CN105766890B - 脐带组织的低温保存及获得其衍生干细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

一种低温保存脐带组织的方法，包含下列步骤：(a)施加张力至一脐带片段，以扩张该脐带片段中三条脐带血管之间的空隙；(b)在各该脐带血管之间的空隙沿着平行于该脐带血管长度的纵向切割该脐带片段，以获得一条状脐带组织，其中该条状脐带组织包含该脐带血管与华顿氏胶(Wharton’s jelly)，该华顿氏胶来自于一血管周边区域、一血管间区域及一羊膜下层区域；(c)将该条状脐带组织与一低温组成物进行混合培养(incubating)；以及(d)低温保存含有该华顿氏胶的该条状脐带组织与该低温组成物。

Description

脐带组织的低温保存及获得其衍生干细胞的方法
技术领域
本发明广泛地有关于干细胞，以及更具体地来说关于一种保存脐带组织衍生干细胞的方法。
背景技术
已有许多文献指出保存一婴儿脐带血的潜在好处。有一类似概念为于出生时保存一婴儿的脐带片段中的脐带组织，其中该脐带组织包含的细胞，可能可供后续使用。该脐带组织可于低温储藏柜中冷冻以利长期保存。当未来有需要该婴儿细胞用于治疗时，该脐带组织可经处理后以当时可获得的最佳技术提取其中的细胞。
举例来说，美国专利公开号第2009/0275127 A1号(其整体被并入本文中作为参考文献)，它公开一种从冷冻脐带组织所提取的可发育的祖细胞(progenitor cells)的方法。所公开的技术中，一脐带组织为一含有血管周边的华顿氏胶(Wharton’s jelly)的血管，而该提取出的祖细胞为人类脐带血管周边细胞(human umbilical cord perivascularcells,HUCPVCs)。在公开的方法中，带有与其相缔结的华顿氏胶的完整脐带血管是藉由从已被纵向切开的脐带中缓慢地拉离各该血管而被获得，并且被横向地切割以产生血管片段。此过程中将会去除该脐带中的大部分华顿氏胶，但留下在血管周边区域与该被提取的血管相缔结的华顿氏胶。该脐带血管的末端被打结固定住(tied off)，以避免血管中的任何残留血液漏出。另一方面，血管中的血液可藉由重复润湿(rinsing)来移除。
被授予本案发明人的美国专利公开号第8,703,411 B2号公开一种保存脐带的方法。该专利的公开内容以其整体被并入本文中作为参考文献。该专利中所公开的方法包含获得一脐带片段；将该脐带切碎成复数个脐带组织碎块；将各该脐带组织碎块与含有一抗冻剂和一蛋白质的一抗冻溶液混合成一混合物；摇晃该混合物历时一不小于20分钟且不大于40分钟的期间；以及超低温保存该混合物。
脐带组织的保存及后续的细胞培养为相对新颖的技术。当先前技术提供一可行的保存脐带组织方法时，仍需要一个有效率的保存脐带组织方法，以供后续使用。
发明内容
本发明有关于一种低温保存脐带组织的方法，根据本发明的实施例，该方法包含下列步骤：(a)施加张力至一脐带片段，以扩张该脐带片段中三条脐带血管之间的空隙；(b)在各该脐带血管之间的空隙沿着平行于该脐带血管长度的纵向切割该脐带片段，以获得一条状脐带组织(umbilical cord tissue strip)，其中该条状脐带组织包含该脐带血管与华顿氏胶(Wharton’s jelly)，该华顿氏胶来自于一血管周边区域(perivascularregion)、一血管间区域(intervascular region)及一羊膜下层区域(subamnion region)；(c)将该条状脐带组织与一低温组成物(cryogenic composition)进行混合培养(incubating)；以及(d)低温保存含有该华顿氏胶的该条状脐带组织与该低温组成物。
根据本发明的实施例，该方法更包含纵向切割该脐带片段的剩余部分，以获得另外两条条状脐带组织。
根据本发明的实施例，该方法中于剪切后需尽快进行该培养步骤，例如于第一次切割后的5至10分钟之间，而于第一次切割后的第6分钟时为佳。
根据本发明的实施例，该方法更包含利用一工具或一探针施加张力至该脐带片段。该工具或该探针的一端可插入至一脐带血管中，而另一端固定或枢接(pivotallyconnected)至一固定装置(stationary device)。
