BR112012004141B1 - Método para recuperar antígenos em uma amostra de tecido fixada em formaldeído - Google Patents
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Abstract
"método e kit para recuperar antígenos em uma amostra de tecido fixada em formaldeído, e, dispositivo de manipulação de amostra" a invenção provê um método para recuperação de antígeno de uma amostra de tecido fixado em formaldeído compreendendo incubar uma amostra de tecido fixada em formaldeído em uma primeira solução de recuperação de antígeno em uma temperatura de mais do que 90 °c, transferindo a amostra de tecido para uma segunda solução de recuperação de antígeno, e incubando a amostra de tecido na segunda solução de recuperação de antígeno em uma temperatura de mais do que 90 °c. a invenção também provê um kit e dispositivo de liberação de amostra para realizar o método.
Description
MÉTODO PARA RECUPERAR ANTÍGENOS EM UMA AMOSTRA DE
TECIDO FIXADA EM FORMALDEÍDO
FUNDAMENTOS
[001] A formação de imagem celular de diagnóstico usa métodos pelos quais as moléculas produzidas pelas células ou pelos tecidos podem ser especificamente localizadas por aquelas células ou tecidos. Isto mune um pesquisador com informação quanto aos sítios de produção ou a atividade daquelas moléculas mencionadas. Para a localização específica das proteínas na patologia de rotina, um procedimento conhecido como imunoistoquímico (IHC) é rotineiramente utilizado. No IHC um anticorpo para um antígeno específico é aplicado a uma amostra de tecido fixada que reconheça uma molécula específica conhecida como uma primeira etapa. Este anticorpo é então detectado com o uso de um anticorpo secundário que tenha sido quimicamente acoplado com uma enzima, tal como a peroxidase de raiz forte. Após a incubação com o substrato cromogênico tal como a diaminobenzidina (DAB), um depósito colorido é produzido no sítio do anticorpo secundário que se tenha ligado ao anticorpo primário no sítio específico da proteína de interesse. Este procedimento é correntemente utilizado por mais de 200 anticorpos nos laboratórios de patologia clínica e muito mais no ambiente de pesquisa.
[002] A natureza do processamento de tecidos requer que as amostras sejam “fixadas” antes da implantação na parafina e microcorte sobre um micrótomo para produzir seções de tecido adequadas para imunocoloração. Durante este processo, as proteínas são preservadas com o uso de um tratamento de formaldeído que produza ligação cruzada que preserve os aspectos celulares do tecido. O formaldeído preserva ou fixa tecido ou células predominantemente por grupos de amina primária mediante ligação cruzada nas proteínas com outros átomos de nitrogênio próximos na proteína ou no DNA através de uma ligação em -CH2-. O processo de fixação de tecido, porém, frequentemente mascara antígenos em proteínas específicas para o que a detecção é desejável para fins de diagnóstico e prognóstico. Tipicamente os procedimentos são otimizados para detecção de moléculas alvo individuais e, quando necessário, seções em série são processadas de uma maneira diferente para a detecção de moléculas alvo adicionais. Com os avanços na capacidade de detectar antígenos múltiplos em uma amostra única, isso necessita ser um processamento de tecido uniforme que seja compatível com a detecção de proteínas múltiplas.
BREVE DESCRIÇÃO
[003] Em um primeiro aspecto, a invenção provê um método de recuperação de antígeno de uma amostra de tecido fixado em formaldeído compreendendo a etapa de incubar a amostra de tecido fixada em formaldeído em uma primeira solução de recuperação de antígeno em uma temperatura de mais do que 90 °C, transferindo a amostra de tecido para uma segunda solução de recuperação de antígeno, e incubando a amostra de tecido na segunda solução de recuperação de antígeno em uma temperatura de mais do que 90 °C.
[004] Em um segundo aspecto, a invenção provê um kit para recuperar antígenos em uma amostra de tecido fixada em formaldeído, compreendendo uma primeira solução de recuperação de antígeno que recupera pelo menos uma porção de antígenos não recuperados na amostra, e uma segunda solução de recuperação de antígenos que recupera pelo menos alguma de outra porção de antígenos não recuperados na amostra.
[005] Em um terceiro aspecto, a invenção provê uma amostra que manipula dispositivo para realizar o método de recuperação de antígeno compreendendo uma amostra que manipula o subsistema, um subsistema que dispensa um reagente, e um subsistema de detecção de sinal.
DESENHOS
[006] Estas e outras características, aspectos e vantagens da presente invenção se tornarão mais bem entendidos quando a seguinte descrição detalhada for lida com referência aos desenhos anexos nos quais os caracteres iguais representam partes iguais na totalidade dos desenhos.
[007] A Figura 1 é uma amostra representativa manipulando dispositivo para contato coma amostra de tecido fixada em formaldeído com soluções de recuperação de um antígeno.
[008] A Figura 2 é uma micrografia monocromática (em ampliação de 20X ou de 63X) apresentando coloração reforçada com o uso de um procedimento de duas etapas em comparação com um procedimento de etapas.
[009] A Figura 3 apresenta micrografias monocromáticas (em ampliação de 20X) apresentando coloração reforçada com o uso de um procedimento de duas etapas em uma análise múltipla FISH de tumor BrCA. [0010] A Figura 4 é um gráfico de barras de resultados de análise quantitativa comparando um método de recuperação de antígeno de duas etapas manual com métodos automáticos.
[0011] A Figura 5 apresenta micrografias monocromáticas (em ampliação de 20X) do efeito de branqueamento na coloração sobre o antígeno S6 sobre a amostra preparada ou pelo método de recuperação manual do antígeno de duas etapas ou por um dos dois processos de recuperação automática de antígeno.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[0012] Para mais clara e concisamente descrever e salientar a matéria objeto da invenção reivindicada, as seguintes definições são fornecidas quanto aos termos específicos que são usados na seguinte descrição e nas reivindicações a ela anexas.
DEFINIÇÕES
[0013] “Anticorpo” refere-se a uma imunoglobulina que especificamente se liga e é por esse meio definida como complementar com uma organização espacial e polar específica de outra molécula. O anticorpo pode ser monoclonal o policlonal e pode ser preparado por técnicas que sejam bem conhecidas na prática, tais como a imunização de um hospedeiro e coleta de soros (policlonal), ou pelo preparo de linhagens celulares híbridas contínuas e coleta da proteína secretada (monoclonal), ou por clonagem e expressão de sequências de nucleotídeos ou suas versões mutagênicas, codificando pelo menos para as sequências de aminoácidos requeridas para ligação específica dos anticorpos naturais. Os anticorpos podem incluir uma imunoglobulina completa ou fragmentos desta, imunoglobulinas estas que incluem as várias classes e isótopos, tais como IGA, IgD, IgE, IgG1, IgG2a, IgG2b e IgG3, IgM. Os fragmentos de anticorpos funcionais podem incluir porções de um anticorpo capaz de reter ligação em afinidade semelhante a um anticorpo de comprimento completo (por exemplo, Fab, Fv e F(ab') ou Fab'). Além disso, os agregados, polímeros e conjugados de imunoglobulinas ou seus fragmentos podem ser usados onde apropriado, contanto que a afinidade de ligação por uma molécula particular seja substancialmente mantida.
