CN108882698A - 用于低温保存的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及低温保存的方法和用于这样的方法的组合物，其中该方法利用低温保存介质的非牛顿流体性质来调节该介质的粘度以提供改进的低温保存过程。

Description

用于低温保存的方法
发明领域
本发明涉及用于低温保存生物样品的无冰方法、用于这样的方法的组合物、包含供使用的该组合物的包以及通过该新颖方法保存的样品。
发明背景
低温保存是用于保存生物样品的技术，其包括将样品冷却至非常低的温度并且将该样品保持在非常低的温度持续延长的时间段，该非常低的温度例如-80℃、-136℃或-196℃。通过将生物样品冷却至低温，将以其他方式降解样品的化学反应或酶促反应的动力学被减慢至使得样品不再降解或仅以非常慢的速率降解的程度。因此，可以将生物样品储存延长的时间段，并且然后返回到如用于使用和/或分析所需要的环境温度。
然而，冷却过程可能对生物样品具有不利影响，并且为了减轻这些影响，已经开发了许多用于低温保存的技术，尽管所有这些技术都具有固有的局限性。传统的低温保存技术包括受控的冷却并且导致冰晶的形成。可选择的无冰技术，玻璃化，避免了在冷却期间形成冰晶，并且替代地包括使水凝固成无定形玻璃。
在低温保存过程中对生物样品的损伤主要发生在冷却/冷冻阶段和加温阶段期间。溶液效应、细胞外的冰形成、细胞内的冰形成、膜效应、溶质毒性和脱水全部可导致样品损伤。通过在低温保存周期期间引入具有已知的保护作用的化合物，可以减少这些效应中的一些。在低温保存期间具有保护作用的化合物被称为冷冻保护剂(cryoprotectant)或冷冻保护添加剂(cryoprotective additive)(CPA)。
存在生物样品在低温保存期间可能遇到的各种应力(stress)，这些应力及其在细胞水平上的作用的实例包括：i)温度的降低—可能潜在地引起膜脂质相的改变和/或细胞骨架的解聚；ii)溶质浓度的增加，例如溶液中溶质的浓度随着一定比例的溶剂冷冻而增加—可导致渗透收缩(osmotic shrinkage)；iii)离子浓度的增加—可以具有对膜的直接作用，包括膜蛋白的溶解；iv)脱水—可以引起脂质双层的不稳定；v)盐的沉淀和共晶体形成(eutectic formation)—可以引起细胞损伤，但机制不太清楚；vi)气泡形成—可以引起机械损伤；vii)粘度的增加—可能影响扩散过程，包括渗透；viii)pH值改变—可以引起蛋白质等的变性；以及ix)细胞变得紧密堆积—可以引起膜损伤。因此存在对于使生物样品向这些各种应力的暴露最小化的低温保存技术的需求。
在标准低温保存技术(有时被称为常规低温保存或平衡低温保存(equilibriumcryopreservation))中，细胞或生物质以特定的速率在控制速率的冷冻机或较便宜的装置例如Mr Frosty或CellCool中被冷却。当样品温度下降到低于其平衡熔点时，冰开始形成(成核)，并且然后冰晶从成核点扩展到整个样品，这常常引起不可修复的损伤。随着冰形成过程继续进行，诸如细胞的生物样品在冰之间的溶质密集的通道中聚集，直到这些通道本身凝固(通过玻璃化)，并且然后样品在其指定的储存温度被储存。
由于可能发生的直接冰损伤，这些存在冰的低温保存技术通常被认为不适合保存组织和器官。简言之，冰晶可能在细胞之间膨胀或生长到细胞内，这引起组织宏观结构的破坏，并且因此破坏组织的功能。实际上，虽然一些细胞外的冰在器官和组织中可以被承受，但细胞内的冰对细胞几乎总是致命的。迄今为止，在存在冰的体系中已经被成功地低温保存的唯一的哺乳动物器官是绵羊卵巢，并且这些器官明显比大多数器官或实际上组织工程化的构建体(tissue-engineered construct)小得多(参见Campbell等人，HumanReproduction 2014年8月；29(8)：1749–1763)。
尽管常规低温保存是对于大量应用的经证实的技术，但其应用通常被限制于细胞或小聚集体的悬浮液。对于体积大于1mm3的活检样品，例如组织、器官或多细胞有机体，由于冰损伤，在冻融期间发生对材料的不可接受的损伤。
与平衡低温保存相比，玻璃化是无冰低温保存技术。在玻璃化中采用了各种机制来避免冰在冷却时生长。玻璃化依赖于使驻留在玻璃化/低温保存介质中的样品达到低于该玻璃化/低温保存介质的玻璃化转变温度(Tg)而不允许形成冰晶。在低于玻璃化转变温度的温度，体系的粘度增加，并且溶剂/介质最终凝固以提供稳定的样品，在稳定的样品中生物材料驻留在无定形固体玻璃化/低温保存介质的低温基质中。
通过玻璃化的低温保存通常需要在冷却之前将包含冷冻保护剂(CPA)的低温保存介质加入到生物样品中，这降低了样品的介质和水性组分的冻结温度，并且还增加了样品的水性组分的粘度，使得在低于平衡凝固点的冷却期间的冰晶形成被避免并且在液态至固态之间的转变不涉及结晶。然而，生物样品的玻璃化通常需要快速冷却，例如10,000℃/min或更高的冷却速率，并且这将方法固有地限制于非常小的样品尺寸。通常，玻璃化样品存在于具有1mm或更小的内径的细管(straw)中。对于较大的样品，很难获得玻璃化。
采用快速冷却和同时施加高压的组合也可以实现玻璃化，但这涉及高成本并且需要熟练的操作员。在冷却前在玻璃化过程中加入高浓度的溶质例如二甲基亚砜(DMSO)可能是有用的，但是经常观察到所得溶液对生物样品的毒性，同时将这些高粘度液体灌注/扩散到复合组织中可能是困难的。
已证明哺乳动物的胚胎和卵母细胞在小体积的液体中的玻璃化(无冰低温保存)在保留细胞生存力和功能上是有效的。然而，尽管有广泛的研究，但较大生物样品的玻璃化尚未被证实在加温后保留生存力和功能，主要地，这似乎是在实现足够快速的冷却速率/加温速率、避免冰核形成(icenucleation)以及使冷冻保护剂毒性最小化方面的实际困难的结果。
许多组织和组织工程化的器官在从患者或培养物中去除后不具有任何保存期限。这导致浪费并且损害使用这些材料的技术的经济性，并且同样地，对于组织工程化的构建体而言，即时制造(Just-in-Time manufacture)通常是不可行的。因此需要用于更好的保存的方法，例如本文描述的方法。
本发明的目的是提供改进的无冰低温保存技术，该技术适合于保存生物样品，特别是不能用现有技术低温保存的样品例如组织或组织构建体。本发明的目的还有提供用作本文所述的方法中的低温保存介质的组合物。
