RU2722661C1

RU2722661C1 - Способ изготовления клеточного блока клеточного материала

Info

Publication number: RU2722661C1
Application number: RU2019122857A
Authority: RU
Inventors: Яков Николаевич Тихонов; Ирина Владимировна Назарова; Иван Владимирович Рева; Екатерина Вадимовна Цегольник; Владислав Сергеевич Тудаков; Галина Витальевна Рева; Светлана Владимировна Енина; Максим Зимулович Горелик; Олеся Михайловна Олексенко; Евгений Анатольевич Коцюрбий; Татьяна Валерьевна Тилик; Валерий Евгеньевич Толмачёв
Priority date: 2019-07-19
Filing date: 2019-07-19
Publication date: 2020-06-02

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к изготовлению цитологического препарата. Способ включает консервирование пробы любой консервирующей жидкостью, пригодной для жидкостной цитологии. Затем ее центрифугируют вместе с консервирующей жидкостью в течение 3-6 мин при 1500 оборотах и отделяют осадок. Параллельно готовят тромбомассу, для чего ее аккуратно перемешивают и одновременно разогревают до температуры 36-37°С. Затем тромбомассу добавляют в емкость с осадком в соотношении 1:1, выдерживают полученный сгусток при комнатной температуре 5-10 минут и после его ретракции центрифугируют в течение 3-6 мин при 1500 оборотах. Затем убирают надосадочную жидкость, добавляют 10% забуференный нейтральный формалин при соотношении осадка к формалину 1:10 и центрифугируют 3 мин при 1500 оборотах. Далее извлекают сгусток и осуществляют его проводку, после чего изготавливают срезы, наносят их на предметные стекла, депарафинируют и окрашивают их. Затем препарат заключают в эпоксидную смолу и подвергают исследованию и/или архивируют. Изобретение позволяет обеспечить возможность длительного хранения полученного материала и соответствие морфологической картины на срезах реальным условиям жизни клетки в ткани. 8 ил.

Description

Изобретение относится к области цитологии и может быть использовано для получения цитологического препарата в цитологической практике.

Известен способ изготовления цитологического препарата, основанный на технике заливки клеточного материала желатином, как объемлющей средой с целью формирования клеточного блока с последующим изготовлением из него тонких срезов и нанесением их на предметное стекло (см. Волченко Н.Н., Борисова О.В., Баранова И.Б. «Технология «клеточный блок» в цитологической практике// Клиническая лабораторная диагностика. — 2015. — №8. — С. 39-41.— Режим доступа: https://rucont.ru/efd/395446).

Недостаток этого способа - если цитологический препарат готовился с использованием желатина, то его невозможно удалить из срезов при фиксации в формалине, поэтому иммуноцитохимическое (ИЦХ) исследование провести невозможно.

Известен также способ изготовления цитологического препарата, включающий консервирование и центрифугирование различных органов, тканей и полостных образований с получением осадка, который помещают в парафин с последующим изготовлением из него тонких срезов и нанесением их на предметное стекло (см. «Использование cell-блоков в онкоцитологии: клинические наблюдения» «Технология «клеточный блок» в цитологической практике. Сайт Ассоциации клинических цитологов России, 2013 г.).

Недостаток этого способа – невозможность хранения полученного материала длительное время и недостаточное соответствие морфологической картины на срезах реальным условиям жизни клетки в ткани.

Задача, на решение которой направлено изобретение, выражается в обеспечении возможности хранения полученного материала длительное время и соответствии морфологической картины на срезах реальным условиям жизни клетки в ткани.

Технический результат, проявляющийся при решении поставленной задачи, выражается в обеспечении возможности длительного хранения полученного материала и соответствии морфологической картины на срезах реальным условиям жизни клетки в ткани.

