RU2617237C2

RU2617237C2 - Способ получения препаратов изолированных клеток дермы

Info

Publication number: RU2617237C2
Application number: RU2015124695A
Authority: RU
Inventors: Сергей Леонидович Кашутин; Леонид Михайлович Журавлёв; Ксения Геннадьевна Вилова; Денис Владимирович Мизгирёв; Андрей Леонидович Зашихин
Priority date: 2015-06-23
Filing date: 2015-06-23
Publication date: 2017-04-24
Also published as: RU2015124695A

Abstract

Изобретение относится к цитологии, дерматологии и касается способа получения препаратов изолированных клеток дермы, что может быть использовано для получения препаратов изолированных клеток дермы с целью цитометрии и фенотипирования. Способ осуществляют следующим образом: после фиксации в формалине кусочков кожи нарезают их при температуре 18-20°С микротомным ножом, обрабатывают 50% гидроксидом калия в течение 15 часов, гомогенизируют клеточный материал струей воды из пипетки Пастера, с последующим суспендированием, не менее пяти раз проводят цикл гомогенизации и центрифугирования клеточного материала при 1500 оборотов в минуту в течение 5 минут до достижения уровня рН надосадочной жидкости 4,0-5,0, готовят мазки из полученной суспензии. Изобретение обеспечивает уменьшение затрат при выделении изолированных клеток дермы, возможность получения более качественных клеточных изолятов за счет более высокой концентрации клеток.

Description

Изобретение относится к цитологии, дерматологии и может быть использовано для получения изолированных клеток дермы с целью цитометрии и фенотипирования.

Известны способы получения изолированных клеток методом щелочной диссоциации фиксированных формалином тканей [1, 2]. Прототипом заявленного изобретения является способ получения препаратов изолированных клеток [3], включающий в себя длительную (14-20 суток) фиксацию ткани в 10% формалине, с последующим замораживанием кусочка ткани хлорэтилом, приготовление срезов препарата на микротоме, окрашивание гематоксилин-эозином, диссоциацию в 50% водном растворе гидроксида калия в течение 2,5-3 часов, отмывание дистиллированной водой, при температуре 18-20°С пятикратно, по 5 минут, гомогенизацию материала струей воды из микропипетки, приготовление мазков из полученной суспензии по общепринятой методике. Описанный способ позволяет приготовить суспензию изолированных клеток для последующего изучения. Однако недостатками описанного способа являются необходимость использования в процессе приготовления суспензии хлорэтила, необходимость выполнения срезов замороженного материала на микротоме и получение суспензии с низкой концентрацией клеток за счет потери клеточного материала на этапе отмывания. Задача предлагаемого изобретения: получение более концентрированных препаратов клеток, содержащихся в дерме. Технический результат предлагаемого изобретения: уменьшение затрат в процессе выделения изолированных клеток дермы, возможность получения более качественных клеточных изолятов за счет более высокой их концентрации.

Указанная задача в предлагаемом способе достигается тем, что фиксированные в формалине кусочки кожи нарезают микротомным ножом при температуре 18-20°С мелкими фрагментами, заливают 1 мл 50% гидроксида калия на 15 часов при температуре 18-20°С, промывают дистиллированной водой пятикратно при температуре 18-20°С, гомогенизируют клеточный материал струей воды из пипетки Пастера, с последующим суспендированием, не менее пяти раз проводят цикл гомогенизации и центрифугирования клеточного материала при 1500 оборотов в минуту в течение 5 минут до достижения уровня рН надосадочной жидкости 4,0-5,0, готовят мазки из полученной суспензии.

Указанный способ осуществляется следующим образом. Фиксированный в течение 14 суток в гистологическом забуференном 10% нейтральном формалине кусочек кожи без предварительной заморозки нарезают микротомным ножом (или микротомным лезвием) на мелкие фрагменты толщиной до 3 мм, помещают полученные фрагменты в центрифужную градуированную пробирку. Заливают фрагменты 1 мл 50% водного раствора гидроксида калия на 15 часов, после чего удаляют из пробирки раствор щелочи путем аспирации пипеткой Пастера и наливают дистиллированную воду при температуре 18-20°С в объеме 5 мл. Гомогенизируют материал при помощи струи воды из пипетки Пастера объемом 2 мл в течение 2-3 минут, доводят объем воды в пробирке до 10 мл и центрифугируют в течение 5 минут при 1500 оборотах в минуту. После центрифугирования аспирируют воду из пробирки таким образом, чтобы клеточный осадок на дне пробирки находился в объеме жидкости, не превышающем 0,5 мл, измеряют рН при помощи универсальной индикаторной бумаги, добавляют дистиллированную воду до объема 5 мл и повторно гомогенизируют материал способом, описанным выше. Цикл гомогенизации и центрифугирования повторяют до достижения уровня рН надосадочной жидкости 4,0-5,0, но не менее 5 раз. После достижения целевого уровня рН 4,0-5,0 в надосадочной жидкости суспендируют полученный клеточный материал путем многократного пассажа содержимого пробирки пипеткой Пастера, полученную суспензию клеток наносят на предметное стекло, готовят мазки по общепринятой методике.

Способ позволяет расширить возможности получения концентрированных клеточных суспензий для выделения и последующего изучения клеток дермы. Заявленный способ является менее затратным по сравнению с описанными ранее способами, позволяет выполнять приготовление материала без использования заморозки хлорэтилом или другим методом, не требует применения микротома и окрашивания среза гематоксилин-эозином. Кроме того, применение в заявленном способе этапа центрифугирования материала позволяет достичь более высокой концентрации изолированных клеток в суспензии и предотвратить потерю клеток во время гомогенизации.

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ

1. Белов Л.Н., Коган М.Е., Леонтьева Т.А. и др. Получение изолированных клеток методом щелочной диссоциации фиксированных формалином тканей. Цитология, 1975, Т. 12, №11, стр. 1332-1338.

2. Коган М.Е., Белов Л.Н., Леонтьева Т.А. Определение количества клеток в различных органах и тканях после щелочной диссоциации. Архив патологии, 1976, Т. 38, №1, стр. 77-80 (прототип).

3. Зашихин А.Л., Агафонов Ю.В., Лисишников Л.В. Способ получения препаратов изолированных клеток. Патент РФ 2104524, заявка 94018751/14, 23.05.1994.

Claims

Способ получения препаратов изолированных клеток дермы, заключающийся в обработке фиксированных в формалине кусочков кожи 50% гидроксидом калия, гомогенизации клеточного материала струей воды из пипетки Пастера, с последующим суспендированием, отличающийся тем, что фиксированные кусочки при температуре 18-20°C нарезают микротомным ножом, не менее пяти раз проводят цикл гомогенизации и центрифугирования клеточного материала при 1500 оборотов в минуту в течение 5 минут до достижения уровня рН надосадочной жидкости 4,0-5,0, готовят мазки из полученной суспензии.