发明概述
在第一方面，本发明提供了用于低温保存生物样品的方法，该方法包括使用非牛顿流体作为低温保存介质。
本发明还涉及用于低温保存的方法，该方法包括通过施加至少一种应力来调节该方法中使用的低温保存介质的粘度。
在优选的实施方案中，本发明的方法是无冰方法。
在一些实施方案中，所述至少一种应力可以被用于实现低温保存介质的剪切稀化(即降低粘度)。用于实现剪切稀化的应力在本文中被称为剪切稀化应力。在本发明的方法的一些实施方案中，所述至少一种应力可以被用于实现低温保存介质的剪切稠化(即增加粘度)。用于实现剪切稠化的应力在本文中被称为剪切稠化应力。在一些实施方案中，该方法可以包括以顺序方式，即一个接一个地，施加两个或更多个应力。在一些实施方案中，该方法包括施加第一应力持续一段时间以产生第一非牛顿流体行为，并且然后改变第一应力的幅度以产生第二非牛顿流体行为。在一些实施方案中，该方法可以包括施加第一剪切稀化应力和第二剪切稠化应力。在一些实施方案中，通过机械手段、声波手段、磁辐射手段或电磁辐射手段或者以同时或顺序的方式的多于一种的这些手段的组合来施加应力。
在一些实施方案中，在从低温保存介质的平衡熔点至40℃的温度施加剪切稀化应力以加速防冻剂(cryoprotective agent)(CPA)向样品例如组织样品或工程化组织构建体中的灌注和/或扩散。在一些实施方案中，在冷却开始之前或者在与冷却启动的同时施加剪切稠化应力。
通常，实施方案中的冷却速率小于100℃每分钟。在一些优选的实施方案中，冷却速率小于50℃每分钟，例如小于20℃每分钟，例如小于10℃每分钟，例如小于5℃每分钟或约1℃每分钟。
在一些实施方案中，该方法还包括以下步骤：采用通过本文所述的方法保存的即低温保存的样品，将样品加温到其玻璃化转变点，并且在低于玻璃化转变温度的温度或在玻璃化转变温度施加剪切稠化应力，直到样品温度升高到高于其凝固点。
在一些实施方案中，根据本发明的方法可以被用于制备用于冷冻干燥的样品。在这样的实施方案中，在已经使用上文和此处详述的方法使样品玻璃化之后，将样品冷冻干燥，即将样品移至冷冻干燥装置并且除去水或其大部分。这有利地允许冷冻干燥以比通过常规方法可能的方式更有效的方式进行。这可以有利地降低冷冻干燥的成本或改进通过冷冻干燥获得的产品。
本发明还涉及具有非牛顿流体性质的低温保存介质组合物以及包括使用这样的介质的方法。
通常，根据本发明的低温保存介质组合物包含具有10μm或更小的平均粒度的颗粒材料，该颗粒材料用于将非牛顿性质赋予低温保存介质组合物。能够将非牛顿性质赋予低温保存介质的、具有10μm或更小的平均粒度的颗粒材料被称为非牛顿添加剂(NNA)。
在优选的实施方案中，非牛顿流体低温保存介质包含从按重量计2％至按重量计约60％的、具有10μm或更小的平均粒度的颗粒材料，即NNA，剩余质量是CPA和水的质量。例如，包含54g的NNA以及总计46g的水和CPA的低温保存介质可以被称为包含54wt％的NNA以及总计46wt％的水和CPA的低温保存介质组合物。为了避免疑问，％wt或wt％是等同的并且意指在总体组合物中的重量百分比。因此，100g的量的根据本发明的低温保存介质包含从2g至60g的非牛顿添加剂。在一些优选的实施方案中，低温保存介质组合物包含从2wt％至55wt％的NNA，例如从5wt％至40wt％或从10wt％至35wt％的NNA。在一些实施方案中，NNA具有1μm或更小的粒度，例如尺寸从1nm至100nm的纳米颗粒。在一些实施方案中，颗粒NNA材料选自二氧化硅(SiO2)、玻璃、二氧化钛、氧化铝、石英、铁氧化物、合成聚合物或生物衍生的聚合物、或这些材料中的两种或更多种的混合物。当NNA是材料的混合物时，这可以有利地被用于提供具有剪切稀化行为和剪切稠化行为两者的低温保存介质。在一些优选的实施方案中，生物衍生的聚合物NNA是天然淀粉或其衍生物，例如羟乙基淀粉。在一些实施方案中，NNA是二氧化硅，例如二氧化硅球(silica ball)。在一些实施方案中，NNA是铁氧化物，例如铁氧化物纳米颗粒。在一些实施方案中，NNA是被封装在聚合物基质中的铁磁材料，例如铁氧化物。
在一些优选的实施方案中，非牛顿流体低温保存介质是水性溶液或悬浮液。
在一些实施方案中，非牛顿流体低温保存介质包含以溶剂的多达按重量计40％(40wt％)、例如从10wt％至40wt％的量的防冻剂。在一些实施方案中，防冻剂选自包括以下的组：二甲基亚砜、甲酰胺、乙酰胺、C1-C3醇、1,2-异丙基二醇、1,2-丙二醇、乙二醇、丙二醇、甘油、葡萄糖、单糖、二糖(蔗糖、海藻糖、乳糖)、多糖(棉子糖、右旋糖酐)、聚蔗糖(ficoll)、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、或这些剂中的两种或更多种的组合。在一些实施方案中，防冻剂选自二甲基亚砜、甘油、葡萄糖、丙二醇和聚乙二醇或这些CPA中的两种或更多种的组合。在优选的实施方案中，非牛顿流体低温保存介质包含10wt％或更多的水，例如30wt％或更多、40wt％或更多、或50wt％的水。
在一些实施方案中，用于本发明的方法的本发明的低温保存介质包含作为非牛顿添加剂的HES。在一些实施方案中，低温保存介质包含以从40wt％至60wt％的量的HES(羟乙基淀粉)，并且在期望剪切稠化性质的优选情况下，组合物包含从48wt％至54wt％的HES。
在其中本发明的低温保存介质包含作为非牛顿添加剂的HES的实施方案中，优选的是，低温保存介质包含从5wt％至20wt％的CPA，例如从10wt％至15wt％的CPA。在这样的组合物中的CPA可以是单一的CPA或者两种或更多种CPA的组合，例如两种CPA。在一些实施方案中，包含HES的组合物还包含作为单一的CPA的DMSO或者DMSO与选自以下的CPA的组合：蔗糖、葡萄糖、甘油、棉子糖、果糖、海藻糖或乳糖或者蔗糖、葡萄糖、甘油、棉子糖、果糖、海藻糖或乳糖的组合。在其中DMSO与蔗糖、葡萄糖、甘油、棉子糖、果糖、海藻糖或乳糖组合使用或与选自蔗糖、葡萄糖、甘油、棉子糖、果糖、海藻糖或乳糖的两种或更多种CPA的组合组合使用的组合物中，DMSO与其他CPA的重量比是从1:2至2:1。因此，在一个实施方案中，本发明提供了具有以下组成的低温保存介质：48wt％-54wt％HES、5wt％至20wt％的CPA或CPA的组合、和水，例如48wt％-54wt％HES、10wt％至15wt％的CPA或CPA的组合、和水。在一些实施方案中，组合物的CPA组分是5wt％DMSO和10wt％蔗糖、葡萄糖、甘油、棉子糖、果糖、海藻糖或乳糖。在一些实施方案中，提供了包含50wt％HES和多达40wt％的CPA且其余为水的低温保存介质组合物。
