KR20130136345A - 검체 시료의 응집용 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 검체 시료의 관찰을 위한 파라핀 블록을 제작함에 있어서 사용되는 검체 시료의 응집용 조성물, 이를 이용한 파라핀 블록의 제작방법 및 상기 파라핀 블록을 이용한 검체 시료의 현미경 관찰방법에 관한 것으로서, 더욱 구체적으로는, 폴리비닐알코올, 카르복시메틸 셀롤로오스, 디메틸 술폭시드 및 증류수를 포함하는 제1 조성물; 및 아세톤, 농축 포르말린 및 시아노아크릴레이트를 포함하는 제2 조성물을 포함하는 검체 시료의 응집용 조성물, 이를 이용한 파라핀 블록 제작방법 및 제작된 파라핀 블록을 이용한 검체 시료의 현미경 관찰방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 미량의 유동성 검체인 조직이나 세포를 이용하여 파라핀 블록을 제작함에 있어서, 검체복합체의 제작과정이 원심분리기를 이용한 원심분리 튜브안에서 이루어지므로 검체의 손실이나 소실을 최소화할 수 있으며, 배경염색을 감소시키고, 파라핀 블록 제작 과정을 용이하게 수행할 수 있으며, 파라핀 블록 제작에 소요되는 시간 및 비용을 절약할 수 있고, 파라핀 블록으로부터 박절된 슬라이드의 질을 개선할 수 있다.
본 발명에 따르면, 미량의 유동성 검체인 조직이나 세포를 이용하여 파라핀 블록을 제작함에 있어서, 검체복합체의 제작과정이 원심분리기를 이용한 원심분리 튜브안에서 이루어지므로 검체의 손실이나 소실을 최소화할 수 있으며, 배경염색을 감소시키고, 파라핀 블록 제작 과정을 용이하게 수행할 수 있으며, 파라핀 블록 제작에 소요되는 시간 및 비용을 절약할 수 있고, 파라핀 블록으로부터 박절된 슬라이드의 질을 개선할 수 있다.
Description
본 발명은 검체 시료의 현미경 관찰을 위한 파라핀 블록을 제작함에 있어서 사용되는 검체 시료의 응집용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 폴리비닐알코올을 유효성분으로 함유하는 검체 시료의 응집용 조성물, 이를 이용한 파라핀 블록의 제작방법 및 상기 파라핀 블록을 이용한 검체 시료의 현미경 관찰방법에 관한 것이다.
조직 검사는 진단 의학 분야에 있어서 매우 중요한 위치를 차지할 뿐 아니라 임상에서 이루어지는 질병진단의 최종적인 결정을 내리는 중요한 역할을 한다. 병리조직검사는 앓고 있는 인체조직을 떼어내어 현미경 관찰을 통해 암 등의 질병의 질환명을 결정 받는 검사이다. 조직 검사는 다른 임상병리학적 방법과는 달리 조직의 형태학적 변화를 관찰하여 판단하는데 기초를 두고 있다. 오늘날에는 객관적인 데이터를 원하는 경향에 따라, 이러한 자료를 얻기 위한 많은 노력이 경주되고 있으며, 이를 위해서, 다양한 특수한 방법들이 이용되고 있다.
특히, 근래에는 객관적 진단의 정확성을 높이기 위해 면역조직화학 (immunohistochemistry), 특수 염색, 분자 병리 검사 방법들이 대거 등장하고 있다. 질병의 정확한 진단과 적절한 치료에 대한 연구를 위해서는 병소에서 채취한 검체의 형태학적 소견을 관찰하는 것이 중요하다. 이러한 형태학적 변화를 관찰하기 위하여 연구자들은 기본적으로 헤마톡시린-에오진 염색표본을 이용하고 있다. 그러나, 각종 질환은 점차 세분화되고, 새로운 진단기술이 소개되고 있으며, 종양의 진단에 도움을 주는 종양표시자, 예후를 판정할 수 있는 예후인자들이 알려지고 있어서 통상적인 헤마톡시린-에오진 염색표본으로는 종합적인 정보를 얻기가 어렵다. 이러한 문제점들을 보완해주는 검사방법이 면역조직화학 염색법이다. 미분화세포의 기원을 확인해 주거나, 효소, 호르몬, 종양표시자 및 예후인자의 존재 유무, 암종과 육종의 구별 및 양성종양과 악성종양의 감별 전이암의 원발병소를 추정하는데 효율적으로 이용되고 있다. 면역조직화학 염색은 민감성과 특이성이 매우 높은 검사법으로 최근 20-30년 사이 진단병리학과 형태학적 연구 등에 필수적인 검사법으로 이용되고 있다.
