KR20120049897A - 항원 복원 공정을 위한 방법 및 장치 - Google Patents
항원 복원 공정을 위한 방법 및 장치 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20120049897A KR20120049897A KR1020127004876A KR20127004876A KR20120049897A KR 20120049897 A KR20120049897 A KR 20120049897A KR 1020127004876 A KR1020127004876 A KR 1020127004876A KR 20127004876 A KR20127004876 A KR 20127004876A KR 20120049897 A KR20120049897 A KR 20120049897A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- antigen
- solution
- sample
- acid
- tris
- Prior art date
Links
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims abstract description 110
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims abstract description 109
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims abstract description 105
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 95
- 230000008569 process Effects 0.000 title description 22
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 66
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 38
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 20
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 20
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 17
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 claims description 15
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 claims description 14
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- SEQKRHFRPICQDD-UHFFFAOYSA-N N-tris(hydroxymethyl)methylglycine Chemical compound OCC(CO)(CO)[NH2+]CC([O-])=O SEQKRHFRPICQDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 claims description 7
- 230000008439 repair process Effects 0.000 claims description 7
- SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 2-(N-morpholiniumyl)ethanesulfonate Chemical compound [O-]S(=O)(=O)CC[NH+]1CCOCC1 SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- -1 dimethyl Arsine Chemical compound 0.000 claims description 6
- FSVCELGFZIQNCK-UHFFFAOYSA-N N,N-bis(2-hydroxyethyl)glycine Chemical compound OCCN(CCO)CC(O)=O FSVCELGFZIQNCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- JOCBASBOOFNAJA-UHFFFAOYSA-N N-tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethanesulfonic acid Chemical compound OCC(CO)(CO)NCCS(O)(=O)=O JOCBASBOOFNAJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 claims description 5
- 238000011084 recovery Methods 0.000 claims description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 4
- IHPYMWDTONKSCO-UHFFFAOYSA-N 2,2'-piperazine-1,4-diylbisethanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCN1CCN(CCS(O)(=O)=O)CC1 IHPYMWDTONKSCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- FTOAOBMCPZCFFF-UHFFFAOYSA-N 5,5-diethylbarbituric acid Chemical compound CCC1(CC)C(=O)NC(=O)NC1=O FTOAOBMCPZCFFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 claims description 3
- UZMAPBJVXOGOFT-UHFFFAOYSA-N Syringetin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2=C(C(=O)C3=C(O)C=C(O)C=C3O2)O)=C1 UZMAPBJVXOGOFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000007997 Tricine buffer Substances 0.000 claims description 3
- 208000034953 Twin anemia-polycythemia sequence Diseases 0.000 claims description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 3
- 229960002319 barbital Drugs 0.000 claims description 3
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 claims description 3
- KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N dihydrochrysin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2OC3=CC(O)=CC(O)=C3C(=O)C2)=C1 KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 claims description 3
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000007998 bicine buffer Substances 0.000 claims description 2
- 238000002509 fluorescent in situ hybridization Methods 0.000 claims description 2
- 238000002493 microarray Methods 0.000 claims description 2
- 102100032218 Cytokine-inducible SH2-containing protein Human genes 0.000 claims 1
- 101000943420 Homo sapiens Cytokine-inducible SH2-containing protein Proteins 0.000 claims 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 claims 1
- 125000004029 hydroxymethyl group Chemical group [H]OC([H])([H])* 0.000 claims 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 claims 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 claims 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 126
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 82
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 26
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 26
- 239000013043 chemical agent Substances 0.000 description 19
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 15
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 15
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 13
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 13
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 11
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 11
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 10
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 10
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 10
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 8
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 8
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 7
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 7
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 7
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 7
- 238000004061 bleaching Methods 0.000 description 6
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 5
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 239000001993 wax Substances 0.000 description 5
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- OXEUETBFKVCRNP-UHFFFAOYSA-N 9-ethyl-3-carbazolamine Chemical compound NC1=CC=C2N(CC)C3=CC=CC=C3C2=C1 OXEUETBFKVCRNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 description 3
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 3
- GLNDAGDHSLMOKX-UHFFFAOYSA-N coumarin 120 Chemical compound C1=C(N)C=CC2=C1OC(=O)C=C2C GLNDAGDHSLMOKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 3
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 3
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 3
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 3
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 3
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 3
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 3
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 3
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- HBEDSQVIWPRPAY-UHFFFAOYSA-N 2,3-dihydrobenzofuran Chemical compound C1=CC=C2OCCC2=C1 HBEDSQVIWPRPAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PXBFMLJZNCDSMP-UHFFFAOYSA-N 2-Aminobenzamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CC=C1N PXBFMLJZNCDSMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OBYNJKLOYWCXEP-UHFFFAOYSA-N 2-[3-(dimethylamino)-6-dimethylazaniumylidenexanthen-9-yl]-4-isothiocyanatobenzoate Chemical compound C=12C=CC(=[N+](C)C)C=C2OC2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC(N=C=S)=CC=C1C([O-])=O OBYNJKLOYWCXEP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HSHNITRMYYLLCV-UHFFFAOYSA-N 4-methylumbelliferone Chemical compound C1=C(O)C=CC2=C1OC(=O)C=C2C HSHNITRMYYLLCV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 2
- BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N Phenolsulfonephthalein Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C1(C=2C=CC(O)=CC=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N Riboflavin Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N 0.000 description 2
- DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N acridine Chemical compound C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3N=C21 DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 2
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 2
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 2
