CN108251373B - 小鼠脑片外泌体的提取方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种小鼠脑片外泌体的提取方法，本方法是通过对小鼠脑片进行培养，对培养基中的外泌体进行收集提取，从而获得保证后续实验的外泌体样品。此方法提供了一种目前新的外泌体收集方法，并结合外泌体提取试剂盒，优化了目前外泌体的提取方法，使脑组织中外泌体得以提取，填补了技术空白。此方法操作简便，节约实验成本，对实验人员技术、实验设备等要求不高，对下游实验无影响，实验结果安全可靠。

Description

小鼠脑片外泌体的提取方法
技术领域
本发明涉及一种组织释放外泌体的收集和提取方法，具体涉及小鼠脑片外泌体的提取方法，属于生物技术领域。
背景技术
外泌体是一种能被绝大多数细胞分泌的小膜泡，其具有脂质双层膜的结构，其直径在30-100nm之间，在这种微小膜泡中包含有细胞特异的蛋白、核酸等的具有遗传信息的物质。现有的对于外泌体的收集和提取方法，一般是从体液中直接提取，还有的对特定细胞进行细胞培养，从培养基中收集提取。这些方法都有一定的局限性，无法对外泌体从局部组织中进行提取。脑片培养是近年来发展起来的一种器官培养方法。与传统的细胞培养相比，脑片培养保留了细胞的组织结构和细胞与细胞之间的联系，可以模拟体内的生理环境，而且能有效地监控特定细胞周围的微环境，施加实验因素，因此是探讨大脑形态发生、结构特点、生理功能以及病理改变等问题的一种理想的方法，在近年来得到飞速发展，成为神经领域的一大研究热点。
超速离心法提取外泌体，获得外泌体的量少，对设备要求高（需要超速离心机），操作步骤多，对实验技术人员的技术要求高。
采用细胞培养的方法收集外泌体，所用的培养基量大，且收集的外泌体浓度低，浪费实验试剂；对于脑科学研究还可以对脑脊液进行研究，可是小鼠脑脊液抽提困难，无法实现；目前还没有对于脑组织释放外泌体的提取方法。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，本发明小鼠脑片外泌体的提取方法，包括外泌体提取试剂盒，本方法采用先对小鼠大脑切下的脑片进行培养，并收集培养基，再利用外泌体提取试剂盒进行提取。
作为本发明所述的小鼠脑片外泌体的提取方法的进一步优化方案，具体方法如下：
首先实验动物小鼠经七氟烷诱导麻醉后，迅速断头，然后用剪刀剪开两耳间的皮肤直至两鼻间，然后翻转皮肤，暴露颅骨。用眼科剪去掉小鼠颅骨，暴露全脑；
随后用眼科镊伸入脑前端下部的嗅球处，轻轻挑起脑的前端，剪断脑神经，翻转全脑，放入冰冷、且预先通入体积百分比为：95% O2+5% CO2混合气 30min的高渗糖溶液中，放置1-2min；取出全脑组织，在冰盒上用刀片切取所需的脑组织部分，获得一个平整的切面，迅速用502胶水将所取的脑组织的有平整切面的一面粘在自动震动切片机的缓冲槽中，用高渗糖溶液浸没组织块，切取脑区的厚度为300μm的脑片，整个过程在8min内完成，高渗糖溶液温度维持在4℃；
将取好的脑片移入Transwell小室中，完全吸弃高渗糖溶液后，先在24孔培养板中加入0.3-0.5毫升的脑片培养基，再将Transwell小室放入24孔培养板中，使培养基的液面刚好达到脑片的水平，但不漫过脑片；
再将24孔培养板置于带有输入气体导管和输出气体导管的密闭容器中，并将密闭容器放入37℃微生物培养箱中过夜培养（过夜培养可以为12h以上），培养过程中，输入气体导管持续稳定通入体积百分比为：95% O2+5% CO2混合气体，培养过程中，脑片处于培养基和混合气体的交界处；脑片过夜培养。培养结束后收集培养基，放入EP管中，利用外泌体提取试剂盒进行外泌体的提取；
所述脑片培养基：是由DMEM低糖培养基与青链霉素混合液，按照体积比1:100混合制备而成；