진단세포학 (diagnostic cytology)이란 세포 소견을 기초로 형태학적 측면에서 병변의 유무나 내용을 판정하는 병리학의 한 분야로서, 여러 임상적인 처치에 의하여 인체의 다양한 부위로부터 자연적으로 탈락된 세포 또는 기구를 이용하여 조직 표면이나 내부로부터 떼어낸 세포를 현미경으로 해석하는 임상 검사의학을 말한다. 진단세포학에는 i) 정상적 또는 병적인 원인에 의해서 자연탈락된 세포들을 소정 방법에 의해서 슬라이드 위에 도말시키고 고정염색시킨 다음 검경하는 자연탈락 진단세포학; ⅱ) 세침을 부착한 주사기를 사용하여 병소에 찔러서 흡입한 다음 세포를 강제적 채취하고 슬라이드에 도말시켜 고정염색 후 검경하는 세포흡입생검 진단세포학; ⅲ) 수술 중이나 수술 후에 진단 결과를 신속히 알기 위해서 육안으로 보여지는 병소에 슬라이드를 직접 밀착접촉시켜 도말한 후 고정염색하여 검경하는 직접 밀착도말 진단세포학; ⅳ) 대상 세포를 채취하여 유리 슬라이드 위에 얇게 도말한 후 현미경으로 관찰하는 세포 도말검사; ⅴ) 액체성 검사물로부터 얻은 세포성 침전물에 파라핀 등을 침투시킨 후 절편을 제작하여 검경하는 세포군집 절편법; 및 ⅵ) 객담 검사 등의 방법이 존재한다. 상기 다양한 세포 진단 방법들 중에서도 세포군집 절편법은 타 방법들에 비해서 우수한 장점들 보유하는데, 필요시 기타 세포 생성물, 세균 및 진균 등을 동정하기 위한 특수 염색이 가능하며, 유동성 검체의 직접 제작이 가능하고, 다른 방법들에서 관찰되지 못하는 가치 있는 진단적 증거가 관찰될 수 있다는 점에서 현저한 진단적 가치를 보유한다.
세포군집 절편법을 적용함에 있어서, 액체성 검사물은 신체의 여러 부위로부터 채취되는데, 호흡기도, 위장관계, 비뇨기계로부터의 유출액 등은 고정액에 고정하여 세포 군집 표본 (cell block)을 만든 다음, 파라핀 절편으로 제작된다. 종래 세포 군집 표본을 만들기 위한 방법으로서, ⅰ) 원심분리 및 포르말린을 이용한 침전 방법을 사용하는 침전물 고정법; ⅱ) 에탄올 속에서 에그 알부민이 응고되는 원리를 이용하는 에그 알부민 사용법; ⅲ) 아가(agar) 사용법; ⅳ) 혈장-트롬빈 응고법; ⅴ) 콜로디온 백 (collodion bag) 사용법; 및 ⅵ) 밀포어 필터 (Millpore filter) 방법 등이 사용되어 왔다. 그러나, 이러한 종래의 방법들은 배경 염색으로 인한 슬라이드 판독의 어려움, 한천 젤을 이용할 때 발생되는 검체 지지 한천의 수축, 파라핀 블록 제작시 소요되는 시간 및 고비용의 문제점 등으로 아직까지 만족할 만한 성과를 얻지 못하고 있는 실정이다.
한편, 파라핀 블록 제작 방법은 조직이나 세포의 형태를 파악하고 이를 기초로 특수염색, 면역조직화학 염색 등 질병의 진단, 치료 및 연구목적에 이용되고 있지만, 세포의 양이 적거나 검체가 작을 경우 지금까지는 파라핀 블록 제작이 어렵거나 불가능하였다. 또한, 조직이나 세포 부유액을 원심분리 방법을 통해 파라핀 블록 제작을 할 경우, 형태나 모양 등이 작거나 적어서 조직이나 세포가 산재되거나, 파라핀 침투 후에 파라핀과의 구분이 어렵고 포매 시 핀셋으로 포매하기가 불가능하다는 문제점들이 있었다.
관련하여, 대한민국 공개특허공보 제2009-97068호는 조직공학용 지지체의 조직 검사를 위한 포매용 레진의 새로운 조성 및 그에 따른 슬라이드 제작방법을 개시하고 있으며, 구체적으로는, 파라핀과 비닐아세테이트가 1-80% 포함된 에틸렌비닐아세테이트 공중합체를 40-100 ℃에서 2-50% 용융 혼합시킨 후 용융액에 검체를 가하여 파라핀과 에틸렌계 공중합체 혼합용액을 침투시키는 것을 포함하는 것을 개시하고 있다.
또한, 일본국 공개특허공보 제2007-046988호는 생물조직 표본용 포매 블록의 제작방법 및 포매 블록용 정보 표시 라벨을, 대한민국 공개특허공보 제2005-46826호는 엘시엠을 이용한 조직 특이적 고정액 파라핀 블록에서의 온전한 알엔에이 추출방법을, 국제 공개특허공보 WO 08/038813호는 파라핀 잠적된 표본으로부터 탈파라핀 공정을 수행하고 이를 분석하는 방법을 개시하고 있다.
