RU2705594C1 - Способ приготовления гистологических препаратов для выявления внутриклеточных липидных включений в тканях человека и животных - Google Patents
Способ приготовления гистологических препаратов для выявления внутриклеточных липидных включений в тканях человека и животных Download PDFInfo
- Publication number
- RU2705594C1 RU2705594C1 RU2019124176A RU2019124176A RU2705594C1 RU 2705594 C1 RU2705594 C1 RU 2705594C1 RU 2019124176 A RU2019124176 A RU 2019124176A RU 2019124176 A RU2019124176 A RU 2019124176A RU 2705594 C1 RU2705594 C1 RU 2705594C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- sections
- solution
- histological
- concentration
- tissue
- Prior art date
Links
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 35
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 30
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 title claims abstract description 17
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 title claims abstract description 7
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 title claims abstract description 7
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims description 6
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 48
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 25
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 24
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 21
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 claims abstract description 21
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 19
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims abstract description 19
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims abstract description 16
- CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N O-Xylene Chemical group CC1=CC=CC=C1C CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 7
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims abstract description 7
- 235000013871 bee wax Nutrition 0.000 claims abstract description 6
- 239000012166 beeswax Substances 0.000 claims abstract description 6
- 238000004040 coloring Methods 0.000 claims abstract description 3
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 claims abstract 2
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 claims abstract 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract 2
- 238000005070 sampling Methods 0.000 claims abstract 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- YCUVUDODLRLVIC-UHFFFAOYSA-N Sudan black B Chemical compound C1=CC(=C23)NC(C)(C)NC2=CC=CC3=C1N=NC(C1=CC=CC=C11)=CC=C1N=NC1=CC=CC=C1 YCUVUDODLRLVIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 239000000834 fixative Substances 0.000 claims description 10
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims description 7
- VSGNNIFQASZAOI-UHFFFAOYSA-L calcium acetate Chemical compound [Ca+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O VSGNNIFQASZAOI-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 6
- 239000001639 calcium acetate Substances 0.000 claims description 6
- 229960005147 calcium acetate Drugs 0.000 claims description 6
- 235000011092 calcium acetate Nutrition 0.000 claims description 6
- UFMZWBIQTDUYBN-UHFFFAOYSA-N cobalt dinitrate Chemical class [Co+2].[O-][N+]([O-])=O.[O-][N+]([O-])=O UFMZWBIQTDUYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 229910001981 cobalt nitrate Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 claims description 5
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 claims description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 5
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 4
- 238000010422 painting Methods 0.000 claims 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 abstract description 4
- 210000003484 anatomy Anatomy 0.000 abstract description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 239000004744 fabric Substances 0.000 abstract 1
- 230000002962 histologic effect Effects 0.000 abstract 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 21
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 9
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 8
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 8
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 5
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 5
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 5
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 5
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 5
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 5
- QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 5,5-dimethyl-2,4-dioxo-1,3-oxazolidine-3-carboxamide Chemical compound CC1(C)OC(=O)N(C(N)=O)C1=O QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 3
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 3
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 3
- 235000014103 egg white Nutrition 0.000 description 3
- 210000000969 egg white Anatomy 0.000 description 3
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 3
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 3
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000005056 compaction Methods 0.000 description 2
