CN104472473B - 脐带组织块冻存方法 - Google Patents

脐带组织块冻存方法 Download PDF

Info

Publication number
CN104472473B
CN104472473B CN201410668456.5A CN201410668456A CN104472473B CN 104472473 B CN104472473 B CN 104472473B CN 201410668456 A CN201410668456 A CN 201410668456A CN 104472473 B CN104472473 B CN 104472473B
Authority
CN
China
Prior art keywords
umbilical cord
tissue block
cord tissue
cryopreservation methods
speed
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201410668456.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN104472473A (zh
Inventor
王灵娟
张怡
王浩宇
梁丽潮
王博昊
赵新新
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sunny stem cell Limited by Share Ltd
Original Assignee
HEILONGJIANG TIANQING STEM CELL Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by HEILONGJIANG TIANQING STEM CELL Co Ltd filed Critical HEILONGJIANG TIANQING STEM CELL Co Ltd
Priority to CN201410668456.5A priority Critical patent/CN104472473B/zh
Publication of CN104472473A publication Critical patent/CN104472473A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN104472473B publication Critical patent/CN104472473B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Landscapes

  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

脐带组织块冻存方法，涉及一种脐带冻存方法。本发明是要解决目前脐带组织保存时间短，容易导致脐带组织细胞死亡的问题。方法：一、组织块的处理：在无菌工作台内，将脐带消毒处理，用生理盐水清洗，剪成段，剥离华通式胶，将华通式胶置于洁净的离心管内剪碎；二、向组织块中加入DMEM，重悬组织块后加入预冷冻存液，分装到冻存管中，采用程控降温仪降温，待细菌检测，微生物检测和病毒检测均为阴性后转入液氮中长期保存，即完成脐带组织块的冻存。本发明冻存并解冻后的组织块在培养瓶内直接接种贴壁存活率在98％以上，细胞生长较好，并且对冻存组织块培养后的细胞进行分化成骨实验，分化功能较强。由于保存脐带组织。