根据本发明的实施例，该方法未涉及以任何酵素来消化(digesting)该条状脐带组织。
根据本发明的实施例，其中步骤(c)更包含于该低温组成物中摇晃该条状脐带组织历时20至40分钟。
本发明另一方面有关于一种获得脐带组织衍生干细胞的方法，根据本发明的实施例，该方法包含下列步骤：(a)解冻一经低温保存的条状脐带组织，其中该经低温保存的条状脐带组织包含一条状脐带组织与一低温组成物，该条状脐带组织包含一脐带血管与华顿氏胶，该华顿氏胶包含有来自于一血管周边区域、一血管间区域、及一羊膜下层区域的胶状组织(gelatinous tissue)；(b)移除该低温组成物；(c)切割该条状脐带组织形成复数个脐带组织碎块，其中该脐带组织碎块的尺寸大于2毫米；以及(d)培养该脐带组织碎块于一培养基中，以获得该脐带组织衍生干细胞。该脐带组织碎块尺寸大于2毫米而无法通过一具有2mm开口的筛孔。根据本发明的实施例，其中该脐带组织碎块的尺寸不小于0.5公分(亦即大于等于0.5公分)。
根据本发明的实施例，该用于获得脐带组织衍生干细胞的方法包含不以酵素来处理该条状脐带组织。
附图说明
图1为一示意图，说明本发明实施例中一用以固定并剪切脐带的装置。
图2A为一示意图，说明一脐带横切面。
图2B为一示意图，说明本发明实施例中以一脐带制备复数个条状脐带组织的操作。
图2C为一示意图，箭头表示该超低温保存溶液与各该条状脐带组织的接触处。
图3为一流程图，说明本发明实施例中处理一脐带的超低温保存的步骤。
图4A为一照片，说明依据美国专利公开号第8,703,411 B2号来处理一脐带用以进行超低温保存、解冻、和培养该预保存的脐带以获得初代脐带间充质干细胞(umbilicalcord mesenchymal stem cells,UC-MSCs)的方法。
图4B为一照片，说明依据本发明的实施例来处理一脐带用以进行超低温保存、解冻、剪切该脐带至粗糙碎块、和培养该碎块以获得初代脐带间充质干细胞的方法。
图4C为一照片，比较依美国专利公开号第8,703,411 B2号所公开的脐带组织碎块大小与本发明的方法所获得的脐带组织碎块大小。
图5A为一示意图，说明本发明一实施例中设计的一可固定脐带位置的工具，以较方便的方式处理该脐带成为条状脐带组织供超低温保存。
图5B为一示意图，说明本发明另一实施例中设计的一可固定脐带位置的工具，以较方便的方式处理该脐带成为条状脐带组织供超低温保存。
图5C为一示意图，说明本发明另一实施例中设计的一可固定脐带位置的工具，以较方便的方式处理该脐带成为条状脐带组织供超低温保存。
图6A为一结果图，比较实验组(本发明的方法)与对照组(根据美国专利公开号第8,703,411 B2号的方法)超低温保存前的操作时间。
图6B为一结果图，说明实验组(本发明的方法)与对照组(根据美国专利公开号第8,703,411 B2号的方法)每克脐带组织中初代培养的UC-MSCs细胞数目。
图6C为一结果图，说明实验组(本发明的方法)与对照组(根据美国专利公开号第8,703,411 B2号的方法)初代培养的天数。
图6D为一表格，比较实验组(本发明的方法)与对照组(美国专利公开号第8,703,411 B2号)的方法，其间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)阳性(positive)与阴性(negative)表面因子的表现量和细胞可活性(cell viability)。
符号说明
(120)固定装置
(1)插槽(或孔洞)
(2)插槽(或孔洞)
(100)脐带
(102)静脉
(104)动脉
(106)动脉
(108)条状脐带组织
(110)条状脐带组织
(112)条状脐带组织
S91-S98步骤
(702)粗糙脐带组织碎块
(704)脐带组织碎块
(5)固定装置
(51)底座
(511)顶部表面
(512)底部表面
(513)前端
(514)后端
(515)隆起部
(52)支架
(521)顶部表面
(522)底部表面
(523)前端
(524)后端
(525)插槽
(53)支柱
(531)顶部端
(532)底部端
(533)前表面
(534)后表面
(54)槽座
(6)固定装置
(61)底座
(611)顶部表面
