KR20170025775A - 악성 중피종의 진단을 위한 정보제공방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 악성 중피종의 정확한 진단을 위한 정보제공방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 종양의 파라핀 조직 절편과 주사전자현미경을 이용하여 종양 세포 사이에 위치하는 미세융모를 관찰함으로써 악성 중피종의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 주사전자현미경을 이용함으로써 길고 가느다란 미세융모의 특징적인 형태를 선명하게 관찰하는 것이 가능하다. 또한, H&E 염색과 면역조직화학염색에 사용되는 검체의 파라핀 조직 블록을 손쉽게 이용함으로써 시료의 제작을 위해 별도의 침습적인 방법을 사용하지 않아도 되는 장점이 있다. 또한 파라핀조직을 사용하여 주사전자현미경 검사를 실시할 경우 종양세포 표면에 있는 미세융모의 길이와 직경 비율(길이/직경 비율)이 5.0 를 넘을 때 악성중피종을 진단할 수 있는 컷오프 밸류(cut-off value)를 제공할 수 있다. 따라서 본 발명의 방법은 H&E 염색이나 면역조직화학염색 등의 방법과 함께 악성 중피종을 정확히 진단하는데 활용될 수 있다.

Description

악성 중피종의 진단을 위한 정보제공방법{Method of providing information for diagnosis of malignant mesothelioma}
본 발명은 악성 중피종의 정확한 진단을 위한 정보제공방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 종양의 파라핀 조직 절편과 주사전자현미경을 이용하여 종양 세포 사이에 위치하는 미세융모를 관찰함으로써 악성 중피종의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.
중피종(mesothelioma)은 중피에 발생하는 종양으로, 주로 폐를 둘러싸고 있는 흉막, 위나 간 등을 보호하는 복막, 심장을 싸고 있는 심막 등의 표면을 덮고 있는 중피세포에서 많이 발생하며, 양성과 악성으로 나눌 수 있다. 모든 양성 중피종은 국소성이고 수술을 통해 거의 완치할 수 있으나, 악성 중피종(malignant mesothelioma)은 예후가 좋지 않다. 악성 중피종은 주로 석면의 장기 노출로 인해 발생하게 되는데, 최근 정부는 석면노출에 의한 악성 중피종 환자들에 대해 피해를 보상해 주고 있기 때문에 악성 중피종을 정확히 진단하는 것은 치료 목적 뿐만 아니라 피해보상 차원에서도 중요한 문제이다.
악성 중피종을 정확히 진단하기 위해서는 종양 병소에서 채취한 검체의 형태학적 소견을 정확하게 관찰하는 것이 중요한데, 통상적인 광학현미경 관찰만으로는 소견이 비슷한 여러 종류의 암들을 정확히 감별 진단하기 어렵기 때문에 진단의 정확성을 높이기 위해서는 여러 병리학적 검사 방법을 사용해 볼 필요가 있다. 종양 병소에서 채취한 검체의 형태학적 변화를 관찰하기 위하여 흔히 사용하는 종래의 방법으로는 헤마톡시린-에오진(hematoxylin & eosin, H&E) 염색이 있다. 그러나, 종양의 종류는 점차 세분화되고 있고, 종양의 진단에 도움을 주는 종양표시자나 예후를 판정할 수 있는 예후인자들이 새롭게 알려지고 있어서 통상적인 헤마톡시린-에오진 염색표본만으로는 진단에 필요한 종합적인 정보를 얻기가 어려운 문제가 있다. 이러한 문제점을 보완하기 위해 면역조직화학 염색법이 사용되고 있는데, 일반적으로 면역조직화학염색법은 미분화세포의 기원을 확인해 주거나, 효소, 호르몬, 종양표시자 및 예후인자의 존재 유무, 암종과 육종의 구별 및 양성종양과 악성종양의 감별, 전이암의 원발병소를 추정하는데 효율적으로 이용되고 있다. 면역조직화학염색은 민감성과 특이성이 매우 높은 검사법으로 최근 20-30년 사이 진단병리학과 형태학적 연구 등에 필수적인 검사법으로 이용되고 있다. 악성 중피종의 진단에도 이와 같은 면역조직화학염색이 널리 실시되고 있으나, 종종 그 결과가 불명확하여 악성 중피종 확진이 어려운 상황이 발생하므로 이를 보충할 수 있는 객관적인 진단방법이 필요한 실정이다.
