CN101963695B - 一种发育阶段特异性生精细胞玻片的制备方法 - Google Patents

Abstract

一种发育阶段特异性生精细胞玻片的制备方法，是将取自动物的睾丸组织去除包膜，分散曲精小管，在解剖显微镜下，根据曲精小管的透光差异确定该部位所在生精上皮波模式对应的分期，选择感兴趣的部位区段制备玻片，于液氮中冷冻后，1wt％多聚甲醛溶液固定，制成需要的特异性生精细胞玻片。本发明方法的最大优势是在体外对生精过程相关分子进行活细胞水平的检测，并且能够获得全面、客观、精确的实验结果，反应生精细胞发育阶段特异性基因产物的表达特征。

Description

一种发育阶段特异性生精细胞玻片的制备方法

技术领域

本发明涉及一种细胞玻片的制备方法，具体涉及一种雄性哺乳动物精子发生过程阶段特异性生精细胞玻片的制备方法。

背景技术

由于男性精子数量及质量的下降，出现了大量不育夫妇，给社会带来诸多方面的负面影响。目前不育症的发病率已高达15％～20％，其中男方因素约占二分之一。男性不育作为男性生殖健康的主要问题，关系到国民整体素质和未来人口健康发展，已经成为迫切需要社会关注和亟待解决的焦点问题。进行男性生殖健康基础研究，揭示精子发生的机制不仅可以为阐明男性不育的发病机制提供实验室依据，还有助于临床男性不育症诊断技术的发展，为男性不育的治疗以及男性避孕药的研制提供新思路。

哺乳动物的精子发生是一个复杂而特异的细胞分化过程，分为有丝分裂期、减数分裂期和变态成形期三个阶段，表现出了许多体细胞所没有的现象。许多精子发生相关基因都呈现出明显的时空表达特性，在特定的细胞类型、特定的发育阶段转录表达，参与精原干细胞的增殖分化、同源染色体重组和精母细胞的减数分裂、精子细胞的形态学改变等特异过程。发现并分析这类基因的表达特征可以为进一步认识哺乳类精子发生的分子机制提供有价值的研究线索。

目前，大多数实验室是以睾丸组织为实验材料，直接制备组织切片(石蜡切片或冰冻切片)用于细胞水平分析的。但由于哺乳类动物睾丸组织曲精小管内不同分化发育阶段的生精细胞和各种间质细胞、体细胞混杂存在，采用睾丸组织为实验材料直接制备组织切片进行细胞水平的分析无法排除细胞之间的干扰，不能对基因及其产物的特异性表达进行准确的细胞定位，也容易导致某些mRNA和蛋白的失活而丢失重要的生物信息。

另外，普通石蜡切片或冰冻切片首先是要使用固定剂对组织固定后，才能进行切片，虽然能较好地保留组织的固有形态，但只能从一个层面上观察细胞，不能反映出整体情况，也容易导致某些蛋白在操作过程中发生变性失活。

曲精小管内的各种生精细胞具有不同的大小、形态、沉降系数及表面分子标记，因此还有少数实验室根据各种生精细胞的物理及免疫学特性差异，先将生精细胞进行分离纯化，然后再制备玻片。这类方法虽然能够保证生精细胞发育阶段特异性的统一，但需要首先将组织制备成细胞悬液，不仅破坏了睾丸组织和曲精小管的固有结构形态，而且不能精确辨别全部发育阶段的各类各级生精细胞，从而遗漏某些生物学信息。

现有的各种制片方法都需要使用化学试剂对组织、细胞进行固定后才能切片或铺片，不可避免地造成细胞内信息的丢失。截至目前，还缺乏有效的生精细胞体外培养体系，很难在活细胞水平对生精过程和生殖调控相关基因进行细胞水平的分析。因此，如何获得确定发育阶段的各类生精细胞并用于体外活细胞水平研究就成为这类课题的技术关键。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的缺陷，提供一种以睾丸组织为材料制备发育阶段特异性生精细胞玻片的方法。