在另外的方面中，本发明提供了包含根据本发明的低温保存介质的包。在一些实施方案中，容器是密封的包，例如安瓿或输注袋(infusion bag)或类似物。在一些实施方案中，包是无菌包。在一些实施方案中，包以无水和/或无溶剂形式被提供用于重构。
在另外的方面中，本发明涉及具有10mm或更小的平均粒度的颗粒材料将非牛顿流体性质赋予低温保存介质的用途。在一些实施方案中，用于使用的颗粒材料是淀粉或例如羟乙基淀粉的淀粉衍生物、二氧化硅、二氧化硅(SiO2)、玻璃、二氧化钛、碳酸钙、氧化铝、石英、铁氧化物或合成聚合物例如聚氯乙烯或聚苯乙烯。在一些实施方案中，用于使用的颗粒材料选自羟乙基淀粉、铁氧化物或二氧化硅。
在另外的方面中，本发明提供了根据此处和上文所述的方法保存的样品，例如组织样品或组织工程化的构建体。
附图简述
为了可以更好地理解本发明，参考下图。
图1示出了作为剪切速率的函数的包含HES、DMSO和水的各种低温保存介质的剪切稀化行为和剪切稠化行为。
图2示出了作为剪切速率的函数的包含HES、所选择的冷冻保护剂和水的各种低温保存介质在室温的剪切稠化行为。
图3A至图3H示出了各种低温保存介质在25℃和0℃的剪切稠化行为。
图4示出了温度对包含50wt％HES、15wt％CPA和35wt％H2O的低温保存介质组合物的剪切稠化行为的影响。
图5示出了各种含SiO2的水性溶液的剪切稀化行为。
图6示出了含CaCO3的低温保存介质组合物的剪切稀化行为。
详述
在本发明的方法中，利用低温保存介质的非牛顿流体性质以如对于低温保存过程的阶段适当的来调节即增加(通过剪切稠化)或降低(通过剪切稀化)低温保存介质的粘度。降低低温保存介质的粘度可能是有利的，因为防冻剂(CPA)胶体溶液最初可能花费许多分钟来灌注和/或扩散到有机组织中，并且诱导一些剪切应力可以降低此粘度(即，防冻剂胶体溶液或低温保存介质的粘度)，从而减少灌注时间。由于CPA毒性是时间依赖性的，所以在灌注状态期间的总毒性作为减少的灌注时间的函数而减少。
如本文所述的通过施加剪切应力来增加低温保存介质的粘度可以有利地被用于在冷却至低于水的凝固点的温度时防止样品中的冰晶的形成，因此基本上或完全地消除了冰晶的生长。这种粘度调节作用在融化周期(thawing cycle)期间是同等重要的，因为在粘度增加的情况下的加热防止或至少大体上降低了在低温保存过程的这个阶段冰结晶的机会。
有利地，一些非牛顿流体，例如本发明的一些低温保存介质，可以在施加第一幅度或类型的剪切应力时剪切稀化并且在施加第一幅度或类型的剪切应力时剪切稠化。因此，本发明涵盖低温保存方法和用于这样的方法的低温保存介质，其中，可以在单个低温保存周期中利用低温保存过程中的剪切稀化和剪切稠化的双重优点。
通过利用非牛顿流体性质来增加低温保存介质的粘度的另一个有利特征是可以应用比本领域的玻璃化方法中使用的冷却速率低得多的冷却速率，并且因此使得不能用形成现有技术的方法低温保存的组织样品和构建体的低温保存是可行的。
另外，利用低温保存介质的非牛顿流体性质可以允许减少量的冷冻保护剂或冷冻保护添加剂(CPA)和/或减少将CPA灌注和/或扩散到样品中所需的时间，并且这有利地减少了在低温保存过程期间CPA可能对生物样品施加的任何毒性作用。降低低温保存介质的粘度还可以通过改变细胞内和细胞外区域中的平衡离子或溶质浓度和/或通过加速跨越细胞膜的离子/溶质输送从而加速达到平衡的速率来潜在地改进跨越细胞膜的流体输送。
低温保存介质的粘度的改变可以通过施加外部应力以诱导非牛顿性质来实现。非牛顿性质的诱导可以通过剪切稠化或剪切稀化、通过声波稠化(sound thickening)或声波稀化、或者通过电磁场稠化或电磁场稀化例如磁场稀化或磁场稠化来获得。一些优选的非牛顿流体在暴露于低频应力时经历粘度降低并且在响应于高频应力时经历粘度增加。在上文和此处提及的剪切稀化和剪切稠化可以指的是机械施加的、声波施加的、磁场施加的或通过电磁辐射施加的应力。
剪切力可以例如通过摇动(振动)、搅拌(搅动)、压力波或其他机械手段来施加。例如，可以通过将棒浸入低温保存介质中并且然后旋转棒来将剪切力施加至在低温保存介质中进而在圆筒形容器中的生物样品。其中可以将剪切力施加到样品的配置的另一个实例将涉及在两个平行的板之间的低温保存介质中放置生物样品，其中这些板中的一个或两个相对于另一个平行地移动。剪切稠化是其中流体的粘度在向流体施加应力时增加的非牛顿行为。剪切稀化是在剪切应力下流体的粘度降低的流体的非牛顿行为。经历剪切稀化或剪切稠化的流体可以是溶液或悬浮液，例如胶体悬浮液。例如，剪切稠化的流体低温保存介质可以是包含诸如二氧化硅的细颗粒的悬浮液、胶体溶液/悬浮液、或溶液本身。这种机制(即，利用低温保存介质的非牛顿流体性质来提供基本上无冰的低温保存方法的低温保存的本发明的方法)对于仅仅其中CPA掺加(spike)有硬壳胶体例如有机硅、HES、玻璃等的系统不是孤立的。掺加有实现电磁场诱导的粘度变化、声波和/或光诱导的粘度变化的材料也是可能的。这个列表并不是穷尽的。
因此，本发明的方法允许通过利用剪切应力以降低粘度来改善灌注/扩散并且因此降低CPA毒性，然后，可以随后利用不同的幅度或类型的剪切应力用于增加低温保存介质的粘度并且允许以比本领域的无冰低温保存技术所用的冷却速率低得多的冷却速率进行无冰低温保存。
根据本发明的示例性低温保存方法包括在冷却至低温之前将待保存的样品置于具有非牛顿流体性质的如本文所述的低温保存介质中，并且然后：
i)施加剪切稀化应力持续足以允许低温保存介质灌注到样品中的第一时间段；
ii)施加剪切稠化应力以增加低温保存介质的粘度；
iii)将样品冷却至低于玻璃化转变温度的温度；
iv)去除剪切稠化应力；以及
v)在低温储存所得的玻璃化样品。
在其中在冷却期间施加剪切稠化应力的本文所述的方法中，通常在低温保存介质的玻璃化转变温度附近的温度去除剪切稠化应力。例如，可能的是，在稍高于低温保存介质的玻璃化转变温度的温度去除剪切应力，因为针对冰核形成的作用在去除应力时将不会立即消散。尽管如此，在这些方法中，通常优选的是保持剪切稠化应力直到样品已被冷却至玻璃化转变温度或低于玻璃化转变温度。