이에 본 발명자들은 악성 중피종 의심 환자에 대한 병리조직검사 중 제작된 파라핀 잔여 조직편을 활용하여 악성 중피종을 확진할 수 새로운 진단방법을 개발하고자 연구한 끝에 파라핀블록 검체에 대한 주사전자현미경 관찰을 통해 악성 중피종 세포표면에 존재하는 특징적인 미세융모 소견을 확인하고 이를 분석함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
대한민국 공개특허공보 제2013-0136345호 국제 공개특허공보 WO 13/115476호
본 발명의 목적은 종양 병소에서 채취한 검체의 파라핀 조직 절편 내에 있는 종양 세포들 사이에서 관찰되는 미세융모의 특징적인 형태에 기초하여 악성 중피종을 감별해 낼 수 있는 악성 중피종 진단을 위한 정보제공방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은, 악성 중피종 의심 환자의 조직으로부터 제작된 파라핀 조직 절편을 이용하여 주사전자현미경 관찰용 시료를 제작하는 단계; 상기 주사전자현미경 관찰용 시료를 주사전자현미경으로 관찰하여 종양세포의 표면에 위치한 미세융모의 길이와 직경을 측정한 후 검증하는 단계; 및 상기 미세융모의 길이/직경 비율을 대조군인 전이성 선암종의 미세융모의 길이/직경 비율과 비교하는 단계를 포함하는 악성 중피종의 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 미세융모의 길이/직경 비율을 대조군인 전이성 선암종의 미세융모의 길이/직경 비율과 비교하는 단계는 통계적인 방법으로 민감도와 특이도를 구하는 단계를 포함한다. 본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 통계적인 방법은 카이제곱검정(Chi-square test)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 미세융모의 길이/직경 비율을 대조군인 전이성 선암종의 미세융모의 길이/직경 비율과 비교하는 단계는 컷오프(cut-off) 값에 의하여 수행될 수 있다. 본 발명의 일실시예에 있어서, 전이성 선암종과 감별할 수 있는 악성 중피종 미세융모의 길이/직경 비율의 컷오프(cut-off) 값은 5 이상인 것이 바람직하다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 파라핀 조직 절편의 두께는 4 내지 5 μm 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 주사전자현미경 관찰용 시료는 다음과 같은 단계를 포함하는 방법으로 제작될 수 있다.
