CN113367124A - 卵母细胞冷冻保存液及磁场低温保存卵母细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种卵母细胞冷冻保存液及磁场低温保存卵母细胞的方法。本发明通过在卵母细胞冷冻保存液中添加海藻糖修饰的超顺磁性纳米颗粒，并在磁场下低温保存鼠卵母细胞，实现了对卵母细胞的冷冻保存方法的优化，在冷冻保存小鼠卵母细胞、胚胎时，不仅克服了现有技术的诸多缺陷，而且保存效率显著提高。

Description

卵母细胞冷冻保存液及磁场低温保存卵母细胞的方法

技术领域

本发明涉及一种卵母细胞的保存方法，特别涉及一种卵母细胞冷冻保存液及磁场低温保存卵母细胞的方法，属于卵母细胞冷冻技术领域。

背景技术

卵母细胞冷冻保存可以使年龄偏大的女性、患有癌症的女性及患有精神、生理并发症的女性通过冻存卵母细胞来保存生育能力。利用卵母细胞冷冻保存技术建立“卵子库”不仅可以解决卵母细胞来源短缺问题，还可以使体外受精不受时间和空间的限制。因此，如何高效的冷冻保存卵母细胞是亟待解决的科学技术问题。

目前最常用的卵母细胞冷冻保存方法为玻璃化冷冻法，其优点是操作简单快捷、降温迅速，降温过程中卵母细胞内外溶液呈玻璃态，避免了冷冻过程中因冰晶形成而导致的损伤，但是冻融后的卵母细胞的存活率、形态正常率、受精率和发育力等有所下降。有研究表明，在复温过程中，现有的冷冻保存试剂不能有效的控制冰晶的生长，从而损害细胞，且玻璃化冷冻时添加高浓度的冷冻保护剂容易引起化学中毒。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种磁场低温保存卵母细胞的方法，以克服现有技术中的不足。

为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：

本发明实施例的一个方面提供了一种卵母细胞冷冻保存液，包括玻璃化冷冻液，所述玻璃化冷冻液包含含量>0且≦1wt％的海藻糖修饰的超顺磁性纳米颗粒。

进一步的，所述玻璃化冷冻液可以采用已知的适用于冷冻保存卵母细胞的玻璃化冷冻液，其可以通过市场购买等途径获取。

在一些实施方式中，所述海藻糖修饰的超顺磁性纳米颗粒的制备方法包括如下步骤：

(1)制备油相Fe₃O₄超顺磁性纳米颗粒；

(2)以异柠檬酸对油相Fe₃O₄超顺磁性纳米颗粒表面进行改性，制得水相Fe₃O₄超顺磁性纳米颗粒；

(3)以海藻糖对所述水相Fe₃O₄超顺磁性纳米颗粒进行表面修饰，获得海藻糖修饰的超顺磁性纳米颗粒。

进一步的，步骤(1)包括：将摩尔比为(0.8～1)：2的FeCl₂和FeCl₃溶解在纯水中，在温度为60～65℃和氮气保护条件下搅拌至得到黄绿色澄清溶液，再调节该黄绿色澄清溶液的pH值为9.0～9.5，继续在温度为58～65℃和氮气保护条件下反应40min以上，其中采用的搅拌速率为400r/min以上，制得油相Fe₃O₄超顺磁性纳米颗粒。

进一步的，步骤(2)包括：将所述油相Fe₃O₄超顺磁性纳米颗粒洗涤后分散于异柠檬酸溶液中，超声至形成均匀透明的稳定体系，从而制得水相Fe₃O₄超顺磁性纳米颗粒。

进一步的，步骤(3)包括：将纯度高于95wt％的海藻糖加入含有所述水相Fe₃O₄超顺磁性纳米颗粒的水相溶液中，在3～10mT交变磁场下搅拌15～25min，然后加热至80～90℃，回流反应1～3h，之后除去残余的异柠檬酸和海藻糖，获得海藻糖修饰的超顺磁性纳米颗粒。

进一步的，所述海藻糖修饰的超顺磁性纳米颗粒的核粒径为5～30nm。

本发明实施例的另一个方面提供了一种磁场低温保存卵母细胞的方法，其包括：

在交变磁场或静磁场中，将卵母细胞依次在冷冻平衡液、冷冻保存液中放置，之后置入液氮中保存；所述冷冻保存液采用所述的卵母细胞冷冻保存液。

在一些实施方式中，所述的磁场低温保存卵母细胞的方法具体包括：在交变磁场或静磁场中，将卵母细胞先在冷冻平衡液放置2～5min，之后在冷冻保存液中放置1～3min，最后置入液氮中保存。

