗涤沉淀，振荡并离心，倒去上清液，空气中干燥。

9.DNA沉淀溶于20μl含胰RNA酶(20μg/ml)的TE溶液(10mM Tris-cl，1mM EDTA，Ph8.0)中，37℃温箱内孵育2-3hr，消化RNA。消化完后，于-20℃中保存。

阳性克隆质粒DNA的纯化：

a.取筛选出的阳性克隆质粒DNA 5-10μg，溶于100μl双蒸水中。

b.加等体积的平衡酚振荡lmin，室温下5000g离心5min。

c.取上清，加等体积氯仿与异丙醇(体积比为1∶1)混合液，振荡1min，室温下5000g离心5min。

4.将上清加2.5倍体积的无水乙醇，1/10体积的3M乙酸钠。

5.-20℃，沉淀2hr。4℃，10000g，离心5min。

6.空气干燥沉淀，溶于TE中，-20℃保存。

E.阳性克隆的鉴定并测序

限制性内切酶消化检测阳性克隆，用MluI+HindIII双酶切提取好的质粒，37℃温浴2hr，电泳酶切产物，鉴定阳性克隆并送Invitrogen生物公司测序。

实施例2：

哺乳动物细胞培养及转染

A.哺乳动物细胞培养

1.细胞复苏

1)将细胞从液氮罐中取出，迅速置37℃水浴中解冻，期间不断摇动冻存管，使细胞液受热均匀；

2)将解冻的细胞移入25ml细胞瓶中，再加入3ml相应的DMEM培养基(生产商GIBCO，下同)；

3)置于37℃，5％(体积比)的CO₂培养箱中培养；

4)细胞贴壁后，置换新的DMEM培养基。

2.细胞传代

1)细胞长满生长的平面空间，倒掉DMEM培养基；

2)加入8ml D-Hank’s缓冲液，荡洗细胞，再移去洗涤液；

3)加入1ml胰酶，置于37℃放置5min；

4)加入4mlDMEM培养基，中和胰酶；

5)吸去2/3的细胞悬液，再加入6mlDMEM培养基，置于37℃，5％(体积比)的CO₂培养箱中培养。

3.细胞冻存

1)配置冻存液(培养基∶甘油∶血清＝7∶1∶2)；

2)取长满的细胞，如上操作，用胰酶消化；

3)用冻存液中和胰酶，分装入2ml冻存管中；

4oC放置4h，转入-80oC冻存一周后。任取一管细胞，复苏检测细胞的活力。复苏成功后，转入液氮罐中冻存。

B.细胞的转染

脂质体转染法。带有负电荷的DNA与阳离子型化合物带有正电荷的末端相结合(Felgner，Gadek et al.1987；Mannino and Gould-Fogerite 1988)，然后DNA结合型脂质和细胞膜相结合，使DNA进入细胞内部。脂质体转染法对有些细胞能够产生极高的转染效率，但是对于其它一些细胞，转染效率和其它方法相比得到的转染效率相当或更差。因此，对于不同的细胞系而言，需要做一些预实验确定哪一种方法更为有效。具体方法如下：

