CN107227294A - 一种冻存口腔干细胞可用性筛检的方法 - Google Patents

一种冻存口腔干细胞可用性筛检的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种冻存口腔干细胞可用性筛检的方法，该方法包括以下步骤：操作准备、培养基形成、培养容器回温、培养容器消毒、干细胞解冻、离心去冷冻保护剂、干细胞与培养基按比混合、干细胞恢复性培养孵育、加入台盼蓝活性染料、观察干细胞存活情况、干细胞初步筛选、以及干细胞全基因筛查。本发明的有益效果是，通过将解冻后的干细胞放入带有小分子肽成份的新鲜培养基中进行恢复性培养孵育，极大限度上提高了干细胞的复苏率；然后通过台盼蓝活性染料将一部分已经死亡的干细胞进行初步筛选；最好再利用染色质免疫共沉淀基因测序分析技术，对干细胞进行PGS与PGD全基因筛查诊断，以得到干细胞的健康程度进而判断其可用性。

Description

一种冻存口腔干细胞可用性筛检的方法
技术领域
本发明涉及干细胞技术领域，尤其是涉及一种可有效提升干细胞健康使用概率的冻存口腔干细胞可用性筛检的方法。
背景技术
干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞，具有增殖和分化潜能、以及自我更新复制的能力，能够产生高度分化的功能细胞。近年来，干细胞在美容整形、器官移植、疾病治疗、生物修复等领域开始得到快速应用和发展。口腔干细胞是继造血干细胞、脐带干细胞、脂肪干细胞之后有一个功能强大、应用领域广泛的干细胞类型。
为了进一步提高口腔干细胞的应用安全及潜能发挥等性能，本案发明人提出了一种冻存口腔干细胞可用性筛检的方法，以便将干细胞在冻存解冻复苏后所存在的基因先天缺陷、染色体损伤等缺陷及时筛检出来，进而确保干细胞在使用过程中的潜能健康发挥。
发明内容
本发明的目的在于提供一种冻存口腔干细胞可用性筛检的方法，为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种冻存口腔干细胞可用性筛检的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
步骤S001、操作人员将手洗净并用消毒水消毒，或者戴上消毒处理后的手套；
步骤S002、自液氮或干冰容器中取出洁净的培养容器，并将由干细胞无血清基础培养基、小分子肽、及螺旋藻混合所组成的新鲜培养基倒入该培养容器内；
步骤S003、将装有上述步骤S002中所述新鲜培养基的所述培养容器快速置于37℃恒温水槽中进行回温；
步骤S004、将上述步骤S003中回温后的所述培养容器用酒精含量达65％以上的酒精棉擦拭，擦拭后移入无菌操作台内待用；
步骤S005、将冻存有口腔干细胞的冷冻保存管取出，并立即放入37℃恒温水槽中快速解冻，且轻摇所述冷冻保存管使其内部的干细胞在1分钟内全部融化；
步骤S006、将经上述步骤S005中解冻后的干细胞悬浮液加入含有上述步骤S002中所述新鲜培养基的离心管内，以1000rpm的转速离心不低于3分钟，然后去除以DMSO或glycerol冷冻保护剂为主要成份的上清液；
步骤S007、将经上述步骤S006离心去除冷冻保护剂后的干细胞液缓缓加入经上述步骤S004处理后的所述培养容器内，并将干细胞液与所述新鲜培养基按照1:5～1:10的稀释比进行均匀混合；
步骤S008、将上述步骤S007中装有稀释混合后干细胞液的所述培养容器放入培养箱中，对干细胞进行10小时以上的恢复性培养孵育；
步骤S009、用洁净试管取出经过上述步骤S008培养孵育后的干细胞10μl，并将10μl台盼蓝活性染料缓缓加入所述洁净试管内与10μl干细胞形成等比混合，轻轻摇晃所述洁净试管使混合充分；
步骤S010、将上述步骤S009中干细胞与台盼蓝活性染料的混合溶液缓缓倒入洁净的血球计数盘，盖上玻片，用100倍显微镜观察干细胞存活情况，没有被台盼蓝活性染料染色的干细胞为活细胞，被台盼蓝活性染料染成蓝色或红色的干细胞为死细胞；
步骤S011、借助上述步骤S010中的显微镜，用吸附器具将上述步骤S010中所发现的死细胞吸出，实现初步筛选；
步骤S012、利用染色质免疫共沉淀基因测序分析技术，对经过上述步骤S011初步筛选后的活干细胞，进行PGS与PGD全基因筛查诊断，以筛检干细胞的健康程度进而判断可用性。