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 2
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 2
- 238000004630 atomic force microscopy Methods 0.000 description 2
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 2
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 2
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000013400 design of experiment Methods 0.000 description 2
- 239000012645 endogenous antigen Substances 0.000 description 2
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IINNWAYUJNWZRM-UHFFFAOYSA-L erythrosin B Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(I)C(=O)C(I)=C2OC2=C(I)C([O-])=C(I)C=C21 IINNWAYUJNWZRM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 2
- 238000003365 immunocytochemistry Methods 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 2
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 2
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 2
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 2
- 229960003531 phenolsulfonphthalein Drugs 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 150000003220 pyrenes Chemical class 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 229940043267 rhodamine b Drugs 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 2
- YBBRCQOCSYXUOC-UHFFFAOYSA-N sulfuryl dichloride Chemical compound ClS(Cl)(=O)=O YBBRCQOCSYXUOC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N texas red Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C1=CC(S(Cl)(=O)=O)=CC=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GIANIJCPTPUNBA-QMMMGPOBSA-N (2s)-3-(4-hydroxyphenyl)-2-nitramidopropanoic acid Chemical compound [O-][N+](=O)N[C@H](C(=O)O)CC1=CC=C(O)C=C1 GIANIJCPTPUNBA-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- DUFUXAHBRPMOFG-UHFFFAOYSA-N 1-(4-anilinonaphthalen-1-yl)pyrrole-2,5-dione Chemical compound O=C1C=CC(=O)N1C(C1=CC=CC=C11)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 DUFUXAHBRPMOFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZTTARJIAPRWUHH-UHFFFAOYSA-N 1-isothiocyanatoacridine Chemical compound C1=CC=C2C=C3C(N=C=S)=CC=CC3=NC2=C1 ZTTARJIAPRWUHH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VGIRNWJSIRVFRT-UHFFFAOYSA-N 2',7'-difluorofluorescein Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(F)C(=O)C=C2OC2=CC(O)=C(F)C=C21 VGIRNWJSIRVFRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RUDINRUXCKIXAJ-UHFFFAOYSA-N 2,2,3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,9,9,10,10,11,11,12,12,13,13,14,14,14-heptacosafluorotetradecanoic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)F RUDINRUXCKIXAJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IOOMXAQUNPWDLL-UHFFFAOYSA-N 2-[6-(diethylamino)-3-(diethyliminiumyl)-3h-xanthen-9-yl]-5-sulfobenzene-1-sulfonate Chemical compound C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=C(S(O)(=O)=O)C=C1S([O-])(=O)=O IOOMXAQUNPWDLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LAXVMANLDGWYJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-5-(2-aminoethyl)naphthalene-1-sulfonic acid Chemical compound NC1=CC=C2C(CCN)=CC=CC2=C1S(O)(=O)=O LAXVMANLDGWYJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CPBJMKMKNCRKQB-UHFFFAOYSA-N 3,3-bis(4-hydroxy-3-methylphenyl)-2-benzofuran-1-one Chemical compound C1=C(O)C(C)=CC(C2(C3=CC=CC=C3C(=O)O2)C=2C=C(C)C(O)=CC=2)=C1 CPBJMKMKNCRKQB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YSCNMFDFYJUPEF-UHFFFAOYSA-N 4,4'-diisothiocyanostilbene-2,2'-disulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)C1=CC(N=C=S)=CC=C1C=CC1=CC=C(N=C=S)C=C1S(O)(=O)=O YSCNMFDFYJUPEF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SJQRQOKXQKVJGJ-UHFFFAOYSA-N 5-(2-aminoethylamino)naphthalene-1-sulfonic acid Chemical compound C1=CC=C2C(NCCN)=CC=CC2=C1S(O)(=O)=O SJQRQOKXQKVJGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YJCCSLGGODRWKK-UHFFFAOYSA-N 5-acetamido-2-[2-(4-isothiocyanato-2-sulfophenyl)ethenyl]benzenesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)C1=CC(NC(=O)C)=CC=C1C=CC1=CC=C(N=C=S)C=C1S(O)(=O)=O YJCCSLGGODRWKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NJYVEMPWNAYQQN-UHFFFAOYSA-N 5-carboxyfluorescein Chemical compound C12=CC=C(O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C2C21OC(=O)C1=CC(C(=O)O)=CC=C21 NJYVEMPWNAYQQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AXGKYURDYTXCAG-UHFFFAOYSA-N 5-isothiocyanato-2-[2-(4-isothiocyanato-2-sulfophenyl)ethyl]benzenesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)C1=CC(N=C=S)=CC=C1CCC1=CC=C(N=C=S)C=C1S(O)(=O)=O AXGKYURDYTXCAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HWQQCFPHXPNXHC-UHFFFAOYSA-N 6-[(4,6-dichloro-1,3,5-triazin-2-yl)amino]-3',6'-dihydroxyspiro[2-benzofuran-3,9'-xanthene]-1-one Chemical compound C=1C(O)=CC=C2C=1OC1=CC(O)=CC=C1C2(C1=CC=2)OC(=O)C1=CC=2NC1=NC(Cl)=NC(Cl)=N1 HWQQCFPHXPNXHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TXSWURLNYUQATR-UHFFFAOYSA-N 6-amino-2-(3-ethenylsulfonylphenyl)-1,3-dioxobenzo[de]isoquinoline-5,8-disulfonic acid Chemical compound O=C1C(C2=3)=CC(S(O)(=O)=O)=CC=3C(N)=C(S(O)(=O)=O)C=C2C(=O)N1C1=CC=CC(S(=O)(=O)C=C)=C1 TXSWURLNYUQATR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZIDRAQTRIQDX-UHFFFAOYSA-N 6-carboxy-x-rhodamine Chemical compound OC(=O)C1=CC=C(C([O-])=O)C=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 WQZIDRAQTRIQDX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YALJZNKPECPZAS-UHFFFAOYSA-N 7-(diethylamino)-3-(4-isothiocyanatophenyl)-4-methylchromen-2-one Chemical compound O=C1OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C(C)=C1C1=CC=C(N=C=S)C=C1 YALJZNKPECPZAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SGAOZXGJGQEBHA-UHFFFAOYSA-N 82344-98-7 Chemical compound C1CCN2CCCC(C=C3C4(OC(C5=CC(=CC=C54)N=C=S)=O)C4=C5)=C2C1=C3OC4=C1CCCN2CCCC5=C12 SGAOZXGJGQEBHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100032187 Androgen receptor Human genes 0.000 description 1
- FYEHYMARPSSOBO-UHFFFAOYSA-N Aurin Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C(C=1C=CC(O)=CC=1)=C1C=CC(=O)C=C1 FYEHYMARPSSOBO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N D-Lyxoflavin Natural products OCC(O)C(O)C(O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 230000008836 DNA modification Effects 0.000 description 1
- XPDXVDYUQZHFPV-UHFFFAOYSA-N Dansyl Chloride Chemical compound C1=CC=C2C(N(C)C)=CC=CC2=C1S(Cl)(=O)=O XPDXVDYUQZHFPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 238000004435 EPR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 description 1
- QTANTQQOYSUMLC-UHFFFAOYSA-O Ethidium cation Chemical compound C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 QTANTQQOYSUMLC-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 208000034951 Genetic Translocation Diseases 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- 101100412856 Mus musculus Rhod gene Proteins 0.000 description 1
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N O-Xylene Chemical compound CC1=CC=CC=C1C CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010026552 Proteome Proteins 0.000 description 1
- BLRPTPMANUNPDV-UHFFFAOYSA-N Silane Chemical compound [SiH4] BLRPTPMANUNPDV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101100242191 Tetraodon nigroviridis rho gene Proteins 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N [4-(4-hydrazinylphenyl)phenyl]hydrazine Chemical compound C1=CC(NN)=CC=C1C1=CC=C(NN)C=C1 SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 239000003929 acidic solution Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 150000001251 acridines Chemical class 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 108010080146 androgen receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000009833 antibody interaction Effects 0.000 description 1