根据本发明的可选择的低温保存方法包括在冷却至低温之前将待保存的样品置于具有非牛顿流体性质的如本文所述的低温保存介质中，并且然后：
i)施加剪切稠化应力以增加低温保存介质的粘度；
ii)将样品冷却至低于玻璃化转变温度的温度；
iii)去除剪切稠化应力；以及
iv)在低温储存所得的玻璃化样品。
根据本发明的可选择的低温保存方法包括在冷却至低温之前将待保存的样品置于具有非牛顿流体性质的如本文所述的低温保存介质中，并且然后：
i)施加剪切稀化应力持续足以允许低温保存介质灌注到样品中的第一时间段；
ii)将样品冷却至低于玻璃化转变温度的温度；以及
iii)在低温储存所得的玻璃化样品。
根据本发明的方法还可以包括加温步骤，即以下的步骤：取出低温的低温保存的样品并且在低于、处于或高于玻璃化转变温度的温度施加剪切稠化应力，直到冰核形成不再可能发生，例如在其平衡凝固点处或接近其平衡凝固点处。虽然通常优选的是在低温保存介质的玻璃化转变温度、或低于低温保存介质的玻璃化转变温度即在样品仍处于完全玻璃化的状态时启动剪切稠化应力，但是可能的是，在施加剪切稠化应力之前，允许温度升高到高于玻璃化转变温度许多度。重要的是确保剪切稠化应力在以下的温度范围内被施加：其中加温步骤中的冰核形成是最可能的，例如在从-80℃至0℃或从-80℃至平衡凝固点的温度范围内被施加。加温速率优选地小于10℃每分钟，例如1℃每分钟。
根据本发明的可选择的低温保存方法包括在冷却至低温之前将待保存的样品置于具有非牛顿流体性质的如本文所述的低温保存介质中，并且然后：
i)将样品冷却至低于玻璃化转变温度的温度；
ii)在低温储存所得的玻璃化样品；
iii)将样品加温至高于其平衡凝固点；
其特征在于，在低于、处于或刚好高于低温保存介质的玻璃化转变温度的温度启动的剪切稠化应力在加温期间被施加至样品。
根据本发明的方法可以以小于或等于100℃每分钟，例如50℃每分钟并且优选地小于10℃每分钟，例如1℃每分钟的冷却速率进行。
本发明的方法中的剪切稀化应力或剪切稠化应力可以通过机械手段、声波手段、磁辐射手段或电磁辐射手段来施加。
在对于给定的生物体系的充分灌注后，胶体悬浮液的粘度可以非常快速地增加，直至其呈现类似固体的性质。这具有克服当前低温生物学中的限制的两个主要优点：
1.溶液的明显的毒性(apparent toxicity)将大大降低—这是因为，由于溶液的高粘度，分子扩散将大大降低。由于毒性与毒素的代谢有关，所以毒性将通过细胞膜周围的降低的扩散速率被降低。
2.冰形成将通过CPA胶体的增加的粘度被抑制。与传统的低温保存的冰形成方法相比，该体系将包含相对少的水。这将降低冰形成的温度和个体成核事件的可能性。由剪切应力引起的增加的粘度将抑制冰形成，这防止了冰损伤。
体系的温度将被降低直到低于Tg(玻璃化转变温度)。在此点，剪切应力可以中断，并且体系处在稳定的玻璃化(无定形固体)状态。为了使该体系融化，将施加足够的剪切应力并且使体系加温。这克服了当前技术现状的融化装置所面临的问题：
1.冰形成将通过上述机制被抑制。这在加温时使冰形成停止而不需要快速的加温速率。
2.由于上述机制，毒性将被降低。通过施加合适的剪切力以降低粘度并由此增加细胞冲洗时间(wash-out time)，在CPA冲洗期间的毒性也被最小化。
3.与目前的玻璃化技术相比，通过所需的相对低的冷却速率和加温速率避免了热应力和热裂化。
在施加剪切应变的情况下粘度增加的材料有时被称为胀流性材料(dilatantmaterial)。在一些实施方案中，一种胀流性低温保存介质或以复数形式的多于一种的胀流性低温保存介质优选地用于本文所述的方法中。
通过加入限定量的添加剂可以赋予低温保存介质非牛顿性质，该添加剂调节介质的行为，所述介质以其它方式基本上呈现牛顿流体性质，即其粘度在施加的应力下不变化。可以用来赋予非牛顿行为的添加剂的类别在本文中被称为非牛顿添加剂(NNA)。典型地，NNA以每100g所得的包含NNA的低温保存介质的总质量从2wt％至60wt％的量被添加至低温保存介质中。在该方法中可以使用任何合适的NNA，尽管对实用性来讲，NNA的选择是基于其在技术条件下对于待保存的样品不施加实质的毒性作用。可以同等地使用在从2wt％至60wt％的特定范围内的NNA的混合物。
一般来说，任何合适的无机颗粒和有机颗粒可以用作NNA。典型地，NNA的平均粒度，即平均最长线性尺寸，是10μm或更小，例如5μm或更小或优选地1μm或更小。在一些实施方案中，纳米颗粒NNA是优选的。如本文使用的术语纳米颗粒是指具有在1nm和100nm之间的平均粒度的颗粒。较小的颗粒可以有利地增加NNA的非牛顿效应并且因此可以以与较大的颗粒相比更低的百分比被应用于低温保存介质中。
在一些实施方案中，NNA可以是有机NNA，例如生物衍生的聚合物，诸如淀粉衍生物或合成聚合物如聚苯乙烯或聚氯乙烯。作为淀粉衍生物的NNA的优选实例包括诸如玉米淀粉、马铃薯淀粉、小麦淀粉和其他植物衍生的淀粉的天然淀粉以及诸如羟乙基淀粉(HES)的半合成淀粉。在羟乙基淀粉中，多于一个羟乙基取代基被引入到葡萄糖单体的羟基基团上，淀粉聚合物主链由所述葡萄糖单体构成。因此，在一些情况下，羟乙基淀粉(HES)可以是以下的淀粉：其中在聚合物中平均每十个葡萄糖单元一个葡萄糖羟基基团可以被羟乙基基团取代，而在羟乙基淀粉中取代度典型地是每10个葡萄糖单元从7-8个羟基。HES淀粉的生物相容性是熟知的，并且因此在某些实施方案中，羟乙基淀粉的使用被优选用于组织样品和工程化组织构建体的低温保存。已经证明，包含从45wt％至55wt％的HES，例如从48wt％至54wt％的HES的低温保存介质具有特别有利的非牛顿性质。
宽范围的全合成聚合物可以被用作NNA，并且在一些有利的实施方案中可以并入功能性芯(functional core)例如铁磁材料。因此，诸如聚苯乙烯、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚氯乙烯或类似的生物相容性聚合物的聚合物的颗粒可以被用作NNA。在其他实施方案中，诸如聚氯乙烯、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚苯乙烯或类似的生物相容性聚合物的聚合物可以被用来涂覆诸如铁氧化物的铁磁材料，例如以确保或改善其生物相容性，以提供将响应于剪切应力或者磁场变化来调节例如增加或降低低温保存介质的粘度的NNA。例如，铁电NNA的颗粒可以以线性方式或来回的方式移动，经受施加的磁场，并且因此快速增加介质的粘度，这进而允许施加稳定的无冰冷却以使样品低于其玻璃化转变温度(Tg)，在此阶段样品经历玻璃化。