Для решения поставленной задачи способ изготовления цитологического препарата, включающий консервирование и центрифугирование различных органов, тканей и полостных образований с получением осадка, который помещают в парафин с последующим изготовлением из него тонких срезов и нанесением их на предметное стекло отличается тем, что пробу консервируют любой консервирующей жидкостью, пригодной для жидкостной цитологии, после чего ее центрифугируют вместе с консервирующей жидкостью в течение 3-6 мин при 1500 оборотах и затем отделяют осадок, кроме того, параллельно готовят тромбомассу, для чего ее аккуратно перемешивают и одновременно разогревают до температуры 36-37^оС, после чего тромбомассу добавляют в емкость с осадком в соотношении 1:1, далее выдерживают полученный сгусток при комнатной температуре 5-10 минут и после его ретракции центрифугируют в течение 3-6 мин при 1500 оборотах, затем убирают надосадочную жидкость, добавляют 10% забуференный нейтральный формалин при соотношении осадка к формалину 1:10 и центрифугируют 3 мин при 1500 оборотах, далее извлекают сгусток и осуществляют его проводку, после чего изготавливают срезы, наносят их на предметные стекла, депарафинируют и окрашивают их, после чего препарат заключают в эпоксидную смолу и подвергают исследованию и/или архивируют.

Сопоставительный анализ признаков заявленного решения с признаками прототипа и аналогов свидетельствует о соответствии заявленного решения критерию «новизна».

Совокупность признаков формулы изобретения обеспечивает возможность длительного хранения полученного материала и соответствие морфологической картины на срезах реальным условиям жизни клетки в ткани.

При этом отличительные признаки формулы изобретения решают следующие функциональные задачи.

Признак «…пробу консервируют любой консервирующей жидкостью, пригодной для жидкостной цитологии…» упрощает организацию сохранения полученной пробы.

Признаки, указывающие что после консервации пробы «ее центрифугируют вместе с консервирующей жидкостью в течение 3-6 мин при 1500 оборотах», обеспечивают возможность получения видимого осадка материала, пригодного для изготовления цитологического препарата.

Признак, указывающий что после центрифугирования «отделяют осадок», обеспечивает получение материала, пригодного для изготовления цитологического препарата.

Признаки, указывающие что «параллельно готовят тромбомассу, для чего ее аккуратно перемешивают и одновременно разогревают до температуры 36-37^оС», обеспечивают сохранение материала пробы в условиях, близких к реальным физиологическим, сохранность клеток в живом состоянии и их защиту при обработке.

Признаки, указывающие что «тромбомассу добавляют в емкость с осадком в соотношении 1:1», позволяют «нарастить» объем сгустка.

Признаки, указывающие что «далее выдерживают полученный сгусток при комнатной температуре 5-10 минут», обеспечивают ретракцию сгустка.

Признаки, указывающие что после ретракции сгустка его «центрифугируют в течение 3-6 мин при 1500 оборотах», обеспечивают отделение от сгустка надосадочной жидкости – неинформативного материала и концентрирование информативного материала с минимизацией его объема для уменьшения расхода лабораторной посуды и экономии времени.

Признаки, указывающие что после центрифугирования сгустка «убирают надосадочную жидкость, добавляют 10% забуференный нейтральный формалин, при соотношении осадка к формалину 1:10 и центрифугируют 3 мин при 1500 оборотах», обеспечивают тщательное перемешивание материала сгустка и консерванта, уплотнение сгустка и, тем самым, повышение информативности пробы при уменьшении расхода красителей, предметных и покровных стекол, реактивов.

Признаки, указывающие что после центрифугирования сгустка «далее извлекают сгусток и осуществляют его проводку», обеспечивают процесс дегидратации (обезвоживания) и обезжиривания сгустка и

пропитки его парафином, т.е. жидкостная и жировая составляющая сгустка замещается парафином.

Признаки, указывающие что после проводки «изготавливают срезы, наносят их на предметные стекла», обеспечивают возможность формирования тонкослойных препаратов, размещаемых на предметных стеклах.

Признаки, указывающие что после нанесения срезов на предметные стекла «депарафинируют и окрашивают их», обеспечивают формирование цветоконтрастных материалов, пригодных для их изучения.

Признаки, указывающие что «препарат заключают в эпоксидную смолу», обеспечивают высокую долговечность препарата».

Признаки, указывающие что после заключения в эпоксидную смолу препарат «подвергают исследованию и/или архивируют», раскрывают возможные пути использования препарата.