따라서, 본 발명은 상기 종래기술의 문제점을 해결하여, 미량의 유동성 검체 조직 또는 세포를 이용하여 파라핀 블록을 제작함에 있어서, 검체 복합체 제작이 원심분리기 튜브안에서 이루어지므로 검체의 소실이나 손실을 최소화할 수 있으며, 배경염색을 감소시키고, 파라핀 블록 제작 과정이 매우 단순하며, 파라핀 블록 제작에 소요되는 시간 및 비용을 절약할 수 있고, 파라핀 블록으로부터 박절된 슬라이드의 질을 개선할 수 있는 검체 시료의 응집용 조성물, 이를 이용한 파라핀 블록의 제작방법 및 상기 파라핀 블록을 이용한 검체 시료의 현미경 관찰방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 상기 첫 번째 과제를 해결하기 위해서,
폴리비닐알코올(polyvinyl alcohol), 카르복시메틸 셀룰로오스(carboxymethyl cellulose), 디메틸 설폭시드(dimethyl sulfoxide) 및 증류수를 포함하는 제1 조성물; 및 아세톤, 농축 포르말린 및 시아노아크릴레이트를 포함하는 제2 조성물;을 포함하는 검체 시료의 응집용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 제1 조성물은 증류수 100 중량부에 대해서 폴리비닐알코올 1.5 내지 2.0 중량부를 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에 따르면, 상기 제1 조성물은 응집 대상이 되는 검체 100 중량부에 대해서 300 내지 500 중량부의 함량으로 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 상기 제2 조성물은 아세톤 100 mL에 대해서 95-96 %(부피/부피) 농도의 시아노아크릴레이트 100 ㎕ 내지 200 ㎕를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 상기 제2 조성물은 응집 대상이 되는 검체 100 중량부에 대해서 300 내지 500 중량부의 함량으로 사용될 수 있다.
본 발명은 상기 두 번째 과제를 달성하기 위해서,
고정된 검체를 원심분리시킨 후 상층액을 제거하고 검체 침전물을 수득하는 단계;
상기 침전물에 폴리비닐알코올(polyvinyl alcohol), 카르복시메틸 셀룰로오스(carboxymethyl cellulose), 디메틸 설폭시드(dimethyl sulfoxide) 및 증류수를 포함하는 제1 조성물을 가하여 제1 검체용액을 제작하는 단계;
상기 제1 검체용액에 아세톤, 농축 포르말린 및 시아노아크릴레이트를를 포함하는 제2 조성물을 가하여 제2 검체용액을 제작하는 단계;
상기 제2 검체용액을 원심분리시킨 후 상층액을 제거하고 응집 검체 침전물을 수득하는 단계; 및
상기 응집 검체 침전물에 대해서 자동침투과정을 수행함으로써 파라핀 블록을 제작하는 단계;를 포함하는 검체 시료의 파라핀 블록 제작방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 검체의 고정은 포르말린 또는 알코올을 사용하여 수행될 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에 따르면, 상기 제1 조성물은 증류수 100 중량부에 대해서 폴리비닐알코올 1.5 내지 2.0 중량부를 포함하며, 상기 제2 조성물은 아세톤 100 mL에 대해서 95-96 %(부피/부피) 농도의 시아노아크릴레이트 100 ㎕ 내지 200 ㎕를 포함하고, 상기 제1 조성물 또는 상기 제2 조성물은 상기 검체 100 중량부에 대해서 300 내지 500 중량부의 함량으로 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 상기 제2 조성물의 첨가 이후에 검체 응집이 관찰되면 상기 제2 검체용액을 교반할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 상기 자동침투과정은 상기 응집 검체 침전물을 종이에 싸서 알코올, 자일렌 및 파라핀의 순으로 처리함으로써 수행될 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 상기 알코올 처리, 자일렌 처리 및 파라핀 처리는 각각 복수 회 수행될 수 있다.
본 발명은 상기 세 번째 과제를 달성하기 위해서,
상기 파라핀 블록을 박절하는 단계; 및
상기 박절된 파라핀 블록을 염색하고 현미경 관찰하는 단계;를 포함하는 검체 시료의 현미경 관찰방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 미량의 유동성 검체 조직을 이용하여 파라핀 블록을 제작함에 있어서, 검체복합체의 제작과정이 원심분리 튜브 안에서 이루어지므로 검체의 손실이나 소실을 최소화할 수 있으며, 파라핀 블록 제작 과정을 용이하게 수행할 수 있으며, 파라핀 블록 제작에 소요되는 시간 및 비용을 절약할 수 있고, 파라핀 블록으로부터 폴리비닐알코올(PVA)의 물리적, 화학적특성으로 박절된 슬라이드를 이용한 염색시 배경염색을 감소시키고 질을 개선할 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 파라핀 블록 제작방법에 대한 개략적인 공정도이다.
도 2는 본 발명에 따라서 폐암 환자의 세포 샘플에서 제작된 파라핀 절편에 대해서 현미경을 사용하여 각각 100 배 배율 및 400 배 배율로 관찰한 사진들이다.
도 3은 본 발명에 따라서 전혈(whole blood)의 버피 코트(buffy coat)로부터 제작된 파라핀 절편 및 쥐의 난자 샘플에 대해서 H&E 염색 및 알시안 블루(alcian blue) 염색을 수행한 다음, 현미경을 사용하여 각각 200 배 배율 또는 100 배 배율 또는 40 배 배율로 관찰한 사진들이다.