- 208000029078 coronary artery disease Diseases 0.000 description 2
- 239000006059 cover glass Substances 0.000 description 2
- 238000007688 edging Methods 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 210000005228 liver tissue Anatomy 0.000 description 2
- 239000013521 mastic Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 210000003934 vacuole Anatomy 0.000 description 2
- 206010012289 Dementia Diseases 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 description 1
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 description 1
- 208000025966 Neurological disease Diseases 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000004810 Vascular dementia Diseases 0.000 description 1
- 230000035508 accumulation Effects 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 238000004026 adhesive bonding Methods 0.000 description 1
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 159000000007 calcium salts Chemical class 0.000 description 1
- 235000012730 carminic acid Nutrition 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 229930183167 cerebroside Natural products 0.000 description 1
- 150000001784 cerebrosides Chemical class 0.000 description 1
- 208000026106 cerebrovascular disease Diseases 0.000 description 1
- 239000011651 chromium Substances 0.000 description 1
- 150000001844 chromium Chemical class 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 229910017052 cobalt Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010941 cobalt Substances 0.000 description 1
- GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N cobalt atom Chemical compound [Co] GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- SOCTUWSJJQCPFX-UHFFFAOYSA-N dichromate(2-) Chemical compound [O-][Cr](=O)(=O)O[Cr]([O-])(=O)=O SOCTUWSJJQCPFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 239000008098 formaldehyde solution Substances 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 1
- 238000009413 insulation Methods 0.000 description 1
- 230000006372 lipid accumulation Effects 0.000 description 1
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000004118 muscle contraction Effects 0.000 description 1
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 1
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003825 pressing Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 125000004805 propylene group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([*:1])C([H])([H])[*:2] 0.000 description 1
- 239000005871 repellent Substances 0.000 description 1
- 239000012047 saturated solution Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- YCUVUDODLRLVIC-VPHDGDOJSA-N sudan black b Chemical compound C1=CC(=C23)NC(C)(C)NC2=CC=CC3=C1\N=N\C(C1=CC=CC=C11)=CC=C1\N=N\C1=CC=CC=C1 YCUVUDODLRLVIC-VPHDGDOJSA-N 0.000 description 1
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 1
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000018405 transmission of nerve impulse Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/30—Staining; Impregnating ; Fixation; Dehydration; Multistep processes for preparing samples of tissue, cell or nucleic acid material and the like for analysis
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/483—Physical analysis of biological material
- G01N33/4833—Physical analysis of biological material of solid biological material, e.g. tissue samples, cell cultures
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Optics & Photonics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Sampling And Sample Adjustment (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области медицины, конкретно к гистологии и патологической анатомии. Раскрыт способ приготовления гистологических препаратов для выявления внутриклеточных липидных включений в тканях человека и животных, включающий забор образцов исследуемой ткани, фиксацию образцов ткани в 10%-ном растворе формалина, отмывку от фиксатора, обезвоживание, приготовление гистологических срезов, нанесение срезов на предметные стекла с последующей окраской срезов в растворе Судана черного «В». При этом уплотненные в фиксаторе образцы исследуемой ткани нарезают на полоски толщиной не более 2 мм, обезвоживают в трех порциях ацетона при температуре 0-4°С в течение 20 минут в каждой порции, далее из последней порции ацетона полоски ткани переносят в расплавленный парафин, содержащий 5% пчелиного воска, с последующим изготовлением парафиновых блоков, приготовлением гистологических срезов и нанесением их на предметные стекла, далее проводят депарафинизацию срезов на стеклах в О-ксилоле и спирте убывающей концентрации, затем срезы окрашивают раствором Судана черного «В» в этиленгликоле в концентрации 15,3 ммоль/л, далее срезы переносят в 85%-ный водный раствор этиленгликоля и выдерживают в течение 2-3 минут. Изобретение обеспечивает упрощение и удешевление известного способа, а также повышение качества гистологических препаратов. 3 з.п. ф-лы, 2 ил., 2 пр.
Description
Изобретение относится к области медицины, конкретно к цитологии, гистологии и патологической анатомии и может быть использовано при приготовлении гистологических препаратов для выявления внутриклеточных липидных включений в тканях человека и животных.