[0014] “Antígeno” refere-se a uma substância que pode ligar um anticorpo ou fragmento de anticorpo. Os antígenos podem ser endógenos por meio do que eles são gerados dentro da célula como um resultado do metabolismo celular normal ou anormal, ou por causa das infecções virais ou bacterianas intracelulares. Antígenos endógenos incluem os xenogênicos (heterólogos), autólogos e idiotípico ou antígenos alogênicos (homólogos). Os antígenos podem também ser antígenos específicos do tumor ou apresentados por células tumorais. Neste caso, eles são denominados de antígenos específicos do tumor (TSAs) e, em geral, resultam de uma mutação específica do tumor. Os antígenos podem também ser antígenos associados ao tumor (TAAs), os quais são apresentados por células tumorais e células normais. Os antígenos também incluem antígenos CD, os quais referem-se a quaisquer dentre vários dos marcadores das superfícies celulares expressos por leucócitos e podem ser usados para distinguir linhagens celulares ou estágios desenvolvimentais. Tais marcadores podem ser identificados por anticorpos monoclonais específicos e são numerados por seu agrupamento de diferenciação.
[0015] “FISH” e “CISH” referem-se à hibridização fluorescente in situ e à hibridização cromogênica in situ, respectivamente. FISH é uma técnica citogenética usada para detectar e localizar a presença ou a ausência de sequências de DNA específicas sobre os cromossomas ou as sequências de RNA em sítios de transcrição, bem como em outras partes das células. FISH utiliza sondas fluorescentes que se ligam apenas àquelas partes do cromossoma com as quais eles apresentam um elevado grau de similaridade de sequência. CISH permite a detecção de amplificação de genes, translocações de cromossoma e número de cromossomas com o uso de reações enzimáticas convencionais sob microscópio de campo iluminado sobre tecidos fixados em formalina implantada em parafina (FFPE).
[0016] “Imunocoloração” refere-se a um método com base em um anticorpo para detectar uma proteína específica em uma amostra. A imunocoloração inclui tanto a coloração imunocitoquímica quanto a coloração imunoistoquímica. A coloração imunocitoquímica (ICC) refere-se a uma técnica que usa anticorpos que alvejam antígenos sobre as células. Isto pode ser realizado para se determinar a presença de certas doenças, por exemplo, tipos de câncer. A coloração imunoistoquímica (IHC) refere-se à coloração e localização de antígenos nas seções teciduais pelo uso de anticorpos rotulados como reagentes específicos através de interações de antígenos-anticorpos que sejam visualizadas por um marcador tal como fluoróforos, substratos de enzima reagida, elemento radioativo ou ouro coloidal.
[0017] “Sonda” refere-se a um agente tendo um aglutinante e um rótulo, tal como um gerador de sinais ou uma enzima. Em algumas formas de realização, o aglutinante e o rótulo (gerador de sinais ou a enzima) são coporificados em uma entidade única. Como aqui usado, “aglutinante” refere-se a uma molécula capaz de reagir com, ou associando-se com, outra molécula, tal como um antígeno ligando-se a um anticorpo. O aglutinante e o rótulo podem ser ligados diretamente (por exemplo, através de uma molécula fluorescente incorporada no aglutinante) ou indiretamente (por exemplo, através de um ligante, que pode incluir um sítio de clivagem) e aplicados à amostra de tecido em uma etapa única. Nas formas de realização alternativas o aglutinante e o rótulo são expressos em entidades discretas (por exemplo, um anticorpo primário capaz de ligar um alvo e uma enzima ou um anticorpo secundário rotulado gerador de sinal capaz de ligar o anticorpo primário). Quando o aglutinante e o rótulo (gerador de sinal ou a enzima) são entidades separadas, eles podem ser aplicados a uma amostra de tecido em uma etapa única ou em etapas múltiplas. A expressão “sonda fluorescente” refere-se a um agente que tenha um aglutinante acoplado a um gerador de sinal fluorescente.
[0018] “Gerador de sinal” refere-se a uma molécula capaz de prover um sinal detectável com o uso de uma ou mais técnicas de detecção (por exemplo, espectrometria, calorimetria, espectroscopia, ou inspeção visual). Exemplos adequados de um sinal detectável podem incluir um sinal óptico, e sinal elétrico, ou um sinal radioativo. Exemplos de geradores de sinal incluem um ou mais dentre um cromóforo, um fluoróforo, uma etiqueta ativa de Raman, ou um rótulo radiativo. Como estabelecido acima, com respeito à sonda, o gerador de sinal e o aglutinante podem estar presentes em uma entidade única (por exemplo, uma proteína de ligação alvo com um rótulo fluorescente) em algumas formas de realização. Alternativamente, o aglutinante e o gerador de sinal podem ser entidades discretas (por exemplo, uma proteína receptora e um anticorpo rotulado contra aquela proteína receptora particular) que se associam entre si antes ou após a introdução na amostra.
[0019] “Fluoróforo” ou “gerador de sinal Fluorescente” referem-se a um composto químico, que quando excitado pela exposição a um comprimento de onda de luz particular, emite luz em um comprimento de onda diferente. Os fluoróforos podem ser descritos em termos de seu perfil de emissão, ou “cor”. Os fluoróforos verdes (por exemplo, Cy3, FITC e Oregon Green) podem ser caracterizados por sua emissão em comprimentos de onde geralmente na faixa de 515 a 540 nanômetros. Os fluoróforos vermelhos (por exemplo, Texas Red, Cy5 e tetrametilrodamina) podem ser caracterizados por sua emissão em comprimentos de ondas geralmente na faixa de 590 a 690 nanômetros. Exemplos de fluoróforos incluem, sem limitar, o ácido 4-acetamido-4’-isotiocianatoestilbeno-2,2’-dissulfônico, acridina, derivados de acridina e isotiocianato de acridina, o ácido 5-(2’-aminoetil)aminonaftaleno-1-sulfônico (EDANS), dissulfonato 4-amino-N-[3-vinilsulfonil)fenil]nafta-limida-5,3 (Lúcifer Yellow VS), N-(4-anilino-1-naftil)maleimida, antranilamida, Brilliant Yellow, coumarina, derivados de coumarina, 7-amino-4-metilcoumarina (AMC, Coumarim 120), 7-amino-trifluorometil couluarina (Coumaran 151), cianosina; 4’,6-diaminidino-2-fenilindol (DAPI), 5’,5”-dibromopirogalol-sulfonaftaleína (Bromopirogalol Red), 7-dietilamino- z 3-(4’-isotiocianatofenil)4-metilcoumarina, Ácido 4,4’-diisotiocianatodiidro-estilbeno-2,2’-dissulfônico, ácido 4,4’-diisotiocia-natoestilbeno-2,2’-dissulfônico, cloreto de 5-[dimetilamino]naftaleno-1-sulfonila (DNS, cloreto de dansila), eosina, derivados de eosina tais como o isotiocianato de eosina, eritrosina. derivados de eritrosina tais como a eritrosina B e o isotiocianato de eritrosina; etídio, fluoresceína e derivados tais como a 5-carboxifluoesceína (FAM), a 5-(4,6-diclorotriazin-2-il)aminofluoresceína (DTAF), 2’7’-dimetóxi-4’,5’-di-cloro-6-carboxifluoresceína (JOE), fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína (FITC), QFITC (XRITC); derivado de fluorescamina (fluorescente após reação com aminas); IR144; IR1446; isotiocianato Malachite Green; 4-metilumbeliferona; orto cresolftaleína; nitrotirosina; pararosanilina; Phenol Red, B-ficoeritrina; derivado de o-ftaldialdeído (fluorescente após a reação com aminas); pireno e derivados tais como o pireno, butirato de pireno e butirato de 1-pireno succinimidil; Reactive Red 4 (Cibacron RTM. Brilliant Red 3B-A), rodamina e derivados tais como o 6-carbóxi-X-rodamina (ROX), 6-carboxirrodamina (R6G), cloreto de lissamina rodamina B sulfonila, rodamina (Rhod), rodamina B, rodamina 123, isotiocianato de rodamina X, sulforrodamina B, sulforrodamina 101 e derivado de sulforrodamina 101 de cloreto de sulfonila de sulforrodamina 101 (Texas Red); N,N,N’N’-tetrametil-6-carboxirrodamina (TAMRA); tetrametilrrodamina, isotiocianato de tetrametil rodamina (TRITC); riboflavina; ácido rosólico e derivados de quelato de lantanida, quantidade de pontos, cianinas, corantes de pirélio, e esquaraínas.