На фиг.1 показан обычный мазок экссудата при использовании метода окрашивания среза гематоксилином и эозином; на фиг.2 показан вид препарата при методах окрашивания среза гематоксилином из цитоблока; на фиг. 3 показан вид препарата при методах окрашивания среза эозином из цитоблока; на фиг. 4 показан вид препарата при иммунной гистохимии на выявление клеток, экспрессирующих Ki67; на фиг.5 и 6 показано количество клеток в поле зрения при окраске мазка, изготовленного из экссудата, методом с применением метиленового синего; на фиг.7 показано количество клеток в поле зрения на препарате, изготовленном методом цитоблока; на фиг.8 показана экспрессия клетками маркера р53, ув.х200.

Материал для цитологического препарата может быть получен практически из всех разновидностей цитологических образцов: жидкости (из серозных оболочек, кисты и др.), пунктаты, полученные при тонкоигольной аспирационной биопсии, эксфолиативный материал, остаточный материал после использования методик жидкостной цитологии и т. д.

Зачастую пунктат содержит жидкость с очень малым количеством клеток, и цитологический анализ провести практически невозможно. Жидкая же часть пунктата (коллоид, содержимое кисты, плазма крови) обычно никак не исследуется. В доступной литературе нам удалось обнаружить лишь указание на то, что коллоид - это жидкость, включающая рибонуклеины, протеиды, тиреоглобулин, йод, цитохромоксидазу и другие ферменты.

Ниже раскрыт вариант, связанный с использованием тонкоигольной аспирационной биопсии (ТАБ) для отбора клеточного материала для получения цитологического препарата.

Соответственно, для отбора клеточного материала используют известные средства для выполнения ТАБ: лоток, шприцы объемом в зависимости от размеров кист и количества инфильтрата (от 5,0 мл до 20 мл); предметные стекла, пробирки, салфетки, карандаш. Кроме того, для центрифугирования используют исследовательскую центрифугу, например, К1015. Для изучения препаратов и изготовления иллюстраций используют микроскоп, например, Olympus Bx51 c фотокамерой DP25.

Заявленный способ реализуется следующим образом.

Материал тонкоигольной аспирационной биопсии (ТАБ) врач должен поместить в любую консервирующую среду, предназначенную для жидкостной цитологии (ЖЦ) и аккуратно перемешать (без образования пены) для большего соприкосновения материала с консервантом. Нами использовались различные консерванты для ЖЦ: Clear Prep фирмы Resolution Biomedical, США; E-Prep фирмы Celltrazone, Ю.Корея; BD,США; Novaprep фирмы Novaprep Solution, Великобритания.

В случае малого количества материала, как например, при пункции образований щитовидной железы, целесообразно использовать пробирку Эппендорф (1,5 мл), содержащую 1 мл консервирующей жидкости. В случае большого количества материла весь материал или его осадок после центрифугирования (как при исследовании жидкостей серозных полостей) можно поместить в виалу с консервантом для жидкостной цитологии или в обычную центрифужную пробирку с консервантом. Важно, чтобы консервирующая жидкость занимала объем не менее, чем объем образца (1:1) или более (до 1:10).

Материал ТАБ, помещенный в консервант, должен быть немедленно доставлен в лабораторию или поставлен в холодильник для доставки в лабораторию. Чем быстрее материал будет переведен в состояние клеточного блока (КБ) на этапе помещения сгустка в формалин, тем меньше вероятность гибели маркеров, в особенности ядерных маркеров, которые можно исследовать в дальнейшем методом ИГХ в КБ.

Поступивший материал переносят в центрифужные пробирки: при поступлении материала в составе консервирующей жидкости в пробирке Эппендорф, его центрифугируют в поступившей пробирке.

Далее центрифугируют весь доставленный материал 3-6 мин при 1500 оборотах. Удаляют супернатант. В случае большого количества исходного материала целесообразно соединить осадки в одну пробирку.

При реализации способа используют тромбоцитарную массу, которую получают на станции переливания крови в стандартных упаковках. Тромбоцитарная масса, используемая в клинических целях, в основном содержит тромбоциты. Когда осядут эритроциты и лейкоциты (или в центрифуге получаем мягким центрифугированием плазму крови, которую тоже центрифугируют). В этом случае осядут уже только тромбоциты. Тромбоцитарная масса должна содержать не менее 50*109 тромбоцитов в одном флаконе. Ее хранят при температуре 20°С. Через три дня хранения тромбоциты начинают терять функциональную активность и их утилизируют.