(A) 파라핀 포매된 조직을 유리 슬라이드에 고정시킨 후 탈파라핀하는 단계;
(B) 상기 탈파라핀한 조직을 에탄올을 사용하여 함수시키는 단계;
(C) 상기 함수된 조직을 그루탈알데하이드(Glutaldehyde)를 이용하여 전고정시키는 단계;
(D) 상기 전고정된 조직을 OsO4를 이용하여 후고정시키는 단계;
(E) 상기 후고정된 조직을 탈수시키는 단계;
(F) 상기 탈수된 조직에 이소아밀 아세테이트(isoamyl acetate)를 치환시키는 단계;
(G) 상기 이소아밀 아세테이트가 치환된 조직을 임계점에서 건조시키고, 은분을 고정시키는 단계; 및
(H) 상기 은분이 고정된 시료 표면을 Pt-Pd로 증착시키는 단계.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 주사전자현미경 관찰용 시료 제작 방법은 상기 (C) 단계의 전고정 및 (D) 단계의 후고정 단계가 종료된 후, 각각 0.1M 인산완충액에 10분간 담구어 세척하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (A) 단계의 진단용 조직은 파라핀 포매 후 3~6㎛ 의 절편으로 세절하여 사용할 수 있다. 본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (A) 단계의 탈파라핀 과정은 자일렌(Xylene)에 상기 유리 슬라이드를 실온에서 2~10분씩 4회 담구어 진행할 수 있다. 본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (B) 단계의 에탄올 함수는 100%, 95%, 90%, 80%, 70% 에탄올 및 증류수에 상기 유리 슬라이드를 각각 실온에서 2~10분씩 담구어 진행할 수 있다. 본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (E) 단계의 탈수 과정은 70%, 80%, 90% 및 95% 및 100% 에탄올(2회)에 각각 실온에서 2~10분씩 담구어 진행할 수 있다. 본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (F) 단계의 이소아밀 아세테이트(isoamyl acetate)를 사용하여 치환시키는 과정은 실온에서 5~15분간 반응시킬 수 있다. 본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (F) 단계의 이소아밀 아세테이트 대신 t-부틸 알코올로 치환이 가능하고, 상기 t-부틸 알코올을 사용하여 치환시키는 과정은 30~40℃에서 20~40분간 반응시킬 수 있다. 본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (H) 단계의 Pt-Pd로 증착시키는 과정은 금속이온 증착기를 이용하여 5~10㎚ 두께로 증착시키는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 종양 진단용 조직 염색 방법은 상기 (D) 단계의 후고정 후, (D-1) 2% 탄닌산(tannic acid)을 이용하여 실온에서 20~40분간 반응시키는 전도염색 단계; 및 (D-2) 상기 전도염색한 샘플을 1% OsO4로 고정시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (D-1) 단계의 전도염색 및 (D-2) 단계의 고정이 종료된 후, 각각 0.1M 인산완충액에 10분간 담구어 세척하는 단계를 더 포함할 수 있다.
광학현미경을 사용하는 종래의 조직 검사 방법의 경우 해상력의 한계로 인해 종양 세포들 틈에 존재하는 미세융모를 분명히 관찰할 수 없으나, 본 발명의 방법은 주사전자현미경을 이용함으로써 길고 가느다란 미세융모의 특징적인 형태를 선명하게 관찰하는 것이 가능하다. 또한, H&E 염색과 면역조직화학염색에 사용되는 검체의 파라핀 조직 블록을 손쉽게 이용함으로써 시료의 제작을 위해 별도의 침습적인 방법을 사용하지 않아도 되는 장점이 있다. 따라서 본 발명의 방법은 H&E 염색이나 면역조직화학염색 등의 방법과 함께 악성 중피종을 정확히 진단하는데 활용될 수 있다.
도 1은 정상 중피세포(A)와 악성 중피종 세포(B)의 사진으로 전이성 암세포(C)와 달리 종양세포 표면의 길고 가느다란 형상의 미세융모의 존재를 잘 보여준다.
도 2는 악성 중피종 세포 사이의 틈새에서 관찰되는 미세융모를 확인하기 위하여, 병리진단용으로 만든 파라핀 블록을 활용하여 세절한 조직편(A)과, 주사전자현미경 관찰을 위하여 조직편이 부착된 유리슬라이드를 유리칼로 트리밍한 유리 슬라이드(B)를 나타내는 사진이다.
도 3은 본 발명에 따른 시료를 이용하여 광학현미경에서 악성 중피종 세포 사이의 틈새(A)를 관찰한 사진과, 주사전자현미경 관찰로 이 부위에 존재하는 많은 미세융모(B)를 확인한 사진이다.
본 발명은 악성 중피종의 진단을 위한 정보제공방법으로, 특히 헤마톡시린-에오진(hematoxylin & eosin, H&E) 염색 또는 면역조직화학염색 결과만으로는 다른 선암종과의 감별이 어려운 경우에 제작된 파라핀 조직편의 남은 검체를 활용하여 주사전자현미경으로 종양세포의 미세융모를 관찰함으로써 악성 중피종을 용이하게 진단할 수 있는 방법이다.