[0020] “Alvo” refere-se ao componente de uma amostra de tecido que pode ser detectado quando presente na amostra de tecido. O alvo pode ser qualquer substância para a qual exista um aglutinante específico de ocorrência natural (por exemplo, um anticorpo), ou para a qual um aglutinante específico pode ser preparado (por exemplo, um aglutinante de molécula pequena ou um aptâmero). Em geral, um aglutinante pode ligar-se a um alvo através de uma ou mais porções química discretas do alvo ou de um componente estrutural tridimensional do alvo (por exemplo, estruturas em 3D resultantes de dobragem de peptídeos). Os alvos podem incluir um ou mais dos peptídeos naturais ou modificados, proteínas (por exemplo, anticorpos, aficorpos ou aptâmeros), ácido nucleico (por exemplo, polinucleotídeos, DNA, RNA ou aptâmeros); polissacarídeos (por exemplo, lectinas ou açúcares), lipídios, enzimas substratos de enzimas, ligantes, receptores, antígenos ou haptenos. Em algumas formas de realização, os alvos podem incluir proteínas ou ácidos nucleicos. Em algumas formas de realização, os alvos podem incluir tanto proteínas, quanto ácidos nucleicos.
[0021] A invenção inclui formas de realização que dizem respeito geralmente a métodos aplicáveis em aplicações analíticas, diagnósticas ou prognósticas tais como detecção de análitos, histoquímica, imunocoloração, imunoistoquímica, imunocitoquímica ou imunofluorescência. Em algumas formas de realização, os métodos apresentados neste relatório podem ser particularmente aplicáveis na imunoistoquímica e na imunocitoquímica.
[0022] De acordo com uma forma de realização, um método é descrito no qual uma seção de tecido derivada de amostragem patológica é processado antes da detecção da proteína para avaliação do biomarcador. Em uma forma de realização, o método compreende um procedimento de duas etapas que é aplicável a antígenos de proteínas múltiplas e pode levar em conta alto nível de retenção de antígeno. Em certas formas de realização, isto leva em conta diagnóstico de multiplexação de amostras clinicamente aplicáveis.
[0023] Em algumas formas de realização, uma amostra de tecido inclui seções de tecidos saudáveis ou doentes (por exemplo, seções de tecidos do cólon, tecidos das mamas, da próstata). Uma amostra de tecido pode incluir uma parte ou peça única de uma seção de tecido, por exemplo, um fatia fina de tecido ou células cortadas de uma seção em de tecido. Em algumas formas de realização, a mesma seção de amostra de tecido pode ser analisada tanto no nível morfológico quanto no molecular.
[0024] Em algumas formas de realização, a amostra de tecido pode ser primeiramente fixada e depois desidratada através de uma série ascendente de alcoóis, infiltrada e implantada com parafina ou outro meio de divisão de modo que a amostra de tecido possa ser seccionada. Em uma forma de realização alternativa, uma amostra de tecido pode ser seccionada e subsequentemente fixada. Em algumas, a amostra de tecido pode ser implantada e processada em parafina. Exemplos de parafina que pode ser usados incluem, sem limitar, Paraplast, Broloid e Tissuecan. Uma vez a amostra de tecido seja implantada, ela poderá ser seccionada por um micrótomo em seções. A espessura das seções pode variar com base no tipo de tecido e na análise. Em certas formas de realização, as secções podem ter uma espessura preferida em uma faixa de cerca de dois mícrons a cerca de cinco mícrons.
[0025] Uma vez seccionadas, as seções podem ser ligadas a cursores com o uso de adesivos. Exemplos de cursores adesivos podem incluir, porém sem limitar, silano, gelatina, poli-L-lisina. Nas formas de realização, se a parafina for usada como o material de implantes, as seções de tecido podem ser desparafinizadas e reidratadas em água. As seções de tecidos podem ser desparafinizadas, por exemplo, pelo uso de agentes orgânicos (tais como xilenos ou gradualmente descendo a série de alcoóis).
[0026] Em outras formas de realização, a amostra de tecido fixado em formaldeído pode ser aderida a um suporte sólido de modo a possibilitar quanto à sua análise, transferência e movimento durante os processos de preparação e de formação de imagem. A amostra de tecido pode ser imobilizada sobre o suporte sólido por adsorção física, por formação de ligação covalente, ou por combinação destas. Um suporte sólido pode incluir um material polimérico, um vidro, ou um material metálico. Exemplos de suportes sólidos incluem uma membrana, uma placa microtituladora, uma conta, um filtro, uma tira de teste, uma lâmina, uma sobrelâmica, e um tubo de teste.
[0027] Em uma forma de realização, um método é descrito no qual uma amostra de tecido fixado em formaldeído é colocada em contato com uma primeira solução de recuperação de antígeno e aquecida a uma temperatura de mais do que 90 °C por um período de mais do que 10 minutos, mais preferível por um período de aproximadamente 20 minutos. O aquecimento pode ocorrer com o uso de uma caldeira de pressão, autoclave, banho de água, chapa quente, microondas, ou aquecedor de vapor, para prover aquecimento uniforme à amostra de tecido imersa na solução de recuperação de antígeno. A amostra de tecido é então transferida sem tratamento adicional para uma segunda solução de recuperação de antígeno que havia sido pré-aquecida a uma temperatura de mais do que 90 °C, por um período de tempo semelhante. O pré-aquecimento pode ocorrer com o uso de uma caldeira de pressão, autoclave, banho de água, chapa quente, microondas aquecimento a vapor ou combinação destes, e pode ser realizada no momento de aquecimento da primeira solução de recuperação do antígeno. Preferivelmente a incubação da amostra na segunda solução de recuperação do antígeno ocorre na pressão atmosférica, e por imersão apenas na solução quente. Isto pode prevenir o dano do tecido. Em uma forma de realização, a primeira solução de recuperação de antígeno é uma solução tampão tendo um variação de pH entre cerca de 5 e cerca de 7, A primeira solução de recuperação de antígeno pode ser uma solução tampão comumente usada para manter o pH na faixa levemente acídica a neutra. Em certas formas de realização, o tampão pode compreender ácido acídico, fosfato diidrogenado de potássio, ácido bórico, ácido barbitúrico dietílico, ácido piperazina-N,N’-bis(2-etanossulfônico, ácido dimetilarsínico, ácido 2-(N-morfolino)etanossulfônico, ou uma combinação destes. Em outras formas de realização a solução tampão pode ser uma solução de tampão de ácido cítrico fosfato de sódio tendo um pH de aproximadamente 6,0 em temperaturas elevadas.