Параллельно готовят тромбомассу, для чего ее аккуратно перемешивают, для этого пробирку с ТМ вращают в ладонях, чем обеспечивается также разогрев ее до температуры тела (36-37^оС), что способствует большей активности тромбоцитов.

Подготовленную таким образом тромбомассу добавляют в емкость с осадком в соотношении 1:1 или более. Далее выдерживают полученный сгусток при комнатной температуре 5-10 минут и после его ретракции центрифугируют в течение 3-6 мин при 1500 оборотах.

Затем убирают надосадочную жидкость, добавляют 10% забуференный нейтральный формалин при соотношении осадка к формалину 1:10 и центрифугируют 3 мин при 1500 оборотах. После центрифугирования препаровальной иглой аккуратно обводят осадок, плотно прижимая иглу к стенке пробирки для увеличения площади соприкосновения осадка с формалином.

Далее извлекают сгусток (окончательное извлечение сгустка из пробирки Эппендорф имеет свои особенности - рекомендуется слить формалин, отрезать дно пробирки и в образованное отверстие вытолкнуть уплотненный сгусток материала).

Далее осуществляют проводку сгустка, эти этапы работы аналогичны таковым при работе с гистологическим материалом. Проводка возможна как ручная, так и автоматическая. Для автоматической проводки можно применять процессор Donatello фирмы Diapath (Италия) в стандартизированном режиме.

В процессе проводки проходит процесс дегидратации (обезвоживания) и обезжиривания сгустка и пропитки сгустка парафином, т.е. жидкостная и жировая составляющая сгустка замещаются парафином.

После этого известным образом (на микротоме) изготавливают срезы и наносят их на предметные стекла.

Далее срезы депарафинируют и окрашивают их - можно осуществлять все виды гистологического окрашивания (иммунная гистохимия, гистохимия, классические морфологические методы окрашивания) и исследуют с помощью PCR метода. После этого препарат известным образом заключают в эпоксидную смолу и подвергают исследованию и/или архивируют - хранят многие годы. Для ИГХ в КБ используют, например, маркеры фирмы Dako, США.

На КБ с последующим повторением при необходимости вышеперечисленных методик или провести все методики сразу на материале КБ. ИЦХ-исследование можно стандартизовать с иммуногистохимическим, так как клеточный материал обрабатывается таким же образом, что и образцы ткани для гистологии (за рубежом ИЦХ-реакция ставится практически всегда на материале КБ и называется иммуногистохимической). Метод дает возможность получить многочисленные срезы из одного КБ для постановки ИЦХ-реакции с различными антителами.

Достоинства нашего метода:

- хранение материала возможно длительное время;

- морфологическая картина на срезах соответствует реальным условиям жизни клетки в ткани;

- окрашивание материала возможно всеми доступными морфологическими и иммуногистохимическими методами, а также исследование с помощью PCR метода;

- блоки с залитым материалом можно архивировать и использовать в дальнейшем в динамике клинического наблюдения за пациентом.

Claims

Способ изготовления цитологического препарата, включающий консервирование и центрифугирование различных органов, тканей и полостных образований с получением осадка, который помещают в парафин с последующим изготовлением из него тонких срезов и нанесением их на предметное стекло, отличающийся тем, что пробу консервируют любой консервирующей жидкостью, пригодной для жидкостной цитологии, после чего ее центрифугируют вместе с консервирующей жидкостью в течение 3-6 мин при 1500 оборотах и затем отделяют осадок, кроме того, параллельно готовят тромбомассу, для чего ее аккуратно перемешивают и одновременно разогревают до температуры 36-37°С, после чего тромбомассу добавляют в емкость с осадком в соотношении 1:1, далее выдерживают полученный сгусток при комнатной температуре 5-10 минут и после его ретракции центрифугируют в течение 3-6 мин при 1500 оборотах, затем убирают надосадочную жидкость, добавляют 10% забуференный нейтральный формалин при соотношении осадка к формалину 1:10 и центрифугируют 3 мин при 1500 оборотах, далее извлекают сгусток и осуществляют его проводку, после чего изготавливают срезы, наносят их на предметные стекла, депарафинируют и окрашивают их, после чего препарат заключают в эпоксидную смолу и подвергают исследованию и/или архивируют.