본 발명에서 사용되는 "종양"이란 용어는 세포 성장의 비제어적, 비체계적 증식현상으로,인간 또는 동물 신체의 임의의 양성 또는 악성 종양을 포함한다. 종양은 침략적이며 전이의 성질을 가질 때 악성 또는 암성이라 한다. 침략적이란 종양이 조직의 방어벽을 형성하는 기본 기저층을 뚫고 주변 조직으로 침투하여 인체의 순환계로 들어가는 경향을 말한다. 전이란 종양이 다른 영역으로 이동하여 초기 발생부위로부터 떨어져 나와 증식 영역을 형성하는 경향을 말한다.
본 발명에서 사용되는 "진단"이라는 용어는 분자적 또는 병리학적 상태, 질환 또는 병증을 확인하는 것, 예컨대, 악성 중피종을 확인하는 것을 의미하거나, 또는 특정 치료 요법으로부터 이익을 얻을 수 있는 악성 중피종 환자를 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 한 실시 양태에서, 진단이란 종양세포 표면에 존재하는 가늘고 길다란 미세융모를 확인함으로서 악성중피종을 진단하는 것을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 "실온"이라는 용어는 실내의 대기온도로, 15~25℃ 전후를 의미한다.
본 발명자들은 종양 진단을 위하여 널리 실시되고 있는 면역조직화학 염색에서 그 결과가 모호한 경우가 많아 종양 진단의 확진이 어렵다는 점에 착안하여, 병리조직검사 중 만들어지는 파라핀 잔여 조직편을 이용하여 주사전자현미경으로 관찰할 때 특정 종양에 특징적으로 나타나는 미세융모 소견을 보다 정확히 확인할 수 있는 시료 제작 기법을 연구하던 중 본 발명을 완성하게 되었다. 최근 악성 중피종 또는 전이성 선암종의 진단 목적으로 임상에서 흔히 환자로 부터 큰 조직을 채취하지 않고 덜 침습적인 방법인 작은 침생검을 실시하는 경우가 많아서 병리 진단용 검체 크기가 작아 통상적으로 병리과에서 환자에서 채취한 검체 모두를 파라핀 조직 블록으로 만들고, 이를 세절(절편 두께 4-5 μm) 하여 얇은 절편을 재료로 H&E 염색과 면역조직화학염색에 사용한다. 그런데 H&E 및 면역조직화학염색한 결과 판독에서 악성중피종과 선암종을 감별하기 힘든 증례가 흔히 있을 수 있으며, 이런 경우 악성중피종(또는 선암종)에 따른 적절한 치료를 할 수 없다. 이러한 증례에서 환자 검체에서 사용하고 남은 파라핀 조직편을 활용하여 악성중피종 진단 목적으로 주사전자현미경 검색을 실시할 수 있다. 그러나 파라핀 절편을 활용한 악성 중피종의 주사전자현미경 검색은 기술상의 어려움 등으로 대부분 병원의 병리과에서 시행되지 않고 있으며, 주사전자현미경 분석을 통한 악성중피종 진단 방법에 대해서는 전혀 연구된 바가 없다.
이에 본 발명자들은 진단용으로 사용하고 남은 파라핀 조직편을 추가로 세절(면역조직화학검색과 동일하게 두께 4-5 μm의 얇은 파라핀 조직 절편)하여 주사전자현미경 검사를 통한 진단 기준을 고안하기 위한 연구를 진행하였다. 이 경우 세절된 조직편(두께 4-5 μm)에서는 악성중피종의 종양세포 표면에 존재하는 길다란 미세융모들이 세절 과정에서 짤려져 미세융모의 길이가 전반적으로 짧아지게 되는데, 같은 파라핀 세절편을 사용할 경우 전이성 선암종의 종양세포의 미세융모 길이/직경 비율치도 같은 조건으로 낮아지게 되므로, 이를 고려하여 양자를 감별할 수 있는 통계적인 의미를 갖는 기준치(cut-off value)를 5.0으로 결정하였다(표 1).