(612)底部表面
(613)前端
(614)后端
(615)球型固定底座
(62)支架
(621)顶部表面
(622)底部表面
(623)前端
(624)后端
(625)插槽
(626)螺丝孔
(63)连接体
(631)球状端
(64)空心帽型旋转座
(641)顶部端
(642)底部端
(643)缺口
(65)螺帽
(7)固定装置
(71)底座
(711)顶部立墙
(712)侧边墙
(713)斜边
(714)平台
(72)支架
(721)顶部表面
(722)底部表面
(723)前端
(724)后端
(725)插槽
(73)横向插槽
(74)垂直插槽。
具体实施方式
本发明的实施例，仅用以下描述的举例做说明。所属领域中具有通常知识者于不脱逸本发明范围的前提下可能做出其他等效修饰或变化。本发明的各种实施例详细描述于以下各段内容中，而参考图式内的元件以数字符号做标示。
定义
本篇说明书中所使用的用语，于所属领域中、本发明的内文、及特定上下文中皆具通常意义。用以描述本发明的特定用语于以下、或说明书中其他部份讨论，以提供有关本发明于实践时的额外引导。为了方便，特定用语将以粗体、斜体、及/或引号标记。粗体标记对本发明的范围和用语的意义并无影响；用语的定义无论是否有粗体标记，于上下文中该意义范围皆相同。
除非另有定义，否则所属领域中具有通常知识者皆可理解本文所使用的技术和科学用语与通常用语具有相同的意思。如有冲突的情形，以本文件、以及包括定义为准。同一件事物可以不只一种方式叙述是可以理解的，所以于本文讨论时一个或多个用语可使用替代字眼或同义词表示；一个用语是否需详细阐述或于本文中讨论并不具特别意义。特定用语可使用同义词，且不排除于详述一个或多个同义词时使用其他同义词。此说明书中所使用的任何例子，包括本文所讨论的任何用语，仅为说明用，无法限制本发明、或任何解释性用语的范围或意义。同样地，本发明并不仅限于以下实施例。
用语「约」、「大约」、或「大概」意指于一数值或范围的上下20％以内，更佳为10％以内，最佳为5％以内。本文所述的数字均为近似值，也就是说如果没有明确说明，则可以用语「约」、「大约」、或「大概」做推断。此外，本文中所公开的任何数值范围包括该范围内的所有数值，等同范围内的每个数值皆被单独公开。
用语「脐带组织碎块(an umbilical cord tissue piece)」、「脐带组织碎块(cordtissue pieces)」、及「粗糙脐带组织碎块(coarse cord tissue pieces)」使用上具有互换性。一粗糙脐带组织碎块意指为一尺寸大于2毫米的脐带组织的一碎块，尺寸大于3毫米为佳，尺寸大于4毫米更佳，尺寸大于5毫米为最佳。一脐带组织碎块的尺寸大于2mm意指为该脐带组织碎块无法通过一筛孔大小2毫米的细胞过滤器。
用语「一脐带片段(a segment of an umbilical cord)」，意指一脐带的一部份。一脐带片段的长度可能为0.5、1、2、3、5、10公分、更长、或以上长度之间任一长度。
用语「超低温保存(cryopreservation or cryopreserving)」意指一处理过程，其中细胞或整个组织降温至低于冷冻的温度保存，例如77K或-196℃(液态氮的沸点)。于如此低温时，将有效遏止任何生物活性，包括导致细胞死亡的生化反应。然而，当未使用抗冻溶液时，细胞保存常于降温至冷冻或解冻至室温时造成损害。
用语「冷冻(freezing)」、及「超低温保存(cryopreserving)」使用上具有互换性。用语「一低温组成物(cryogenic composition)」、「一低温溶液(cryogenic solution)」、「一低温保存组成物(cryopreservation composition)」、及「一抗冻溶液(anti-freezingsolution)」可互换使用。任何低温组成物或低温保存组成物为本所属领域中普遍使用之。举一低温组成物或一低温保存组成物为例，其中可能包含浓度约从1％至70％的二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)，浓度大约5％至55％更佳。其他低温组成物或低温保存组成物的例子，如美国专利公开号第8,703,411 B2号的方法，可能包含一抗冻剂及一蛋白质以形成一混合物。