- 229940027998 antiseptic and disinfectant acridine derivative Drugs 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 239000003637 basic solution Substances 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 238000006664 bond formation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 238000000339 bright-field microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000012267 brine Substances 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- CBBHMYUUBDQHHS-UHFFFAOYSA-N butanoic acid;pyrene Chemical class CCCC(O)=O.C1=CC=C2C=CC3=CC=CC4=CC=C1C2=C43 CBBHMYUUBDQHHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007707 calorimetry Methods 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000019522 cellular metabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 1
- 238000002038 chemiluminescence detection Methods 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 230000002559 cytogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- OOYIOIOOWUGAHD-UHFFFAOYSA-L disodium;2',4',5',7'-tetrabromo-4,5,6,7-tetrachloro-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-3',6'-diolate Chemical compound [Na+].[Na+].O1C(=O)C(C(=C(Cl)C(Cl)=C2Cl)Cl)=C2C21C1=CC(Br)=C([O-])C(Br)=C1OC1=C(Br)C([O-])=C(Br)C=C21 OOYIOIOOWUGAHD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- KPBGWWXVWRSIAY-UHFFFAOYSA-L disodium;2',4',5',7'-tetraiodo-6-isothiocyanato-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-3',6'-diolate Chemical compound [Na+].[Na+].O1C(=O)C2=CC=C(N=C=S)C=C2C21C1=CC(I)=C([O-])C(I)=C1OC1=C(I)C([O-])=C(I)C=C21 KPBGWWXVWRSIAY-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- XHXYXYGSUXANME-UHFFFAOYSA-N eosin 5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC(Br)=C(O)C(Br)=C1OC1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 XHXYXYGSUXANME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940011411 erythrosine Drugs 0.000 description 1
- 239000004174 erythrosine Substances 0.000 description 1
- 235000012732 erythrosine Nutrition 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004754 hybrid cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 238000012760 immunocytochemical staining Methods 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 150000002540 isothiocyanates Chemical class 0.000 description 1
- 238000000370 laser capture micro-dissection Methods 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 229940107698 malachite green Drugs 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 239000007769 metal material Substances 0.000 description 1
- 239000011325 microbead Substances 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 108091005601 modified peptides Proteins 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 125000004433 nitrogen atom Chemical group N* 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000010915 one-step procedure Methods 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- AFAIELJLZYUNPW-UHFFFAOYSA-N pararosaniline free base Chemical compound C1=CC(N)=CC=C1C(C=1C=CC(N)=CC=1)=C1C=CC(=N)C=C1 AFAIELJLZYUNPW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002978 peroxides Chemical class 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 1
- ZWLUXSQADUDCSB-UHFFFAOYSA-N phthalaldehyde Chemical class O=CC1=CC=CC=C1C=O ZWLUXSQADUDCSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 1
- 229920000729 poly(L-lysine) polymer Polymers 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 150000003141 primary amines Chemical group 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000002331 protein detection Methods 0.000 description 1
- 238000000751 protein extraction Methods 0.000 description 1
- 238000000164 protein isolation Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 239000002096 quantum dot Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- MYFATKRONKHHQL-UHFFFAOYSA-N rhodamine 123 Chemical compound [Cl-].COC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=CC(=[NH2+])C=C2OC2=CC(N)=CC=C21 MYFATKRONKHHQL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002151 riboflavin Substances 0.000 description 1
- 235000019192 riboflavin Nutrition 0.000 description 1
- 229960002477 riboflavin Drugs 0.000 description 1
- 210000003079 salivary gland Anatomy 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000004574 scanning tunneling microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N serine Chemical compound OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 229910000077 silane Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- FYKDNWHPKQOZOT-UHFFFAOYSA-M sodium;dihydrogen phosphate;2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O.OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O FYKDNWHPKQOZOT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- 239000012192 staining solution Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- COIVODZMVVUETJ-UHFFFAOYSA-N sulforhodamine 101 Chemical compound OS(=O)(=O)C1=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C1C1=C(C=C2C3=C4CCCN3CCC2)C4=[O+]C2=C1C=C1CCCN3CCCC2=C13 COIVODZMVVUETJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N tetramethylrhodamine Chemical compound C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C([O-])=O ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M thionine Chemical compound [Cl-].C1=CC(N)=CC2=[S+]C3=CC(N)=CC=C3N=C21 ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000000451 tissue damage Effects 0.000 description 1
- 231100000827 tissue damage Toxicity 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 238000011179 visual inspection Methods 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- 239000008096 xylene Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/30—Staining; Impregnating ; Fixation; Dehydration; Multistep processes for preparing samples of tissue, cell or nucleic acid material and the like for analysis
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/30—Staining; Impregnating ; Fixation; Dehydration; Multistep processes for preparing samples of tissue, cell or nucleic acid material and the like for analysis
- G01N1/31—Apparatus therefor
- G01N1/312—Apparatus therefor for samples mounted on planar substrates
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Sampling And Sample Adjustment (AREA)
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
본 발명은 90℃ 초과의 온도에서 제1 항원 복원 용액에서 포름알데히드-고정된 조직 샘플을 인큐베이션하는 단계, 조직 샘플을 제2 항원 복원 용액으로 이전시키는 단계, 및 90℃ 초과의 온도에서 제2 항원 복원 용액에서 조직 샘플을 인큐베이션하는 단계를 포함하는, 포름알데히드-고정된 조직 샘플의 항원 복원 방법을 제공한다. 또한 본 발명은 본 방법을 실시하기 위한 키트 및 샘플 전달 기구를 제공한다.
Description
진단적 세포 영상화는 조직 또는 세포에 의해 생성된 분자를 그 세포 또는 조직에 특이적으로 국소화시킬 수 있는 방법을 이용한다. 이는 그러한 주어진 분자의 생성 또는 활성 부위에 대한 정보를 연구자에게 제공한다. 일상적인 병리학에 있어서 단백질의 특이적인 국소화를 위해서는 면역조직화학 (IHC)으로 공지된 절차가 일상적으로 이용된다. IHC에서, 특정 항원에 대한 항체는 고정된 조직 샘플에 적용되며, 이는 제1 단계로서 공지된 특정 분자를 인식한다. 그 후 이 항체는 서양 고추냉이 퍼옥시다제와 같은 효소와 화학적으로 커플링된 이차 항체의 사용에 의해 검출된다. 발색 기질, 예컨대 디-아미노-벤지딘 (DAB)와 함께 인큐베이션한 후, 관심있는 단백질의 특정 부위에서 일차 항체에 결합된 이차 항체의 부위에서 착색된 침착물이 생성된다. 이 절차는 임상 병리학 실험실에서 200가지 초과의 항체에 현재 이용되며 연구 환경에서는 더 많이 이용된다.
조직 프로세싱의 성질은 샘플을 "고정한" 후 파라핀에 매립시키고 마이크로톰 (microtome)에서 박편화하여 면역염색에 적합한 조직 절편을 생성하는 것을 필요로 한다. 이 과정 동안, 단백질은 조직의 세포 특징을 보존하는 화학적 가교결합을 생성하는 포름알데히드 프로세싱을 이용하여 보존된다. 포름알데히드는 주로 단백질 중 일차 아민기를 -CH2- 결합을 통하여 DNA 또는 단백질 중 다른 근처 질소 원자와 가교결합시킴으로써 조직 또는 세포를 보존하거나 고정시킨다. 그러나, 조직 고정 과정은 빈번하게는 진단 및 예측 목적에 있어서 검출이 바람직한 특정 단백질 상의 항원을 차폐시킨다. 전형적으로 절차는 개개의 표적 분자의 검출에 대하여 최적화되며, 필요할 경우 연속 절편이 추가의 표적 분자의 검출과는 상이한 방식으로 프로세싱된다. 단일 샘플에서 다수의 항원을 검출하는 능력이 진보하여 다수의 단백질의 검출과 양립가능한 균일한 조직 프로세싱일 필요가 있다.
간략한 설명
제1 측면에서, 본 발명은 90℃ 초과의 온도에서 제1 항원 복원 용액에서 포름알데히드-고정된 조직 샘플을 인큐베이션하는 단계, 조직 샘플을 제2 항원 복원 용액으로 이전시키는 단계, 및 90℃ 초과의 온도에서 제2 항원 복원 용액에서 조직 샘플을 인큐베이션하는 단계를 포함하는, 포름알데히드-고정된 조직 샘플의 항원 복원 방법을 제공한다.
제2 측면에서, 본 발명은 샘플에서 복원되지 않은 항원의 적어도 일부분을 복원시키는 제1 항원 복원 용액 및 샘플에서 복원되지 않은 항원의 다른 부분의 적어도 일부를 복원시키는 제2 항원 복원 용액을 포함하는, 포름알데히드-고정된 조직 샘플에서 항원을 복원시키는 키트를 제공한다.
제3 측면에서, 본 발명은 샘플 취급 하위시스템, 시약 분배 하위시스템 및 신호 검출 하위시스템을 포함하는, 항원 복원 방법을 실시하기 위한 샘플 취급 기구를 제공한다.
도면
본 발명의 이들 및 기타 특징, 측면 및 이점은 하기의 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용을 첨부된 도면을 참조로 하여 읽어보면 더 잘 이해될 것인데, 도면에서 유사 기호는 도면 전체에 걸쳐 유사 부분을 나타낸다.