无机NNA也适合用于本发明的方法中。无机NNA的实例包括二氧化硅(SiO2)、玻璃、二氧化钛、氧化铝、石英、诸如铁氧化物的铁磁材料、各种粘土及类似物。二氧化硅是特别优选的NNA，因为它可以容易地以确定的粒度和纯度获得并且是与水相容的。铁氧化物，例如呈纳米颗粒形式的铁氧化物，也是优选的NNA，因为它是生物相容的并且适合用于体内应用。铁氧化物允许通过施加磁场来施加剪切稠化应力或剪切稀化应力。铁氧化物可以呈磁铁矿Fe3O4或磁赤铁矿Fe2O3的形式。
除了包含NNA之外，用于本发明的方法的低温保存介质还包含防冻剂(CPA)。在低温保存中使用CPA是熟知的。CPA被用于减轻生物样品在低温保存过程中所经历的一些应力。适合用于本发明的方法的CPA是水溶性的并且通常与水形成稳定的氢键。CPA与水分子形成稳定的氢键的能力降低了低温保存介质的凝固点。
CPA的作用是多方面的，并且取决于其使用的情形(context)和浓度。例如，低分子量CPA可以在冷却过程期间进入细胞并且降低冷却期间发生冰核形成的趋势。高分子量CPA通常不会穿过细胞膜并因此在细胞外环境中发挥其作用。在降低细胞外液的凝固点时，CPA可以防止水从细胞中过度流出，从而防止细胞的收缩超过细胞的最小临界体积。通过减少细胞收缩，CPA可以减弱细胞内液的超浓缩，并且从而抑制蛋白质的沉淀。理想地，CPA将能够以足以发挥其保护作用的速率灌注到生物样品中，与其中10,000℃每分钟的冷却速率是常见的现有技术的玻璃化方法相比，本发明方法的有利地缓慢的冷却速率允许在低温保存过程的冷却阶段期间的渐进性灌注(progressive perfusion)。CPA还可以防止在冷冻过程期间产生可能对细胞是毒性的过量的盐浓度。例如，在溶液中，溶质的相对浓度将随着溶质溶解于其中的溶剂的凝固(冻结)而增加。
在本发明的方法中可以使用任何合适的CPA或CPA的组合。在本发明的方法中可以单独使用或组合使用的熟知的CPA的实例是二甲基亚砜、甲酰胺、乙酰胺、C1-C3醇、1,2-异丙基二醇、1,2-丙二醇、乙二醇、丙二醇、甘油、葡萄糖、单糖、二糖(例如蔗糖、海藻糖、乳糖)、多糖(例如棉子糖、右旋糖酐)、聚蔗糖、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮。CPA的选择将在一定程度上取决于待低温保存的样品的性质。因此，当保存蛋白质样品时，CPA跨越细胞膜的传递将不是重要的考量，而对于细胞、组织和工程化组织构建体的保存，这将是较重大的因素。同样，对于技术人员将明显的是，相对于分离的细胞，CPA灌注/扩散到样品中的能力对于组织样品更重要。
典型地，在本发明的方法中，在低温保存介质中的CPA的浓度或CPA的浓度的总和小于或等于50wt％并且通常小于或等于40wt％，例如从10wt％至40wt％。在低于10wt％的CPA的浓度，冰核形成变成更重要的因素。
可以用于本发明方法中的防冻剂的实例包括但不限于：可以穿过细胞膜的低分子量(Mr<400)的CPA，比如醇，例如甲醇、乙醇、1,2-异丙基二醇、1,2-丙二醇、甘油、乙二醇，甲酰胺，乙酰胺和二甲基亚砜；以及较高分子量CPA和/或非穿透性CPA(non-penetratingCPA)，例如单糖(例如葡萄糖)、二糖(例如蔗糖、海藻糖、乳糖)、多糖(棉子糖、右旋糖酐)、聚蔗糖、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮和胎牛血清。特别优选的CPA是DMSO、甘油、葡萄糖、丙二醇和聚乙二醇。
现有技术的无冰玻璃化方法通常在数百摄氏度的范围内并且常常具有10,000℃每分钟的级别。如上所述，本发明方法中使用的冷却速率比本领域的无冰玻璃化方法中的冷却速率慢得多，并且小于或等于100℃每分钟，例如50℃每分钟，并且优选地小于10℃每分钟，例如从1℃每分钟至10℃每分钟或1℃每分钟。这些相对缓慢的冷却速率的使用有利地使得比可以用本领域的无冰玻璃化方法保存的样品大得多的样品的低温保存成为可能。最终，精确的冷却速率将是样品的尺寸和组成的函数，但上文概述的速率已被证明是用于本文所述的低温保存技术的合适的工作范围。
本发明的无冰方法具有广泛的应用范围，并且对于太大以致不能经历用现有技术的方法的无冰低温保存的样品是特别有利的。例如，许多组织和组织工程化的器官在从宿主有机体/患者/培养物中取出后不具有保存期限或具有极其有限(典型地不超过几个小时)的保存期限。有限的保存期限导致过度的浪费并且导致使用这样的样品的成本大大增加。因此，对于组织工程化的构建体，即时制造通常是不可行的。因此，本发明的方法为基于组织工程化的构建体例如基于干细胞的复合组织构建体(composite tissue construct)的再生医学的发展提供了巨大的优势。这样的构建体可以用本发明的方法保存，并且这将使组织工程化的样品能够被储存并且以“现货供应(off the shelf)”的方式使用，并且因此从根本上改进基于这样的样品的治疗性干预的经济性和可用性。
本发明还提供了用作本发明方法中的低温保存介质的组合物。
本发明的低温保存介质组合物是包含从10wt％至40wt％的防冻剂(CPA)和从2wt％至60wt％的非牛顿添加剂(NNA)的水性溶液或悬浮液，所述非牛顿添加剂是具有平均最长线性尺寸10μm或更小的生物相容性颗粒材料。在一些实施方案中，低温保存介质是包含从10wt％至40wt％的防冻剂(CPA)和从2wt％至60wt％的非牛顿添加剂(NNA)的无淀粉的水性溶液或悬浮液，所述非牛顿添加剂是具有平均最长线性尺寸10μm或更小的生物相容性颗粒材料。如本文使用的，术语无淀粉指的是不包含淀粉或任何半合成淀粉衍生物例如羟乙基淀粉的组合物。
非牛顿添加剂是具有平均最长线性尺寸10μm或更小的有机或无机颗粒材料。在一些实施方案中，非牛顿添加剂具有平均最长线性尺寸1μm或更小。在一些实施方案中，非牛顿添加剂呈纳米颗粒形式，例如具有从1nm至100nm的平均最长线性尺寸的铁氧化物颗粒。