用语「脐带组织衍生细胞(cord tissue-derived cells)」、「脐带组织碎块衍生细胞(cord tissue pieces-derived cells)」、「脐带组织衍生干细胞(cord tissue-derivedstem cells)」、及「脐带组织衍生间充质干细胞(cord tissue-derived MSCs)」使用上具有互换性，除非另有其他指定。
用语「倍增时间(doubling time)」意指为体积或数值增加一倍所需的时间。
实施例
根据本发明的实施例，在不限定本发明范围的前提下，示范仪器、装置、方法、及相关实验结果于叙述如下。实施例中出现的标题与副标题为方便阅读用，无法限制本发明的范围。此外，本文中只要是根据本发明而不考虑任何特定理论或实践方式所提出和公开的特定理论，不论其对错皆无法限制本发明的范围。
材料与方法
美国专利公开号第8,703,411 B2号公开一种制备对照组样品的方法。简短地说，一适当长度的脐带经清洗与杀菌消毒，在移除两脐带动脉血管后，无方向性的剪切脐带组织成为每块大约2mm大小的碎块状。将该组织碎块施以酵素处理作用一最理想的时间。当酵素作用终止后，清洗该组织碎块以移除残留的酵素，再加入含有DMSO的抗冻溶液，并将组织碎块放入液态氮中保存。在超过一个星期的超低温保存之后，解冻该组织碎块，并清洗以移除抗冻溶液，以进行细胞初代培养。根据细胞生长情形，收集细胞、计算细胞数量、及细胞可活性和特性测定分析。
美国专利公开号第8,703,411 B2号公开的方法费时耗力，因为脐带光滑且难以剪切。本发明的方法设计用来克服脐带的滑溜与韧度，且仅需一人便可方便地进行操作。
根据本发明的一个实施例，提出一个可提供支持力及固定力的工具，例如：钳子，可插入脐带中而不需要移除脐带内的血管。此外，一固定物(或固定装置)可固定该脐带于一适当位置，并撑开(stretching open)该脐带，如此可方便地供单人纵向剪切该脐带组织。
一脐带包括三条血管，分别为一条静脉和两条动脉。根据本发明的方法，一脐带可被纵向的切为二或三条条状脐带片段，每片段至少包含一条血管及与其相缔结的血管周边的华顿氏胶，其中该华顿氏胶来自于一血管周边区域、一血管间区域、及一羊膜下层区域。因此，根据本发明的实施例，有一种方法只需切两到三刀，可获得华顿氏胶层全部暴露出的条状脐带组织，让华顿氏胶层可直接与低温保存溶液接触，从而增加低温保存溶液渗入华顿氏胶层的渗透效率。该低温保存溶液可直接加入该条状脐带组织。和低温保存溶液混合之后，该脐带条状组织可储存于液态氮中。
为展示由本发明的方法所保存的细胞活性，在超低温保存超过一星期后，解冻该条状组织，清洗以移除抗冻溶液，并剪切至每块尺寸大于2mm的碎块(例如：2～10mm或2～5mm为佳)，接着将华顿氏胶层的切面朝下放置进行初代培养(即为朝向培养皿底部)。根据细胞生长情形，收集细胞、计算细胞数量、及细胞可活性和特性测定分析(表面标记分析和细胞可活性分析)。
根据细胞动力学的集落形成单位(colony forming unit,CFU)，于10至14天后采集对照组(根据美国专利公开号第8,703,411 B2号的方法)和实验组(本发明的方法)两者的初代脐带间充质干细胞。以7-氨基放线菌素-D(7-aminoactinomycin-D,7-AAD)染色，再利用流式细胞仪分析间充质干细胞的阳性与阴性表面标记、阶段-特异性胚胎抗原4(stage-specific embryonic antigen 4,SSEA-4)[一种细胞表面的鞘糖脂基因(a cellsurface glycosphingolipid gene)]、及细胞可活性。
实施例一 条状脐带组织的制备：
图1为一示意图，说明一固定装置120可用于剪切一脐带成为条状脐带组织前固定该脐带。此为该装置的一实施例，可使本发明的方法更容易完成。所属领域中具有通常知识者理解可使用其他装置，只要可以使本发明的方法更容易操作即可。如图1所示，此实施例中该固定装置120配置有两个插槽(或孔洞)1和2，用以固定/容纳工具(如钳子)方便以本发明的方法进行脐带剪切。