도 1은 포름알데히드 고정된 조직 샘플을 항원 복원 용액과 접촉시키는 대표적인 샘플 취급 기구이다.
도 2는 1단계 절차와 비교하여 2단계 절차를 이용할 경우 향상된 염색을 나타내는 단색 현미경 사진 (20배 또는 63배 배율)이다.
도 3은 BrCA 종양의 다중 분석 FISH에서 2단계 절차를 이용할 경우 향상된 염색을 나타내는 단색 현미경 사진 (20배 배율)이다.
도 4는 수동식 2단계 항원 복원 방법을 자동화 방법과 비교한 정량적 분석 결과의 막대 차트이다.
도 5는 수동식 2단계 항원 복원 방법에 의해 또는 2가지 자동화 항원 복원 공정 중 하나에 의해 준비된 샘플에서의 항원-S6 염색에 대한 표백의 영향에 대한 단색 현미경 사진 (20배 배율)을 나타낸다.
본 발명의 이들 및 기타 특징, 측면 및 이점은 하기의 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용을 첨부된 도면을 참조로 하여 읽어보면 더 잘 이해될 것인데, 도면에서 유사 기호는 도면 전체에 걸쳐 유사 부분을 나타낸다.
도 1은 포름알데히드 고정된 조직 샘플을 항원 복원 용액과 접촉시키는 대표적인 샘플 취급 기구이다.
도 2는 1단계 절차와 비교하여 2단계 절차를 이용할 경우 향상된 염색을 나타내는 단색 현미경 사진 (20배 또는 63배 배율)이다.
도 3은 BrCA 종양의 다중 분석 FISH에서 2단계 절차를 이용할 경우 향상된 염색을 나타내는 단색 현미경 사진 (20배 배율)이다.
도 4는 수동식 2단계 항원 복원 방법을 자동화 방법과 비교한 정량적 분석 결과의 막대 차트이다.
도 5는 수동식 2단계 항원 복원 방법에 의해 또는 2가지 자동화 항원 복원 공정 중 하나에 의해 준비된 샘플에서의 항원-S6 염색에 대한 표백의 영향에 대한 단색 현미경 사진 (20배 배율)을 나타낸다.
청구된 발명의 대상을 더욱 명백하게 그리고 간결하게 기술하고 언급하기 위하여 하기 설명 및 그에 첨부된 특허청구범위에서 사용되는 특정 용어에 대하여 하기 정의가 제공된다.
정의
"항체"는 또 다른 분자에 특이적으로 결합하고 그에 의해 상기 또 다른 분자의 특정한 공간적인 그리고 정반대인 조직화에 의해 상보성인 것으로 정의된다. 항체는 단클론 또는 다클론 항체일 수 있으며, 당업계에 공지된 기술, 예컨대 숙주의 면역화 및 혈청의 수집에 의해 (다클론) 또는 계속적인 하이브리드 세포주를 제조하고 분비된 단백질을 수집함에 의해 (단클론) 또는 적어도 천연 항체의 특이적 결합에 필요한 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 그의 돌연변이 버전을 클로닝하고 발현시킴으로써 제조될 수 있다. 항체는 전 면역글로불린 또는 그의 단편을 포함할 수 있으며, 상기 면역글로불린은 다양한 클래스 및 이소형, 예컨대 IgA, IgD, IgE, IgG1, IgG2a, IgG2b 및 IgG3, IgM을 포함한다. 기능적 항체 단편은 전장 항체와 유사한 친화도의 결합성을 유지할 수 있는 항체의 부분 (예를 들어, Fab, Fv 및 F(ab')2, 또는 Fab')을 포함할 수 있다. 게다가, 특정 분자에 대한 결합 친화도가 실질적으로 유지되기만 한다면 적절할 경우 면역글로불린 또는 그의 단편의 응집체, 중합체 및 콘쥬게이트 (conjugate)가 사용될 수 있다.
"항원"은 항체 또는 항체 단편에 결합할 수 있는 물질을 나타낸다. 항원은 정상적이거나 비정상적인 세포 대사의 결과로서 또는 바이러스 감염 또는 세포내 세균 감염 때문에 세포 내에서 생성되는 내인성 항원일 수 있다. 내인성 항원은 이종발생성 (이종), 자가 및 유전형 또는 동종이형 (동종) 항원을 포함한다. 또한 항원은 종양-특이적 항원일 수 있거나 종양 세포에 의해 제시될 수 있다. 이 경우, 항원은 종양-특이적 항원 (tumor-specific antigen, TSA)으로 칭해지며, 일반적으로 종양-특이적 돌연변이에서 생긴다. 또한 항원은 종양-관련 항원 (tumor-associated antigen, TAA)일 수 있으며, 이는 종양 세포 및 정상 세포에 의해 제시된다. 또한 항원은 백혈구에 의해 발현되는 다수의 세포 표면 마커들 중 임의의 것을 나타내고 세포 계통 또는 발생 단계를 구별하는 데 사용될 수 있는 CD 항원을 포함한다. 그러한 마커는 특정 단클론 항체에 의해 확인될 수 있으며, 그의 분화 클러스터에 의해 넘버링된다.
"FISH" 및 "CISH"는 각각 형광 원위치 혼성화 (fluorescent in situ hybridization) 및 발색 원위치 혼성화 (chromagenic in situ hybridization)를 나타낸다. FISH는 세포의 다른 부분에서뿐만 아니라 전사 부위에서의 RNA 서열 또는 염색체 상의 특정 DNA 서열의 존재 또는 부재도 탐지 및 국소화하는 데 사용되는 세포유전학적 기술이다. FISH에서는 고도의 서열 유사상을 나타내는 염색체의 부분에만 결합하는 형광 프로브가 사용된다. CISH는 포르말린-고정, 파라핀-매립 (formalin-fixed, paraffin-embedded, FFPE) 조직에서의 명시야 현미경 하에 통상적인 효소 반응을 이용하여 유전자 증폭, 염색체 전좌 및 염색체 수의 탐지를 허용한다.
"면역염색"은 샘플 중 특정 단백질을 탐지하는 항체-기반 방법을 나타낸다. 면역염색은 면역세포화학적 (immunocyctochemical) 염색 및 면역조직화학적 (immunhistochemical) 염색 둘 모두를 포함한다. 면역세포화학적 (ICC) 여색은 세포 상의 항원을 표적화하는 항체를 이용하는 기술을 나타낸다. 이는 특정 질환, 예를 들어 암 유형의 존재를 결정하기 위하여 수행될 수 있다. 면역조직화학적 (IHC) 염색은 마커, 예컨대 형광단, 반응한 효소 기질, 방사성 원소 또는 콜로이드성 금에 의해 가시화되는 항원-항체 반응을 통하여 특정 시약으로서 표지된 항체를 사용함으로써 조직 절편에서 항원을 염색 및 국소화하는 것을 나타낸다.