Важность выявления клеточных липидных включений в патоморфологии как человека, так и экспериментальных животных сложно переоценить. Это связано с тем, что атеросклероз, гипертоническая болезнь и ишемическая болезнь сердца (ИБС) составляют печальную триаду XXI века. К этой триаде с полным правом можно добавить и тесно связанные с атеросклерозом неврологические заболевания - инсульт и сосудистую деменцию, учитывая их высокую социальную значимость и инвалидизирующие последствия [1]. Атеросклероз-ассоциированные цереброваскулярные заболевания (ЦВЗ) - вторая по частоте (20%) причина деменции в США и Европе после болезни Альцгеймера (БА) [2]. Отмечается существенный вклад ЦВЗ в патогенез ряда нейродегенеративных заболеваний: около 50% лиц, страдающих БА, имеют признаки ЦВЗ, выявляемые при патоморфологических исследованиях [3, 4, 5]. Липиды содержатся во всех клетках человека и животных [6]. Будучи одним из основных компонентов биологических мембран клеток, липиды влияют на проницаемость их мембран и активность многих клеточных ферментов, а также участвуют в передаче нервного импульса, в мышечном сокращении, в создании межклеточных контактов и иммунохимических процессах. Липиды образуют энергетический резерв организма человека и животных, участвуют в создании водоотталкивающих и термоизоляционных покровов живых существ и защищают различные органы от механических воздействий.
При определенных условиях (например, в полевых условиях) для целей окраски липидов невозможно использование замороженных срезов, приготовленных в криостате, или с использованием замораживающего микротома (учитывая громоздкость и сложность транспортировки этого оборудования, а также его дороговизну). В этом случае на помощь приходит применение альтернативных методик окраски тканей на липидные включения. Для этого удобно использовать окраски на парафиновых срезах, изготовленных из парафиновых блоков, фиксацию, проводку и заливку для которых можно выполнить в любых условиях, включая походные.
Актуальность предлагаемого способа для биологии, цитологии, гистологии и патологической анатомии обусловлена ролью фосфолипидов и цереброзидов в организме в норме и патологии.
Известен способ приготовления гистологических препаратов для выявления внутриклеточных липидных включений в животных тканях [7], включающий взятие образцов исследуемой ткани, фиксацию последних в течение 1-5 недель в 40% растворе формальдегида, содержащем соли кобальта и кальция, последующую обработку образцов 3% раствором бихромата калия (K2Cr2O7) в течение 2 суток, обезвоживание образцов тканей в ацетоне комнатной температуры, погружение их в расплавленный парафин. Из полученных парафиновых блоков на микротоме изготавливались срезы и наносились на предметные стекла. В дальнейшем они обрабатывались по следующей схеме [8]: срезы переносились в 70% этиловый спирт, окрашивались в течение 30 мин. при комнатной температуре в насыщенном растворе Судана черного «В» в 70% этиловом спирте, избыток красителя удалялся ополаскиванием в 70% этиловом спирте, срезы промывались водопроводной водой, при необходимости, докрашивались квасцовым кармином Майера (в течение 16 часов), промывались водой, заключались в водную глицерин-желатиновую среду для хранения.
Недостатками известного способа являются длительность процесса фиксации образцов и окрашивания срезов, использование достаточно токсичных солей хрома и применение этанола.
Наиболее близким к заявляемому способу-прототипу является способ приготовления гистологических препаратов для выявления внутриклеточных липидных включений в животных тканях [9], включающий взятие образцов исследуемой ткани, фиксацию последних в 10% растворе формалина, приготовление, без заливки в парафин, из них срезов на замораживающем микротоме (или в криостате) и наклеивание последних на предметные стекла. В дальнейшем срезы, наклеенные на стекла (гистологический препарат), обрабатывались по следующей схеме: срезы окрашивались в растворе Судана черного «В» в пропиленгликоле в течение 5-7 мин. Краситель приготовлялся растворением 0,7 г. Судана черного «В» в 100 мл чистого пропиленгликоля, при нагревании до 100° в течение нескольких минут. Далее гистологические препараты переносились в 85% раствор пропиленгликоля на 2 мин., затем переносились в 50% раствор пропиленгликоля на 2 мин., далее промывались в теплой воде в течение 1 мин., при необходимости, докрашивались гематоксилином Майера в течение 4 мин., повторно промывались водой и заключались в водную глицерин-желатиновую среду.