图2A为一示意图，说明一脐带的横截面，具有三条血管。一条脐带包含三层：羊膜、脐带血管(即两条动脉与一条静脉)、及基质(一种称为华顿氏胶的粘液结缔组织，其位于羊膜上皮细胞内衬和脐带血管之间)。华顿氏胶可被细分为位在三种不同的区域：羊膜下层区域(约在羊膜上皮细胞内衬的区域)、血管间区域(约在脐带血管之间的区域)、及血管周边区域(大致围绕在每条脐带血管周围)。
图2B展示本发明一个实施例的概念。如图2B所示，一脐带100含有一静脉102与两动脉104和106。所示的三条切割线位于脐带血管之间，可分离三条血管成为三条条状脐带组织，并且其血管周围伴随着华顿氏胶。每个条状脐带组织皆含有一条脐带血管及华顿氏胶，由此所获得的华顿氏胶来自于三个区域：羊膜下层区域、血管间区域、及血管周边区域。此实施例中，静脉102与周围的华顿氏胶层形成一条状脐带组织110。动脉104与周围的华顿氏胶层形成另一条状脐带组织112。而动脉106与周围的华顿氏胶层形成另一条状脐带组织108。
一旦将各该条状脐带组织分离，将暴露出更多华顿氏胶的表面，如图2C所示。更大的华顿氏胶暴露表面积可促进低温保存溶液渗透进入该条状脐带组织。因此，条状脐带组织内的细胞于冷冻和解冻过程受到损伤的可能性下降，造成更多可利用的细胞可从低温保存的条状脐带组织中回收。
本发明的方法设计用以快速分离脐带，同时增加华顿氏胶层与低温溶液的接触面积。可搭配具有支持力与固定力的工具(如一对钳子)用来固定、维持该脐带。
举例来说，依据图2A到2C，工具(如一对钳子)的一端被插入至一脐带片段100内的血管管腔(例如脐带静脉102)中。接着，相同工具的另一端可被固定于一装置上，例如插入脐带固定装置120(图1)上的插槽(或孔洞)1中。在一相似的程序中，一第二工具的一端被插入至第二条血管的管腔中(例如脐带动脉104)。该第二工具的另一端被固定于脐带固定装置120(图1)上的插槽2中。
同样地，将第三工具的一端插入至第三条血管的管腔(例如脐带动脉106)。接着，施加轻微的张力至脐带(透过插入的工具)，以扩张与其他血管之间的空隙，如脐带动脉106、脐带静脉102、及脐带动脉104。
当脐带于该张力作用下时，可使用一剪切工具(如手术刀)划破华顿氏胶的区域，沿着脐带血管间的空隙进行纵向切割，如脐带动脉106与脐带静脉102之间，其切割方向平行于各该脐带血管的长度。接着，第二刀沿着脐带动脉106和脐带动脉104间的空隙进行纵向切割，以获得包含脐带动脉106的条状脐带组织108。
同样地，条状脐带组织110和112可由接下来的剪切得到。举例来说，当施加张力至剩余的脐带以打开脐带静脉102与脐带动脉104之间的华顿氏胶，再进一步的切开华顿氏胶便可分开剩余的脐带成为两条条状脐带组织110和112。
特别注意上述例子中所描述的插入工具和脐带的分离需有特定顺序。于不脱离本发明的范围下，所属领域中具有通常知识者了解插入工具和分离脐带的顺序。此外当工具如上述所说插入血管的管腔时，仍有可能插入靠近血管的华顿氏胶层。所属领域中具有通常知识者可察知，插入的工具为提供一轻微的张力以打开血管间的空间和/或拉直该脐带片段以方便剪切的操作。因此，工具可藉由插入至血管的管腔或插入至靠近血管的华顿氏胶层中来达致相同的操作目的。
获得各该条状脐带组织后，各该条状脐带组织将被清洗、消毒，并浸泡于低温保存溶液中，预防细胞在冷冻或解冻过程中受到损伤。举例来说，将各该条状脐带组织108、110、及112置于含有抗冻溶液的试管中一个适当的时间(如30秒到数分钟)，以清洗各该条状脐带组织。接着再将各该条状脐带组织以缓冲溶液清洗以移除杂质。
各该条状脐带组织108、110、及112接下来以适当时间(如20-60分钟)于低温(如低于10℃)环境下与低温保存溶液一起混合培养并进行摇晃。脐带组织与低温保存溶液应在剪切后迅速进行混合培养，举例来说，在第一次切割后的5、6、7、8、9、或10分钟时进行混合培养；而在第一次切割后的6分钟内为佳。最后，各该条状脐带组织108、110、及112可被缓慢降温至适宜温度(如-70℃)，接着以超低温保存温度(如低于-120℃)低温保存于液态氮桶中。