도 2는 본 발명에 따라서 폐암 환자의 세포 샘플에서 제작된 파라핀 절편에 대해서 현미경을 사용하여 각각 100 배 배율 및 400 배 배율로 관찰한 사진들이다.
도 3은 본 발명에 따라서 전혈(whole blood)의 버피 코트(buffy coat)로부터 제작된 파라핀 절편 및 쥐의 난자 샘플에 대해서 H&E 염색 및 알시안 블루(alcian blue) 염색을 수행한 다음, 현미경을 사용하여 각각 200 배 배율 또는 100 배 배율 또는 40 배 배율로 관찰한 사진들이다.
이하, 도면 및 실시예를 참조하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다.
본 발명은 검체 시료의 응집용 조성물, 이를 이용한 파라핀 블록의 제작방법 및 상기 파라핀 블록을 이용한 검체 시료의 현미경 관찰방법을 제공하며, 본 발명에 따른 검체 시료의 응집용 조성물은 제1 조성물 및 제2 조성물을 포함하고, 상기 제1 조성물은 폴리비닐알코올(PVA), 카르복시메틸 셀룰로오스(CMC), 디메틸 설폭시드(DMSO) 및 증류수를 포함한다.
폴리비닐알코올 (polyvinylalcohol, PVA)은 물에 녹는 특이한 고분자 물질로, 1924년 독일의 W.O. Herrman 박사에 의해 발명된 이래로 직물 가공제, 접착제, 유화 안정제 등의 용도로 점차 개발되어 널리 쓰이고 있다. 수용성 고분자 화합물인 PVA는 종래의 천연 반합성의 수용성 고분자보다 뛰어난 성질을 많이 가지고 있다. PVA는 분자변수의 조절을 통하여 고강력 섬유에서 의료용 재료까지 매우 광범위하게 응용될 수 있고, 저가의 혼성배열을 갖는 저분자량 PVA부터 고가의 입체 규칙성을 지니는 고분자량 PVA에 이르기까지 매우 다양한 형태로 활용될 수 있기 때문에 매우 광범위하게 활용되고 있는 매력적인 고분자라 할 수 있다. 특히, PVA는 알코올, 자일렌, 아세톤 등 유기용제에는 잘 녹지 않고 물에 잘 녹는 특성을 갖는데, 이는 PVA가 분자 구조에 친수성기인 -OH기를 갖기 때문이다.
본 발명에서는 이러한 폴리비닐알코올의 화학적 특성들을 검체 시료의 포매용 조성물에 응용하고자 하였다. 즉, PVA는 알코올, 자일렌, 또는 파라핀 등과 같은 유기 용매에는 용해되지 않고 물에는 용해되는 특성을 갖기 때문에 증류수에 PVA가 용해된 PVA 용액을 아세톤과 함께 검체 응집용으로 사용하게 되면 응집 시에 검체와 PVA가 복합체를 형성하고 이것을 원심분리시 침전되면서 더욱 단단해진다. 이러한 검체 복합체는 추후 염색 과정 시에는 PVA가 갖는 물리적 특성 때문에 흐르는 물에서 복합체 중의 PVA는 물과 반응하여 제거되고 유리 슬라이드 위에 관찰대상인 검체만 단독으로 남게 되므로 이를 이용한 염색시 염색에 아무런 지장을 주지 않게 되는 것이다.
또한 본 발명의 카르복시메틸 셀룰로오스(CMC)는 셀룰로오스(cellulose)를 구성하고 있는 글루코오스 잔기의 C6 위의 히드록시기(cellulose-OH)를 카르복시메틸기(-CH2COOH) 로 치환한 것으로, 상기 히드록시기의 40% 이상을 카르복시메틸기로 치환한 것은 물에 녹아 안정된 젤을 만든다. 이러한 카르복시메틸 세룰로오스는 식품점조제 또는 안정제로서, 단백질의 분리 및 정제 등 연구용에 이용되고 있다. 이러한 카르복시메틸 셀룰로오스는 폴리비닐알코올이 생체 시료와 복합체를 형성할 때 이를 보조하는 역할을 수행한다.
또한 본 발명의 디메틸 설폭시드(DMSO)는 비프로톤성 극성 용매로서 일반적으로 유기반응의 연구와 유기합성에 사용되며, 본 발명에서는 생체 시료와 폴리비닐알코올이 복합체를 형성할 때 양자의 결합을 강화하여 생체 시료와 폴리비닐알코올이 쉽게 분리되지 않도록 한다.
상기 제1 조성물의 각 성분별 함량비는 증류수 100 중량부에 대해서 폴리비닐알코올 1.5 내지 2 중량부가 포함될 수 있는데, 폴리비닐알코올의 함량이 상기 범위를 초과하는 경우에는 검체의 편재된 응집이 발생한다는 문제점이 있고, 상기 범위 미만인 경우에는 검체 응집력이 약화될 수 있다는 문제점이 있다.