用作NNA的颗粒材料通常选自包括以下的组：二氧化硅(SiO2)、玻璃、二氧化钛、氧化铝、石英、铁氧化物、合成聚合物或这些材料中的两种或更多种的生物衍生的聚合物混合物。在一些实施方案中，生物衍生的聚合物是天然淀粉或其衍生物，例如羟乙基淀粉。在一些实例中，颗粒材料是二氧化硅，例如二氧化硅球。在一些实例中，颗粒材料是铁氧化物，任选地铁氧化物纳米颗粒。在实例中，颗粒材料是封装在聚合物基质中的铁磁材料。
在一些实例中，防冻剂选自包括以下的组：二甲基亚砜、甲酰胺、乙酰胺、C1-C3醇、1,2-异丙基二醇、1,2-丙二醇、乙二醇、丙二醇、甘油、葡萄糖、单糖、二糖(蔗糖、海藻糖、乳糖)、多糖(棉子糖、右旋糖酐)、聚蔗糖、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮或这些剂中的两种或更多种的组合。在一些实例中，防冻剂选自二甲基亚砜、甘油、葡萄糖、丙二醇和聚乙二醇、或这些CPA中的两种或更多种的组合。在一些优选的实例中，防冻剂包含二甲基亚砜。
因此，本发明提供了机敏材料(smart material)，其在生物制品(生物样品)的低温保存期间降低毒性、减少热应力并且抑制冰形成。可以在方法中使用用于低温保存的掺加化学品(spiking chemical)(CPA)例如甘油、二甲基亚砜、糖、醇、聚乙二醇、乙二醇与小的(<10μm)固体颗粒例如二氧化硅球、纳米颗粒、HES和/或SiO2以通过非牛顿流体性质来低温保存生物样品，所述非牛顿流体性质经由增加和/或降低用于实现低温保存的溶液的粘度来利用。
该机敏材料是以下的那些材料：其中使用的任何(掺加)化学品(CPA)被记录为具有温度依赖性细胞膜稳定化效应，降低细胞内的冰的可能性，抑制基于水的溶液的凝固点，降低冰形成的可能性，降低基于水的溶液的平衡熔点，减少冷激(cold-shock)或寒温(cold-temperate)有关的损伤，或保护免受任何其他的与低温保存相关的损伤，或这些中的任何组合。
所使用的固体颗粒通过剪切稠化和/或剪切稀化、声波稠化和/或声波稀化、电磁场稠化和/或电磁场稀化、电磁辐射稠化和/或电磁辐射稀化、或者任何其他非牛顿机制、或这些中的组合来诱导非牛顿行为。
本发明还涉及使用具有10μm或更小的平均粒度的颗粒材料以将非牛顿流体性质赋予低温保存介质。适合于此用途的颗粒材料的实例是淀粉或例如羟乙基淀粉的淀粉衍生物、二氧化硅、二氧化硅(SiO2)、玻璃、二氧化钛、氧化铝、石英、铁氧化物或例如聚氯乙烯或聚苯乙烯的合成聚合物。
非牛顿添加剂可以在包例如无菌包中提供，任选地与用于用限定量的水和/或CPA重构的必需量的CPA组合。此处和上文所述的低温保存介质可以以准备好用于此处和上文所述的低温保存方法的包例如无菌包来供应。包例如无菌包可以被储存，准备好用于允许在新鲜样品刚变成可用的时就对其进行低温保存，并且从而提高低温保存成功率。
如本领域技术人员将理解的，关于上述的方法或组合物的每个要素的优选实施方案可以被自由组合。这样的组合提供了以例如低温保存介质的组分的优选的组成范围和性质或者所述方法的优选的步骤为特征的实施方案。因此，具有本文指定的粒度、分子特性(molecular identity)和组成范围(按重量计％)的非牛顿添加剂可以与防冻剂的组成范围和分子特性自由地组合成水性溶液，以给出优选的组合物用于本发明的方法或用于提供为例如以无菌包的形式使用的产品。
本发明的另外的实施方案在以下编号的项目中提出：
1.一种机敏材料，其在生物制品的低温保存期间降低毒性、减少热应力并且抑制冰形成。可以在方法中使用用于低温保存的掺加化学品如甘油、二甲基亚砜、糖、醇、聚乙二醇、乙二醇与小的(<10μm)固体颗粒例如二氧化硅球、纳米颗粒、HES和/或SiO2以通过非牛顿流体性质来低温保存生物样品，所述非牛顿流体性质经由增加和/或降低用于实现低温保存的溶液的粘度来利用。
2.如1所述，其中使用的任何化学品被记录为具有温度依赖性细胞膜稳定化效应，降低细胞内的冰的可能性，抑制基于水的溶液的凝固点，降低冰形成的可能性，降低基于水的溶液的平衡熔点，减少与冷激或寒温有关的损伤，或保护免受任何其他的与低温保存相关的损伤，或这些中的任何组合。
3.如1所述，其中所使用的固体颗粒通过剪切稠化和/或剪切稀化、声波稠化和/或声波稀化、电磁场稠化和/或电磁场稀化、电磁辐射稠化和/或电磁辐射稀化、或者任何其他非牛顿机制、或这些中的组合来诱导非牛顿行为。
4.如1和3所述，其中所使用的颗粒是分子、离子、不呈固态、或不具有均匀的组成、或者这些的任何组合。
5.如1、2、3和4所述，其中非牛顿材料由多于两种的组分组成，无论是2中描述的那些的组合、3中描述的那些的组合、4中描述的那些的组合，还是上述的任何组合。
为了可以更好地理解本发明，本文提供了根据本发明的低温保存介质和它们的非牛顿流体行为的若干实施例。本领域技术人员将认识到，其中并入非牛顿添加剂的包含CPA的水性溶液的这些和类似的低温保存介质可以被用于如在本文中且特别地在所附权利要求书中所定义的本发明的方法中。
实施例
制备具有25％水、25％DMSO和50％HES(全部按重量计)的溶液。将该溶液用搅拌棒搅拌直至完全混合。然后将混合物加入到具有同心圆筒测量装置的RheoLab QC流变仪(Anton-Paar,Graz,Austria)。以在0.01/s至2/s之间的剪切速率测量溶液的粘度。发现在增加的剪切速率<0.5/s时，混合物表现出增加的剪切稀化。在0.5/s和1/s之间的临界点处，混合物的行为显著地改变为剪切稠化。在含有在水中按重量计50％HES的溶液中也观察到类似的行为。
进行了大量另外的实验来参数化在剪切应力下非牛顿添加剂对低温保存介质的流体行为的影响。
在包含非牛顿添加剂的低温保存介质中的剪切稀化和剪切稠化作用
研究了包含各种量的作为非牛顿添加剂的HES与各种冷冻保护剂和水的组合的低温保存介质的非牛顿行为。来自该研究的结果在图1中提供，其中是剪切速率在室温对包含10wt％DMSO、HES(羟乙基淀粉，54wt％(组合物A)、50wt％(组合物B)和45wt％(组合物C))和余量的水的三组分低温保存介质的粘度的影响(参见表1)。在这项研究中，使用联接至DG42测量系统和RheoCompass软件的市售的Anton Paar RheolabQC流变仪，将剪切力施加于低温保存介质。