所述高渗糖溶液中各原料及其用量为：蔗糖254mM；D-葡萄糖10mM；磷酸二氢钠1.25mM；碳酸氢钠24mM；MgSO4▪7H2O，2mM；KCl，3mM；二水氯化钙2mM；用去离子水溶解，使用前通入30分钟体积百分比为：95% O2+5% CO2的混合气。
作为本发明所述的小鼠脑片外泌体的提取方法的进一步优化方案，所述Transwell小室的孔径为400纳米，可以有效过滤掉大分子的杂质，更有助于获得直径较小的物质。
本发明有益技术效果：本方法可以更多的体现实验的完整性，更好的本方法是一种新的提取外泌体的方法，采用脑片培养的方法对于细胞培养的方法相比，在研究脑细胞释放物质、传递信息更具可信性，而且培养基用量少，以至于提取试剂用量也少，可以节约实验成本，提高实验效率。比益效果可以由运算效率提高、降低能耗、产率提高、精度提高、工序简化、控制方便，以及有用性能的出现等方面反映出来。
附图说明
图1是本发明样品粒径分析仪测量结果图；
图2是本发明样品蛋白电泳结果图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
首先实验动物小鼠经七氟烷诱导麻醉后，迅速断头，然后用剪刀剪开两耳间的皮肤直至两鼻间，然后翻转皮肤，暴露颅骨。用眼科剪去掉小鼠颅骨，暴露全脑；
随后用眼科镊伸入脑前端下部的嗅球处，轻轻挑起脑的前端，剪断脑神经，翻转全脑，放入冰冷、且预先通入体积百分比为：95% O2+5% CO2混合气 30min的高渗糖溶液中，放置1-2min；取出全脑组织，在冰盒上用刀片切取所需的脑组织部分，获得一个平整的切面，迅速用502胶水将所取的脑组织的有平整切面的一面粘在自动震动切片机的缓冲槽中，用高渗糖溶液浸没组织块，切取脑区的厚度为300μm的脑片，整个过程在8min内完成，高渗糖溶液温度维持在4℃；
将取好的脑片移入Transwell小室中，完全吸弃高渗糖溶液后，先在24孔培养板中加入0.3-0.5毫升的脑片培养基，再将Transwell小室放入24孔培养板中，使培养基的液面刚好达到脑片的水平，但不漫过脑片；
再将24孔培养板置于带有输入气体导管和输出气体导管的密闭容器中，并将密闭容器放入37℃微生物培养箱中过夜培养（12-24小时均可），培养过程中，脑片处于培养基和混合气体的交界处；输入气体导管持续稳定通入体积百分比为：95% O2+5% CO2混合气体；培养结束后收集培养基，放入EP管中，利用外泌体提取试剂盒进行外泌体的提取；
所述脑片培养基：是由DMEM低糖培养基与青链霉素混合液，按照体积比1:100混合制备而成；
所述高渗糖溶液中各原料及其用量为：蔗糖254mM；D-葡萄糖10mM；磷酸二氢钠1.25mM；碳酸氢钠24mM；MgSO4▪7H2O，2mM；KCl，3mM；二水氯化钙2mM；用去离子水溶解，使用前通入30分钟体积百分比为：95% O2+5% CO2的混合气。
所述DMEM低糖培养基（ABB210359）购自HyClone 公司。
所述青链霉素混合液（VC2003）购自VICMED公司。
所述外泌体提取试剂盒(厂家invitrogen货号 4478359 生产地Vilnius,Lithuania)。
所述Transwell 24孔板细胞培养小室（3413）购自Corning公司。
所述高渗糖溶液为自配溶液，其中所有试剂均购自sigma公司。
按照外泌体提取试剂盒的使用说明进行外泌体的提取，具体为：将EP管中收集的培养基先2000g离心30分钟，将培养基上清转入新EP管中，加入0.5倍试剂，充分混合，4度过夜，10000g，4度离心60分钟，吸弃液体，将所得沉淀用PBS悬浮，即可获得外泌体样品。
取上述方法制备的样品进行粒径分析，图1为样品粒径分析仪测量结果图；从图上可以得出所测物质中粒径在58.1纳米左右的物质占比为99.4%。绝大多数样品直径在30-100纳米之间，符合外泌体直径的要求。
通过用上述方法制备的4个样品的外泌体总RNA进行提取，检测其A260/280，判断其RNA纯度，并获得其浓度的数值，均符合后续实验的要求。表1是总RNA样本质检报告。