[0028] Com a aplicação do calor, a primeira solução de recuperação de antígeno pode atuar para hidrolisar ligações de reticulação, o que pode ter sido formado entre a formalina e o antígeno, durante a fixação da amostra. Isto resulta em pelo menos alguma porção do antígeno na amostra que esteja sendo recuperada.
[0029] Em uma forma de realização, a segunda solução de recuperação de antígeno é uma solução tampão que tem um pH alcalino na faixa de cerca de 7,5 a cerca de 11. A segunda solução de recuperação de antígeno pode ser um uso de uma solução comumente usada para manter o pH em uma faixa levemente alcalina. Em certas formas de realização a solução tampão pode ser compreendida de tris-(hidroximetil)metilamina (TRIS), ácido 2-(morfolino)etanossulfônico (TAPS), N,N-bis-2-hidroxietil)glicina (Bicine), N-tris(hidroximetil)-metilglicina (Tricina), ácido 4-2-hidroxietil-piperazina-etanossulfônico (HEPES), ácido 2{[tris-(hidroximetil)metil)amino etanossulfônico (TES), ou uma combinação destes. Em outra forma de realização, a solução tampão pode ser um tampão de TRIS-HCL tendo um pH de aproximadamente 10 em temperaturas elevadas.
[0030] Como foi o caso com a primeira solução de recuperação de antígeno, a segunda solução de antígeno pode atuar para hidrolisar ligações de reticulação, as quais podem ser formadas entre a formalina e o antígeno durante a fixação da amostra. A porção do antígeno sendo recuperado é pelo menos algum de outra porção de antígenos recuperados na amostra.
[0031] Deve-se observar que, em outras formas de realização, a primeira solução de recuperação de antígeno pode ser uma solução tampão na faixa de cerca de 7,5 a cerca de 11, e a segunda solução de recuperação de antígeno pode ser uma solução tampão na faixa de cerca de 5 a cerca de 7. [0032] O antígeno recuperado pela exposição à primeira e à segunda soluções de recuperação de antígeno podem ser mais suscetíveis à imunocoloração de modo a levar em conta estudos de morfologia tanto analítica quanto funcional. A imunocoloração inclui tanto a coloração imunoistoquímica (IHC) quanto a coloração imunocitoquímica (ICC). Em certas formas de realização o melhoramento pode incluir a intensidade aumentada da coloração positiva e a coloração de fundo reduzido.
[0033] Em certas formas de realização, após a aplicação da segunda solução de recuperação de antígeno, a imunocoloração da amostra pode ocorrer. Uma solução de anticorpo (por exemplo uma sonda) pode ser colocada em contato com a seção de tecido por um período suficiente de tempo e sob condições adequadas para ligação do anticorpo rotulado ao antígeno. Dois métodos de detecção podem ser usados: direto ou indireto. Em uma detecção direta, o anticorpo primário rotulado gerador de sinal (por exemplo, anticorpo primário rotulado de fluoróforo) pode ser incubado com um antígeno na amostra de tecido, o que pode ser visualizado sem interação de outro anticorpo. Em uma detecção indireta, um anticorpo primário não conjugado pode ser incubado com um antígeno e depois um anticorpo rotulado pode ligar-se ao anticorpo primário. A amplificação de sinal pode ocorrer como vários anticorpos secundários podendo reagir com diferentes epítopos sobre o anticorpo primário. Nas formas de realização em que o anticorpo secundário possa ser conjugado a um rótulo enzimático, um substrato cromogênico ou fluorogênico pode ser adicionado para proporcionar a visualização do antígeno. Em algumas modalidades, duas ou mais (no máximo quatro) formas de realização primárias (rotuladas ou não rotuladas) podem ser colocadas em contato com a amostra de tecido. Os anticorpos não rotulados podem ser então colocados em contato com os anticorpos secundários rotulados correspondentes. Em algumas formas de realização, outros métodos podem ser empregados para intensificação do sinal tal como o uso de um anticorpo terciário ou quaternário rotulado.
[0034] Em algumas formas de realização após o processo de recuperação de antígeno, sondas de ácido nucleico são aplicadas à amostra para realizar hibridização fluorescente in situ (FISH) ou hibridização cromogênica in situ (CISH).
[0035] Um sinal do gerador de sinais na sonda pode ser detectado com o uso de um sistema de detecção. A natureza do sistema de detecção usado pode depender da natureza dos geradores de sinal usados. O sistema de detecção pode incluir um sistema de detecção de ressonância de rotação de elétrons (ESR), um sistema de detecção de dispositivo de carga acoplado (CCD) (por exemplo, para radioisótopos), um sistema de detecção fluorescente, um sistema de detecção elétrica, um sistema de detecção de filme fotográfico, um sistema de detecção quimiluminescente, um sistema de detecção de enzimas, um sistema de detecção de microscopia de força atômica (AFM) e um sistema de detecção de microscopia de abertura de túnel de varredura (STM) (ambos usados Por exemplo na detecção de micropérolas), um sistema de detecção ótimo, um sistema de detecção próximo ao campo, ou um sistema de detecção de reflexão interna total (TIR). [0036] Uma ou mais das técnicas acima mencionadas podem ser usadas para se observar uma ou mais das características de um primeiro sinal de um primeiro gerador de sinal. Em algumas formas de realização, a intensidade do sinal, o comprimento de onda do sinal, a localização do sinal, a frequência do sinal ou o deslocamento do sinal podem ser determinados com o uso de uma ou mais das técnicas acima mencionadas. Em algumas formas de realização, uma ou mais das características acima mencionadas do sinal podem ser observadas, medidas e registradas. Em algumas formas de realização, um sinal pode ser observado in situ, isto é, um sinal pode ser observado diretamente do gerador de sinais associado através do aglutinante com o alvo na amostra de tecido. Em algumas formas de realização, um sinal do gerador de sinais pode ser analisado dentro da amostra de tecido, removendo a necessidade de separar sistemas de detecção à base de disposições separadas. Em outras formas de realização, após a ligação das sondas, o sinal pode ser separado do aglutinante e detectado fora da amostra biológica. Métodos para a separação do sinal podem incluir, sem limitar, o ELISA e espectrometria de massa, microdisposições de hibridizações.