Недостатками прототипа являются сложность и длительность способа, необходимость наличия специальных условий (криостат, или замораживающий микротом), и применение не всегда доступного пропиленгликоля, а также использование водной глицерин-желатиновой среды, требующей довольно трудоемкой окантовки покровного стекла валиком из специальной мастики для создания так называемой «влажной камеры», не удобной для длительного архивного хранения полученных гистологических препаратов.
Задачей изобретения является упрощение и удешевление известного способа, обеспечение возможности выполнения способа в полевых условиях, а также исключение применения водной глицерин-желатиновой среды для заключения окрашенных гистологических препаратов и их архивного хранения.
Технический результат: упрощение и удешевление известного способа, повышение качества гистологических препаратов.
Поставленная задача достигается предлагаемым способом, заключающимся в следующем.
После забора биоматериала, образцы изучаемой ткани заливают фиксирующим раствором (фиксатором) на основе 10% раствора формалина, содержащего соли нитрата кобальта и ацетата кальция, и выдерживают в течение 13-15 дней в темноте при температуре 10-15°С. Уплотненные в фиксаторе образцы изучаемой ткани при помощи бритвы нарезают на тонкие полоски, толщиной не более 2 мм, обсушивают при помощи фильтровальной бумаги, избегая нажима на исследуемую ткань. Полученные полоски ткани, без предварительной промывки в воде, быстро обезвоживают в трех порциях холодного чистого ацетона (при температуре 0-4°С), по 20 минут в каждой порции, при постоянном перемешивании. Из последней порции ацетона образцы изучаемой ткани переносят сразу же в расплавленный парафин, содержащий 5% пчелиного воска. Далее по стандартной методике выполняют изготовление парафиновых блоков, приготовление из них гистологических срезов толщиной от 7 до 15 микрометров на санном или ротационном микротоме, фиксацию расправленных парафиновых срезов на предметных стеклах, предварительно покрытых для лучшей адгезии тонким слоем яичного белка и высушенных в термостате.
После депарафинизации срезов в О-ксилоле, стекла со срезами «проводят» по водным растворам изопропилового спирта убывающей концентрации (от 100% до 70%, с шагом в 10%), споласкивают в двух порциях дистиллированной воды, а затем выдерживают в двух порциях 100% этиленгликоля. После этого приступают к процессу окраски срезов в растворе Судана черного «В» в этиленгликоле (концентрация раствора 15,3 ммоль/л) в течение 7-9 минут при комнатной температуре.
Далее стекла со срезами, без промывки, переносят в 85% водный раствор этиленгликоля и выдерживают в течение 2-3 минут. Затем стекла со срезами промывают в трех сменах дистиллированной воды в течение 3-4 минут, после чего заключают срезы в 16% водный раствор поливинилового спирта под покровные стекла для изучения препаратов под микроскопом и длительного архивного хранения полученных гистологических препаратов.
Определяющими отличиями предлагаемого способа от прототипа, являются:
- образцы исследуемой ткани обезвоживают в трех порциях ацетона при температуре 0-4°С, по 20 минут в каждой порции, при постоянном перемешивании, что позволяет упростить способ за счет исключения стадий их предварительной промывки в проточной воде и уплотнения в спиртах возрастающей концентрации (путем проводки материала по батарее, состоящей из растворов этилового спирта возрастающей концентрации: 50%, 60%, 70%, 80%, 96%, абсолютный (100% этанол) 1-й, абсолютный 2-й);
- для заливки образцов используют расплавленный парафин, содержащий 5% пчелиного воска, что позволяет улучшить пластические свойства парафина и получить более тонкие срезы на санном или ротационном микротоме;
- для окраски срезов используют раствор Судана черного «В» в этиленгликоле в концентрации 15,3 ммоль/л, который является более дешевым и легко доступным, обладающим лучшей проникающей способностью в ткани, чем раствор в пропиленгликоле, используемый в прототипе;
- после депарафинизации в О-ксилоле, стекла с наклеенными на них срезами (гистологические препараты) «проводят» по водным растворам изопропилового спирта убывающей концентрации, что позволяет упростить и удешевить способ за счет большей доступности и дешевизны изопропилового спирта, по сравнению с этиловым спиртом, используемым в прототипе;
- для целей архивного хранения, окрашенные Суданом черным «В», гистологические препараты помещают в 16% водный раствор поливинилового спирта, что позволяет исключить применение водной глицерин-желатиновой среды, требующей довольно трудоемкой окантовки покровного стекла валиком из специальной мастики для создания так называемой «влажной камеры», не удобной для длительного архивного хранения полученных гистологических препаратов.