Description

脐带组织块冻存方法
技术领域
本发明涉及一种脐带冻存方法。
背景技术
脐带是连接胎儿和胎盘的管状结构，有两条动脉和一条静脉，在血管和内壁之间含有疏松的胶状物质(称为华通氏胶)，该胶状物质里含有丰富的脐带间充质干细胞。
间充质干细胞是干细胞家族的重要成员，具有自我复制和多向分化潜能的原始细胞，是机体的起源细胞，是形成人体各种组织器官的原始细胞。在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞或组织器官，医学界称为“万用细胞”，适用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复的种子细胞。
干细胞是一类未分化未成熟的细胞，其细胞表面的抗原表达很微弱，患者自身的免疫系统对这种未分化细胞的识别能力很低，无法判断它们的属性，从而避免了器官移植引起的免疫排斥反应及过敏反应等，使同种异体移植干细胞非常安全。由于脐带间充质干细胞因其来源广泛，易获得，对机体没有任何损伤，并具有间充质干细胞的所有特性，日益受到人们的关注，越来越多的人开始储存脐带间充质干细胞以备将来不时之需。
脐带组织在4℃冰箱里保存时间最多为10天，而超过10天后再培养脐带组织细胞，则细胞生长困难。
发明内容
本发明是要解决目前脐带组织保存时间短，容易导致脐带组织细胞死亡的问题，提供一种脐带组织块冻存方法。
本发明脐带组织块冻存方法，按以下步骤进行：
一、组织块的处理：
在无菌工作台内，将脐带通过体积百分浓度75％的酒精消毒处理，然后用生理盐水清洗2次，将清洗后的脐带剪成长度为2～3cm的段，然后放在平皿内，剥离华通式胶，将华通式胶置于洁净的离心管内，用手术剪剪碎至1～2mm3的块状；
二、组织块的冷冻：
向组织块中加入DMEM，DMEM的体积为组织块体积的二分之一，重悬组织块后加入与DMEM等体积的预冷冻存液，然后按每管1mL分装到冻存管中，采用程控降温仪降温，具体为：先于4℃平衡30min，然后以1℃/min的速度降至-5℃，接着以21℃/min的速度降至-54℃，再以10℃/min的速度升温至-21℃，然后以2℃/min的速度降至-40℃，接着以10℃/min的速度降至-80℃，最后于-196℃过夜保存，待细菌检测，微生物检测和病毒检测均为阴性后转入液氮中长期保存，即完成脐带组织块的冻存。
本发明的优势：
(1)本发明是先将剥离后的华通式胶剪碎至1mm3大小，这种处理后再加入遇冷的冻存液，有利于冻存保护剂渗透进入组织细胞内，使细胞内水分脱出；所以冷冻时能有效地防止组织细胞内冰晶的生成。
(2)本发明使用剪碎至1mm3大小的华通式胶组织块，在复苏后有利于清洗，复苏过程较简单，不需要再次手动剪碎华通式胶，清洗2次后可直接进行接种培养，对细胞影响较小，并且通过组织冻存实验证明，解冻后组织块在培养瓶内直接接种贴壁存活率在98％以上，细胞生长较好，并且对冻存组织块培养后的细胞进行分化成骨实验，分化功能较强。
(3)本发明方法可应用于新生儿出生后脐带的保存，脐带组织块可以在液氮深低温环境长期保存并具有新鲜组织类似的活性、生长能力和分化能力，根据需要可复苏、扩增后应用到未来疾病的治疗中。
组织块加入冷冻保存液后，通过程控降温仪降温，梯度降温冻存组织块，根据组织冻存过程中的升温及降温的规律设定相应的冻存速率，能最大限度的保护组织细胞不受损伤。通过本发明采用的脐带组织冻存方法能够保存脐带组织20年以上，根据使用情况进行复苏组织块，用于细胞培养。
附图说明
图1为冷冻前脐带组织块的P1代细胞生长状态；图2为解冻复苏后P1代细胞生长状态；图3为脐带组织块冻存前后的生长曲线；图4为冻存组织块复苏后培养的细胞分化成骨细胞照片；图5为冻存前的新鲜组织细胞分化成骨细胞照片。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式脐带组织块冻存方法，按以下步骤进行：
一、组织块的处理：
在无菌工作台内，将脐带通过体积百分浓度75％的酒精消毒处理，然后用生理盐水清洗2次，将清洗后的脐带剪成长度为2～3cm的段，然后放在平皿内，剥离华通式胶，将华通式胶置于洁净的离心管内，用手术剪剪碎至1～2mm3的块状；
二、组织块的冷冻：