本发明的目的是基于以下环节实现的：

整个精子发生过程受许多特异分子及细胞间作用的严格调节，其中以Sertoli细胞为中心的旁分泌调节机制至关重要，保证精子发生处于有规律的周期性同步过程。在曲精小管的任何一个横切面上，都可以看到若干代生殖细胞的重叠，这些细胞的发育彼此密切相关，并形成特定的细胞组合，具有周期性，构成生精上皮波。在解剖显微镜下，不同部位曲精小管的光吸收模式与生精上皮波的特异阶段是对应的，借此可以判断出生精细胞所在的阶段特异性。并且，结合活细胞在相差显微镜下的形态变化，能够显著提高识别的准确性。例如，成年小鼠的曲精小管上皮可以划分为12期，区段内生精细胞核染色质凝集程度越高，光吸收越强，由于每期又有特定的细胞组成方式，决定了每一区段都会表现出特有的透光度，这也是本发明方法得以实施的重要依据。

本发明发育阶段特异性生精细胞玻片的制备方法是将取自动物的睾丸组织去除包膜，分散曲精小管，在解剖显微镜下，根据曲精小管的透光差异确定该部位所在生精上皮波模式对应的分期，选择感兴趣的部位区段制备玻片，于液氮中冷冻后，1wt％多聚甲醛溶液固定，制成需要的特异性生精细胞玻片。

在相差显微镜下，细胞各部细微结构的折射率和厚度不同，当光波通过时，发生的相位变化可以转变为振幅差，藉此可以观察活细胞标本。因此，上述制备好的玻片可以再通过相差显微镜进一步确认。各发育阶段生精细胞的形态学特征具有明显的差异，在相差显微镜下可以很容易地加以区别。

本发明发育阶段特异性生精细胞玻片的具体制备方法包括以下步骤：

1).无菌操作下取出动物睾丸组织，置于含预冷PBS溶液的平皿中；

2).仔细剥去动物睾丸组织的白膜，尽量剔除血管，将曲精小管充分分离，移入另一含预冷PBS溶液的平皿中；

3).用PBS溶液洗涤分离出的曲精小管数次，去除包括组织碎块在内的其它杂质；

4).在解剖显微镜下将分离出的单条曲精小管拉展，进行透光度观察，根据透光度差异确定生精上皮的12个分期部位；

5).剪切下具有需要分期阶段的曲精小管，置于干净的玻片上，盖上盖玻片，避免产生气泡；

6).轻压盖玻片，使细胞分散，并吸去多余液体；

7).在相差显微镜下观察，根据生精细胞的形态特征、大小及其与其他细胞间的联系再次确定剪切下的曲精小管为所需要的材料；

8).将玻片放入液氮中冷冻30秒，取出，移走盖玻片，将曲精小管置于1wt％多聚甲醛溶液中固定10分钟，取出，置室温晾干。

由于液氮温度特别低(-196℃)，而且无毒、无副作用，在生物科学研究中常常被用于冷藏、冷冻细胞和组织，需要时进行复苏即可。又因为液氮冻结的时间非常短，冻结速度大于细胞内外蒸汽渗透速度，细胞内外同时生成的冰晶细小，对细胞无破坏作用。因此，利用液氮的这些特殊作用将固定在载玻片上的曲精小管进行瞬时冷冻处理后再加以固定，能够使曲精小管中的各种细胞结构完整保存下来，并且瞬间冷冻使细胞内的原有蛋白在最大程度上保持了生物活性。在此基础上进行的蛋白染色、定位分析实质上相当于在体外进行的活细胞水平检测。