Предлагаемый способ является более простым, чем способ-прототип, поскольку в нем отсутствуют стадии отмывки образцов тканей в проточной воде и уплотнение их в спиртах возрастающей концентрации, приготовление срезов на замораживающем микротоме или в криостате.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.
Пример 1.
Образцы ткани печени мыши заливают фиксатором на основе 10% раствора формалина, содержащего соли нитрата кобальта и ацетата кальция, и выдерживают в течение 15 дней в темноте при температуре 10°С. Водный раствор фиксатора содержит в своем составе кальция ацетат безводный в концентрации 158,06 ммоль/л, кобальта нитрат безводный в концентрации 54,66 ммоль/л, растворенные при комнатной температуре в 10% (1:10) водном растворе свежего продажного формалина.
Уплотненные в фиксаторе образцы изучаемой ткани при помощи бритвы нарезают на тонкие полоски, толщиной не более 2 мм. Полученные полоски обсушивают при помощи фильтровальной бумаги, затем быстро обезвоживают в трех порциях холодного чистого ацетона (при температуре 0-4°С), по 20 минут в каждой порции, при постоянном перемешивании. Из последней порции ацетона образцы ткани переносят в расплавленный парафин, содержащий 5% пчелиного воска. Далее, выполняют изготовление парафиновых блоков, приготовление из них гистологических срезов толщиной от 7 до 15 микрометров на санном микротоме, фиксацию расправленных парафиновых срезов на предметных стеклах, предварительно покрытых для лучшей адгезии тонким слоем яичного белка и высушенных в термостате.
После депарафинизации в О-ксилоле, стекла со срезами «проводят» по водным растворам изопропилового спирта убывающей концентрации (от 100% до 70%, с шагом в 10%), споласкивают в двух порциях дистиллированной воды, а затем выдерживают в двух порциях 100% этиленгликоля.
Готовят красящий раствор путем растворения 0,7 г Судана черного «В» в 100 мл безводного этиленгликоля при нагревании на водяной бане (до 100°С) и постоянном помешивании в течение 3-5 минут, затем полученный раствор охлаждают до комнатной температуры и фильтруют под вакуумом. После этого приступают к процессу окраски срезов в растворе Судана черного «В» в этиленгликоле (в концентрации 15,3 ммоль/л) в течение 7 минут при комнатной температуре.
Далее срезы на стеклах переносят в 85% водный раствор этиленгликоля и выдерживают в течение 2-х минут. Затем срезы на стеклах промывают в трех сменах дистиллированной воды в течение 3-х минут, после чего заключают в 16% водный раствор поливинилового спирта под покровные стекла для изучения препаратов под микроскопом и длительного архивного хранения полученных гистологических препаратов.
Липиды в гепатоцитах и эритроцитах печени мыши окрашиваются в черный или темно-коричневый цвет, что зависит от содержания в них липидов.
В результате получают гистологические препараты высокого качества с сохраненной гистоструктурой, позволяющей быстро и достоверно провести исследование.