图3为一流程图，说明本发明中的其中一项实施例，为制备条状脐带组织用以低温保存的过程。适当长度的一脐带片段(举例来说：大约3公分、5公分、7公分、或10公分，3-7公分为佳)包含三条脐带血管。如上述所说，于脐带血管管腔插入一或多个工具。施加一缓和力量以撑开(stretch open)位于第一和第二、三条血管之间的华顿氏胶层(第一空间)，接着以手术刀纵向地切开该第一空间(亦即平行于各该血管)，以获得第一条状脐带组织(包含有该第一条血管及其相缔结的华顿氏胶层)。之后撑开位于第二与第三条血管之间的华顿氏胶层(第二空间)，并纵向划开第二空间(平行于各该血管)以获得第二条状脐带组织(包含有该第二条血管及其相缔结的华顿氏胶层)和第三条状脐带组织(包含有该第三条血管及其相缔结的华顿氏胶层)。
图4A、4B为照片，说明本发明(图4B：实验组)和先前技术(图4A：对照组，参考美国专利公开号第8,703,411 B2号)之间，制备脐带组织用以低温保存的差异。
图4A(先前技术)说明将一脐带片段消毒、清洗、移除其中两动脉血管、及手动无方向性地剪切脐带组织至每块大小约2毫米的碎块。接着，各该碎块被施以酵素消化处理历时约20-40分钟后，之后该消化溶液被添加至一含有血清的培养基或酵素终止试剂中，以终止酵素的消化作用。各该碎块以缓冲液或细胞培养基(如dulbecco's modified eaglemedium,DMEM)清洗后，以低速离心机沈淀该组织碎块，并移除残余酵素。该组织碎块再与低温保存溶液于10℃摇晃混合20-60分钟，接着于液态氮中超低温度保存。
为测试超低温保存的细胞可活性，在超过一个星期的超低温保存之后，该组织碎块中的一样本在37℃下快速解冻，并清洗数次，再以低速离心机沈淀碎块组织以利完全移除低温保存溶液。接者，将该组织碎块进行初代细胞培养，根据细胞生长状况，于10-14天后收集细胞。
图4B说明本发明中一实施例：一脐带片段经杀菌、清洗、及不需先移除脐带血管便可剪切为细长的条状脐带组织。接着，该条状脐带组织于一适当温度(不大于10℃，例如0-10℃)与低温保存溶液混合(如摇晃)一段时间(例如20-60分钟，30-50分钟为佳)。再将该条状脐带组织于超低温(如液态氮中)保存。
为测试超低温保存的细胞可活性，在超过一个星期的超低温保存之后，该组织碎块中的一样本在37℃下快速解冻，并清洗数次，再以低速离心机沈淀碎块组织。在完全移除低温保存溶液后，该条状脐带组织将以一锋利工具(例如剪刀或手术刀)切成每块尺寸大于2毫米(例如5毫米)的块状(粗糙脐带组织碎块)。将该块状组织进行初代细胞培养，根据细胞生长状况，于10-14天后收集细胞。
图4C为一照片，说明脐带组织碎块704(依据图4A方法所获得)与粗糙脐带组织碎块702(依据图4B方法所获得)大小的不同。
图5A至5C说明根据本发明的实施例，用以固定脐带以方便剪切操作的固定装置的各种例子。该固定装置是以简化、便利性、单人操作、及最小的污染机会为目的所设计。图5A中，该固定装置5包含下列元件：一底座51、一支架52、一支柱53以及一槽座54。
(i)该底座51具有一顶部表面511、一底部表面512、一前端513与一后端514，该顶部表面511靠近该前端513处包含复数隆起部515，各该隆起部515平均地彼此间隔(beingevenly spaced apart)。
(ii)该支架52具有一顶部表面521、一底部表面522、一前端523与一后端524，该顶部表面521靠近前端523处包含一或多个插槽525，每个插槽525皆可合适地容纳一工具或探针的一端，而该后端524可以和该底座51的后端514连结。
(iii)该支柱53具有一顶部端531、一底部端532、前表面533和后表面534，该顶部端531可连结至该支架52的底部表面522，且该底部端532可滑动式的接合于该底座51的顶部表面511并位于各该隆起部515之间。
(iv)该槽座54可移动式的接合于该底座51的底部表面512。
图5A的固定装置5仅为一实施例。所属领域具通常知识者可察知该固定装置可根据本发明的方法而有许多改良与种类。举例来说。图5B说明利用该固定装置实施本发明的方法的另一例子。图5B中，该固定装置6包含下列元件：一底座61、一支架62、一连接体63、一空心帽型旋转座64以及一螺帽65。
(i)该底座61具有一顶部表面611、一底部表面612、一前端613与一后端614，以一螺丝(图中未示)固定于该底座61的该顶部表面611，而一球型固定底座615位于该螺丝上方。