그러므로 본 발명에서 고안한 새로운 기준치는 종양세포를 이용한 파라핀 조직편을 대상으로 주사전자현미경 분석 시 적용할 수 있는 악성 중피종의 진단을 위한 정보로 사용할 수 있다.
특히 종양세포의 미세융모 길이/직경 비율치가 5.0 이상인 경우에는 악성 중피종으로 판단할 수 있으며, 5.0 미만인 경우에는 전이성 선암종으로 판단할 수 있음을 확인함으로써 5.0이 중요한 컷오프 밸류에 해당된다는 것을 확인할 수 있었다.
이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
< 실시예 1>
주사전자현미경을 이용한 파라핀 조직 시료내 종양세포의 미세융모 관찰
파라핀 절편을 이용한 주사전자현미경 관찰용 시료의 제작 및 주사전자현미경 관찰은 다음과 같은 방법으로 수행하였다.
악성 중피종 20 증례와 전이성 선암종 10증례를 선택하여 각각 파라핀 절편(두께 4-5 μm)을 얻은 후, 탈파라핀, 계열에탄올 함수, 2.5% 그루탈알데하이드 전고정, 0.1M PB로 세척, 1% OsO4 후고정, 0.1M PB로 세척, 계열알코올 탈수, 이소아밀아세테이트 침투, 임계점건조, 및 Pt-Pd로 증착 과정을 거친 후 Hitachi S4200 주사전자현미경으로 관찰하였다. 각 단계의 구체적인 실험예는 다음과 같다.
< 실험예 1>
1 단계: 슬라이드 제작
악성 중피종 진단을 위해 주사전자현미경 검색을 할 증례의 조직을 통상적인 방법으로 포르말린 고정 후 파라핀 포매하고 4~5㎛ 절편으로 세절하여 유리슬라이드에 올려 염색 판독용 단일 조직 슬라이드를 제작하였다.
2 단계: 탈파라핀 (20분)
이후, Xylene(Junsei, 일본)이 담겨진 Coplin jar에 상기 유리슬라이드를 넣은 후 실온에서 5분씩 4회 반응시키는 탈파라핀 과정을 진행한다.
3 단계: 계열 에탄올 함수(30분)
Ethanol (Merck, 독일)을 사용하며, 100%, 95%, 90%, 80%, 70% 에탄올 및 증류수에 상기 유리 슬라이드를 각각 5분씩 실온에서 담구어 함수시킨다.
4 단계: 2.5% 그루탈알데하이드 전고정 (30분)
25% Glutaraldehyde (Merck , 독일) 10mL에 0.1M 인산완충액 90mL을 넣고 희석(2.5% 그루탈알데하이드 용액)하여 샘플을 30분간 전고정 한다. 이 때, 0.1M 인산완충액(0.1M phosphate buffer, pH 7.4)은, Sodium phosphate, monobasic (Junsei, 일본) 15.6g을 증류수 1L에 녹인 A용액 190ml와 Sodium phosphate, dibasic (Junsei, 일본) 14.2g을 증류수 1L에 녹인 B용액 810mL를 섞어 제조한다.
5 단계: 세척(10분)
이후, 상기 전고정된 샘플을 0.1M 인산완충액에 10분간 담구어 세척한다.
6 단계: 1% OsO 4 후고정 (30분)
Osmium tetroxide (Merck 회사, 독일) 1g을 증류수 50mL에 녹인 용액과 0.1M 인산완충액과 동량으로 희석한 후 상기 용액에 상기 세척된 샘플을 30분간 담구어 후고정한다.
7 단계: 세척(10분)
이후, 상기 후고정된 샘플을 0.1M 인산완충액에 10분간 담구어 세척한다.