[0037] Em algumas formas de realização, observar um sinal pode incluir capturar uma imagem da amostra de tecido. Em algumas formas de realização, um microscópio conectado a um dispositivo de formação de imagem pode ser usado como um sistema de detecção, de acordo com os métodos aqui apresentados. Em algumas formas de realização, um gerador de sinal (tal como um fluoróforo) pode ser excitado e o sinal obtido (tal como um sinal de fluorescência) pode ser observado e registrado na forma de um sinal digital (por exemplo, uma imagem digitalizada). O mesmo procedimento pode ser repetido para diferentes geradores de sinal (se presentes) que sejam ligados na amostra com o uso dos filtros de fluorescência apropriados.
[0038] Um agente químico pode ser aplicado à amostra de tecido para modificar o sinal. Em algumas formas de realização, a modificação do sinal pode incluir uma ou mais dentre uma mudança na característica de sinal, por exemplo, uma redução na intensidade do sinal, uma alteração no pico do sinal, uma mudança na frequência ressonante, ou clivagem (remoção) do gerador de sinal que resulte na remoção de sinal.
[0039] Em algumas formas de realização, um agente químico pode estar na forma de uma solução e a amostra de tecido pode estar em contato com a solução de agente químico por uma extensão de tempo predeterminada. A concentração da solução de agente químico e o tempo de contato podem ser dependentes do tipo de modificação de sinal desejado. Em algumas formas de realização, as condições de contato para o agente químico podem ser selecionadas de tal modo que o aglutinante, o alvo, a amostra de tecido, e a ligação entre o aglutinante e o alvo possam não ser afetados. Em algumas formas de realização, um agente químico pode apenas afetar o gerador de sinal e o agente químico pode não afetar a ligação de alvo/aglutinante ou a integridade do aglutinante. Assim, por meio de exemplo, um aglutinante pode incluir um anticorpo primário ou uma combinação de anticorpo primário/secundário. Um agente químico de acordo com os métodos apresentados neste relatório pode apenas afetar o gerador de sinal, e o anticorpo primário ou a combinação de anticorpo primário/anticorpo secundário podem essencialmente permanecer não afetados. Em algumas formas de realização, um aglutinante (tal como um anticorpo primário ou combinação de anticorpo primário ou combinação de anticorpo primário/anticorpo secundário) pode permanecer ligado ao alvo na amostra de tecido após se proceder ao contato da amostra com o agente químico. Em algumas formas de realização, um aglutinante pode permanecer ligado ao alvo na amostra de tecido após o contato de amostra com o agente químico, e a integridade do aglutinante pode permanecer essencialmente não afetada (por exemplo, um anticorpo pode substancialmente não desnaturar ou eluir na presença de um agente químico). Em outras formas de realização, o agente químico pode afetar a ligação de alvo/aglutinante/contatos de sinal/ligações. [0040] Em algumas formas de realização, alvos múltiplos podem ser detectados através de “despojar a sonda e voltar a sondar a amostra”; Despojar geralmente se refere a qualquer método, tal como, porém sem limitar, a imersão ou fluxo mediante aplicação repetida de uma solução não rotulada ou outra substância, tal como, porém sem limitar, água, solução salina, solução salina tamponada, ou etanol, de modo a prover um meio para dissociação, dispersão e remoção da sonda da amostra. Em algumas formas de realização, alvos múltiplos podem ser detectados através do uso de luz para fluorescentemente branquear o repórter ou gerador de sinal, por esse meio permitindo que o gerador de sinal seja reutilizado sobre uma nova sonda. Estes processos podem ser repetidos reiterativamente para se obter sondagens múltiplas da mesma amostra.
[0041] Em algumas formas de realização, uma característica do sinal pode ser observada após o contato da amostra com um agente químico para determinar a eficácia da modificação de sinal. Por exemplo, uma cor pode ser observada antes da aplicação do agente químico e a cor pode estar ausente após a aplicação do agente químico. Em outro exemplo, a intensidade da fluorescência de um gerador de sinal fluorescente pode ser observada antes do contato com o agente químico e após o contato com o agente químico. Em algumas formas de realização, uma redução na intensidade do sinal por uma quantidade predeterminada pode ser referida como modificação de sinal. Em algumas formas de realização, a modificação do sinal pode referir-se a uma redução na intensidade do sinal por uma quantidade em uma faixa de mais do que 50 por cento. Em algumas formas de realização, a modificação do sinal pode referir-se a um decréscimo na intensidade do sinal por uma quantidade em uma faixa de mais do que cerca de 60 por cento. Em algumas formas de realização, a modificação do sinal pode referir-se a um decréscimo na intensidade de sinal em uma quantidade em uma faixa de mais do que cerca de 80 por cento.
[0042] Em algumas formas de realização, a amostra de tecido pode ser colocada em contato com uma segunda sonda com o uso de um ou mais procedimentos neste relatório acima descritos quanto à primeira sonda. A segunda sonda pode ser capaz de se ligar a alvo diferente do alvo ligado pela primeira sonda. Nas formas de realização em que uma pluralidade de sondas possam ser colocadas em contato com a amostra de tecido na primeira etapa de contato de sonda, a segunda sonda pode ser capaz de ligar-se a um alvo diferente dos alvos ligados pelo primeiro conjunto de sondas. Em algumas formas de realização, uma amostra de tecido pode ser colocada em contato com uma pluralidade de sondas na segunda etapa de contato de sonda.
[0043] Um ou mais métodos de detecção aqui escritos mais acima podem ser usados para se observar uma ou mais características de um sinal subsequente (por exemplo, segundo, terceiro etc.) de um segundo gerador de sinal (presente na sonda subsequente). Em algumas formas de realização, a intensidade de sinal, o comprimento de onda do sinal, a localização do sinal, a frequência do sinal, ou o deslocamento do sinal podem ser determinados com o uso de uma ou mais das técnicas supra mencionadas. Semelhante ao primeiro sinal, um sinal subsequente (por exemplo, um sinal de fluorescência) obtido pode ser registrado na forma de um sinal digital (por exemplo, uma imagem digitalizada). Em algumas formas de realização, a observação de um sinal subsequente pode também incluir a captura de uma imagem óptica da amostra de tecido.
[0044] Em algumas formas de realização, após o contato, a amostra com uma sonda subsequente (por exemplo, segunda, terceira etc.), agente de modificação e subsequente administração de sonda, pode ser repetida múltiplas vezes. Em algumas formas de realização, após observar-se um segundo sinal da segunda sonda, a amostra de tecido pode ser colocada em contato com um agente químico para modificar o sinal da segunda sonda. Além disso, uma terceira sonda pode ser colocada em contato a amostra de tecido, em que a terceira sonda possa ser capaz de ligar-se a um alvo diferente das primeira e segunda sondas. Da mesma forma, um sinal da terceira sonda pode ser observado em seguida pela aplicação do agente químico para modificar o sinal. As etapas de contato, ligação e observação podem ser repetidas iterativamente por múltiplas vezes com o uso de uma enésima sonda capaz de ligar-se a alvos adicionais para prover o usuário com a informação acerca de uma variedade de alvos com o uso de uma variedade de alvos utilizando uma variedade de sondas e/ou geradores de sinais.