其中，
所述步骤S002中的所述小分子肽是由2～4个氨基酸所组成的活性小分子肽；
所述新鲜培养基中干细胞无血清基础培养基、小分子肽、以及螺旋藻三者的组份比为9:0.35:0.65。
所述步骤S012还包括以下分步骤：
分步骤S01：利用植入前遗传学筛查PGS对干细胞的染色体数目和染色体结构进行检测，通过所述步骤S012中的染色质免疫共沉淀基因测序分析技术，分析检测干细胞的染色体是否存在数目和结构上的缺陷、以及是否存在遗传物质现象；
分步骤S02：利用植入前基因诊断PGD对干细胞中是否携带病变基因和遗传缺陷基因进行检测，通过所述步骤S012中的染色质免疫共沉淀基因测序分析技术，分析检测干细胞的基因病变几率。
本发明的有益效果是，通过将解冻后的干细胞放入带有小分子肽成份的新鲜培养基中进行恢复性培养孵育，极大限度上提高了干细胞的复苏率；然后通过台盼蓝活性染料将一部分已经死亡的干细胞进行初步筛选；最好再利用染色质免疫共沉淀基因测序分析技术，对干细胞进行PGS与PGD全基因筛查诊断，以得到干细胞的健康程度进而判断其可用性。
附图说明
图1是本发明实施例中方法实现流程示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例，参照图1所示，本发明所提供的一种冻存口腔干细胞可用性筛检的方法，将通过以下步骤来实现：
步骤S001、操作准备
操作人员将手洗净并用消毒水消毒，或者戴上消毒处理后的手套；
步骤S002、培养基形成
自液氮或干冰容器中取出洁净的培养容器，并将由干细胞无血清基础培养基、小分子肽、及螺旋藻混合所组成的新鲜培养基倒入该培养容器内。该步骤内，所述小分子肽是由2～4个氨基酸所组成的活性小分子肽；在所述新鲜培养基中干细胞无血清基础培养基、小分子肽、以及螺旋藻三者的组份比为9:0.35:0.65。利用小分子肽的修复特性将会对冻存后的干细胞起到良好的修复、激活、补充养分等作用；
步骤S003、培养容器回温
将装有新鲜培养基的所述培养容器快速置于37℃恒温水槽中进行回温，或者放入一种恒温装置中，以确保所述培养容器内的新鲜培养基的温度能够满足干细胞所需要的正常温度值；
步骤S004、培养容器消毒
将上述步骤S003中回温后的所述培养容器用酒精含量达65％以上的酒精棉擦拭，擦拭后移入无菌操作台内待用，以杜绝细菌等污染；
步骤S005、干细胞解冻
将冻存有口腔干细胞的冷冻保存管取出，并立即放入37℃恒温水槽、或者放入一种恒温装置中，以便实现对冻存干细胞的快速解冻，且轻摇所述冷冻保存管使其内部的干细胞在1分钟内全部融化；
步骤S006、离心去冷冻保护剂
将经上述步骤S005中解冻后的干细胞悬浮液加入含有上述步骤S002中所述新鲜培养基的离心管内，以1000rpm的转速离心不低于3分钟，然后去除以DMSO(二甲基亚砜)或glycerol(甘油；丙三醇)冷冻保护剂为主要成份的上清液；
步骤S007、干细胞与培养基按比混合
将经上述步骤S006离心去除冷冻保护剂后的干细胞液缓缓加入经上述步骤S004处理后的所述培养容器内，并按照1:5～1:10的稀释比进行均匀混合；
步骤S008、干细胞恢复性培养孵育
将上述步骤S007中装有稀释混合后干细胞液的所述培养容器放入培养箱中，对干细胞进行10小时以上的恢复性培养孵育，通过观察来决定干细胞恢复性培养孵育的具体时间；
步骤S009、加入台盼蓝活性染料
用洁净试管取出经过上述步骤S008培养孵育后的干细胞10μl，并将10μl台盼蓝活性染料缓缓加入所述洁净试管内与10μl干细胞形成等比混合，轻轻摇晃所述洁净试管使混合充分；
步骤S010、观察干细胞存活情况
将上述步骤S009中干细胞与台盼蓝活性染料的混合溶液缓缓倒入洁净的血球计数盘，盖上玻片，用100倍显微镜观察干细胞存活情况，没有被台盼蓝活性染料染色的干细胞为活细胞，被台盼蓝活性染料染成蓝色或红色的干细胞为死细胞；
步骤S011、干细胞初步筛选
借助上述步骤S010中的显微镜，用吸附器具将上述步骤S010中所发现的死细胞吸出，实现初步筛选；
步骤S012、干细胞全基因筛查
利用染色质免疫共沉淀基因测序分析技术(又称ChIP-seq基因测序技术)，对经过上述步骤S011初步筛选后的活干细胞，进行PGS(又称植入前遗传学筛查)与PGD(又称植入前基因诊断)全基因筛查诊断，以筛检干细胞的健康程度进而判断可用性。
