RU2709608C1 - Способ определения белка свертываемости крови у животных - Google Patents
Способ определения белка свертываемости крови у животных Download PDFInfo
- Publication number
- RU2709608C1 RU2709608C1 RU2019107048A RU2019107048A RU2709608C1 RU 2709608 C1 RU2709608 C1 RU 2709608C1 RU 2019107048 A RU2019107048 A RU 2019107048A RU 2019107048 A RU2019107048 A RU 2019107048A RU 2709608 C1 RU2709608 C1 RU 2709608C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- minutes
- washed
- antibodies
- smear
- distilled water
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области медицины и представляет собой способ определения фактора Виллебранда, включающий использование иммуногистохимии, отличающийся тем, что мазки периферической крови от животных, фиксированные 96% спиртом, после 5-минутной промывки в дистиллированной воде переносят в 3%-ный водный раствор перекиси водорода на 10 мин при комнатной температуре, затем смывают дистиллированной водой и помещают в 0,01 М фосфатно-солевой буфер с рН 7,4 на 5-10 мин, наносят 5%-ный бычий сывороточный альбумина 10 мин, на одну из областей мазка наносят первичные поликлональные кроличьи антитела к фВ, а на вторую область мазка наносят фосфатно-солевой буфер, помещают предметные стекла с мазками во влажную камеру и ставят в термостат с температурой 27°С на 24 ч, затем смывают антитела, помещают стекла в сосуд со свежей порцией буфера на 5-10 мин, наносят вторичные кроличьи антитела, ставят в термостат с температурой 27°С на 35 мин, смывают антитела и наносят рабочий раствор 3,3-диаминобензидина, в течение 1-3 мин процесс контролируют, чтобы остановить реакцию до появления неспецифического фона, затем промывают препараты в 2-3 порциях дистиллированной воды по 3-5 мин в каждой, мазки докрашивают азур-эозином по Май-Грюнвальду или по Романовскому, после обезвоживания в спиртах восходящей крепости препараты просветляют в ксилоле и заключают в полистерол, фактор Виллебранда определяют по его преципитатам черно-коричневого цвета в виде мелкой зернистости и многочисленных агглютинированных тромбоцитов. Заявленное изобретение позволяет быстро и просто определить фактор Виллебранда в крови. 3 ил., 3 пр.
Description
Изобретение относится, к иммуногистохимическим исследованиям в медицине, и может быть использовано при изучении проблем ангиологии и «эндотелиальной дисфункции» сердечно-сосудистой системы позвоночных животныхи человека в норме и патологии.
Известно, что методы иммуногистохимии (ИГХ) занимают важное место среди методов морфологической диагностики. Их разработка и совершенствование важны как для научных работников, так и для практикующих специалистов здравоохранения. Исчерпывающая информация о применении некоторых современных методических приемов изложена в серии руководств, изданных в последние годы под редакцией профессора РАН Д.Э. Коржевского (2014).
Прототипом нашего изобретению можно считать работу группы американских авторов Lee Ann Sporn, Stephen l. Chavin, Victor J. Marder, Denisa D. Wagner. Название их статьи: «Biosyntesis of von Willebrand Protein by Human Megakaryocytes». Она опубликована в The American Society for Clinical Investigation. 1985. Vol. 76. P. l102-1106. В статье описывается клинический случай 39-летней женщины, у которой была диагностирована хроническая миелогенная лейкемия. В исследовании использовали изоляты тромбоцитов и культуру эндотелиальных клеток из пупочной вены, а также мазки крови из костного мозга пациентки. Для определения фВ использовали меченые флуорохромами антитела к данному белку а для визуализации иммунофлуоресцентный метод. В работе приведены иллюстративные материалы. На микрофотографиях представлены фВ+ специфически окрашенные форменные элементы крови больной: «микромегакариоциты», различных размеров тромбоциты и эндотелиальные клетки. К сожалению, в работе описывается только один случай с больной острой лейкимией. Следует отметить, что в морфологическом отношении в этой работе интенсивность ИГХ реакции недостаточно выражена во всех элементах, кроме ядер микромегариоцитов.
Техническим результатом является быстрота обработки, оценки и анализа полученных результатов (фактов) на световом микроскопе по сравнению с исследованиями, выполненными на клеточных культурах, с помощью электронной микроскопии или спектрофотометрии.