"프로브"는 효소 또는 신호 발생제와 같은 표지체 및 바인더 (binder)를 갖는 에이전트 (agent)를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 바인더 및 표지체 (신호 발생제 또는 효소)는 단일한 실체 (entity)로 구현된다. 본원에서 사용될 때, "바인더"는 또 다른 분자와 반응하거나 그와 회합될 수 있는 분자, 예컨대 항체에 결합하는 항원을 나타낸다. 바인더 및 표지체는 1단계로 조직 샘플에 직접적으로 (예를 들어, 바인더 내에 혼입된 형광 분자를 통하여) 또는 간접적으로 (예를 들어, 절단 부위를 포함할 수 있는 링커를 통하여) 부착되고 적용될 수 있다. 대안적인 실시양태에서, 바인더 및 표지체는 별개의 실체로 구현된다 (예를 들어, 표적에 결합할 수 있는 일차 항체 및 일차 항체에 결합할 수 있는 효소 또는 신호 발생제-표지된 이차 항체). 바인더 및 표지체 (신호 발생제 또는 효소)가 별도의 실체일 경우, 이들은 1단계 또는 다단계로 조직 샘플에 적용될 수 있다. "형광 프로브"라는 용어는 바인더가 형광 신호 발생제에 커플링된 에이전트를 나타낸다.
"신호 발생제"는 하나 이상의 검출 기술 (예를 들어, 분광법, 열량 측정법, 분광광도법 또는 시각적 검사)을 이용하여 검출가능한 신호를 생성할 수 있는 분자를 나타낸다. 검출가능한 신호의 적합한 예는 광신호, 전기 신호, 또는 방사성 신호를 포함할 수 있다. 신호 발생제의 예는 발색단, 형광단, 라만-활성 (Raman-active) 태그, 또는 방사성 표지체 중 하나 이상을 포함한다. 상기에 진술한 바와 같이, 프로브와 관련하여, 신호 발생제 및 바인더는 일부 실시양태에서 단일 실체 (예를 들어, 형광 표지체를 포함하는 표적 결합 단백질)로 존재할 수 있다. 대안적으로, 바인더 및 신호 발생제는 샘플로 도입하기 전에 또는 샘플로 도입시에 서로와 회합되는 별개의 실체 (예를 들어, 수용체 단백질과, 그 특정 수용체 단백질에 대한 표지된 항체)일 수 있다.
"형광단" 또는 "형광 신호 발생제"는 특정 광 파장에의 노출에 의해 여기될 경우 상이한 파장에서 발광하는 화학적 화합물을 나타낸다. 형광단은 그의 발광 프로필 또는 "색"의 견지에서 기술될 수 있다. 녹색 형광단 (예를 들어, Cy3, FITC, 및 오레곤 그린 (Oregon Green))은 일반적으로 515 내지 540 nm의 범위의 파장에서의 그의 발광을 특징으로 할 수 있다. 적색 형광단 (예를 들어, 텍사스 레드 (Texas Red), Cy5, 및 테트라메틸로다민)은 일반적으로 590 내지 690 nm의 범위의 파장에서의 그의 발광을 특징으로 할 수 있다. 형광단의 예는 4-아세트아미도-4'-이소티오시아나토스틸벤-2, 2'디술폰산, 아크리딘, 아크리딘 유도체 및 아크리딘 이소티오시아네이트, 5-(2'-아미노에틸)아미노나프탈렌-1-술폰산 (EDANS), 4-아미노-N-[3-비닐술포닐)페닐]나프탈이미드-3,5 디술포네이트 (루시퍼 옐로우 (Lucifer Yellow) VS), N-(4-아닐리노-1-나프틸)말레이미드, 안트라닐아미드, 브릴리언트 옐로우 (Brilliant Yellow), 쿠마린 (coumarin), 쿠마린 유도체, 7-아미노-4-메틸쿠마린 (AMC, 쿠마린 120), 7-아미노-트리플루오로메틸쿨루아린 (쿠마란 (Coumaran) 151), 시아노신; 4',6-디아미니디노-2-페닐인돌 (DAPI), 5',5"-디브로모피로갈롤-술폰프탈레인 (브로모피로갈롤 레드 (Bromopyrogallol Red)), 7-디에틸아미노-3-(4'-이소티오시아나토페닐)4-메틸쿠마린, -, 4,4'-디이소티오시아나토디히드로-스틸벤-2,2'-디술폰산, 4,4'-디이소티오시아나토스틸벤-2,2'-디술폰산, 5-[디메틸아미노]나프탈렌-1-술포닐 클로라이드 (DNS, 단실 클로라이드), 에오신, 에오신 유도체, 예컨대 에오신 이소티오시아네이트, 에리트로신, 에리트로신 유도체, 예컨대 에리트로신 B 및 에리트로신 이소티오시아네이트; 에티듐; 플루오레세인 및 유도체, 예컨대 5-카르복시플루오레세인 (FAM), 5-(4,6-디클로로트리아진-2-일) 아미노 플루오레세인 (DTAF), 2'7'-디메톡시-4'5'-디클로로-6-카르복시플루오레세인 (JOE), 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC), QFITC (XRITC); 플루오레사민 유도체 (아민과의 반응시에 형광성); IR144; IR1446; 말라카이트 그린 (Malachite Green) 이소티오시아네이트; 4-메틸움벨리페론; 오르토 크레졸프탈레인; 니트로티로신; 파라로사닐린; 페놀 레드 (Phenol Red), B-피코에리트린; o-프탈디알데히드 유도체 (아민과의 반응시에 형광성); 피렌, 피렌 부티레이트 및 숙신이미딜 1-피렌 부티레이트와 같은 피렌 및 유도체; 리액티브 레드 (Reactive Red) 4 (시바크론 (Cibacron) .RTM. 브릴리언트 레드 3B-A), 로다민 및 유도체, 예컨대 6-카르복시-X-로다민 (ROX), 6-카르복시로다민 (R6G), 리사민 로다민 B 술포닐 클로라이드, 로다민 (Rhod), 로다민 B, 로다민 123, 로다민 X 이소티오시아네이트, 술포로다민 B, 술포로다민 101 및 술포로다민 101의 술포닐 클로라이드 유도체 (텍사스 레드); N,N,N',N'-테트라메틸-6-카르복시로다민 (TAMRA); 테트라메틸 로다민, 테트라메틸 로다민 이소티오시아네이트 (TRITC); 리보플라빈; 로졸산 및 라타나이드 킬레이트 유도체, 양자점, 시아닌, 피렐륨 (pyrelium) 염료 및 스쿠아라인을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
"표적"은 조직 샘플에 존재할 경우 검출될 수 있는 조직 샘플의 구성요소를 나타낸다. 표적은 천연의 특이적 바인더 (예를 들어, 항체)가 존재하거나 특이적 바인더가 제조될 수 있는 (예를 들어, 소분자형 바인더 또는 압타머 (aptamer)) 임의의 물질일 수 있다. 일반적으로, 바인더는 표적의 3차원 구조 구성요소 (예를 들어, 펩티드 폴딩에서 생기는 3D 구조체) 또는 표적의 하나 이상의 별개의 화학적 모이어티 (moiety)를 통하여 표적에 결합할 수 있다. 표적은 천연 또는 변형 펩티드, 단백질 (예를 들어, 항체, 어피바디 (affibody) 또는 압타머), 핵산 (예를 들어, 폴리뉴클레오티드, DNA, RNA 또는 압타머); 다당류 (예를 들어, 렉틴 또는 당), 지질, 효소, 효소 기질, 리간드, 수용체, 항원 또는 합텐 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적은 단백질 또는 핵산을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적은 단백질 및 핵산 둘 모두를 포함할 수 있다.
본 발명은 일반적으로 분석, 진단 또는 예측 응용에서 응용가능한 방법, 예컨대 분석물 검출, 조직화학, 면역염색, 면역조직화학, 면역세포화학 또는 면역형광에 관한 실시양태를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 특히 면역조직화학 및 면역세포화학에서 응용가능할 수 있다.