表1在图1中评价的低温保存介质组合物
组合物 非牛顿添加剂 冷冻保护剂 水
A 54wt％HES 10wt％DMSO 36wt％
B 50wt％HES 10wt％DMSO 40wt％
C 45wt％HES 10wt％DMSO 45wt％
在这些实验中，将候选的非牛顿低温保存介质样品置于由从地板向上突出的两个同轴圆筒形壁所界定的室中。然后将联接到发动机以驱动其旋转的空心圆筒，即流变仪，浸入位于室中的样品中。然后以测量的速率，剪切速率γ，使空心圆筒旋转，通过比较旋转速度和达到该旋转速度所需的扭矩来测量剪切应力。剪切速率由空心圆筒的运动速度除以在空心圆筒和室边缘之间的间隙来定义。实现空心圆筒在样品中的旋转所需的扭矩被记录并且可以被用于确定溶液的粘度。因此可以确定作为剪切速率的变化的函数的粘度变化。
如图1中可以看出的，对于54wt％HES/10wt％DMSO/36wt％H2O体系(A)，使剪切速率从10-4s-1增加至约0.5s-1引起溶液的剪切稀化(观察到粘度在此范围内降低超过1000倍)。在同一样品中，在室温使剪切速率从1s-1增加到约6s-1同时引起低温保存介质的粘度的10倍增加(即剪切稠化效应)。在粘度的10倍增加后，流变仪达到其最大扭矩，并因此测量结束。定性地，在此阶段发生低温保存介质的凝固，例如用金属棒敲击介质指示存在固体。因此，尽管不能明确地测量介质的精确粘度，但低温保存介质的固体性质指示粘度将是超过109mPa.s。
因此证明，单一样品中的剪切稀化和剪切稠化行为可以仅通过改变样品所经受的剪切速率(且因此剪切应力)来实现。对于组合物B和组合物C观察到剪切稠化行为。根据该研究，看起来45wt％至54wt％HES表现出非牛顿行为，并且粘度变化的尺度在50wt％和高于50wt％更明显。
作为冷冻保护剂的函数的剪切稠化效应的变化
进行实验以确定冷冻保护剂是否在室温对剪切稠化行为具有影响，来自该研究的数据在图2中提供。对于在该研究中具有50％HES(非牛顿添加剂)、10％冷冻保护剂和40％水(％是按重量计的)的组成的所有低温保存介质都观察到剪切稠化行为。低温保存介质中的冷冻保护剂(CPA)是蔗糖(组合物2A)、甘油(组合物2B)、葡萄糖(组合物2C)和DMSO(组合物2D)。尽管在所有低温保存介质中均观察到剪切稠化行为，但剪切稠化的程度作为个体组合物的函数而变化，即作为CPA的函数而变化。因此明显的是，使用非牛顿添加剂可以提供具有独立于CPA的性质的非牛顿流体性质的低温保存介质，尽管观察到的绝对剪切稠化作用确实在一定程度上作为存在于组合物中的CPA的函数而变化。在室温，可能需要>100s-1的相对高的剪切速率来获得明显的剪切稠化。
在含各种非牛顿添加剂的包含HES、CPA和H2O的组合物的低温保存介质中温度对剪切稠化的影响
然后进行实验以确定非牛顿行为是否将作为温度的函数而变化，因为在预期的应用中，在低温显现非牛顿行为是很重要的。图3提供了来自这些研究的数据，并且可以立即看出的是，不仅非牛顿效应在低温呈现，事实上，温度的降低还增强了非牛顿效应并且降低了临界剪切速率(剪切稠化最先变得明显时所处的速率)。在此实验中评价的低温保存介质的组合物在下文表2中提供。
表2在图3中评价的低温保存介质组合物
对于具有50％HES/10％CPA/40％H2O组合物(％按重量计)的根据本发明的含非牛顿添加剂的低温保存介质的结果在图3a-图3f中示出。如可以看出的并且如所预期的，温度的降低导致样品粘度的增加。出乎意料地，从本实验还明显的是，由在较低温度时施加剪切应力产生的剪切稠化相对于在室温使用相同组合物获得的剪切稠化被大大增强(例如0℃对约25℃)—在低温时的效应的尺度以及还在低温启动效应所需的临界剪切速率的降低两方面显现增强。由于在所有评估的低温保存介质中都发现剪切稠化对于温度降低的这种增强，因此这似乎是一般的效应。剪切稠化在降低的温度增强的这种迄今未知的效果是显著的，因为高度粘性的低温保存介质可以以比在室温将需要的剪切应力低得多的剪切应力来获得。由此可见，由于在0℃获得特定的粘度或特定的粘度增加所需的剪切应力相对于在室温所需的剪切应力被降低，因此在根据本发明的低温保存技术中可以使用比以其他方式将预期的剪切应力更低的剪切应力。有利地，这意味着在根据本发明的方法中可以使用小于100s-1的剪切速率，并且通过这些方法保存的样品可以在该方法期间暴露于较低的剪切应力。因此，通过在低于室温的温度开始剪切稠化应力减少或消除了由用于低温保存的样品可能遭受的任何与剪切应力有关的损伤。这种意想不到的在低温的剪切稠化的增强也是显著的，因为基于在室温观察到的效应，将以其他方式呈现出不适合用于非牛顿低温保存技术的低温保存介质组合物，实际上在考虑了在0℃的非牛顿效应时是可行的。
在图3a-图3f中显示的结果还揭示，某些CPA提供了比其他CPA更强的作为温度的函数的剪切稠化的增强。看出包含糖类CPA(葡萄糖、果糖、乳糖、棉子糖和蔗糖)的组合物给出了比用相应的含DMSO的低温保存介质所产生的更强的作为温度的函数的剪切稠化的增强(图3d)。这提供了使用两种CPA的组合来提供用于低温保存的优化的粘度概况(viscosity profile)的可能性。例如，在低温保存介质中使用5wt％的DMSO和10wt％的糖类CPA(图3h)提供了具有在低温的优良的剪切稠化性质(源自糖类CPA)以及良好的细胞渗透(源自DMSO)的组合物。
温度对剪切稠化的影响
为了进一步检查剪切稠化效应的温度依赖性，进行了实验，在该实验中评价作为从-9℃至50℃的温度的函数的50wt％HES/15wt％CPA/35wt％H2O低温保存介质的剪切稠化。此研究的结果在图4中提供。在此实验中，CPA是DMSO和蔗糖的1:2混合物(即5wt％DMSO和10wt％蔗糖)。从图4中可以看出的，温度对剪切稠化效应的影响在溶液的冻结温度附近，在此情况下在-7℃至-9℃附近，是最显著的，在此时采用0.01s-1或更小的剪切速率获得至少2个或3个数量级的粘度增加。因此证实的是，其中在低温时可以使用非常低的剪切应力提供极大提高的粘度的低温保存介质是可获得的。用一系列的糖/DMSO混合物提供了类似的温度依赖性剪切稠化行为。
包含二氧化硅和碳酸钙的低温保存介质组合物的剪切稀化
如上文提到的，非牛顿添加剂可以被用于为粘性低温保存介质提供剪切稀化性质。评价了表3的水性SiO2组合物的非牛顿流体性质并且观察到显著的剪切稀化(参见图5)。用表4的碳酸钙/CPA/水组合物获得了类似的结果(参见图6)。