Технический результат достигается тем, что в качестве иммуногистохимического маркера применяют фактор Виллебранда (фВ), который путем аппликации капли раствора с антителами к данному белку наносят только на одну половину мазка периферической крови, оставляя вторую в качестве контроля, затем после окончания иммунной реакции мазок докрашивают азур-эозином, проводят классическую гистологическую обработку материала, накрывают препарат покровным стеклом и после этого с помощью микроскопа определяют по преципитатам маркера присутствие белка фВ среди форменных элементов крови животного. Способ обладает выраженной простотой по сравнению с аналогами, не требует дорогостоящего оборудования (как при использовании спектрофотометрии, электрофореза или конфокальной лазерной микроскопии).
Сущность способа поясняется фотографиями,
где на Фиг 1а - среди форменных элементов крови видны преципитаты белка фВ (черно-коричневого цвета) в виде мелкой зернистости и многочисленных агглютинированных тромбоцитов, б - отрицательный контроль. Докраска азур-эозином. Ув.: ×400
где на Фиг 2а - преципитаты белка фВ (черно-коричневого цвета) в виде мелкой зернистости и многочисленных агглютинированных тромбоцитов; б -отрицательный контроль. Ув.: ×100
где на Фиг 3а - преципитаты белка фВ (черно-коричневого цвета) в виде мелкой зернистости и многочисленных агглютинированных тромбоцитов; б - отрицательный контроль. Ув.: ×400 Осуществление способа проводили следующим образом:
1. Мазки периферической крови от животных, приготовленные на предметных стеклах и фиксированные 96% спиртом, после 5-минутной промывки в дистиллированной воде переносили в 3%-ный водный раствор перекиси водорода на 10 мин при комнатной температуре для блокирования эндогенной пероксидазы.
2. Смывали перекись водорода дистиллированной водой и стекла с мазками помещали в 0,01 М фосфатно-солевой буфер (ФСБ) с рН 7,4 на 5-10 мин.
3. Аккуратно промокнув фильтровальной бумагой стекло вокруг мазка (для образования сухого поля), обводили две области мазка гидрофобным фломастером DakoPen (Dako, Дания) и наносили необходимое количество (для покрытия мазков) блокировочного раствора 5%-го бычьего сывороточного альбумина (BSA, Sigma, США) на 10 мин при комнатной температуре.
4. Сливали излишек блокировочного раствора и на одну из областей мазка наносили необходимое количество первичных поликлональных кроличьих антител к фВ (1:250)(Dako, Дания). На вторую область мазка (которая служила отрицательным контролем) наносили ФСБ. Помещали предметные стекла во влажную камеру (например, в чашки Петри) и ставили в термостат с температурой 27°С на 24 ч.
5. Смывали антитела ФСБ и затем помещали стекла в сосуд со свежей порцией буфера на 5-10 мин.
6. Аккуратно промокнув фильтровальной бумагой стекло вокруг мазка, наносили необходимое количество реагента EnVision+/HRP-Anti-Rabbit (Dako, Дания) (вторичные антитела) и ставили в термостат с температурой 27°С на 35 мин. Смывали антитела ФСБ (5-10 мин).
7. Аккуратно промокнув фильтровальной бумагой стекло вокруг мазка, наносили необходимое количество рабочего раствора 3,3-диаминобензидина (DAB+, Dako, Дания). В течение 1-3 мин происходило образование окрашенного продукта гистохимической реакции (преципитатов). Этот процесс контролировали под микроскопом, чтобы остановить реакцию до появления неспецифического фона.
8. Смывали раствор хромогена и промывали препараты в 2-3 порциях дистиллированной воды по 3-5 мин в каждой.
Мазки докрашивали азур-эозином по Май-Грюнвальду или по Романовскому. После обезвоживания в спиртах восходящей крепости, препараты просветляли в ксилоле и заключали в полистерол.
В результате проведения реакции фВ+структуры окрашиваются в коричневый цвет.
Пример 1.
Из хвоста крысы брали каплю венозной крови, наносили ее на предметное стекло и изготавливали мазок. После фиксации мазка в 96% спирте (40 мин) проводили ИГХ реакцию. Для этого достаточное количество раствора с антителами к фактору Виллебранда наносили на одну половину мазка, оставляя вторую в качестве контроля. После окончания иммунной реакции мазок докрашивали азур-эозином, обезвоживали и заключали в полистерол под покровное стекло.
а - среди форменных элементов крови видны преципитаты белка фВ (черно-коричневого цвета) в виде мелкой зернистости и многочисленных агглютинированных тромбоцитов, б - отрицательный контроль. Ув.: ×400;
Пример 2.
Из вены собаки брали каплю венозной крови, наносили ее на предметное стекло и изготавливали мазок. После фиксации мазка в 96% спирте (40 мин) проводили ИГХ реакцию. Для этого достаточное количество раствора с антителами к фактору Виллебранда наносили на одну половину мазка, оставляя вторую в качестве контроля. После окончания иммунной реакции мазок обезвоживали и заключали в полистерол под покровное стекло.