또한, 상기 제1 조성물은 응집 대상이 되는 검체 100 중량부에 대해서 300 내지 500 중량부의 함량으로 사용될 수 있는데, 상기 제1 조성물을 상기 함량을 초과하여 사용하는 경우에는 과응집으로 인한 검체의 미미한 붕괴 가능성의 문제점이 있고, 상기 범위 미만으로 사용하는 경우에는 검체 응집력이 약화되거나 검체 응집이 지연된다는 문제점이 있어서 바람직하지 않다.
한편, 본 발명은 검체 시료의 응집용 조성물은 상기 제1 조성물 이외에도, 제2 조성물을 포함하며, 상기 제2 조성물은 아세톤, 농축 포르말린 및 시아노아크릴레이트를 포함한다.
PVA는 전술한 바와 같이 물에는 잘 녹지만, 알코올, 자일렌 등의 유기 용매에는 잘 녹지 않고 저장 중에 변질되지 않는 특징을 가지고 있다. 특히, PVA는 아세톤을 첨가한 후 흔들어주면 백색 앙금을 형성하며 응집되는 성향이 있는데, 본 발명에서는 이러한 아세톤, PVA 및 시아노아크릴레이트의 화학적 특성을 응용하여, 상기 제1 조성물을 사용하여 형성된 검체 복합체에 아세톤을 포함하는 제2 조성물을 가해주어 상기 검체 복합체를 응집시킴으로써 응집 검체 침전물을 형성하고자 하였다. 상기 응집 검체 침전물은 추후 원심분리 과정 등을 통하여 단단한 펠렛으로 형태화되며, 이러한 펠렛에 대해서 추후 과정을 거침으로써 파라핀 블록을 제작할 수 있게 된다.
또한, 상기 제2 조성물의 농축 포르말린은 아세톤에 의해 PVA가 검체와 검체 복합체를 형성한 후 응집될 때 이러한 응집 반응을 보다 용이하게 도와준다. 따라서 상기 농축 포르말린에 의해 응집 검체 침전물이 보다 많이 형성된다.
또한, 의료용 점착 또는 접착제로 알려진 시아노아크릴레이트는 의료용구의 포장으로부터 외과용 점착 또는 접착 및 지혈 등에 이르기까지 광범위한 분야에 사용되며, 생체 적합성, 생분해성 및 멸균성 등의 특성을 갖는다. 특히, 시아노아크릴레이트는 물 또는 약염기와 접촉시 순식간에 중합체를 형성하여 고형화되는 특성을 갖는데, 본 발명에서는 이러한 시아노아크릴레이트의 화학적 특성을 응용하여, 상기 제1 조성물을 사용하여 형성된 검체 복합체의 응집을 더욱 용이하게 하고자 하였다.
상기 제2 조성물은 아세톤 100 mL에 대해서 95-96 %(부피/부피) 농도의 시아노아크릴레이트 100 ㎕ 내지 200 ㎕를 포함할 수 있는데, 시아노아크릴레이트의 함량이 상기 범위를 초과하는 경우에는 파라핀 블록제작 후 염색시 물에 의한 수세 과정에서 결정체가 유리 슬라이드에 미미하게 잔존할 수 있는 가능성이 있기 때문에 문제가 되고, 상기 범위 미만인 경우에는 검체 복합체 형성시 결합력이 약해지는 문제점이 있다.
또한, 상기 제2 조성물은 응집 대상이 되는 검체 100 중량부에 대해서 300 내지 500 중량부의 함량으로 사용될 수 있는데, 상기 응집용 조성물을 상기 함량을 초과하여 사용하는 경우에는 검체량에 비해서 검체응집 복합체가 커질 가능성이 있기 때문에 문제가 되고, 상기 범위 미만으로 사용하는 경우에는 검체를 지지하는 응집체의 부족 가능성이 문제가 된다.
한편, 본 발명은 상기 응집용 조성물을 이용한 검체 시료의 파라핀 블록 제작방법을 제공하는데, 본 발명에 따른 방법은,
고정된 검체를 원심분리시킨 후 상층액을 제거하고 검체 침전물을 수득하는 단계; 상기 침전물에 폴리비닐알코올, 카르복시메틸 셀룰로오스, 디메틸 설폭시드 및 증류수를 포함하는 제1 조성물을 가하여 제1 검체용액을 제작하는 단계; 상기 제1 검체용액에 아세톤, 농축 포르말린 및 시아노아크릴레이트를 포함하는 제2 조성물을 가하여 제2 검체용액을 제작하는 단계; 상기 제2 검체용액을 원심분리시킨 후 상층액을 제거하고 응집 검체 침전물을 수득하는 단계; 및 상기 응집 검체 침전물에 대해서 자동침투과정을 수행함으로써 파라핀 블록을 제작하는 단계;를 포함한다.
도 1에는 본 발명에 따른 파라핀 블록 제작방법에 대한 개략적인 공정도를 도시하였다. 도 1을 참조하면, 세포 또는 그 외 검체 시료는 고정액을 사용하여 고정된다 (단계 1). 이러한 검체 시료의 고정 단계는 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법, 예를 들어 포르말린 또는 알코올 등을 사용하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
다음으로, 소량이거나 작은 크기를 갖는 고정된 검체는 원심분리 과정을 거쳐서 상층액 및 검체 침전물로 분리되며, 분리 이후에는 상층액을 제거하고 검체 침전물을 수득하게 된다 (단계 2). 특히, 상층액 제거 과정 중에는 침전된 검체가 소실되지 않도록 조심스럽게 상층액을 따라 내는 것이 바람직하다.