[0045] Em algumas formas de realização, uma série de sondas pode ser colocada em contato com a amostra de tecido de uma maneira sequencial para obter uma análise multiplexada da amostra de tecido. Em algumas formas de realização, uma série de conjunto de sondas (incluindo cerca de 4 sondas em um conjunto) pode ser colocado em contato com a amostra de tecidos de um maneira sequencial para se obter uma análise multiplexada da amostra de tecido. A análise multiplexada refere-se geralmente à análise dos alvos múltiplos em uma amostra de tecido com o uso do mesmo mecanismo de detecção.
[0046] Em certas formas de realização, um kit útil para realizar os métodos de recuperação de antígeno descritos acima é fornecido. O kit pode compreender uma ou mais das soluções de recuperação do antígeno. O kit pode compreender ainda instrução para uso.
[0047] Em algumas formas de realização, um kit incluirá um ou mais reagentes adicionais para imunocoloração e detecção. Por exemplo, em algumas formas de realização, o kit pode incluir um gerador de sinais tais como um cromóforo, um fluoróforo, uma etiqueta ativa de Raman, ou um rótulo radiativo. O kit pode também incluir reagentes, que possam melhorar a detecção ou amplificar o sinal como descrito acima, incluindo, porém não limitando, a enzima polimerase, outros tampões, cátions e sais de metais. [0048] De acordo com uma forma de realização, como mostrado na Figura 1, um dispositivo de manipulação de amostra 10 é descrito para proceder ao contato de uma amostra 15 de tecido fixado com formaldeído, com a recuperação de antígeno acima mencionado e outras soluções de lavagem e de coloração. O dispositivo de manipulação de amostra pode ser compreendido de um subsistema 20 de manipulação de amostra e um subsistema 30 de dispensação de reagente. Em certas formas de realização, o dispositivo pode também incluir um subsistema 40 de detecção de sinal. Em uma das formas de realização, o dispositivo de manipulação das amostras pode ser incorporado como um componente de um dispositivo analítico, tal como um sistema automático de elevada produção que seja capaz de manchar e processar a imagem da amostra de tecido fixada em formaldeído em um sistema e ainda mais analisar as imagens.
[0049] Como tal, em uma forma de realização, o sistema pode incluir um subsistema de manipulação de amostra para posicionar e mover a amostra de tecido fixada em formaldeído para análise, e um reagente de dispensação do subsistema para o contato da amostra com pelo menos um dentre uma primeira solução de recuperação de antígeno, uma segunda solução de recuperação de antígeno, e um regente de imunocoloração. O sistema de manipulação de amostra pode envolver múltiplos componentes e possibilitar o movimento da amostra de uma área para a seguinte. Por exemplo, a amostra pode ser colocada em contato com reagentes com o uso de um dispositivo, e movida e afixada até um estágio para retenção da imagem, o movimento do estágio sendo controlável. O estágio pode ser incorporado em um microscópio e capaz de movimentar a amostra através de um campo de formação de imagem.
[0050] O sistema pode também incluir um subsistema de detecção de sinal (não mostrado) para capturar imagens da amostra através do processo de coloração. A imagem pode ser capturada com o uso de várias fontes de iluminação. Em certas formas de realização, a captura da imagem pode fazer parte de um microscópio de formação de imagem capaz de capturar e transferir uma imagem digital da amostra em várias ampliações. Em ainda outra forma de realização, o sistema automatizado pode incluir um meio legível de computador que possa incluir instruções para a técnica automatizada para a análise da amostra de tecido fixada em formaldeído manchado.
[0051 ] Em outras formas de realização, o dispositivo de manipulação da amostra pode ser capaz de ciclagem através de múltiplas etapas de recuperação de antígeno, rotulagem de fluorescência, formação de imagem, e extração da sonda fluorescente. A coloração pode também envolver a rotulagem de imunoperoxidase. Em uma forma de realização, um substrato de peroxidase solúvel em álcool, 3-amino-9-etilcarbazol (AEC), pode ser usado seguido pela remoção do precipitado de AEC, opcional ainda a inativação da peroxidase com um tratamento de peróxido brando e coloração repetida. Em outras formas de realização, a sonda fluorescente pode ser excisada através de um tratamento químico, um tratamento térmico ou uma combinação destes. [0052] O dispositivo de manipulação da amostragem pode ser automatizado de tal modo que os ciclos múltiplos possam ocorrer in situ, para minimizar deslocamento da amostra e auxiliar no mapeamento dos múltiplos marcadores em um setor do tecido ou na amostra celular.
EXPERIMENTAL
MÉTODOS
[0053] As variáveis que afetam a relação de sinal para ruído, o que é uma reflexão da sensibilidade do sistema, foram analisadas com o uso de uma delineação da abordagem da experiência (DOE). As variáveis incluíram a temperatura, tempo de exposição, pH e sequência de lavagem. As imagens foram adquiridas com o uso de um microscópio Zeiss Axilmager Z1 em ampliação de 20x ou 63x. A quantificação das imagens foi feita com o uso do software GNU Image Manipulation Program (GIMP) calculando a intensidade média do pixel por área após subtrair a intensidade de fundo do pixel das áreas não manchadas. A intensidade média de pixéis foi calculada como a média de 10 imagens do mesmo tecido.
[0054] Os seguintes materiais foram usados para o estudo: o tecido humano de arquivos foi de uma variedade de fontes e incluíram amostras para as mamas, a próstata, os pulmões, o cólon, a placenta, a glândula salivar, linfonodo, cérebro e pele. Todas as amostras foram de arquivos de tecidos. Os específicos usados para a fixação são desconhecidos e presume-se tenham seguido a prática da patologia padrão. Os anticorpos para AR foram obtidos do Lab Vision Corporation (parte do Thermo Fisher Scientific) e foram conjugados na firma com os fluorocromos Cy3 e Cy5 com o uso de procedimentos padrão. Solução de recuperação de antígeno à base de citrato foi obtida da Vector Laboratories e diluída a 1:20 com um valor de pH final 6,0. Um tampão à base de Tris consistiu de Tris 10 mM [tris(hidroximetil)aminometano], EDTA 1 mM (ácido etilenodiaminatetraacético), 1 % de Tween-20 (monolaurato de polioxietilenossorbitano para dar um valor de pH de 8 (feito de uma solução de estoque de 10x recém-preparada). Um fogão doméstico padrão foi usado para aquecer, estabelecer em alta potência por 20 minutos e manualmente monitorado.
[0055] Seções de tecidos implantadas em parafina fixada em formalina foram processadas pelo cozimento das lâminas em 65 °C por 1 hora e remoção da cera da seção de amostra com um agente de purificação de histoescolha. Foi observado que assar as amostras não foi necessário, mas foi usado como uma prática padrão.
[0056] As amostras foram então processadas através de uma série de lavagens de álcool de concentração decrescente (100, 95, 70, 50 % tipicamente), cada uma duas lavagens de 10 minutos, e depois levadas a condições salinas em solução de PBS por 10 minutos. As amostras foram então permeabilizadas com um breve tratamento em PBS contendo 0,3 % de Triton X-100, seguido pelo processo de recuperação.