向组织块中加入DMEM，DMEM的体积为组织块体积的二分之一，重悬组织块后加入与DMEM等体积的预冷冻存液，然后按每管1mL分装到冻存管中，采用程控降温仪降温，具体为：先于4℃平衡30min，然后以1℃/min的速度降至-5℃，接着以21℃/min的速度降至-54℃，再以10℃/min的速度升温至-21℃，然后以2℃/min的速度降至-40℃，接着以10℃/min的速度降至-80℃，最后于-196℃过夜保存，待细菌检测，微生物检测和病毒检测均为阴性后转入液氮中长期保存，即完成脐带组织块的冻存。
本发明先将脐带华通式胶剪碎后加入遇冷的冻存液，以便于冷冻保护剂渗透进入组织细胞内，使细胞内水分脱出，减少细胞受损。该方法操作步骤较简单、花费时间短。冻存的组织块解冻后就可直接接种到培养瓶内培养。一次能冻存较多数量的华通式胶组织块，复苏后组织块贴壁存活率高达98％以上。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：将清洗后的脐带剪成长度为2.5cm的段。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是：用手术剪剪碎至1.5mm3的块状。其它与具体实施方式一或二相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：所述冻存液由6.8～7.2mLDMEM、0.7～1.2mL胎牛血清、0.1～0.2mLL-谷氨酰胺和2mL二甲基亚砜组成，配制好后于4℃预冷保存。其它与具体实施方式一至三之一相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是：所述冻存液由6.9～7.1mLDMEM、0.8～1.1mL胎牛血清、0.15mLL-谷氨酰胺和2mL二甲基亚砜组成，配制好后于4℃预冷保存。其它与具体实施方式一至四之一相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是：所述冻存液由7mLDMEM、1mL胎牛血清、0.15mLL-谷氨酰胺和2mL二甲基亚砜组成，配制好后于4℃预冷保存。其它与具体实施方式一至五之一相同。
实施例1：
本实施例脐带组织块冻存方法，按以下步骤进行：
一、组织块的处理：
在无菌工作台内，将脐带通过体积百分浓度75％的酒精消毒处理，然后用生理盐水清洗2次，将清洗后的脐带剪成长度为2cm的段，然后放在平皿内，剥离华通式胶，将华通式胶置于洁净的离心管内，用手术剪剪碎至1mm3的块状；
二、组织块的冷冻：
向组织块中加入DMEM，DMEM的体积为组织块体积的二分之一，重悬组织块后加入与DMEM等体积的预冷冻存液，然后按每管1mL分装到冻存管中，采用程控降温仪降温，具体为：先于4℃平衡30min，然后以1℃/min的速度降至-5℃，接着以21℃/min的速度降至-54℃，再以10℃/min的速度升温至-21℃，然后以2℃/min的速度降至-40℃，接着以10℃/min的速度降至-80℃，最后于-196℃过夜保存，待细菌检测，微生物检测和病毒检测均为阴性后转入液氮中长期保存，即完成脐带组织块的冻存。
所述冻存液由7mLDMEM、0.8mL胎牛血清(FBS)、0.2mLL-谷氨酰胺和2mL二甲基亚砜(DMSO)组成，配制好后于4℃预冷保存。
为验证本实施例的效果进行以下实验：
(1)将冻存组织块复苏的操作步骤如下：
解冻时，先将冻存管从液氮中取出，放在37℃水浴中1min完成解冻。
用移液管将解冻的组织块吸入放入洁净的离心管中，加入2-3倍体积的DMEM混匀，然后于4℃、1300转/分钟离心6分钟，去掉上清液，使用DMEM反复清洗2-3次，并去掉上清液。
将组织块直接接种到T75培养瓶中，加入培养液后放入CO2培养箱内培养。培养后的第3天进行第一次换液，以后5天换一次液。细胞融合度达到70％以上后，使用胰蛋白酶进行消化后传代。
冷冻前脐带组织块的P1代细胞生长状态如图1所示。复苏后P1代细胞生长状态如图2所示。实验结果表明解冻后组织块在培养瓶内直接接种贴壁存活率高达99％，细胞生长较好。脐带组织块冻存前后的生长曲线如图3所示—●—表示冻存前的新鲜脐带组织，—■—表示解冻复苏后的脐带组织。由图3可以看出，脐带组织块冻存前后的生长状态基本一致。
(2)细胞成骨分化操作步骤：
将冻存组织块复苏后的细胞接种于24孔板中，按照2×104个细胞/孔接种，3天后换成骨分化培养基，每三天换一次液，至培养后的第14天，固定细胞，染色，镜检。分化的成骨细胞照片如图4所示。对冻存组织块培养后的细胞进行分化成骨实验，结果表明细胞分化功能较强。与冻存前的新鲜组织细胞成骨分化(如图5所示)相比，分化功能一致。