表3图5的组合物
组合物 非牛顿添加剂 水
A 60wt％SiO2 40wt％
B 50wt％SiO2 50wt％
C 40wt％SiO2 60wt％
表4图6的组合物
组合物 非牛顿添加剂 冷冻保护剂 水
A 50wt％CaCO3 10wt％DMSO 40wt％
B 50wt％CaCO3 10wt％甘油 40wt％

Claims (29)

1.一种用于低温保存生物样品的方法，包括使用非牛顿流体作为低温保存介质。
2.根据权利要求1所述的用于低温保存生物样品的方法，还包括通过经由机械手段、声波手段、磁场手段或电磁场手段向所述低温保存介质施加应力来调节所述低温保存介质的粘度的步骤。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，还包括施加应力以增加所述低温保存介质的粘度的步骤。
4.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，还包括施加应力以降低所述低温保存介质的粘度的步骤。
5.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，还包括以下步骤：施加第一应力以降低所述低温保存介质的粘度，去除所述第一应力，并且然后施加第二应力以增加所述低温保存介质的粘度。
6.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，还包括以下步骤：施加第一应力以降低所述低温保存介质的粘度，并且然后调节所述第一应力的幅度以引起所述低温保存介质的粘度的增加。
7.根据任一前述权利要求所述的方法，包括以下步骤：施加应力以增加所述低温保存介质的粘度，并且然后保持所述应力，同时将所述样品冷却至低于所述样品的玻璃化转变温度的温度。
8.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述样品以50℃每分钟或更少例如10℃每分钟或更少、或1℃每分钟或更少的速率被冷却。
9.根据任一前述权利要求所述的方法，还包括以下步骤：将所冷却的样品保持在低于其玻璃化转变温度的温度，任选地保持在-80℃或低于-80℃。
10.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述低温保存介质是包含从2wt％至60wt％的非牛顿添加剂的水性溶液或悬浮液，所述非牛顿添加剂是具有10μm或更小的平均粒度的颗粒材料。
11.根据权利要求10所述的方法，其中用作非牛顿添加剂的所述颗粒材料选自二氧化硅(SiO2)、玻璃、二氧化钛、碳酸钙、氧化铝、石英、铁氧化物、合成聚合物或生物衍生的聚合物例如HES、或这些材料中的两种或更多种的混合物。
12.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述低温保存介质包含从10wt％至40wt％的防冻剂。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述防冻剂选自包括以下的组：二甲基亚砜、甲酰胺、乙酰胺、C1-C3醇、1,2-异丙基二醇、1,2-丙二醇、乙二醇、丙二醇、甘油、葡萄糖、单糖、二糖例如蔗糖、海藻糖和乳糖、多糖例如棉子糖和右旋糖酐、聚蔗糖、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮或这些剂中的两种或更多种的组合。
14.根据权利要求10至13中任一项所述的方法，其中所述非牛顿添加剂是羟乙基淀粉(HES)。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述低温保存介质包含从45wt％至55wt％的HES。
16.一种用于重构低温保存的样品的方法，所述低温保存的样品例如是通过根据任一前述权利要求的方法低温保存的样品，所述方法包括以下步骤：将所述低温保存的样品加温至其玻璃化转变点，并且在低于玻璃化转变温度的温度或在玻璃化转变温度施加剪切稠化应力直到所述样品升高到高于其凝固点。
17.一种用于冷冻干燥样品的方法，包括通过根据权利要求1至15中任一项的方法低温保存样品，并且然后通过冷冻干燥从所述样品中去除水。
18.一种低温保存介质，具有非牛顿流体性质。
19.根据权利要求18所述的低温保存介质，包含按重量计从2wt％至60wt％的颗粒材料的水性溶液，所述颗粒材料具有10μm或更小的平均粒度。
20.根据权利要求19所述的组合物，还包含从10％wt至40％wt的防冻剂。
21.根据权利要求20中任一项所述的低温保存介质，其中所述防冻剂选自包括以下的组：二甲基亚砜、甲酰胺、乙酰胺、C1-C3醇、1,2-异丙基二醇、1,2-丙二醇、乙二醇、丙二醇、甘油、葡萄糖、单糖、二糖例如蔗糖、海藻糖和乳糖、多糖例如棉子糖和右旋糖酐、聚蔗糖、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮或这些剂中的两种或更多种的组合。
22.根据权利要求18所述的低温保存介质，包含以下或由以下组成：45wt％至55wt％的羟乙基淀粉(HES)、5wt％至20wt％的防冻剂和水。
23.根据权利要求20至22中任一项所述的低温保存介质，其中所述防冻剂选自DMSO或者DMSO与蔗糖、葡萄糖、甘油、棉子糖、果糖或乳糖中的一种或更多种的组合。
24.根据权利要求18至23的低温保存介质在低温保存方法、任选地根据权利要求1至17中任一项的低温保存方法中的用途。
25.一种包，包含根据权利要求18至23中任一项的低温保存介质，任选地其中所述包是无菌的。
26.一种无菌包，包含至少非牛顿添加剂，所述非牛顿添加剂用于通过向其引入水而重构成无菌的根据权利要求18至23中任一项的低温保存介质。
27.具有10μm或更小的平均粒度的颗粒材料将非牛顿流体性质赋予低温保存介质的用途。
28.一种生物样品，依照根据权利要求1至17中任一项的方法保存或在根据权利要求18至23中任一项的组合物中保存。
29.根据权利要求28的组织样品或组织工程化的构建体。
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