8 단계: 계열 알코올 탈수(30분)
상기 세척된 샘플을 Ethanol (Merck, 독일)을 사용하며, 70%, 80%, 90% 및 95% 및 100% 에탄올(x 2회)에 각각 5분씩 실온에서 담구어 탈수한다.
9 단계: 이소아밀아세테이트 치환(10분)
상기 탈수된 샘플을 Isoamyl acetate (Junsei, 일본)를 사용하여 실온에서 10분 반응시킨다. 이 경우, 이소아밀아세테이트 대신 t-부틸 알코올(Junsei, 일본)을 사용할 수 있으나, 이는 37℃에서 30분간 반응시키는 것이 바람직하다.
10 단계: 트리밍
상기 침투 단계를 마친 후, 유리슬라이드에 부착된 종양 부분을 유리칼로 트리밍한다.
11 단계: 임계점 건조(60분)
임계점건조기(Critical point dryer, Hitachi사, HCP-2, 일본)를 사용하여 임계점 건조 후, 시료대에 은분(Silver paste, Nissin EM Co, 일본)을 사용하여 시료를 고정한다. 이 경우, 임계점건조기 대신 동결 건조기(Hitachi사, E-2030, 일본)를 사용할 수 있으며, 이 경우에는 120분간 건조시키는 것이 바람직하다. 여기서 임계점이란 38~40℃ 상에서 HCP-2 장치의 압력계기가 110kgf/cm2를 가리키는 상태를 뜻한다.
12 단계: Pt - Pd 로 증착(30분)
금속이온증착기(Ion sputter, Hitachi 회사, E-1030, 일본)를 사용하여, 금속이온 증착기에 Pt-Pd를 사용하여 은분이 고정된 시료 표면을 5-10 nm 두께로 이온 증착한다.
13 단계: 주사전자현미경 관찰
상기 이온 증착된 샘플을 주사전자현미경(Scanning electron microscope, Hitachi사, S-4200, 일본)을 사용하여 가속전압 10KV로 관찰한다.
< 실험예 2>
상기 실험예 1에 기재된 방법에 전도염색을 추가로 수행하여 시료를 제작할 수 있다. 이를 위해서는, 상기 6단계의 후고정 및 상기 7 단계의 세척 과정을 거친 후, 하기와 같은 과정을 추가하여 진행할 수 있다.
7-1 단계: 전도염색 과정(30분)
상기 후고정 후 세척한 샘플을 2% Tannic acid (Kanto사, 일본)를 사용하여 실온에서 30분 반응시킨다.
7-2 단계: 세척(10분)
이후 상기 전도염색한 샘플을 0.1M 인산완충액으로 10분간 세척한다.
7-3 단계: 1% OsO 4 으로 고정(30분)
Osmium tetroxide (Merck 회사, 독일) 1g을 증류수 50mL에 녹인 용액과 0.1M 인산완충액과 동량으로 희석한 후 상기 용액에 상기 세척된 샘플을 30분간 담구어 고정한다.
7-4 단계: 세척(10분)
이후, 상기 후고정된 샘플을 0.1M 인산완충액에 10분간 담구어 세척한다.
< 실시예 2>
악성 중피종 진단을 위한 기준 설정
상기 실시예 1의 방법으로 제작된 시료를 주사전자현미경으로 관찰할 경우 종양의 파라핀 잔여 조직에 대한 광학현미경 관찰시 종양 세포들 틈에서 희미하게 보이던 미세융모를 선명하게 관찰할 수 있다(도 3). 이와 같이 주사전자현미경으로 관찰이 가능한 종양세포의 미세융모의 형태적 특징을 이용하여 악성 중피종과 선암종을 감별해 내기 위하여, 악성 중피종 진단을 위한 미세융모의 “길이/직경 비율” 기준치(cut-off value)를 다음과 같은 방법으로 개발하였다.