(ii)该支架62具有一顶部表面621、一底部表面622、一前端623与一后端624，该顶部表面621靠近前端623处包含至少2个插槽625，每个插槽625皆可合适地容纳一工具(图中未示)或一探针(图中未示)的一端，而该支架62含有一螺丝孔626。
(iii)该连接体63具有可拆卸地与可旋转地连接于该球型固定底座615的一球状端631，以及一相对于该球状端631且带有一螺纹孔(图中未示)的另一端。
(iv)该空心帽型旋转座64具有一顶部端641与一底部端642，该顶部端641与该底部端642皆有开口，该顶部端641侧边有一缺口643连接至该顶部端641的开口，该空心帽型旋转座64以螺丝固定且该连接体63的球状端631置于该空心帽型旋转座64内部，而该空心帽型旋转座64的顶部端641开口小于该球状端631，以利该空心帽型旋转座64可旋紧该球状端631，且该连接体63的另一端突出于该顶部端641与该缺口643。
(v)该螺帽65具有一端穿越该螺丝孔626以旋紧固定该支架62。
图5C说明利用该固定装置实施本发明的方法的另一例子。图5C中，该固定装置7包含下列元件：一底座71、一支架72、一横向插槽73以及两垂直凹槽74。
(i)该底座71具有一不具底面的中空矩形箱体结构，包含一顶部立墙711及垂直于该顶部立墙711的两侧边墙712，该两侧边墙712具一梯型形状并互相平行，该两侧边墙712的较长边与顶部立墙711结合而较短边维持该固定装置垂直立于平台，此外每侧边墙712皆具有一斜边713可维持该固定装置7倾斜立于一平台714。
(ii)该支架72具有一顶部表面721、一底部表面722、一前端723与一后端724，该顶部表面721靠近前端723处包含至少2个插槽725，每个插槽725皆可合适地容纳一工具(图中未示)或一探针(图中未示)的一端。
(iii)该横向插槽73设于该顶部立墙711以切合该支架72。
(iv)两垂直凹槽74设于该两侧边墙712的内侧，且从该横向插槽73的下方向下延伸，用以固定该支架72。
为了解“条状脐带组织的长度”和“经解冻并剪切条状脐带组织所获得的脐带组织碎块的尺寸”对于细胞培养的影响，申请人进行不同的比较实验，其中该条状脐带组织的测试长度范围由0.5公分至10公分；而解冻后，用于组织培养的组织碎块尺寸从0.5公分至10公分。比较不同组别的细胞数目和培养结果：发现1-10公分长度的条状脐带组织结果最佳。然而，超过此范围的长度仍可获得不错的结果，因此也可使用此范围的长度。特别地，较佳的条状脐带组织长度为3-7公分。
实施例二 本发明与先前技术方法的比较：
图6A为一结果图，比较本发明的方法与先前技术(亦即美国专利公开号第8,703,411 B2号)的方法的操作时间。该操作时间是以用来制备低温保存的脐带组织。制备的方法已于实施例一当中做详细描述。本发明(实验组)省时、不需移除血管(时间约30分钟)、不需施以酵素处理和终止酵素反应、及不需清洗以移除酵素(时间约45分钟)。新的剪切方式/方法节省剪切脐带组织的时间(对照组需60分钟，而实验组仅需10分钟)。总体来说，本发明的方法可较先前技术节省约125分钟。
和先前技术所公开的方法相比之下，本发明具有一种或更多下列的优点：简单、快速、增加细胞培养速率、提高初代细胞培养产量、及减少人为因素带来的变因。
图6B为一结果图，比较对照组与实验组的细胞产量。对照组和实验组中的该脐带组织来源皆来自相同脐带。细胞产量由以下方式计算：将收集的细胞总数除以初代细胞培养的组织重量(亦即，每克组织中的细胞数目)。对照组中初代细胞培养的产量为2.6x105±2.5x105个细胞(平均值±SD)，而实验组为1.3x106±1.0x106个细胞(平均值±SD)。利用双样本t检定分析结果，实验组细胞产量为对照组的5倍，其p值小于0.05(样本数为6)具统计显著性。此外，实验组的初代培养细胞产量与对照组相比，样本间显示较小的变异性(对照组：CV％＝96.34％；实验组：CV％＝77.93％)
考虑到初代细胞培养所节省的时间，实验组可节省1.8天(图6C中，对照组：12.83±2.71天；实验组：11±0.89天)(平均值±SD)。两组皆可获得具有良好品质且无差别的初代脐带间充质干细胞(UC-MSC)的细胞可活性与纯度。