进一步的，所述交变磁场的强度为3～20mT，频率为50～200Hz。

进一步的，所述静磁场的强度为3～20mT。

进一步的，所述冷冻平衡液包括2～2.5％(v/v)乙二醇、1.0～1.25％(v/v)二甲基亚砜、1.2～1.25％(v/v)丙二醇和1.15～1.25％(w/w)乙酰胺，余量为Earle's平衡盐溶液。

本发明实施例的另一个方面还提供了一种试剂盒，用于卵母细胞冷冻保存，所述试剂盒包括冷冻平衡液和冷冻保存液，所述冷冻保存液采用所述的卵母细胞冷冻保存液。

较之现有技术，本发明通过在卵母细胞冷冻保存液中添加海藻糖修饰的超顺磁性纳米颗粒，并在磁场下低温保存鼠卵母细胞，实现了对卵母细胞的冷冻保存方法的优化，在冷冻保存小鼠卵母细胞、胚胎时，不仅克服了现有技术的诸多缺陷，而且保存效率显著提高。

具体实施方式

下面将结合若干实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。

实施例1配制卵母细胞冷冻保存用的试剂，包括：

按以下配方配置冷冻平衡液，该冷冻平衡液2.5％(v/v)乙二醇、1.25％(v/v)二甲基亚砜、1.25％(v/v)丙二醇、1.25％(w/w)乙酰胺，余量为Earle's平衡盐溶液。

前述的冷冻平衡液也可以替换为市售的其它品牌卵母细胞冷冻保存用冷冻平衡液。

2.按以下配方配置多种卵母细胞冷冻保存液(如下简称冷冻保存液)：

冷冻保存液a，为玻璃化冷冻液(品牌为易核)。

冷冻保存液b，在玻璃化冷冻液(同上)中添加0.5wt％海藻糖修饰的超顺磁性纳米颗粒。

冷冻保存液c，在玻璃化冷冻液(同上)中添加1wt％海藻糖修饰的超顺磁性纳米颗粒。

前述的玻璃化冷冻液也可以替换为市售的其它品牌卵母细胞冷冻保存用玻璃化冷冻液。

本实施例中所采用的海藻糖修饰的超顺磁性纳米颗粒是采用如下方法制备：

(1)制备油相Fe₃O₄超顺磁性纳米颗粒：1mol FeCl₂·H₂0和2mol FeCl₃·H₂0溶解在100ml纯水中，在65℃、氮气保护下搅拌至得到黄绿色澄清溶液，再滴入5wt％氨水至溶液pH为9.0～9.5，反应温度位65℃，搅拌速率为400r/min左右，反应体系在氮气保护下持续40min，制得油相Fe₃O₄超顺磁性纳米颗粒；

(2)以异柠檬酸对油相Fe₃O₄超顺磁性纳米颗粒表面进行改性：将上述制备的油相Fe₃O₄超顺磁性纳米颗粒洗涤后分散于异柠檬酸溶液中，超声至形成均匀透明的稳定体系，使油相Fe₃O₄超顺磁性纳米颗粒被转变为水相Fe₃O₄超顺磁性纳米颗粒，所述水相Fe₃O₄超顺磁性纳米颗粒能够均匀稳定悬浮于水相溶液中；

(3)将纯度高于95wt％的海藻糖加入到含有水相Fe₃O₄超顺磁性纳米颗粒的水相溶液中，在8mT交变磁场处理下搅拌20分钟，然后加热至90℃，回流反应1.5小时；

(4)将多余的异柠檬酸和海藻糖通过透析方式去除，从而得到海藻糖修饰的超顺磁性纳米颗粒，其核粒径为5～30nm。

前述步骤(3)中，也可以将纯度高于95wt％的海藻糖加入到含有水相Fe₃O₄超顺磁性纳米颗粒的水相溶液中，在10mT交变磁场处理下搅拌15分钟，然后加热至90℃，回流反应1小时。同样可以获得核粒径为5～30nm的海藻糖修饰的超顺磁性纳米颗粒。

前述步骤(3)中，也可以将纯度高于95wt％的海藻糖加入到含有水相Fe₃O₄超顺磁性纳米颗粒的水相溶液中，在3mT交变磁场处理下搅拌25分钟，然后加热至80℃，回流反应3小时。也可以获得核粒径为5～30nm的海藻糖修饰的超顺磁性纳米颗粒。

实施例2采用实施例1制备的卵母细胞冷冻保存用的试剂按表1所示各实验方案分别进行卵母细胞的冷冻保存，具体实验方法如下。

1.冷冻：将卵母细胞冷冻保存液从冰箱中取出恢复至室温，室温下平衡20min以上。在磁场作用下，把需要冷冻的2～4枚卵母细胞转移至冷冻平衡液放置2～5min，随后在冷冻保存液中放置1～3min，转移至H0101型Cryoleaf玻璃化冷冻载杆上，快速投入液氮中，封闭载管后继续保存。