일 실시양태에 따르면, 바이오마커 평가를 위한 단백질 탐지 전에 병리적 샘플링으로부터 유래된 조직 절편을 프로세싱하는 방법이 기술된다. 일 실시양태에서, 본 방법은 다수의 단백질 항원에 응용가능한 2단계 절차를 포함하며, 고수준의 항원 복원을 제공할 수 있다. 특정 실시양태에서, 이는 임상적으로 관련있는 샘플의 다중 진단을 허용한다.
일부 실시양태에서, 조직 샘플은 건강한 또는 질환에 걸린 조직 유래의 조직 절편 (예를 들어, 결장, 유방 조직, 전립선 유래의 조직 절편)을 포함한다. 조직 샘플은 조직 절편의 단일한 부분 또는 조작, 예를 들어 조직 절편으로부터 절단된 조직 또는 세포의 얇은 슬라이스를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 조직 샘플의 동일한 절편은 형태적 및 분자적 수준 둘 모두에서 분석될 수 있다.
일부 실시양태에서, 조직 샘플은 조직 샘플이 절편화될 수 있도록 먼저 고정되고, 그 후 위쪽으로 향하는 일련의 알콜을 통하여 탈수되고, 파라핀 또는 기타 절편화 매질로 침투 및 매립될 수 있다. 대안적인 실시양태에서, 조직 샘플은 절편화되고 후속적으로 고정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 조직 샘플은 파라핀 내에 매립되어 프로세싱될 수 있다. 사용될 수 있는 파라핀의 예는 파라플라스트 (Paraplast), 브롤로이드 (Broloid) 및 티슈캔 (Tissuecan)을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 일단 조직 샘플이 매립되면, 샘플은 마이크로톰에 의해 절편으로 절편화될 수 있다. 절편의 두께는 분석법 및 조직의 유형을 기반으로 하여 달라질 수 있다. 특정 실시양태에서, 절편은 약 2 마이크로미터 내지 약 5 마이크로미터의 범위의 바람직한 두께를 가질 수 있다.
일단 절편화되면, 절편은 접착제를 이용하여 슬라이드에 부착시킬 수 있다. 슬라이드 접착제의 예는 실란, 젤라틴, 폴리-L-리신을 포함할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 실시양태에서, 파라핀이 매립 물질로서 사용될 경우, 조직 절편은 파라핀 제거되고 물에서 재수화될 수 있다. 조직 절편은 예를 들어 유기 에이전트 (예컨대, 자일렌 또는 점진적으로 하강하는 시리즈의 알콜)의 사용에 의해 파라핀 제거될 수 있다.
다른 실시양태에서, 포름알데히드 고정된 조직 샘플은 준비 및 영상화 과정 동안 그의 분석, 이전 및 이동을 허용하기 위하여 고형 지지체에 부착될 수 있다. 조직 샘플은 물리적 흡착에 의해, 공유 결합 형성에 의해 또는 그의 조합에 의해 고형 지지체 상에 고정될 수 있다. 고형 지지체는 중합체, 유리 또는 금속 물질을 포함할 수 있다. 고형 지지체의 예는 막, 마이크로타이터 플레이트, 비드, 필터, 시험 스트립, 슬라이드, 커버 슬립 및 시험관을 포함한다.
일 실시양태에서, 포름알데히드 고정된 조직 샘플을 제1 항원 복원 용액과 접촉시키고 90℃ 초과의 온도로 10분 초과의 기간 동안, 더 바람직하게는 대략 20분의 기간 동안 가열하는 방법이 기술된다. 가열은 항원 복원 용액에 침지된 조직 샘플에 균일한 가열을 제공하기 위하여 압력솥, 오토클레이브, 수조, 핫플레이트, 마이크로웨이브 또는 스팀 히터를 사용하여 일어날 수 있다. 그 후 조직 샘플은 추가의 처리 없이 제2 항원 복원 용액으로 이전되는데, 상기 제2 항원 복원 용액은 90℃ 초과의 온도로 유사한 시간 동안 예열되었다. 예열은 압력솥, 오토클레이브, 수조, 핫플레이트, 마이크로웨이브, 스팀 히트 또는 그의 조합을 사용하여 일어날 수도 있으며, 제1 항원 복원 용액을 가열할 때 수행될 수 있다. 바람직하게는, 제2 항원 복원 용액에서의 샘플의 인큐베이션은 대기압에서, 그리고 단지 고온 용액에 침지시킴으로써 일어난다. 이는 조직 손상을 방지할 수 있다.
일 실시양태에서, 제1 항원 복원 용액은 pH 범위가 약 5 내지 약 7인 완충 용액이다. 제1 항원 복원 용액은 pH를 약간 산성 내지 중성의 범위로 유지하기 위하여 사용되는 일반적으로 사용되는 완충 용액일 수 있다. 특정 실시양태에서, 완충제는 시트르산, 인산이수소칼륨, 붕산, 디에틸 바르비투르산, 피페라진-N,N'-비스(2-에탄술폰산), 디메틸아르신산, 2-(N-모르폴리노)에탄술폰산 또는 그의 조합을 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 완충 용액은 승온에서 pH가 대략 6.0인 시트르산 인산나트륨 완충 용액일 수 있다.
열을 적용하면, 제1 항원 복원 용액은 가교결합을 가수분해하는 작용을 할 수 있는데, 상기 가교결합은 샘플 고정 동안 포르말린과 항원 사이에 형성되었을 수 있다. 이는 복원되는 샘플 중 항원의 적어도 일부분을 생성한다.
일 실시양태에서, 제2 항원 복원 용액은 약 7.5 내지 약 11의 범위의 알칼리성 pH를 갖는 완충 용액이다. 제2 항원 복원 용액은 pH를 약간 알칼리성의 범위로 유지하기 위하여 사용되는 일반적으로 사용되는 완충 용액일 수 있다. 특정 실시양태에서, 완충 용액은 트리스(히드록시메틸)메틸아민 (트리스 (TRIS)), 2-(N-모르폴리노)에탄술폰산 (TAPS), N,N-비스(2-히드록시에틸)글리신 (비신 (Bicine)), N-트리스(히드록시메틸)메틸글리신 (트리신 (Tricine)), 4-2-히드록시에틸-1-피페라진에탄술폰산 (HEPES), 2-{[트리스(히드록시메틸)메틸]아미노}에탄술폰산 (TES), 또는 그의 조합으로 이루어질 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 완충 용액은 승온에서 pH가 대략 10인 트리스-HCl 완충제일 수 있다.
제1 항원 복원 용액에서와 같이, 제2 항원 복원 용액은 가교결합을 가수분해하는 작용을 할 수 있는데, 상기 가교결합은 샘플 고정 동안 포르말린과 항원 사이에 형성되었을 수 있다. 복원되는 항원의 부분은 샘플에서 복원되지 않은 항원의 또 다른 부분의 적어도 일부이다.
다른 실시양태에서 제1 항원 복원 용액은 약 7.5 내지 약 11의 범위의 완충 용액일 수 있으며, 제2 항원 복원 용액은 약 5 내지 약 7의 범위의 완충 용액일 수 있음이 인식되어야 한다.