其中，
所述步骤S012还包括以下分步骤：
分步骤S01：利用PGS对干细胞的染色体数目和染色体结构进行检测，通过所述步骤S012中的染色质免疫共沉淀基因测序分析技术，分析检测干细胞的基因是否存在缺陷、及存在遗传物质现象；
分步骤S02：利用PGD对干细胞中是否携带病变基因和遗传缺陷基因进行检测，通过所述步骤S012中的染色质免疫共沉淀基因测序分析技术，分析检测干细胞的基因病变几率。
本发明通过将解冻后的干细胞放入带有小分子肽成份的新鲜培养基中进行恢复性培养孵育，极大限度上提高了干细胞的复苏率；然后通过台盼蓝活性染料将一部分已经死亡的干细胞进行初步筛选；最好再利用染色质免疫共沉淀基因测序分析技术，对干细胞进行PGS与PGD全基因筛查诊断，以得到干细胞的健康程度进而判断其可用性。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (3)

1.一种冻存口腔干细胞可用性筛检的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
步骤S001、操作人员将手洗净并用消毒水消毒，或者戴上消毒处理后的手套；
步骤S002、自液氮或干冰容器中取出洁净的培养容器，并将由干细胞无血清基础培养基、小分子肽、及螺旋藻混合所组成的新鲜培养基倒入该培养容器内；
步骤S003、将装有上述步骤S002中所述新鲜培养基的所述培养容器快速置于37℃恒温水槽中进行回温；
步骤S004、将上述步骤S003中回温后的所述培养容器用酒精含量达65％以上的酒精棉擦拭，擦拭后移入无菌操作台内待用；
步骤S005、将冻存有口腔干细胞的冷冻保存管取出，并立即放入37℃恒温水槽中快速解冻，且轻摇所述冷冻保存管使其内部的干细胞在1分钟内全部融化；
步骤S006、将经上述步骤S005中解冻后的干细胞悬浮液加入含有上述步骤S002中所述新鲜培养基的离心管内，以1000rpm的转速离心不低于3分钟，然后去除以DMSO或glycerol冷冻保护剂为主要成份的上清液；
步骤S007、将经上述步骤S006离心去除冷冻保护剂后的干细胞液缓缓加入经上述步骤S004处理后的所述培养容器内，并将干细胞液与所述新鲜培养基按照1:5～1:10的稀释比进行均匀混合；
步骤S008、将上述步骤S007中装有稀释混合后干细胞液的所述培养容器放入培养箱中，对干细胞进行10小时以上的恢复性培养孵育；
步骤S009、用洁净试管取出经过上述步骤S008培养孵育后的干细胞10μl，并将10μl台盼蓝活性染料缓缓加入所述洁净试管内与10μl干细胞形成等比混合，轻轻摇晃所述洁净试管使混合充分；
步骤S010、将上述步骤S009中干细胞与台盼蓝活性染料的混合溶液缓缓倒入洁净的血球计数盘，盖上玻片，用100倍显微镜观察干细胞存活情况，没有被台盼蓝活性染料染色的干细胞为活细胞，被台盼蓝活性染料染成蓝色或红色的干细胞为死细胞；
步骤S011、借助上述步骤S010中的显微镜，用吸附器具将上述步骤S010中所发现的死细胞吸出，实现初步筛选；
步骤S012、利用染色质免疫共沉淀基因测序分析技术，对经过上述步骤S011初步筛选后的活干细胞，进行PGS与PGD全基因筛查诊断，以筛检干细胞的健康程度进而判断可用性。
2.根据权利要求1所述的一种冻存口腔干细胞可用性筛检的方法，其特征在于：所述步骤S002中的所述小分子肽是由2～4个氨基酸所组成的活性小分子肽；
所述新鲜培养基中干细胞无血清基础培养基、小分子肽、以及螺旋藻三者的组份比为9:0.35:0.65。
3.根据权利要求1所述的一种冻存口腔干细胞可用性筛检的方法，其特征在于：所述步骤S012还包括以下分步骤：
分步骤S01：利用植入前遗传学筛查PGS对干细胞的染色体数目和染色体结构进行检测，通过所述步骤S012中的染色质免疫共沉淀基因测序分析技术，分析检测干细胞的染色体是否存在数目和结构上的缺陷、以及是否存在遗传物质现象；
分步骤S02：利用植入前基因诊断PGD对干细胞中是否携带病变基因和遗传缺陷基因进行检测，通过所述步骤S012中的染色质免疫共沉淀基因测序分析技术，分析检测干细胞的基因病变几率。
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