실시예 1에서 사용된 각 증례당 최소 5군데 이상의 종양 병변에서 미세융모의 길이 및 직경을 측정한 후 “길이/직경 비율(L/D ratio, LDR)”을 계산하여 각 증례당 실험 데이터를 작성하였다. 각 증례 당 최소 20개 이상의 미세융모에 대한 길이 및 직경의 측정치를 구한 후 Mann
Figure pat00001
Whitney U test의 통계학적 방법을 사용하여 미세융모의 길이/직경 비율치에 대한 검증을 하였으며, Chi-square test로 민감도와 특이도를 구하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
실험결과
악성 중피종 종양세포의 미세융모의 길이(L)와 직경(D)의 비율(ratio, R)을 측정하고, 이와 감별 진단할 전이성 선암종의 종양세포 표면에 위치한 미세융모들의 길이/직경 비율(LDR)을 측정하여 분석한 결과, 악성 중피종 진단에 통계적 의의를 갖는 LDR의 진단기준이 5.0으로 나왔으며, 이러한 진단 기준에서는 민감도, 특이도가 높아 진단의 정확도가 매우 우수하므로, LDR 5.0 이상을 전이성 선암종과 구별하여 악성 중피으로 진단할 수 있는 새로운 악성 중피종의 진단 기준치(cut-off value)로 결정하였다(표 1).
비교항목 악성중피종 전이성 선암종 p value
평균길이(L)(um) 2.55 (±076) 0.97 (±0.34) p <0.001
평균직경(D)(um) 0.34 (±0.28) 0.35 (±0.08) p =0.552
L/D 비율 7.73 (±2.21) 2.77 (±0.78) p <0.001
L/D 비율 cutoff 기준 >= 5.0 < 5.0 p <0.001
실제 악성 중피종의 중피세포 표면에 존재하는 미세융모 길이는 매우 길고 가는 것으로 알려져 있다. 그러나 파리핀 조직 절편을 주사전자현미경의 검체로 사용할 경우 4-5 μm의 얇은 세절편을 사용함으로써 미세융모의 길이가 세절 과정에서 절단됨으로, 포르말린 고정 또는 흉수 세포진의 잔여 검체를 사용하는 경우와는 달리 악성 중피종 세포의 미세융모 길이가 전반적으로 짧아질 수 있다. 이에 따라 미세융모의 길이/직경 비율(LDR)이 위 포르말린 고정 또는 흉수 세포진의 잔여 검체를 사용한 경우보다 상대적으로 낮아질 수 있다.
본 발명은 H&E 또는 면역조직화학검사 결과가 모호하여 진단하기 어려운 증례들에서 추가로 적용할 수 있는 새로운 방법이며, H&E 진단용으로 사용하고 남은 파라핀 조직편을 활용하여 악성 중피종 진단에 결정적인 정보를 제공할 수 있는 유용한 기술이 될 수 있다. 그리고 본 발명의 방법을 적용할 경우, 진단 정확도를 더욱 높일 수 있는 효과가 있다.
통상적으로 수술로 절제한 신선 종양조직 또는 포르말린 고정 종양조직을 사용하여 전자현미경 검사를 실시할 수도 있겠으나, 악성중피종 진단을 위해서는 수술로 종양을 적출하지 않고 있다. 최근에는 진단을 위해 비침습적인 방법을 선호하고 있고 가능한 환자로부터 작은 생검, 침생검 또는 세포진 검사로 종양 조직을 최소한으로 작게 채취하여 병리과로 보냄으로 진단을 위해 채취한 종양조직편 모두를 파라핀 블록으로 제작하고 있다. 따라서 악성중피종 진단을 위한 전자현미경용의 별도 시료는 남아있지 않아서 파라핀 조직편을 사용할 수 밖에 없는 경우가 대부분이다.
그러나 아직까지 이러한 파라핀 블록을 대상으로 전자현미경관찰로 악성 중피종을 진단할 수 있는 기준이 전혀 제시된 바 없다.