제1 및 제2 항원 복원 용액에 노출시킴으로써 복원된 항원은 면역염색에 더욱 민감하여서 분석적 및 기능적 형태 연구 둘 모두를 허용할 수 있다. 면역염색은 면역조직화학적 (IHC) 염색 및 면역세포화학적 (ICC) 염색 둘 모두를 포함한다. 특정 실시양태에서, 개선은 양성 염색의 강도 증가 및 배경 염색 감소를 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 제2 항원 복원 용액의 적용 후, 샘플의 면역염색이 일어날 수 있다. 항체 용액 (예를 들어, 프로브)은 표지된 항체가 항원에 결합하기에 적합한 조건 하에서 그리고 상기 결합에 충분한 시간 동안 조직 절편과 접촉될 수 있다. 직접적이거나 간접적인 2가지 검출 방법이 사용될 수 있다. 직접적인 검출법에서, 신호 발생제-표지된 일차 항체 (예를 들어, 형광단-표지된 일차 항체)는 조직 샘플 중 항원과 함께 인큐베이션될 수 있으며, 이는 추가의 항체 상호작용 없이 가시화될 수 있다. 간접적인 검출법에서, 콘쥬게이션되지 않은 일차 항체는 항원과 함께 인큐베이션될 수 있으며, 그 후, 표지된 이차 항체는 일차 항체에 결합할 수 있다. 몇몇 이차 항체가 일차 항체 상의 상이한 에피토프와 반응할 수 있기 때문에 신호 증폭이 일어날 수 있다. 이차 항체가 효소 표지체에 콘쥬게이션될 수 있는 실시양태에서, 발색성 또는 형광성 기질을 첨가하여 항원의 가시화를 제공할 수 있다. 일부 실시양태에서, 2가지 이상 (많아야 4가지)의 일차 항체 (표지되거나 표지되지 않음)를 조직 샘플과 접촉시킬 수 있다. 표지되지 않은 항체는 그 후 상응하는 표지된 이차 항체와 접촉시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 표지된 삼차 또는 사차 항체의 사용과 같이 다른 방법이 신호 향상에 이용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 항원 복원 과정 후, 핵산 프로브를 샘플에 적용하여 형광 원위치 혼성화 (FISH) 또는 발색 원위치 혼성화 (CISH)를 수행한다.
프로브 중 신호 발생제로부터의 신호는 검출 시스템을 사용하여 검출될 수 있다. 사용되는 검출 시스템의 성질은 사용되는 신호 발생제의 성질에 의존적일 수 있다. 검출 시스템은 전자 스핀 공명식 (electron spin resonance, ESR) 검출 시스템, 전하 결합 소자식 (charge coupled device, CCD) 검출 시스템 (예를 들어, 방사성 동위원소의 경우), 형광 검출 시스템, 전기적 검출 시스템, 사진용 필름식 검출 시스템, 화학발광 검출 시스템, 효소 검출 시스템, 원자간력 현미경법식 (atomic force microscopy, AFM) 검출 시스템 및 주사 터널 현미경법식 (scanning tunneling microscopy, STM) 검출 시스템 (둘 모두 미세비드의 검출에 사용됨), 광학적 검출 시스템, 근접장 검출 시스템, 또는 전 내부 반사식 (total internal reflection, TIR) 검출 시스템을 포함할 수 있다.
전술한 기술 중 하나이상을 이용하여 제1 신호 발생제로부터의 제1 신호의 하나 이상의 특징을 관찰할 수 있다. 일부 실시양태에서, 신호 강도, 신호 파장, 신호 위치, 신호 주파수 또는 신호 시프트는 전술한 기술 중 하나 이상을 이용하여 결정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 신호의 하나 이상의 전술한 특징이 관찰, 측정 및 기록될 수 있다. 일부 실시양태에서, 신호 발생제는 형광단을 포함할 수 있으며, 형광 파장 또는 형광 강도는 형광 검출 시스템을 사용하여 측정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 신호는 원위치에서 관찰될 수 있으며, 즉, 신호는 조직 샘플 중 표적에 바인더를 통하여 결부된 신호 발생제로부터 직접적으로 관찰될 수 있다. 일부 실시양태에서, 신호 발생제로부터의 신호를 조직 샘플 내에서 분석하여 별도의 어레이-기반 검출 시스템에 대한 필요성을 없앨 수 있다. 다른 실시양태에서, 프로브 결합 후, 신호는 바인더와 구별되고 생물 샘플로부터 떨어져서 검출될 수 있다. 신호의 구별 방법은 ELISA 및 질량 분광법, 혼성화 마이크로어레이를 포함할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
일부 실시양태에서, 신호 관찰은 조직 샘플의 영상을 포착하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 영상화 기구에 연결된 현미경을 본원에 개시된 방법에 따라 검출 시스템으로 사용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 신호 발생제 (예컨대, 형광단)이 여기될 수 있으며, 수득된 신호 (예컨대, 형광 신호)는 디지털 신호 (예를 들어, 디지털화된 영상)의 형태로 관찰 및 기록될 수 있다. 적절한 형광 필터를 이용하여 샘플 중 결합된 신호 발생제 (존재할 경우)에 대하여 동일한 절차가 반복될 수 있다.
화학적 에이전트를 조직 샘플에 적용하여 신호를 변형시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 신호 변형은 신호 특징의 변화, 예를 들어 신호 강도 감소, 신호 피크 시프트, 공진 주파수의 변화, 또는 신호를 제거하는 신호 발생제의 절단 (제거) 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 화학적 에이전트는 용액 형태일 수 있으며, 조직 샘플은 소정량의 시간 동안 화학적 에이전트 용액과 접촉될 수 있다. 화학적 에이전트 용액의 농도 및 접촉 시간은 요망되는 신호 변형 유형에 의존성일 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적 에이전트의 접촉 조건은 바인더, 표적, 조직 샘플, 및 바인더와 표적 사이의 결합이 영향을 받을 수 없도록 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적 에이전트는 단지 신호 발생제에 영향을 줄 수 있으며, 화학적 에이전트는 표적/바인더 결합 또는 바인더 온전성에 영향을 줄 수 없다. 따라서, 예로서 바인더는 일차 항체 또는 일차 항체/이차 항체 조합을 포함할 수 있다. 본원에 개시된 방법에 따른 화학적 에이전트는 단지 신호 발생제에 영향을 줄 수 있으며, 일차 항체 또는 일차 항체/이차 항체 조합은 본질적으로 영향을 받지 않은 채 남아있을 수 있다. 일부 실시양태에서, 바인더 (예컨대, 일차 항체 또는 일차 항체/이차 항체 조합)는 샘플과 화학적 에이전트의 접촉 후 조직 샘플 중 표적에 결합된 채 남아있을 수 있다. 일부 실시양태에서, 바인더는 샘플과 화학적 에이전트의 접촉 후 조직 샘플 중 표적에 결합된 채 남아있을 수 있으며, 바인더 온전성은 본질적으로 영향을 받지 않은 채 남아있을 수 있다 (예를 들어, 항체는 화학적 에이전트의 존재 하에 실질적으로 변성되지 않거나 용출되지 않을 수 있음). 다른 실시양태에서, 화학적 에이전트는 표적/바인더 결합 또는 바인더/신호 접촉/결합에 영향을 줄 수 있다.
일부 실시양태에서, 다수의 표적은 프로브의 "스트리핑 (stripping)" 및 샘플의 재프로빙을 통하여 검출될 수 있다. 일반적으로 스트리핑은 샘플로부터의 프로브의 해리, 해산, 및 제거를 위한 매질을 제공하기 위하여 물, 염수, 완충 염수 또는 에탄올과 같은 그러나 이에 한정되는 것은 아닌 비-표지 용액 또는 기타 물질의 반복된 적용에 의한 플러싱 (flushing) 또는 그에 침지시키는 것과 같은 그러나 이에 한정되는 것은 아닌 임의의 방법을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 다수의 표적은 광을 이용하여 리포터 또는 신호 발생제를 형광 표백함에 의해 검출함으로써 신호 발생제가 새로운 프로브에서 재사용되게 한다. 이들 과정은 동일한 샘플의 다수의 프로빙을 달성하기 위하여 다시 반복적으로 반복될 수 있다.