Claims (5)

1.脐带组织块冻存方法，其特征在于该方法按以下步骤进行：
一、组织块的处理：
在无菌工作台内，将脐带通过体积百分浓度75％的酒精消毒处理，然后用生理盐水清洗2次，将清洗后的脐带剪成长度为2～3cm的段，然后放在平皿内，剥离华通式胶，将华通式胶置于洁净的离心管内，用手术剪剪碎至1～2mm3的块状；
二、组织块的冷冻：
向组织块中加入DMEM，DMEM的体积为组织块体积的二分之一，重悬组织块后加入与DMEM等体积的预冷冻存液，然后按每管1mL分装到冻存管中，采用程控降温仪降温，具体为：先于4℃平衡30min，然后以1℃/min的速度降至-5℃，接着以21℃/min的速度降至-54℃，再以10℃/min的速度升温至-21℃，然后以2℃/min的速度降至-40℃，接着以10℃/min的速度降至-80℃，最后于-196℃过夜保存，待细菌检测，微生物检测和病毒检测均为阴性后转入液氮中长期保存，即完成脐带组织块的冻存；
所述冻存液由6.8～7.2mLDMEM、0.7～1.2mL胎牛血清、0.1～0.2mLL-谷氨酰胺和2mL二甲基亚砜组成，配制好后于4℃预冷保存。
2.根据权利要求1所述的脐带组织块冻存方法，其特征在于将清洗后的脐带剪成长度为2.5cm的段。
3.根据权利要求1或2所述的脐带组织块冻存方法，其特征在于用手术剪剪碎至1.5mm3的块状。
4.根据权利要求3所述的脐带组织块冻存方法，其特征在于所述冻存液由6.9～7.1mLDMEM、0.8～1.1mL胎牛血清、0.15mLL-谷氨酰胺和2mL二甲基亚砜组成，配制好后于4℃预冷保存。
5.根据权利要求3所述的脐带组织块冻存方法，其特征在于所述冻存液由7mLDMEM、1mL胎牛血清、0.15mLL-谷氨酰胺和2mL二甲基亚砜组成，配制好后于4℃预冷保存。
CN201410668456.5A 2014-11-20 2014-11-20 脐带组织块冻存方法 Active CN104472473B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410668456.5A CN104472473B (zh) 2014-11-20 2014-11-20 脐带组织块冻存方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410668456.5A CN104472473B (zh) 2014-11-20 2014-11-20 脐带组织块冻存方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN104472473A CN104472473A (zh) 2015-04-01
CN104472473B true CN104472473B (zh) 2016-03-16

Family

ID=52747199

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410668456.5A Active CN104472473B (zh) 2014-11-20 2014-11-20 脐带组织块冻存方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN104472473B (zh)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105145547B (zh) * 2015-10-28 2018-07-10 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 一种脐带间充质干细胞的冻存保护液及冻存方法
EP3367791B1 (en) 2015-10-29 2021-07-21 Asymptote Ltd Methods for cryopreservation
CN105766890B (zh) * 2016-02-26 2018-05-22 生宝生物科技股份有限公司 脐带组织的低温保存及获得其衍生干细胞的方法
CN106417260A (zh) * 2016-11-30 2017-02-22 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 一种脐带组织冻存液
CN106508892A (zh) * 2016-11-30 2017-03-22 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 一种脐带组织冻存液及冻存方法
CN109864063A (zh) * 2018-06-29 2019-06-11 江苏艾尔康生物医药科技有限公司 一种人源视网膜色素上皮细胞的程序性降温冻存的方法及应用
CN109392891B (zh) * 2018-10-26 2020-10-16 银丰生物工程集团有限公司 一种依结构层次系统冻存人脐带组织的方法和应用
CN114099779A (zh) * 2020-08-28 2022-03-01 傅毓秀 可促进骨质新生的瓦顿氏凝胶制品
CN112741081B (zh) * 2021-01-29 2021-12-21 华夏源(上海)生物科技有限公司 一种冻存降温效果优异的人脐带间充质干细胞的程序降温方法
WO2023164799A1 (zh) * 2022-03-01 2023-09-07 傅毓秀 可促进骨质新生的瓦顿氏凝胶制品