图6D说明细胞表面抗原标记的分析结果。该结果均符合国际细胞治疗研究会(International Society of Cellular Therapy,ISCT)对间充质干细胞的规范：阳性标记(例如CD13、CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、及HLA-ABC)均大于95％及阴性标记(例如CD31、CD34、CD45、及HLA-DR)均小于2％。干细胞早期标记SSEA-4于两组中皆有表现且表现量非常相近。初代脐带间充质干细胞可活性于两组中皆大于95％。
因此，实验组具有省时、简单、便利、较少因手动操作而造成的尺寸差异、避免或减少于剪切组织至碎块时造成的机械伤害、及增加暴露的华顿氏胶层与低温保存溶液接触表面积的优点。冷冻组织可活性(frozen tissue viability)如此高，可使后续处理以获得脐带组织碎块的初代培养细胞产量增加。
惟以上所述者，仅为本发明的实施例，所属领域中具有通常知识者可以本发明所公开的技术，于不脱离本发明范围的前提下做出其他等效修饰或变化。因此，本发明的范围由所附的申请专利范围限定。

Claims (15)

1.一种低温保存脐带组织的方法，其特征在于，包含下列步骤：
(a)施加张力至一脐带片段，以扩张该脐带片段中三条脐带血管之间的空隙；
(b)在各该脐带血管之间的空隙沿着平行于该脐带血管长度的纵向切割该脐带片段，获得一条状脐带组织，其中该条状脐带组织包含该脐带血管与华顿氏胶，该华顿氏胶来自于一血管周边区域、一血管间区域及一羊膜下层区域；
(c)将该条状脐带组织与一低温组成物进行混合培养；以及
(d)低温保存含有该华顿氏胶的该条状脐带组织与该低温组成物。
2.如权利要求1所述的低温保存脐带组织的方法，其特征在于，在步骤(c)之前还包含：
(b’)纵向切割该脐带片段的剩余部分，获得另外两条条状脐带组织。
3.如权利要求1所述的低温保存脐带组织的方法，其特征在于，该培养步骤始于第一次切割后的5至10分钟之间。
4.如权利要求1所述的低温保存脐带组织的方法，其特征在于，该培养步骤始于第一次切割后的第6分钟时。
5.如权利要求1所述的低温保存脐带组织的方法，其特征在于，步骤(a)更包含：
利用一工具施加张力至该脐带片段。
6.如权利要求1所述的低温保存脐带组织的方法，其特征在于，步骤(a)之前还包含：
插入一工具的一端至一脐带血管的管腔中。
7.如权利要求6所述的低温保存脐带组织的方法，其特征在于，该工具的另一端固定或枢接至一固定装置。
8.如权利要求1所述的低温保存脐带组织的方法，其特征在于，该条状脐带组织未施以酵素处理。
9.如权利要求1所述的低温保存脐带组织的方法，其特征在于，步骤(c)还包含在该低温组成物中将该条状脐带组织搖晃20至40分钟。
10.如权利要求1所述的低温保存脐带组织的方法，其特征在于，该培养步骤中该条状脐带组织内的该华顿氏胶是切面向下方。
11.如权利要求1所述的低温保存脐带组织的方法，其特征在于，该方法包含不将该条状脐带组织切碎成具有每块尺寸小于0.5公分的脐带组织碎块。
12.如权利要求1所述的低温保存脐带组织的方法，其特征在于，该方法包含不将各该脐带血管从该脐带中剥离、拉离、或移除。
13.一种获得脐带组织衍生干细胞的方法，其特征在于，包含下列步骤：
解冻一经低温保存的条状脐带组织，其中该经低温保存的条状脐带组织包含一条状脐带组织与一低温组成物，该条状脐带组织包含一脐带血管与华顿氏胶，该华顿氏胶包含有来自于一血管周边区域、一血管间区域、及一羊膜下层区域的胶状组织；
移除该低温组成物；
切割该条状脐带组织形成多个脐带组织碎块，其中该脐带组织碎块的尺寸大于2毫米；以及
培养该脐带组织碎块于一培养基中，以获得该脐带组织衍生干细胞。
14.如权利要求13所述的获得脐带组织衍生干细胞的方法，其特征在于，该脐带组织碎块的尺寸大于或等于0.5公分。
15.如权利要求13所述的获得脐带组织衍生干细胞的方法，其特征在于，该方法包含不以酵素来处理该条状脐带组织。
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