На фиг. 1 представлена фотография среза печени мыши (увеличение ×250). На фотографии видно значительное накопление липидов, жировой гепатоз с очаговой вакуольной, гидропической дистрофией гепатоцитов. На фоне неравномерно выраженного капиллярно-венозного полнокровия с эритростазами неравномерное расширение перисинусоидальных пространств Диссе.
Пример 2.
Образцы ткани печени мыши заливают фиксатором на основе 10% раствора формалина, содержащего соли нитрата кобальта и ацетата кальция, и выдерживают в течение 13 дней в темноте при температуре 15°С. Водный раствор фиксатора содержит в своем составе кальция ацетат безводный в концентрации 158,06 ммоль/л, кобальта нитрат безводный в концентрации 54,66 ммоль/л, растворенные при комнатной температуре в 10% (1:10) водном растворе свежего продажного формалина.
Уплотненные в фиксаторе образцы изучаемой ткани при помощи бритвы нарезают на тонкие полоски, толщиной не более 2 мм. Полученные полоски обсушивают при помощи фильтровальной бумаги, затем быстро обезвоживают в трех порциях ацетона (при температуре 0-4°С), по 20 минут в каждой порции, при постоянном перемешивании. Из последней порции ацетона образцы ткани переносят в расплавленный парафин, содержащий 5% пчелиного воска. Далее, по стандартной методике, выполняют изготовление парафиновых блоков, приготовление из них гистологических срезов толщиной от 7 до 15 микрометров на санном или ротационном микротоме, фиксацию расправленных парафиновых срезов на предметных стеклах, предварительно покрытых для лучшей адгезии тонким слоем яичного белка и высушенных в термостате.
После депарафинизации в О-ксилоле, стекла со срезами (гистологические препараты) «проводят» по водным растворам изопропилового спирта убывающей концентрации (от 100% до 70%, с шагом в 10%), споласкивают в двух порциях дистиллированной воды, а затем выдерживают в двух порциях 100% этиленгликоля.
После этого приступают к процессу окраски срезов в растворе Судана черного «В» в этиленгликоле (в концентрации 15,3 ммоль/л) в течение 9 минут при комнатной температуре.
Далее срезы на стеклах переносят в 85% водный раствор этиленгликоля и выдерживают в течение 3-х минут. Затем срезы на стеклах промывают в трех сменах дистиллированной воды в течение 4-х минут, после чего заключают гистологические препараты в 16% водный раствор поливинилового спирта под покровные стекла для изучения препаратов под микроскопом и длительного архивного хранения полученных гистологических препаратов.
На фиг. 2 представлена фотография среза печени мыши (увеличение ×400). Отмечается умеренно выраженное накопление липидов, очаговая вакуольная дистрофия гепатоцитов.
В результате выполнения предлагаемого способа были получены хорошие результаты окрашивания структур исследуемой ткани, содержащих липиды. Это позволяет рекомендовать данный способ для приготовления гистологических препаратов исследуемых тканей для выявления внутриклеточных липидных включений в полевых условиях при отсутствии криостата или замораживающего микротома.
Литература.
1. Яхно Н.Н., Захаров В.В., Деменции М.: Мед-пресс-информ. 2011. 272 с.
2. Fratiglioni L, Launer LJ, Andersen K, et al. Incidence of dementia and major subtypes in Europe: a collaborative study of population-based cohorts. Neurologic diseases in the elderly research group. Neurology 2000; 54(11 Suppl 5):S10-5.
3. Левин O.C., Трусова H.A. Сосудистые факторы риска болезни Альцгеймера // Журнал неврологии и психиатрии им. Корсакова. 2013. Т. 113. №7. С. 3-12.
4. Schneider J.A. High blood pressure and microinfarcts: a link between vascular risk factors, dementia, and clinical Alzheimer's disease. J. Am Geriatr Soc. 2009 Nov; 57(11):2146-7. doi: 10.1111/j.1532-5415.2009.02521.x.