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101971798A (zh) * 2010-11-03 2011-02-16 江苏省北科生物科技有限公司 人脐带华通氏胶组织块冻存保护液
CN101971799A (zh) * 2010-11-03 2011-02-16 江苏省北科生物科技有限公司 一种人脐带华通氏胶组织块冻存保护液
CN102660497A (zh) * 2012-05-21 2012-09-12 博雅干细胞科技有限公司 脐带组织冻存、复苏以及分离和扩增干细胞的方法
CN102660502A (zh) * 2012-05-21 2012-09-12 博雅干细胞科技有限公司 冻存和复苏脐带全细胞并分离和扩增干细胞的方法
CN104145943A (zh) * 2014-07-21 2014-11-19 重庆市红汇脐血干细胞中心有限公司 一种人脐带华通氏胶组织的冻存保护液及其制备与应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101971798A (zh) * 2010-11-03 2011-02-16 江苏省北科生物科技有限公司 人脐带华通氏胶组织块冻存保护液
CN101971799A (zh) * 2010-11-03 2011-02-16 江苏省北科生物科技有限公司 一种人脐带华通氏胶组织块冻存保护液
CN102660497A (zh) * 2012-05-21 2012-09-12 博雅干细胞科技有限公司 脐带组织冻存、复苏以及分离和扩增干细胞的方法
CN102660502A (zh) * 2012-05-21 2012-09-12 博雅干细胞科技有限公司 冻存和复苏脐带全细胞并分离和扩增干细胞的方法
CN104145943A (zh) * 2014-07-21 2014-11-19 重庆市红汇脐血干细胞中心有限公司 一种人脐带华通氏胶组织的冻存保护液及其制备与应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
不同冻存液对人脐带间充质干细胞生物学特性的影响;李田等;《器官移植》;20130915;第4卷(第5期);268-272 *
脐带血干细胞低温保存的理论和实验研究;张绍志;《浙江大学博士学位论文》;20031231;全文 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN104472473A (zh) 2015-04-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104472473B (zh) 脐带组织块冻存方法
CN101974484B (zh) 一种人脐带间充质干细胞的制备方法
KR100779812B1 (ko) 비-조혈 조직으로부터의 비-배아세포의 보존
CN104145943B (zh) 一种人脐带华通氏胶组织的冻存保护液及其制备与应用
US6767740B2 (en) Stem cell and dental pulp harvesting method and apparatus
CA1310588C (en) Method for cryopreserving heart valves
CN108251361A (zh) 一种脐带组织块冻存、复苏以及制备间充质干细胞的方法
CN107306940A (zh) 一种海水鱼类的精巢冷冻保存剂及精原细胞的制备方法
US20170260500A1 (en) Improvements in tissue processing
JP2009247276A (ja) 生体供給用、生体移植用、生体添加用、生体投与用の解凍器官若しくは組織または解凍細胞群とその製造方法及びそれらに用いる過冷却液並びに製造装置
CN102763642B (zh) 一种冷冻保护液以及冷冻保存人胎盘羊膜和绒毛膜的方法
CN113925049A (zh) 一种保持细胞活性的细胞保存液及其制备方法和应用
CN105211053B (zh) 一种人跟腱来源肌腱干细胞的冻存液及其制备方法
CN108812642B (zh) 一种依结构层次制备胎盘组织及冻存的系统方法和应用
CN109042624B (zh) 人胎盘绒毛膜下大血管组织的制备冻存方法和应用
Kumari Stem Cell
CN108192859A (zh) 一种胎盘组织冻存、复苏和制备间充质干细胞的方法
RU2695364C1 (ru) Способ лечения нерубцовой алопеции
Fukushima et al. Dendritic Cell and Natural Killer cell stability for immunotherapy after long-term cryopreservation
CN110373381A (zh) 一种通过均质器高效胎盘间充质干细胞的制备方法
EP3220737A2 (en) Apparatus and method for storing tissue
Kay et al. Medicine and Biology: Technologies Operating at Extremely Low Temperatures
Herati et al. Processing and cryopreservation of testicular sperm
Kawkab Al–Muhja Impact of Cryopreservation Techniques on Embryos Viability and Normality in Awassi Sheeps
Sharma et al. lndigenous Livestock and Poultry Breeds

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CP03 Change of name, title or address

Address after: The innovation of science and technology city top two high tech Industrial Development Zone, Heilongjiang province Harbin City Road 150028 No. 199

Patentee after: Sunny stem cell Limited by Share Ltd

Address before: 602 room 1, unit 24, Songshan Road, Nangang concentration zone, Harbin Development Zone, Heilongjiang 150090, China

Patentee before: HEILONGJIANG TIANQING STEM CELL CO., LTD.

CP03 Change of name, title or address