이러한 점에서 본 기술은 병원에서 손쉽게 얻을 수 있는 파라핀 블록 조직편을 이용하여 정확도 있는 악성 중피종을 주사전자현미경으로 진단할 수 있는 진단 기준을 고안하였고, 그 기준으로 종양세포 표면에 있는 미세융모의 길이와 직경 비율(길이/직경 비율)의 컷오프 밸류(cut-off value)가 5.0 이상인 경우를 악성 중피종으로 진단할 때 통계적인 의의가 있으며, 5.0 미만인 경우를 전이성 선암종으로 진단할 수 있다는 것을 확인하였다(p<0.001). 그리고 미세융모의 길이와 직경 비율의 컷오프 밸류를 5.0 이상으로 할 때 높은 진단 특이도(specificity)와 민감도(sensitivity)를 가질 수 있다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시 예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 방법으로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 제시된 실시 예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (9)

  1. 악성 중피종 의심 환자의 조직으로부터 제작된 파라핀 조직 절편을 이용하여 주사전자현미경 관찰용 시료를 제작하는 단계;
    상기 주사전자현미경 관찰용 시료를 주사전자현미경으로 관찰하여 종양세포의 표면에 위치한 미세융모의 길이와 직경을 측정한 후 검증하는 단계; 및
    상기 미세융모의 길이/직경 비율을 대조군인 전이성 선암종의 미세융모의 길이/직경 비율과 비교하는 단계를 포함하는, 악성 중피종의 진단을 위한 정보제공방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 미세융모의 길이/직경 비율을 대조군인 전이성 선암종의 미세융모의 길이/직경 비율과 비교하는 단계는 통계적인 방법인 카이제곱검정(Chi-square test) 방법을 이용하여 민감도와 특이도를 구하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    전이성 선암종과 악성 중피종을 감별할 수 있기 위한 악성 중피종 미세융모의 길이/직경 비율의 컷오프(cut-off) 값은 5 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    미세융모의 길이/직경 비율의 컷오프(cut-off) 값이 5 이상인 경우 악성 중피종으로 판별할 수 있고, 미세융모의 길이/직경 비율의 컷오프(cut-off) 값이 5 미만인 경우에는 전이성 선암종으로 판별할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 파라핀 조직 절편의 두께는 4 내지 5 μm 인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 주사전자현미경 관찰용 시료는,
    (A) 파라핀 포매된 조직을 유리 슬라이드에 고정시킨 후 탈파라핀하는 단계;
    (B) 상기 탈파라핀한 조직을 에탄올을 사용하여 함수시키는 단계;
    (C) 상기 함수된 조직을 그루탈알데하이드(Glutaldehyde)를 이용하여 전고정시키는 단계;
    (D) 상기 전고정된 조직을 OsO4를 이용하여 후고정시키는 단계;
    (E) 상기 후고정된 조직을 탈수시키는 단계;
    (F) 상기 탈수된 조직에 이소아밀 아세테이트(isoamyl acetate)를 치환시키는 단계;
    (G) 상기 이소아밀 아세테이트가 치환된 조직을 임계점에서 건조시키고, 은분을 고정시키는 단계; 및
    (H) 상기 은분이 고정된 시료 표면을 Pt-Pd로 증착시키는 단계를 포함하는 방법으로 제작하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 (C) 단계의 전고정 및 (D) 단계의 후고정 단계가 종료된 후, 각각 0.1M 인산완충액에 10분간 담구어 세척하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 (D) 단계의 후고정 후,
    (D-1) 2% 탄닌산(tannic acid)을 이용하여 실온에서 20~40분간 반응시키는 전도염색 단계; 및
    (D-2) 상기 전도염색한 샘플을 1% OsO4로 고정시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 (D-1) 단계의 전도염색 및 (D-2) 단계의 고정이 종료된 후, 각각 0.1M 인산완충액에 10분간 담구어 세척하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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