2а - преципитаты белка фВ (черно-коричневого цвета) в виде мелкой зернистости и многочисленных агглютинированных тромбоцитов; б -отрицательный контроль. Ув.: ×100
Пример 3.
Из вены ягненка брали каплю крови, наносили ее на предметное стекло и изготавливали мазок. После фиксации мазка в 96% спирте (40 мин) проводили ИГХ реакцию. Для этого достаточное количество раствора с антителами к фактору Виллебранда наносили на одну половину мазка, оставляя вторую в качестве контроля. После окончания иммунной реакции мазок докрашивали азур-эозином, обезвоживали и заключали в полистерол под покровное стекло.
а - преципитаты белка фВ (черно-коричневого цвета) в виде мелкой зернистости и многочисленных агглютинированных тромбоцитов, б -отрицательный контроль. Ув.: ×400
Преимущества предлагаемого способа.
В отличие от представленного выше метода, наш метод имеет следующие преимущества:
1. позволяет проводить иммунную реакцию на фВ на мазке периферической крови, используя гистологическую технику приготовления препарат и изучать светооптически;
2. позволяет проводить одновременную сравнительную оценку на одном и том стекле иммуногистохимической реакции и гистологической окраски мазка классическим методом (азур-эозином), что позволяет изучать взаимоотношения белка свертываемости крови с форменными элементами крови;
3. позволяет одновременно на одном и том же стекле определять иммунопозитивную и иммунонегативную реакцию, которая служит отрицательным контролем;
4. способ обладает выраженной простотой по сравнению с аналогами, не требует дорогостоящего оборудования (как при использовании спектрофотометрии, электрофореза или конфокальной лазерной микроскопии);
5. способ позволяет получать результат достаточно быстро (по сравнению с исследованиями на электронном или конфокальном лазерном микроскопах). Достаточно обладать только световым микроскопом;
6. перечисленные преимущества указывают на то, что метод может быть использован для диагностики в клинике.
Claims (1)
- Способ определения фактора Виллебранда, включающий использование иммуногистохимии, отличающийся тем, что мазки периферической крови от животных, фиксированные 96% спиртом, после 5-минутной промывки в дистиллированной воде переносят в 3%-ный водный раствор перекиси водорода на 10 мин при комнатной температуре, затем смывают дистиллированной водой и помещают в 0,01 М фосфатно-солевой буфер с рН 7,4 на 5-10 мин, наносят 5%-ный бычий сывороточный альбумина 10 мин, на одну из областей мазка наносят первичные поликлональные кроличьи антитела к фВ, а на вторую область мазка наносят фосфатно-солевой буфер, помещают предметные стекла с мазками во влажную камеру и ставят в термостат с температурой 27°С на 24 ч, затем смывают антитела, помещают стекла в сосуд со свежей порцией буфера на 5-10 мин, наносят вторичные кроличьи антитела, ставят в термостат с температурой 27°С на 35 мин, смывают антитела и наносят рабочий раствор 3,3-диаминобензидина, в течение 1-3 мин процесс контролируют, чтобы остановить реакцию до появления неспецифического фона, затем промывают препараты в 2-3 порциях дистиллированной воды по 3-5 мин в каждой, мазки докрашивают азур-эозином по Май-Грюнвальду или по Романовскому, после обезвоживания в спиртах восходящей крепости препараты просветляют в ксилоле и заключают в полистерол, фактор Виллебранда определяют по его преципитатам черно-коричневого цвета в виде мелкой зернистости и многочисленных агглютинированных тромбоцитов.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019107048A RU2709608C1 (ru) | 2019-03-12 | 2019-03-12 | Способ определения белка свертываемости крови у животных |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019107048A RU2709608C1 (ru) | 2019-03-12 | 2019-03-12 | Способ определения белка свертываемости крови у животных |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2709608C1 true RU2709608C1 (ru) | 2019-12-19 |
Family
ID=69007027
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2019107048A RU2709608C1 (ru) | 2019-03-12 | 2019-03-12 | Способ определения белка свертываемости крови у животных |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2709608C1 (ru) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2271010C2 (ru) * | 2004-03-31 | 2006-02-27 | Общество с ограниченной ответственностью "Фирма МонА" | Способ иммуноферментного анализа для определения фактора виллебранда, моноклональное антитело к фактору виллебранда (варианты) и штамм гибридных культивируемых клеток животных mus. musculus l. - продуцент моноклональных антител к фактору виллебранда (варианты) |