[0057] O processo de recuperação incluiu colocar as amostras em uma Solução A (Tris pH 8,0 com 1 % de Tween 20) em um fogão a pressão ou microondas por aproximadamente 20 minutos. No final do ciclo de calor, as amostras foram colocadas em uma solução B pré-aquecida (solução de citrato, pH 6) em uma câmara aquecida sem calor adicional. As amostras não foram transferidas para uma solução fria de PBS entre as duas soluções quentes, não expostas a calor adicional na segunda solução. Após as amostras na segunda solução terem chegado à temperatura ambiente (aproximadamente 20 minutos), elas foram lavadas em PBS extensivamente antes de qualquer etapa adicional de processamento, tal como o tratamento de bloqueio ou de peroxidase (para inativação da peroxidase endógena).
[0058] As amostras podem, então, sofrer de imunodetecção. Após uma primeira rodada de detecção de imunodetecção, as amostras podem ser depuradas do sinal e novamente sondadas quanto aos antígenos adicionais. [0059] Alternativamente, lâminas eram processadas com o uso de um Discovery® XT Autocorante (Ventana Medical Systems, Inc.) usando um ajuste de programa semelhante às condições do processo manual. Posteriormente, amostras de código de barras e reagentes de preparo, lâminas, lâminas eram carregadas no auto-corante e processadas como segue: as amostras foram aquecidas e desenceradas por lavagem em um reagente EZ-prep (solução de remoção de cera por Ventana Discovery XT). A recuperação dos antígenos foi realizada com o uso de CC1 e CC2 (duas soluções para recuperação de antígenos fornecidas por Ventana para uso sobre o auto- X corante Discovery XT), soluções com base em Tris e Ácido Cítrico, respectivamente. Para os fins de comparação com o método manual de duas etapas, recuperações curtas e intermediárias de antígenos foram conduzidas, as quais foram expressas como brandas e padrão no programa da Discovery XT Autostainer program. Deve ser observado que, em sistemas automatizados, as amostras de tecidos são lavadas entre as duas etapas de recuperação de antígenos, uma diferença chave entre o processo manual aqui descrito e os processos automáticos. As lâminas foram então manchadas manualmente junto das amostras laterais processadas pelo método manual de duas etapas.
RESULTADOS E OBSERVAÇÕES O uso de um anticorpo receptor androgênico para detecção de AR nas seções de tecido prostático humanos de arquivos inicialmente foi selecionado para análise. Esta combinação foi escolhida por causa da falta de sinal detectável produzido quando a coloração é feita na ausência de desmascaramento de epítopo (não mostrado). Com o uso de dois tampões comuns para desmascaramento de antígeno, citrato ou Tris, e tratando as amostras por 20 minutos, uma coloração em fogão de pressão de intensidade moderada foi produzido com o uso de um corante fluorescente. As condições de desmascaramento de citrato que foram usadas representa o protocolo comumente usado para detecção de AR por uma variedade de anticorpos. Várias condições foram testadas, incluindo o Citrato sozinho (conjunto 1), Tris isolado (conjunto 2), Tris depois Citrato (conjunto 3) e Citrato depois Tris (conjunto 4). Todas as condições foram testadas sobre lâminas em triplicata, exceto as amostras de controle em que dez lâminas foram manchadas para estabelecer uma medição de linha de base.
[0060] Uma primeira série de experiências usou o anticorpo AR do Lab Vision, seguido pela detecção com anticorpo secundário Cy3 anti-coelho de macaco. Todos os dados de aquisição usaram tempos de exposição iguais e as imagens foram coletadas imediatamente após a coloração. Como mostrado na Figura 2, o processo de duas etapas forneceu uma intensificação significativa à coloração de AR quando comparado a qualquer dentre citrato ou tris isolados. A Figura 2 é uma imagem monocromática da coloração, mostrando coloração intensificada sobre a luz, com o uso de um procedimento de suas etapas.
[0061] Em geral, para cada conjunto de lâminas, um aumento de duas vezes ou mais na intensidade de coloração foi observado quanto ao AR com um método de duas etapas em comparação com uma amostra de controle. O tempo de exposição para uma solução aquecida foi controlado com todas as lâminas que receberam um tempo de 50 minutos. A primeira etapa aquecida foi realizada sob pressão em um fogão de pressão doméstico para todas as lâminas experimentais. Após 25 minutos, as lâminas dos conjuntos 1 e 2 foram colocadas dentro de um novo vaso de solução pré-aquecida (a mesma solução da primeira etapa aquecida em vasos separados, enquanto a primeira etapa se achava a caminho) e deixada esfriar no fogão de pressão (não sob pressão) por um adicional de 25 minutos. As lâminas foram então lavadas em PBS e manchadas durante a noite em 4 °C com o anticorpo primário. Quanto às lâminas dos conjuntos 3 e 4, as soluções foram mudadas para as respectivas condições, conforme descrito acima, durante os últimos 25 minutos de tratamento e processadas em paralelo com os outros conjuntos.
[0062] Várias permutações no procedimento de duas etapas foram também testadas. Em uma permutação, a sequência na qual as duas soluções foram usadas não influenciaram os resultados. Nenhuma diferença nos resultados era observada caso a solução acídica fosse usada em primeiro lugar, seguida pelo básico, ou vice-versa.
[0063] Outras permutações no método provaram ser prejudiciais ao processo. Estas incluíram a repressurização da amostra pelo segundo período de aquecimento, e lavagem em PBS entre a primeira e a segunda etapas. Ambas estas mudanças resultaram em uma perda dramática do tecido da lâmina e foram assim evitadas.
[0064] Após os testes nos anticorpos primários para AR e detecção com anticorpos secundários, anticorpos de AR conjugados diretamente a Cy5 foram testados. Resultados semelhantes foram encontrados com o uso dos conjugados diretos por meio dos quais a coloração reforçada foi observada nos testes de uma ampla amostragem de outros anticorpos comercialmente disponíveis. O processo resultou também em coloração intensificada com o uso de vários fosfoepítopos de graduação comercial, os quais são frequentemente instáveis e propensos à degradação em processos de recuperação.
[0065] O procedimento pode também ser administrado em outras aplicações tais como o isolamento de proteínas dos tecidos FFPE em que métodos de recuperação de antígenos foram apresentados para intensificar a extração e a recuperação de proteínas. O procedimento pode também ter uso na micro-dissecção de captura a laser dos tecidos FFPE como uma fonte de proteínas para análise proteômica.
[0066] Em outra forma de realização, a invenção pode ser usada sobre amostras de FFPE antes da análise de FISH ou CISH. Tipicamente, a amostra de FFPE, sendo submetida às análises de FISH ou CISH, será exposta a uma etapa de pré-tratamento de calor antes da desnaturação do DNA e da hibridização de sonda. De acordo com uma forma de realização, o procedimento de duas etapas pode ser substituído pela etapa de pré-tratamento de calor ou outros procedimentos usados para preparar a amostra de tecido antes das análises de FISH ou CISH. A Figura 3 mostra micrografias monocromáticas (em ampliação de 20X e de 63X) apresentando coloração intensificada com o uso de um procedimento de duas etapas em uma análise FISH multíplex de tumor BrCA com o uso de vários anticorpos.