이어서, 상층액을 따라 내고 얻어진 침전물에 본 발명에 따른 응집용 조성물 중 제1 조성물을 가해주게 되는데 (단계 3), 상기 제1 조성물은 전술한 바와 같이 폴리비닐알코올, 카르복시메틸 셀룰로오스, 디메틸 설폭시드 및 증류수를 포함하며, 증류수 100 중량부에 대해서 폴리비닐알코올 1.5 내지 2.0 중량부를 포함할 수 있고, 사용되는 제1 조성물의 양은 응집 대상이 되는 검체 100 중량부에 대해서 300 내지 500 중량부일 수 있다. 특히, 첨가해주는 제1 조성물의 양은 추후 파라핀 블록 제작시 블록 크기를 고려하여, 검체량이 많을 때에는 작은 양을 사용하여도 무방하지만, 검체량이 작을 때에는 많은 양을 사용하는 것이 바람직하다.
상기와 같이 검체 침전물에 제1 조성물을 가해줌으로써 얻어진 용액 (설명의 편의를 위하여 본 명세서에서는 "제1 검체용액"이라 한다)에 대해서, 다음 단계로 본 발명에 따른 제2 조성물을 비교적 빠르게 가해주는 단계를 수행하게 되는데 (단계 4), 상기 제2 조성물은 전술한 바와 같이 아세톤, 농축 포르말린 및 시아노아크릴레이트를 포함하며, 아세톤 100 mL에 대해서 95-96 %(부피/부피) 농도의 시아노아크릴레이트 100 ㎕ 내지 200 ㎕를 포함하는 것이 바람직하고, 응집 대상이 되는 검체 100 중량부에 대해서 300 내지 500 중량부의 함량으로 사용될 수 있다. 이러한 과정에 의해서, 상기 제2 조성물의 첨가에 의해서 얻어진 용액 (설명의 편의를 위하여 본 명세서에서는 "제2 검체용액"이라 한다) 중에서 검체가 응집되어 침전물을 형성하게 된다.
바람직하게는, 상기 응집용 조성물의 첨가 이후에 검체 응집이 관찰되면 상기 검체 응집용액을 가볍게 두드려주는 (tapping) 방식에 의해서 교반함으로써, 제1 검체용액과 제2 조성물의 혼합을 용이하게 하고 결과적으로 응집 형성을 더욱 촉진해줄 수도 있다.
다음 단계로, 상기 제2 검체용액에 대해서 원심분리를 수행하면 침전물이 용기 하층부로 더욱 응집되며 (단계 5), 마지막으로 용액 중 상층액을 제거하고 응집 검체 침전물을 수득하고, 얻어진 응집 검체 침전물에 대해서 자동침투과정을 수행 (단계 6)하게 되면 본 발명에 따른 파라핀 블록을 제작할 수 있다. 자동침투과정은 응집 검체 침전물을 종이에 싸서 알코올, 자일렌 및 파라핀의 순으로 처리함으로써 수행할 수 있다. 상기 자동침투과정이 필요한 기본적 이유는 다음과 같다. 즉, 현미경 관찰 대상이 되는 조직 또는 세포를 얇게 박절하기 위해서는 먼저 파라핀 침투가 가능하도록 고정액에 고정된 검체로부터 알코올을 이용하여 조직이나 세포의 물을 제거하여야 한다 (알코올 처리단계). 다음으로, 처리된 알코올에 의해서 검체 내의 수분은 제거된다 하더라도 알코올과 파라핀이 서로 섞이지 않기 때문에 자일렌을 이용하여 알코올을 제거하여야 한다 (자일렌 처리단계). 마지막으로, 검체시료의 현미경 관찰을 위해서는 검체시료를 얇게 박절하는 과정이 수행되어야 하기 때문에, 박절 과정의 수행을 위해서 검체시료 중의 알코올 제거 및 파라핀 침투 과정을 수행하게 된다 (파라핀 처리단계). 이때, 검체의 양이나 크기에 따라서, 알코올 처리단계는 여러 단계로 나누어 수행될 수 있는데, 예를 들어 먼저 저농도 알코올을 처리하고 (복수 회 가능) 이어서 고농도 알코올을 처리하는 (복수 회 가능) 방식으로 수행될 수도 있다. 이러한 복수 회에 걸친 처리는 자일렌 처리단계 및 파라핀 처리단계의 경우에도 동일하게 적용될 수 있다.