本发明方法的最大优势是：在体外对生精过程相关分子进行活细胞水平的检测，并且能够获得全面、客观、精确的实验结果，反应生精细胞发育阶段特异性基因产物的表达特征。

利用本发明方法制备的阶段特异性生精细胞主要用于进行体外活细胞水平的研究和分析，可以监测生精过程的细胞分化活动；结合生物化学与分子生物学技术，还能够在基因水平对精子发生的分子机制进行精细研究；评估细胞毒性物质和环境因素对雄性生殖系统的影响；用于对男性不育症生精细胞缺陷的快速、精确诊断；结合遗传修饰动物模型，还可以探索精子分化、精原干细胞生物学、染色质结构变化、减数分裂周期调控等过程的机制。

具体实施方式

本发明的发育阶段特异性生精细胞玻片制备方法特别适合用于大鼠及小鼠生精细胞的分离，在此以小鼠为例详细说明操作步骤。

1.断颈处死大于60天龄的性成熟雄性小鼠，75％乙醇浸泡，无菌操作取出睾丸组织，置于含预冷PBS溶液的平皿中；

2.仔细剥去白膜，尽量剔除血管，将曲精小管充分分离，移入另一含预冷PBS溶液的平皿中；

3.用PBS溶液洗涤数次，去除组织碎块等其它杂质；

4.在解剖显微镜下，用精细尖嘴镊子将已分离的单条曲精小管拉展(避免用力破坏小管结构)，进行透光度观察，根据透光度差异确定出生精上皮的12个分期部位；

5.选择感兴趣的研究分期阶段部位，用解剖剪剪切曲精小管并置于干净的玻片上，盖上盖玻片，避免产生气泡；

6.轻压盖玻片，使细胞分散，并吸去多余液体；

7.在相差显微镜下观察，根据不同发育阶段生精细胞的形态特征、大小及其与其他细胞间的联系确定所取材料是否为研究所需材料；

8.将玻片放入液氮中冷冻30秒，取出后移走盖玻片，置于1wt％多聚甲醛中固定10分钟，取出，置室温晾干；

9.继续进行细胞水平研究。

上述操作过程应在2小时内完成，为了达到最好的染色效果，剪切曲精小管的长度应尽可能短，压片时也应尽可能做到使细胞分散。

由于未成熟小鼠的生精细胞染色质没有高度凝集，不易观察透光性，实验需要选择大于60天龄的成熟小鼠，才能观察到各区段明确的光吸收模式。

Claims (3)

1.一种发育阶段特异性生精细胞玻片的制备方法，其特征是将取自动物的睾丸组织去除包膜，分散曲精小管，在解剖显微镜下，根据曲精小管的透光差异确定该部位所在生精上皮波模式对应的分期，选择感兴趣的部位区段制备玻片，于液氮中冷冻后，1wt％多聚甲醛溶液固定，制成需要的特异性生精细胞玻片。

2.根据权利要求1所述的发育阶段特异性生精细胞玻片的制备方法，其特征是制备的玻片在液氮冷冻之前，再通过相差显微镜进一步确认。

3.根据权利要求1或2所述的发育阶段特异性生精细胞玻片的制备方法，其特征是包括以下步骤：

1).无菌操作下取出动物睾丸组织，置于含预冷PBS溶液的平皿中；

2).仔细剥去动物睾丸组织的白膜，尽量剔除血管，将曲精小管充分分离，移入另一含预冷PBS溶液的平皿中；

3).用PBS溶液洗涤分离出的曲精小管数次，去除包括组织碎块在内的其它杂质；

4).在解剖显微镜下将分离出的单条曲精小管拉展，进行透光度观察，根据透光度差异确定生精上皮的分期部位；

5).剪切下具有需要分期阶段的曲精小管，置于干净的玻片上，盖上盖玻片，避免产生气泡；

6).轻压盖玻片，使细胞分散，并吸去多余液体；

7).在相差显微镜下观察，根据生精细胞的形态特征、大小及其与其他细胞间的联系再次确定剪切下的曲精小管为所需要的材料；

8).将玻片放入液氮中冷冻30秒，取出，移走盖玻片，将曲精小管置于1wt％多聚甲醛溶液中固定10分钟，取出，置室温晾干。