COMPARAÇÃO DOS MÉTODOS
[0067] Um processo automático foi também avaliado com o uso do Discovery® XT Autocorante. Houve diferenças nas condições do processo entre o autocorante e o processo manual de duas etapas relacionadas à operação do instrumento. Por exemplo, o autocorante usado quente e o detergente para desencerar amostras, enquanto o processo manual usou o reagente não tóxico Histochoice® para limpar a cera (Amresco).
[0068] Células LNCaP (FFPE) fixadas em formalina, implantadas em parafina (American Type Culture Collection (ATCC, Maryland) foram manchadas por S6, phospho-S6 ser235/236, ou phospho-S6 ser240/244, após as células terem sido preparadas por recuperação manual de antígeno de duas etapas aqui descrita, ou por dois métodos semelhantes com o uso de autocorante Discovery® XT. Enquanto a recuperação de antígeno foi realizada com o uso de um processo manual ou automático, diferenças foram observadas na remoção/modificação de sinal e na re-decoração. Na maioria dos casos, uma redução na decoração resulta de 1 ou 5 etapas de modificação de sinal com o uso do sistema automático. Para S6, uma perda completa de decoração resultou após apenas uma rodada de modificação de sinal com o uso dos métodos automáticos. Em todos os casos, o método manual de duas etapas também apresentou menos sensibilidade quando manchando, tampouco fosfo-epítopo.
[0069] As diferenças são ilustradas na Figura 4, a qual é uma representação gráfica de uma análise quantitativa comparando a estabilidade do maior epítopo proporcionada pelo método manual de recuperação de antígeno em comparação com dois processos automáticos. As intensidades médias dos pixéis são mostradas avaliando-se o efeito de branqueamento sobre o antígeno-S6. As lâminas foram preparadas por três diferentes métodos de remoção de cera e recuperação de antígenos e submetidas a 0, 1 e 5 rodadas de branqueamento antes de serem manchadas. A análise quantitativa indicou o método manual de duas etapas que melhor preservou o antígeno. Diferentes epítopos sobre a mesma proteínas responderam de forma diferente ao branqueamento, o que pode indicar um efeito de epítopo predominantemente, não perda de proteína. Isto é também mostrado na Figura 5, que são micrografias monocromáticas (com ampliação de 20X) do efeito de branqueamento sobre o antígeno-56 comparando o método manual de recuperação de antígenos de duas etapas com dois processos automáticos. [0070] A invenção pode ser expressa em outras formas específicas sem que se afaste do seu espírito ou características essenciais. As formas de realização precedentes devem portanto ser consideradas em todos os sentidos como ilustrativas, ao invés de limitativas, da invenção descrita nesta relatório descritivo. O escopo da invenção é, assim, indicado pelas reivindicações anexas, ao invés de pela descrição precedente, e todas as mudanças que se situem dentro do significado e da faixa de equivalência das reivindicações, tenciona-se, portanto, que sejam incluídos na invenção.
REIVINDICAÇÕES
Claims (7)
1. Método para recuperar antígenos em uma amostra de tecido fixada em formaldeído, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: incubar a amostra de tecido fixada em formaldeído em uma primeira solução de recuperação de antígeno a uma temperatura maior que 90°C; transferir a amostra de tecido fixada em formaldeído para uma segunda solução de recuperação de antígeno; e incubar a amostra de tecido fixada em formaldeído na segunda solução de recuperação de antígeno a uma temperatura maior que 90°C; em que a primeira solução de recuperação de antígeno compreende uma solução tampão tendo uma faixa de pH entre 5 e 7, e a segunda solução de recuperação de antígeno compreende uma solução tampão tendo uma faixa de pH entre 7,5 e 11; ou a primeira solução de recuperação de antígeno compreende uma solução tampão tendo uma faixa de pH entre 7,5 e 11, e a segunda solução de recuperação de antígeno compreende uma solução tampão tendo uma faixa de pH entre 5 e 7, em que a solução tampão tendo uma faixa de pH entre 5 e 7 compreende ácido cítricoe a solução tampão com uma faixa de pH entre 7,5 e 11 compreende tris-(hidroximetil)metilamina (TRIS).
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a solução tampão com uma faixa de pH entre 5 e 7 é uma solução tampão de fosfato de sódio de ácido cítrico tendo um pH de aproximadamente 6,0.
3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a amostra de tecido fixada em formaldeído é implantada em parafina.
4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que as etapas de incubação com a primeira solução de recuperação de antígeno e a segunda solução de recuperação de antígeno compreende a incubação em um dispositivo de aquecimento por um período maior que dez minutos; opcionalmente em que o dispositivo de aquecimento é um fogão de pressão, autoclavagem, banho de água, placa quente, microondas, aquecimento a vapor, ou combinações destes.
5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que ainda compreende a etapa de imunocoloração dos antígenos; opcionalmente em que a imunocoloração compreende a rotulagem de imunoperoxidase sequencial e raspagem.
6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a amostra de tecido fixada em formaldeído sofre a análise FISH ou CISH.
7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a amostra de tecido é transferida à segunda solução de recuperação de antígeno sem tratamento adicional.
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| US10274498B1 (en) | 2018-04-05 | 2019-04-30 | Rarecyte, Inc. | Analyte detection |
| US10330684B1 (en) * | 2018-04-05 | 2019-06-25 | Rarecyte, Inc. | Analyte detection |
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| JP3797418B2 (ja) * | 2001-05-29 | 2006-07-19 | 茂樹 並松 | 抗原賦活化法及びその抗原賦活剤 |
| US20040029184A1 (en) * | 2002-08-09 | 2004-02-12 | Pickcell Laboratories B.V. | Method for antigen retrieval and submersion fluid compositions for use therein |
| GB0304515D0 (en) | 2003-02-27 | 2003-04-02 | Dakocytomation Denmark As | Standard |
| JP3899407B2 (ja) * | 2003-06-26 | 2007-03-28 | 国立大学法人 鹿児島大学 | 免疫組織化学的染色方法による抗原の検出方法 |
| US20050053626A1 (en) * | 2003-09-05 | 2005-03-10 | Harrington John Ames | Grace process biotechnology patent the cure to the herpes virus |
| DK1751275T3 (da) * | 2004-06-01 | 2017-11-27 | Avigen Inc | Sammensætninger og fremgangsmåder til forebyggelse af aggregering af aav-vektorer |
| US7867443B2 (en) | 2004-07-23 | 2011-01-11 | Dako Denmark A/S | Method and apparatus for automated pre-treatment and processing of biological samples |
| CA2609453C (en) * | 2005-05-24 | 2014-07-08 | Lee H. Angros | In situ heat induced antigen recovery and staining apparatus and method |
| WO2007047450A1 (en) | 2005-10-13 | 2007-04-26 | Aureon Laboratories, Inc. | Multiplex in situ immunohistochemical analysis |
| US8048640B2 (en) * | 2007-01-30 | 2011-11-01 | Health Research, Inc. | Methods for evaluating and implementing prostate disease treatments |
| ES2385523T3 (es) * | 2007-02-09 | 2012-07-26 | Dako Denmark A/S | Recuperación de antígeno horizontal |
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