2.解冻：将冷冻的卵母细胞置于37℃的解冻液中平衡12～16min。

该解冻步骤采用的解冻液为玻璃化解冻液(易核)。

3.胚胎发育评价：将卵母细胞解冻后，计算存活率，再对卵母细胞进行卵胞浆内单精子注射，计算受精率、卵裂率、囊胚形成率。

表1.鼠卵母细胞冷冻实验方案及实验结果

根据表1可以看出，通过在冷冻保存液中添加海藻糖修饰的超顺磁性纳米颗粒，并在交变磁场处理下冷冻保存鼠卵母细胞，解冻后的存活率、受精率、卵裂率、囊胚形成率比无磁场处理时有了提升，在静磁场处理下冷冻保存鼠卵母细胞时，解冻后的存活率、受精率、卵裂率、囊胚形成率比无磁场处理时有更为明显的提升。可见，本发明通过在卵母细胞冷冻保存液中添加海藻糖修饰的超顺磁性纳米颗粒，并在磁场下低温保存鼠卵母细胞，实现了对卵母细胞的冷冻保存方法的优化，在冷冻保存小鼠卵母细胞、胚胎时，不仅克服了现有技术的诸多缺陷，而且保存效率显著提高。

应当理解，上述实施例仅为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种卵母细胞冷冻保存液，包括玻璃化冷冻液，其特征在于，所述玻璃化冷冻液包含含量>0且≦1wt％的海藻糖修饰的超顺磁性纳米颗粒。

2.根据权利要求1所述的卵母细胞冷冻保存液，其特征在于，所述海藻糖修饰的超顺磁性纳米颗粒的制备方法包括如下步骤：

(1)制备油相Fe₃O₄超顺磁性纳米颗粒；

(2)以异柠檬酸对油相Fe₃O₄超顺磁性纳米颗粒表面进行改性，制得水相Fe₃O₄超顺磁性纳米颗粒；

(3)以海藻糖对所述水相Fe₃O₄超顺磁性纳米颗粒进行表面修饰，获得海藻糖修饰的超顺磁性纳米颗粒。

3.根据权利要求1所述的卵母细胞冷冻保存液，其特征在于，步骤(1)包括：将摩尔比为(0.8～1)：2的FeCl₂和FeCl₃溶解在纯水中，在温度为60～65℃和氮气保护条件下搅拌至得到黄绿色澄清溶液，再调节该黄绿色澄清溶液的pH值为9.0～9.5，继续在温度为58～65℃和氮气保护条件下反应40min以上，其中采用的搅拌速率为400r/min以上，制得油相Fe₃O₄超顺磁性纳米颗粒。

4.根据权利要求1所述的卵母细胞冷冻保存液，其特征在于，步骤(2)包括：将所述油相Fe₃O₄超顺磁性纳米颗粒洗涤后分散于异柠檬酸溶液中，超声至形成均匀透明的稳定体系，从而制得水相Fe₃O₄超顺磁性纳米颗粒。

5.根据权利要求1所述的卵母细胞冷冻保存液，其特征在于，步骤(3)包括：将纯度高于95wt％的海藻糖加入含有所述水相Fe₃O₄超顺磁性纳米颗粒的水相溶液中，在3～10mT交变磁场下搅拌15～25min，然后加热至80～90℃，回流反应1～3h，之后除去残余的异柠檬酸和海藻糖，获得海藻糖修饰的超顺磁性纳米颗粒。

6.根据权利要求1～5中任一项所述的卵母细胞冷冻保存液，其特征在于：所述海藻糖修饰的超顺磁性纳米颗粒的核粒径为5～30nm。

7.一种磁场低温保存卵母细胞的方法，其特征在于包括：

在交变磁场或静磁场中，将卵母细胞依次在冷冻平衡液、冷冻保存液中放置，之后置入液氮中保存；所述冷冻保存液采用权利要求1～6中任一项所述的卵母细胞冷冻保存液。

8.根据权利要求7所述的磁场低温保存卵母细胞的方法，其特征在于具体包括：在交变磁场或静磁场中，将卵母细胞先在冷冻平衡液放置2～5min，之后在冷冻保存液中放置1～3min，最后置入液氮中保存。

9.根据权利要求7所述的磁场低温保存卵母细胞的方法，其特征在于：所述交变磁场的强度为3～20mT，频率为50～200Hz；所述静磁场的强度为3～20mT。

10.根据权利要求7所述的磁场低温保存卵母细胞的方法，其特征在于：所述冷冻平衡液包括2～3％(v/v)乙二醇、1～1.5％(v/v)二甲基亚砜、1～1.5％(v/v)丙二醇和1～1.5％(w/w)乙酰胺，余量为Earle's平衡盐溶液。