通过用上述方法制备的4个样品的外泌体蛋白进行提取，方法为取适量的样品，加入0.4毫升的蛋白裂解液，超声破碎，每次2秒，间隔10秒，共超声破碎5次，以上操作在冰上完成。4度，10000g，离心30分钟，取上清转入新EP管。采用radford试剂进行蛋白定量测定，制作标准曲线，获得定量结果，见表2蛋白抽提质检报告。进行SDS-PAGE电泳检测，各取25 μg蛋白质样品5:1 (v/v)加入5×上样缓冲液，沸水浴5 min，14,000 g，离心10 min取上清，进行10% SDS-PAGE电泳。电泳条件：恒流14 mA，电泳时间90 min。考马斯亮蓝染色。电泳结果如图2。上述电泳结果分析，4个样品总蛋白在10 -220 kDa分子量范围内得到一定分离，蛋白无降解，4个样品整体蛋白条带具有相似的带型，蛋白总量满足后续实验；
此外，为了提供示例性实施方案的简练描述，可以不描述实际实施方案的所有特征(即，与当前考虑的执行本发明的最佳模式不相关的那些特征，或于实现本发明不相关的那些特征)。
应理解的是，在任何实际实施方式的开发过程中，如在任何工程或设计项目中，可做出大量的具体实施方式决定。这样的开发努力可能是复杂的且耗时的，但对于那些得益于此公开内容的普通技术人员来说，不需要过多实验，所述开发努力将是一个设计、制造和生产的常规工作。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
表1是总RNA样本质检报告
Figure 505475DEST_PATH_IMAGE001
表2是蛋白抽提质检报告
Figure 708441DEST_PATH_IMAGE002

Claims (2)

1.小鼠脑片外泌体的提取方法，包括外泌体提取试剂盒，其特征在于：本方法采用先对小鼠脑组织切下的脑片进行培养，并收集培养基，再利用外泌体提取试剂盒进行提取；具体方法如下：
首先实验动物小鼠经七氟烷诱导麻醉后，迅速断头，然后用剪刀剪开两耳间的皮肤直至两鼻间，然后翻转皮肤，暴露颅骨；用眼科剪去掉小鼠颅骨，暴露全脑；
随后用眼科镊伸入脑前端下部的嗅球处，轻轻挑起脑的前端，剪断脑神经，翻转全脑，放入冰冷、且预先通入体积百分比为：95% O2+5% CO2混合气 30min的高渗糖溶液中，放置1-2min；取出全脑组织，在冰盒上用刀片切取所需的脑组织部分，获得一个平整的切面，迅速用502胶水将所取的脑组织上有平整切面的一面粘在自动震动切片机的缓冲槽中，用高渗糖溶液浸没所取的脑组织，切取脑区的厚度为300μm的脑片，整个过程在8min内完成，高渗糖溶液温度维持在4℃；
将取好的脑片移入Transwell小室中，完全吸弃高渗糖溶液后，先在24孔培养板中加入0.3-0.5毫升的脑片培养基，再将Transwell小室放入24孔培养板中，并转移置于带有输入气体导管和输出气体导管的密闭容器中，将密闭容器放入37℃微生物培养箱中过夜培养，培养过程中，输入气体导管持续稳定通入体积百分比为：95% O2+5% CO2混合气体；培养结束后收集培养基，放入EP管中，利用外泌体提取试剂盒进行外泌体的提取；
所述脑片培养基：是由DMEM低糖培养基与青链霉素混合液，按照体积比1:100混合制备而成；
所述高渗糖溶液中各原料及其用量为：蔗糖254mM；D-葡萄糖10mM；磷酸二氢钠1.25mM；碳酸氢钠24mM；MgSO4▪7H2O，2mM；KCl，3mM；二水氯化钙2mM；用去离子水溶解，使用前通入30分钟体积百分比为：95% O2+5% CO2的混合气。
2.根据权利要求1所述的小鼠脑片外泌体的提取方法，其特征在于：所述Transwell小室的孔径为400纳米，可以有效过滤掉大分子的杂质，更有助于获得直径较小的物质。
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