以下转染操作以24孔板为例。转染全过程必须严格无菌操作。

1)在转染前一天将待转染细胞接种于24孔板中，37℃培养。转染前的细胞密度以40-60％为准。

2)准备以下溶液：

a)稀释2-20μl Lipofectin2000试剂于100μl无血清、无抗菌素的RIPM培养基。混匀后室温静置3min。

b)稀释1-2μg待转染质粒DNA于100μl无血清、无抗菌素的RIPM培养基。混匀后室温静置。

3)混合a)、b)两种溶液，室温静置20min。然后再加入800μl无血清、无抗菌素的DMEM培养基，振荡混匀(溶液可能会呈雾状浑浊，但不影响转染)。

4)弃掉培养板中的旧培养基，用2ml无血清、无抗菌素的DMEM培养基清洗细胞2次。

5)加以上Lipofectin2000试剂-DNA混合物1ml覆盖细胞。

6)37℃温育6h。

7)吸出转染液，加入正常生长培养基DMEM，37℃培养。

8)48-72h后检测。

实施例3：

A.EILSA法检测IL-32蛋白表达量

1.血清，细胞培养上清或者细胞裂解液样品按1∶50用PBS(PH 7.4)稀释，取100μl加入到ELISA板小孔中，37℃包被一小时或者4℃包被过夜。

2.用PBS洗ELISA板5次(每次洗过尽量把液体拍干净，以保证尽量洗干净)。

3.配3％(体积比)PBST脱脂奶粉，用PBST溶解，按每孔100μl加入到ELISA板上，37℃封闭一小时或者4℃封闭过夜。

4.用PBST洗5次以上。

5.多肽免疫家兔制备的IL-32抗体用PBST按1∶500稀释，每孔加100μl，37℃一小时。

6.用PBST洗5次以上。

7.辣根过氧化物酶偶联的羊抗兔IgG用PBST按1∶5000稀释，37℃半小时。

8.用PBST洗5次以上。

9.加酶结合物，每孔一滴，37℃半小时

10.用PBST洗5次。

11.每孔分别加入显色液A和B(Sigma公司生产的ELISA显色试剂盒，显色液A和B分别为商用TMB显色底物和显色缓冲液)，各一滴，37℃避光显色5分钟。

12.每孔加终止液一滴，酶标仪读数。

B.血凝效价实验测定A型流感病毒滴度(HA assay)

1.在96孔微量反应板上进行，自左至右各孔加75μL不同稀释度的细胞培养上清样品，如表4.1所示：

表1.HA试验稀释度设置

孔号	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
													病毒稀释度	1/25	1/50	1/75	1/100	1/125	1/150	1/175	1/200	1/225	1/250	1/300	阴性对照

3.自右至左依次向各孔加入0.5％鸡红细胞悬液75μL，在振荡器上振荡，室温下静置后观察结果。

4.结果判定：从静置后20min开始观察结果，待对照孔红细胞已沉淀即可进行结果观察。红细胞全部凝集，沉于孔底，平铺呈网状，即为100％凝集(++++)，不凝集者(-)红细胞沉于孔底呈点状。以100％凝集的病毒最大稀释度为该病毒血凝价，即为一个凝集单位。

C.荧光定量PCR测定病毒各种RNA含量(Real-Time PCR)

1.A型流感病毒感染3小时后，收集MDCK细胞，按照说明书提取总RNA并使用设计好的不同引物逆转录cDNA。

2.使用针对NP和γ-actin的特异性引物进行荧光定量PCR。反应条件如下：(95℃，5分钟)，1个循环；(95℃，30秒)——(55℃，30秒)——(72℃，1分钟)，40个循环；

3.使用Rotor-gene software(Corbett Research)软件进行结果分析，根据Ct值得到相对的RNA拷贝数，其中γ-actin作为平衡NP的内参。

实施例4：

IL-32不同剪接异构体对MDCK细胞毒性进行评价。

1、消化T25瓶中MDCK细胞，加适量细胞培养基，吹打细胞10-15次。

2、将细胞铺到96孔板中，放置于培养箱中，培养24h待用。

3、将培养的MDCK细胞取出，倒去原有培养液，换用2％FBS的维持培养基稀释的梯度药物，培养24h待用。

4、然后依照实施例2中的细胞转染方法转入IL-32七种剪接异构体质粒以及空载体质粒。继续培养48h后，弃培养液上清，于培养板加入5mg/mL MTT液50μL/孔(以不含血清的DMEM培养基配制成)，置CO2培养箱中继续培养。

5、培养2-3h后，弃MTT上清，PBS洗3次，每孔加溶解液(DMSO∶乙醇体积比为1∶1)100μL，振荡5-10分钟.

6、待结晶完全溶解，置酶标测定仪上，测定570nm波长处的光密度OD值。

细胞存活率＝IL-32剪接异构体过表达组平均OD570/转染空载体细胞对照组平均OD570*100％

Claims (1)

1.一种人白介素-32在制备治疗或预防A型流感病毒感染药物中的应用。

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