-
2019
- 2019-03-12 RU RU2019107048A patent/RU2709608C1/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2271010C2 (ru) * | 2004-03-31 | 2006-02-27 | Общество с ограниченной ответственностью "Фирма МонА" | Способ иммуноферментного анализа для определения фактора виллебранда, моноклональное антитело к фактору виллебранда (варианты) и штамм гибридных культивируемых клеток животных mus. musculus l. - продуцент моноклональных антител к фактору виллебранда (варианты) |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| LEE ANN SPORN ET AL. Stephen l. Chavin, Victor J. Marder, Denisa D. Wagner. "Biosyntesis of von Willebrand Protein by Human Megakaryocytes"// The American Society for Clinical Investigation. 1985. Vol. 76. P. l102-1106. * |
| АЛЕКСЕЕВА Л.А. И ДР. Значение гематологических показателей при острых респираторных вирусных инфекциях у детей// Журнал инфектологии. 2013, т.5, N3, с.44. * |
| АЛЕКСЕЕВА Л.А. И ДР. Значение гематологических показателей при острых респираторных вирусных инфекциях у детей// Журнал инфектологии. 2013, т.5, N3, с.44. LEE ANN SPORN ET AL. Stephen l. Chavin, Victor J. Marder, Denisa D. Wagner. "Biosyntesis of von Willebrand Protein by Human Megakaryocytes"// The American Society for Clinical Investigation. 1985. Vol. 76. P. l102-1106. * |
| ЧУМАСОВ И ДР. Структурно-функциональная характеристика эндотелиальных клеток сосудов сердца новорожденной крысы (иммуногистохимическое исследование)// Регионарное кровообращение и микроциркуляция, 2018, 17(2), Статья принята к печати 28.02.2018, с.78-82. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Frank et al. | Aortic smooth muscle cells contain vimentin instead of desmin. | |
| Fujiwara et al. | Simultaneous localization of myosin and tubulin in human tissue culture cells by double antibody staining | |
| Cymerman et al. | Human T lymphocyte subpopulations in chronic periapical lesions | |
| McQueen et al. | Rabies Diagnosis by Fluorescent Antibody. I—Its Evaluation in a Public Health Laboratory | |
| Nickolls et al. | A study of modern methods of grouping dried blood stains | |
| CN106980018B (zh) | 一种应用cd45免疫荧光联合cep17探针鉴定循环肿瘤细胞的试剂盒及其应用 | |
| Abed et al. | Immunofluorescence labelling of human and murine neutrophil extracellular traps in paraffin-embedded tissue | |
| CN106970225B (zh) | 一种应用cd45免疫荧光联合cep 8探针鉴定循环肿瘤细胞的试剂盒及其应用 | |
| CN106771185A (zh) | 一种鼻咽癌循环肿瘤细胞检测试剂盒 | |
| DK164306B (da) | Fremgangsmaade til fremstilling af immunocytokemiske objektglas og kontrol-objektglas fremstillet ved denne fremgangsmaade | |
| CN106970224A (zh) | 一种应用cd45免疫荧光联合cep探针鉴定循环肿瘤细胞的试剂盒及其应用 | |
| RU2709608C1 (ru) | Способ определения белка свертываемости крови у животных | |
| SE450665B (sv) | Nukleolera antigener fran cancerceller, framstellning av motsvarande antikroppar och reagenslosning innehallande merkta antikroppar | |
| Robinson | Immunofluorescent and immunoperoxidase staining of antibodies to fibrous keratin: improved sensitivity for detecting epidermal cancer cells | |
| Yunis et al. | Cell Antigens and Cell Specialization: I. A Study of Blood Group Antigens on Normoblasts | |
| Fritsch et al. | XC Protein Components of Human Perilymph: I. Preliminary Study | |
| WO2005035736A1 (ja) | 粘液除去方法並びにこれに用いる細胞処理液及び保存液 | |
| D'ANDREA‐WINSLOW et al. | Sea urchin coelomocyte arylsulfatase: A modulator of the echinoderm clotting pathway | |
| Seshi | Cell blotting: techniques for staining and microscopical examination of cells blotted on nitrocellulose paper | |
| RU2705811C1 (ru) | Способ выявления эндотелиальных клеток на гистологических препаратах | |
| Hudson | Keratins as markers of epithelial cells | |
| CN105699657A (zh) | 一种肾癌患者外周血Vimentin检测方法 | |
| CN102174465A (zh) | 一种从组织中分离富集靶细胞的方法 | |
| Shindel et al. | An indirect fluorescent antibody test for the detection of Cytauxzoon-like organisms in experimentally infected cats. | |
| CN111579769A (zh) | 一种对组织样本进行免疫标记的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20210313 |