5. Schneider J.A., Bennett D.A. Where vascular meets neurodegenerative disease. Stroke 2010; 41(10 Suppl): S144-6.
6. Fahy E. et al. A comprehensive classification system for lipids // J. Lipid. Res. 2005. V. 46, №5. P. 839-861.
7. McManus J.F.A. Granules of the human polymorphonuclear leucocyte // Nature. - 1945. - T. 156. - №.3954. - C. 173.
8. McManus J.F.A. The demonstration of certain fatty substances in paraffin sections // The Journal of pathology and bacteriology. - 1946. - T. 58. - №.1. - C. 93-95.
9. Chiffelle T.L., Putt F.A. Propylene and ethylene glycol as solvents for Sudan IV and Sudan black В // Stain technology. - 1951. - T. 26. - №.1. - C. 51-56.
Claims (4)
1. Способ приготовления гистологических препаратов для выявления внутриклеточных липидных включений в тканях человека и животных, включающий забор образцов исследуемой ткани, фиксацию образцов ткани в 10%-ном растворе формалина, отмывку от фиксатора, обезвоживание, приготовление гистологических срезов, нанесение срезов на предметные стекла с последующей окраской срезов в растворе Судана черного «В», отличающийся тем, что уплотненные в фиксаторе образцы исследуемой ткани нарезают на полоски толщиной не более 2 мм, обезвоживают в трех порциях ацетона при температуре 0-4°С в течение 20 минут в каждой порции, далее из последней порции ацетона полоски ткани переносят в расплавленный парафин, содержащий 5% пчелиного воска, с последующим изготовлением парафиновых блоков, приготовлением гистологических срезов и нанесением их на предметные стекла, далее проводят депарафинизацию срезов на стеклах в О-ксилоле и спирте убывающей концентрации, затем срезы окрашивают раствором Судана черного «В» в этиленгликоле в концентрации 15,3 ммоль/л, далее срезы переносят в 85%-ный водный раствор этиленгликоля и выдерживают в течение 2-3 минут.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что фиксацию образцов ткани осуществляют в 10%-ном водном растворе формалина, содержащего соли нитрата кобальта в концентрации 54,66 ммоль/л и ацетата кальция в концентрации 158,06 ммоль/л.
3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что после депарафинизации в О-ксилоле, стекла со срезами перед окраской «проводят» по водным растворам изопропилового спирта убывающей концентрации - от 100% до 70%, с шагом в 10%, споласкивают в двух порциях дистиллированной воды, а затем выдерживают в двух порциях 100% этиленгликоля.
4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что для целей архивного хранения окрашенные Суданом черным «В» гистологические препараты помещают в 16%-ный водный раствор поливинилового спирта.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019124176A RU2705594C1 (ru) | 2019-07-25 | 2019-07-25 | Способ приготовления гистологических препаратов для выявления внутриклеточных липидных включений в тканях человека и животных |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019124176A RU2705594C1 (ru) | 2019-07-25 | 2019-07-25 | Способ приготовления гистологических препаратов для выявления внутриклеточных липидных включений в тканях человека и животных |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2705594C1 true RU2705594C1 (ru) | 2019-11-11 |
Family
ID=68579465
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2019124176A RU2705594C1 (ru) | 2019-07-25 | 2019-07-25 | Способ приготовления гистологических препаратов для выявления внутриклеточных липидных включений в тканях человека и животных |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2705594C1 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2722661C1 (ru) * | 2019-07-19 | 2020-06-02 | Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Дальневосточный федеральный университет" (ДВФУ) | Способ изготовления клеточного блока клеточного материала |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2420299C1 (ru) * | 2010-03-04 | 2011-06-10 | Федеральное государственное учреждение "Межотраслевой научно-технический комплекс "Микрохирургия глаза" имени академика С.Н. Федорова Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи" | Способ приготовления гистологических препаратов |