또한, 본 발명은 전술한 방법에 의해서 제작된 파라핀 블록을 사용하여 검체 시료를 현미경을 사용하여 관찰하는 방법을 제공하는데, 이는 상기 서술된 방법으로 제작된 파라핀 블록을 적당한 크기로 박절하여 절편화하고, 상기 박절된 파라핀 블록을 염색하고 관찰하는 단계를 포함한다. 상기 박절 단계는 마이크로톰 (microtome) 등과 같은 통상적인 박절 기기를 사용하여 수행될 수 있으며, 당업계에서 통상적으로 사용되는 염색시약을 사용하여 염색과정이 수행될 수 있다. 특히, 본 발명에 따른 파라핀 블록은 염색 과정 중, 파라핀 블록에 포함된 PVA의 물리적 특성으로 인하여 PVA가 물과 반응하여 PVA, 물 및 초산을 형성하게 된다. 따라서, 흐르는 물을 사용하여 생성된 PVA 및 초산이 제거하면 관찰 대상이 되는 검체가 놓여진 유리 슬라이드 상에는 검체만 존재하게 되고, 결과적으로 염색시 염색에 아무런 지장을 주지 않는다는 장점이 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 하되, 하기 실시예는 본 발명의 범위를 제한하기 위한 것은 아니며, 본 발명의 이해를 돕기 위한 목적으로 서술된 것이다.
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실시예
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실시예
1. 폐암 환자의 세포 관찰
포르말린 (10% 중성 완충 포르말린, MDPOS KOREA로부터 구입)에 고정된 폐암환자의 세포를 원심분리 튜브를 사용하여 13,000 rpm으로 1 분 동안 원심분리한 다음, 상층액을 제거하여 검체 침전물을 수득하였다. 증류수 100 mL에 2.0 g의 폴리비닐알코올(DUSAN KOREA), 1.0 g의 카르복시메틸 셀룰로오스 및 2.0 g의 디메틸 설폭시드를 잘 혼합하여 제1 조성물을 제작하였다. 제작된 제1 조성물을 검체 침전물에 상기 검체 침전물의 3 배 중량으로 가하였다. 이어서, 100 mL 아세톤(SIGMA USA)에 95 %(부피/부피) 시아노아크릴레이트 (LOCTITE HENKEL, GERMANY) 100 ㎕, 농축 포르말린 200㎕를 첨가한 혼합용액에 검체 튜브를 30 초 동안 가볍게 태핑(tapping)하였다. 침전물이 생성되기 시작하는 것을 확인하고, 상기 튜브를 13,000 rpm으로 3 분 동안 원심분리한 다음, 상층액을 제거하여 침전물을 수득하였다. 결과물인 침전물을 현미경 렌즈 페이퍼에 싼 다음 tissule capsule에 넣고 알코올에 1 시간 동안 담구어 두었으며, 이러한 과정을 5 회 반복하였다. 다음으로, 동일한 부피의 자일렌 및 파라핀에 대해서도 상기 과정을 동일한 시간 동안 각각 3 회 반복함으로써 파라핀 블록을 제작하였다. 상기 과정을 거쳐서 제작된 파라핀 블록을, 마이크로톰(LECEA, GERMANY)을 사용하여 4 ㎛ 두께를 갖는 파라핀 절편으로 제작하였다.
도 2는 상기 제작된 파라핀 박편에 대해서 현미경을 사용하여 각각 100 배 배율 및 400 배 배율로 관찰한 사진들이다. 도 2(A)는 본 발명의 파라핀 블록 제작 방법이 아닌 팹스미어(PAP smear)가 행해진 것으로 비정형 세포의 밀도가 아주 낮게 나타났다. 반면, 본 발명에 따라서 제작된 파라핀 절편에 대한 도 2(B), 2(C) 및 2(D)는 다수의 비정형 세포를 명확히 확인할 수 있다(도면에 삽입된 사진의 배율은 400 배). 따라서 본 발명에 따라서 제작된 파라핀 절편은 손실된 검체의 양이 매우 작고, 배경염색이 거의 관찰되지 않으며, 현명한 해상도를 갖는다는 사실을 알 수 있다.
실시예
2.
전혈의
버피코트의
관찰
전혈의 버피코트 및 쥐의 난자 샘플에 대하여, 실시예 1과 동일한 방법에 의해서 파라핀 블록을 제작한 후 관찰하였다.
도 3(B), 3(C) 및 3(D)는 각각 L26, CD3, Ki67을 본 발명의 방법으로 제작된 파라핀 블록으로 제작하여 면역조직화학적 염색한 혈액 세포에 대한 200 배 배율의 현미경 사진이다. 또한, 도 3(E) 및 도 3(F)는 각각 쥐의 난자 샘플을 본 발명의 방법으로 제작된 파라핀 블록으로 제작하여 H&E 염색 알시안 블루(alcian blue) 염색한 후 100 배 배율로 촬영한 현미경 사진이다.
상기 도 3(B) 내지 도 3(F)에 따르면, 실시예 1에서와 마찬가지로, 손실 검체량이 최소화되고, 배경염색이 전무하며, 또렷한 해상도를 갖는 파라핀 절편을 제작할 수 있음을 알 수 있다.