| RU2499242C2 (ru) * | 2011-08-29 | 2013-11-20 | Андрей Викторович Иванченко | Способ подготовки образцов биологических тканей к гистологическим исследованиям |
-
2019
- 2019-07-25 RU RU2019124176A patent/RU2705594C1/ru active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2420299C1 (ru) * | 2010-03-04 | 2011-06-10 | Федеральное государственное учреждение "Межотраслевой научно-технический комплекс "Микрохирургия глаза" имени академика С.Н. Федорова Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи" | Способ приготовления гистологических препаратов |
| RU2499242C2 (ru) * | 2011-08-29 | 2013-11-20 | Андрей Викторович Иванченко | Способ подготовки образцов биологических тканей к гистологическим исследованиям |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| CARRIEL V. et al. Tissue Fixation and Processing for the Histological Identification of Lipids // Methods in Molecular Biology, 2017, V.1560, pp.197-206. * |
| CHIFFELLE T.L. et al. PROPYLENE AND ETHYLENE GLYCOL AS SOLVENTS FOR SUDAN IV AND SUDAN BLACK B // Stain Technology, 1951, V.26, pp.51-56. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2722661C1 (ru) * | 2019-07-19 | 2020-06-02 | Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Дальневосточный федеральный университет" (ДВФУ) | Способ изготовления клеточного блока клеточного материала |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Aparicio et al. | A rapid methylene blue‐basic fuchsin stain for semi‐thin sections of peripheral nerve and other tissues | |
| Grimley et al. | Preparation of large epoxy sections for light microscopy as an adjunct to fine-structure studies | |
| CN103940658A (zh) | 一种组织细胞标本石蜡包埋的制作方法 | |
| CN103940648A (zh) | 鱼鳃组织石蜡切片的制备方法 | |
| CN105588943A (zh) | 一种胃癌患者外周血循环肿瘤细胞Her-2基因的检测方法 | |
| RU2705594C1 (ru) | Способ приготовления гистологических препаратов для выявления внутриклеточных липидных включений в тканях человека и животных | |
| WO2006047252A1 (en) | Enhanced cell preseravtive solution and methods for using same | |
| CN107144456B (zh) | 一种石蜡病理切片组织的水凝胶支撑和脂质清除处理方法 | |
| CN103257055A (zh) | 一种三角帆蚌外套膜组织切片的制备方法 | |
| JP3723204B1 (ja) | 難浸透性組織迅速固定液 | |
| RU2293324C2 (ru) | Способ получения биологической жидкости для морфологического исследования | |
| CN105548569A (zh) | 一种肾癌患者外周血vegf的检测方法 | |
| Woodruff et al. | Advantages of glycol methacrylate embedding systems for light microscopy | |
| Al-Refu | General methods in preparation of skin biopsies for haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry | |
| CN108168969A (zh) | 琼脂细胞蜡块及其制备方法 | |
| US3440317A (en) | Cell coloring process and composition for cytological examination | |
| CN110411813A (zh) | 一种细胞蜡块定型固定板及用其制作细胞蜡块的方法 | |
| RU2801049C1 (ru) | Способ установления возрастной принадлежности неизвестного человека при проведении судебно-медицинской экспертизы | |
| RU2798117C1 (ru) | Способ выявления тучных клеток на гистологических препаратах сердца человека | |
| RU2719163C1 (ru) | Способ демаскирования антигенов при проведении иммуноцитохимических реакций | |
| SU1264040A1 (ru) | Способ приготовлени гистологических препаратов дл микроскопических исследований | |
| Gray | Accurate localization in ultrathin sections by direct observation of the block face for trimming | |
| RU2709608C1 (ru) | Способ определения белка свертываемости крови у животных | |
| Ferguson et al. | A technique for identifying areas of interest human breast tissue before embedding for electron microscopy. | |
| RU2666256C2 (ru) | Способ одновременного выявления нейронов и астроцитов на гистологических препаратах нервной ткани |