본 발명에 따른 검체 시료의 응집용 조성물, 이를 이용한 파라핀 블록의 제작방법 및 상기 파라핀 블록을 이용한 검체 시료의 현미경 관찰방법은 병원 및 그 부속 연구소, 의과대학, 생물학과, 공대 생명공학, 줄기세포배양 연구 등 조직 또는 세포를 이용하여 현미경 관찰을 수행하는 다양한 기관및 연구소에서 일반적으로 유용하게 사용될 수 있다.
Claims (12)
- 폴리비닐알코올, 카르복시메틸 셀룰로오스, 디메틸 설폭시드 및 증류수를 포함하는 제1 조성물; 및
아세톤, 농축 포르말린 및 시아노아크릴레이트를 포함하는 제2 조성물;을 포함하는 검체 시료의 응집용 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 제1 조성물은 증류수 100 중량부에 대해서 폴리비닐알코올 1.5 내지 2.0 중량부를 포함하는 것을 특징으로 하는 검체 시료의 응집용 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 제1 조성물은 응집 대상이 되는 검체 100 중량부에 대해서 300 내지 500 중량부의 함량으로 사용되는 것을 특징으로 하는 검체 시료의 응집용 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 제2 조성물은 아세톤 100 mL에 대해서 95-96 %(부피/부피) 농도의 시아노아크릴레이트 100 ㎕ 내지 200 ㎕를 포함하는 것을 특징으로 하는 검체 시료의 응집용 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 제2 조성물은 응집 대상이 되는 검체 100 중량부에 대해서 300 내지 500 중량부의 함량으로 사용되는 것을 특징으로 하는 검체 시료의 응집용 조성물. - 고정된 검체를 원심분리시킨 후 상층액을 제거하고 검체 침전물을 수득하는 단계;
상기 침전물에 폴리비닐알코올, 카르복시메틸 셀룰로오스, 디메틸 설폭시드 및 증류수를 포함하는 제1 조성물을 가하여 제1 검체용액을 제작하는 단계;
상기 제1 검체용액에 아세톤, 농축 포르말린 및 시아노아크릴레이트를 포함하는 제2 조성물을 가하여 제2 검체용액을 제작하는 단계;
상기 제2 검체용액을 원심분리시킨 후 상층액을 제거하고 응집 검체 침전물을 수득하는 단계; 및
상기 응집 검체 침전물에 대해서 자동침투과정을 수행함으로써 파라핀 블록을 제작하는 단계;를 포함하는 검체 시료의 파라핀 블록 제작방법. - 제6항에 있어서,
상기 검체의 고정은 포르말린 또는 알코올을 사용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 검체 시료의 파라핀 블록 제작방법. - 제6항에 있어서,
상기 제1 조성물은 증류수 100 중량부에 대해서 폴리비닐알코올 1.5 내지 2.0 중량부를 포함하며, 상기 제2 조성물은 아세톤 100 mL에 대해서 95-96 %(부피/부피) 농도의 시아노아크릴레이트 100 ㎕ 내지 200 ㎕를 포함하고, 상기 제1 조성물 또는 상기 제2 조성물은 상기 검체 100 중량부에 대해서 300 내지 500 중량부의 함량으로 사용되는 것을 특징으로 하는 검체 시료의 파라핀 블록 제작방법. - 제6항에 있어서,
상기 제2 조성물의 첨가 이후에 검체 응집이 관찰되면 상기 제2 검체용액을 교반하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 검체 시료의 파라핀 블록 제작방법. - 제6항에 있어서,
상기 자동침투과정은 상기 응집 검체 침전물을 종이에 싸서 알코올, 자일렌 및 파라핀의 순으로 처리함으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 검체 시료의 파라핀 블록 제작방법. - 제10항에 있어서,
상기 알코올 처리, 자일렌 처리 및 파라핀 처리는 각각 복수 회 수행되는 것을 특징으로 하는 검체 시료의 파라핀 블록 제작방법. - 제6항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따라서 제작된 검체 시료의 파라핀 블록을 박절하는 단계; 및
상기 박절된 파라핀 블록을 염색하고 현미경 관찰하는 단계;를 포함하는 검체 시료의 현미경 관찰방법.
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| EP12867600.4A EP2811281B1 (en) | 2012-01-31 | 2012-12-06 | Composition for aggregating biological sample, method for preparing paraffin block using same, and method for analysing paraffin blocks by microscopy |
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|---|---|---|---|---|
| KR20170025775A (ko) | 2015-08-31 | 2017-03-08 | 계명대학교 산학협력단 | 악성 중피종의 진단을 위한 정보제공방법 |
| CN113390700A (zh) * | 2021-05-24 | 2021-09-14 | 杭州电子科技大学 | 一种基于离心法的细胞蜡块自动制备系统及其方法 |
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2012
- 2012-06-04 KR KR1020120060074A patent/KR20130136345A/ko not_active Application Discontinuation
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| CN113390700A (zh) * | 2021-05-24 | 2021-09-14 | 杭州电子科技大学 | 一种基于离心法的细胞蜡块自动制备系统及其方法 |
| CN113390700B (zh) * | 2021-05-24 | 2022-12-23 | 杭州电子科技大学 | 一种基于离心法的细胞蜡块自动制备系统及其方法 |
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