일부 실시양태에서, 신호의 특징을 샘플과 화학적 에이전트의 접촉 후 관찰하여 신호 변형의 유효성을 결정할 수 있다. 예를 들어, 색은 화학적 에이전트의 적용 전에 관찰될 수 있으며, 색은 화학적 에이전트의 적용 후에는 없을 수 있다. 또 다른 예에서, 형광 신호 발생제로부터의 형광 강도는 화학적 에이전트와의 접촉 전에 그리고 화학적 에이전트와의 접촉 후에 관찰될 수 있다. 일부 실시양태에서, 소정량만큼의 신호 강도 감소는 신호 변형으로 언급될 수 잇다. 일부 실시양태에서, 신호 변형은 약 50% 초과의 범위의 양만큼의 신호 강도 감소를 언급할 수 있다. 일부 실시양태에서, 신호 변형은 약 60% 초과의 범위의 양만큼의 신호 강도 감소를 언급할 수 있다. 일부 실시양태에서, 신호 변형은 약 80% 초과의 범위의 양만큼의 신호 강도 감소를 언급할 수 있다.
일부 실시양태에서, 조직 샘플은 제1 프로브에 대하여 상기에서 본원에 기술된 하나 이상의 절차를 이용하여 제2 프로브와 접촉될 수 있다. 제2 프로브는 제1 프로브가 결합하는 표적과는 상이한 표적에 결합할 수 있다. 제1 프로브 접촉 단계에서 복수의 프로브를 조직 샘플과 접촉시킬 수 있는 실시양태에서, 제2 프로브는 제1 프로브 세트가 결합하는 표적과는 상이한 표적에 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 조직 샘플을 제2 프로브 접촉 단계에서 복수의 프로브와 접촉시킬 수 있다.
상기에서 본원에 기술된 하나 이상의 검출 방법을 이용하여 제2 신호 발생제 (후속 프로브에 존재함)로부터의 후속 (예를 들어, 제2, 제3 등) 신호의 하나 이상의 특징을 관찰할 수 있다. 일부 실시양태에서, 신호 강도, 신호 파장, 신호 위치, 신호 주파수 또는 신호 시프트는 전술한 기술 중 하나 이상을 이용하여 결정될 수 있다. 제1 신호와 유사하게, 수득된 후속 신호 (예를 들어, 형광 신호)는 디지털 신호 (예를 들어, 디지털화된 영상)의 형태로 기록될 수 있다. 일부 실시양태에서, 후속 신호의 관찰은 조직 샘플의 광학 영상의 포착을 또한 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 샘플과 후속 (예를 들어, 제2, 제3 등) 프로브의 접촉 후, 에이전트 변형 및 후속 프로브 투여가 다회 반복될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제2 프로브로부터의 제2 신호의 관찰 후, 조직 샘플을 화학적 에이전트와 접촉시켜 제2 프로브로부터의 신호를 변형시킬 수 있다. 더욱이, 제3 프로브가 조직 샘플과 접촉될 수 있으며, 여기서, 제3 프로브는 제1 및 제2 프로브와는 상이한 표적에 결합할 수 있다. 이와 마찬가지로, 제3 프로브로부터의 신호를 관찰하고, 이어서 화학적 에이전트를 적용하여 신호를 변형시킬 수 있다. 접촉, 결합 및 관찰 단계는 추가의 표적에 결합할 수 있는 n번째 프로브를 사용하여 반복적으로 다회 반복하여 다양한 프로브 및/또는 신호 발생제를 이용한 다양한 표적에 관한 정보를 사용자에게 제공할 수 있다.
일부 실시양태에서, 일련의 프로브를 순차적인 방식으로 조직 샘플과 접촉시켜 조직 샘플의 다중 분석을 수득할 수 있다. 일부 실시양태에서, 일련의 프로브 세트 (한 세트 내에 약 4가지의 프로브를 포함함)를 순차적인 방식으로 조직 샘플과 접촉시켜 조직 샘플의 다중 분석을 수득할 수 있다. 일반적으로 다중 분석은 동일한 검출 기작을 사용한 조직 샘플에서의 다수의 표적의 분석을 나타낸다.
특정 실시양태에서, 상기에 기술된 항원 복원 방법을 실시하기에 유용한 키트가 제공된다. 본 키트는 하나 이상의 항원 복원 용액을 포함할 수 있다. 키트는 또한 사용 설명서를 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 키트는 면역염색 및 검출을 위한 하나 이상의 추가의 시약을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 키트는 발색단, 형광단, 라만-활성 태그, 또는 방사성 표지체와 같은 신호 발생제를 포함할 수 있다. 본 키트는 또한 폴리머라제 효소, 기타 완충제, 금속 양이온 및 염을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아닌, 상기에 기술된 바와 같이 신호를 증폭시키거나 그의 검출을 향상시킬 수 있는 시약을 또한 포함할 수 있다.
일 실시양태에 따르면, 도 1에 나타낸 바와 같이, 포름알데히드-고정된 조직 샘플 (15)을 전술한 항원 복원 및 기타 세척 및 염색 용액과 접촉시기 위한 샘플 취급 기구 (10)가 설명된다. 샘플 취급 기구는 샘플 취급 하위시스템 (20) 및 시약 분배 하위시스템 (30)으로 이루어질 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 기구는 신호 검출 하위시스템 (40)을 또한 포함할 수 있다. 실시양태들 중 하나에서, 샘플 취급 기구는 하나의 시스템에서 포름알데히드-고정된 조직 샘플을 염색 및 영상화할 수 있는 및 또한 영상을 분석하는 자동화 고작업량 시스템과 같은 분석 기구의 구성요소로서 포함될 수 있다.
그와 같이, 일 실시양태에서, 본 시스템은 분석용의 포름알데히드-고정된 조직 샘플을 배치하고 이동시키는 샘플 취급 하위시스템과, 샘플을 제1 항원 복원 용액, 제2 항원 복원 용액 및 면역염색 시약 중 적어도 하나와 접촉시키는 시약 분배 하위시스템을 포함할 수 있다. 샘플 취급 시스템은 다수의 구성요소를 포함하며 샘플이 한 영역으로부터 다음 영역으로 이동하게 할 수 있다. 예를 들어, 샘플은 하나의 기구를 이용하여 시약과 접촉시키고, 영상화를 위하여 스테이지로 이동시켜 스테이지에 부착시킬 수 있다. 스테이지는 현미경 내에 포함시킬 수 있으며, 샘플을 영상화 시야를 통하여 이동시키는 것이 가능할 수 있다.
또한 본 시스템은 신호 검출 하위시스템 (예시하지 않음)을 포함하여서 염색 과정을 통하여 샘플의 영상을 포착할 수 있다. 영상은 다양한 조명원을 이용하여 포착할 수 있다. 특정 실시양태에서, 영상 포착은 샘플의 디지털 영상을 다양한 배율로 포착 및 전달할 수 있는 영상화 현미경의 부분일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 자동화 시스템은 염색된 포름알데히드-고정 조직 샘플의 분석을 위하여 자동화 기술에 대한 설명서를 포함할 수 있는 컴퓨터-판독가능 매체를 포함할 수 있다.
다른 실시양태에서, 샘플 취급 기구는 항원 복원, 형광 태깅, 영상화, 및 형광 프로브의 스트리핑의 다수의 단계를 통하여 사이클링가능할 수 있다. 염색은 또한 면역퍼옥시다제 표지를 포함할 수 있다. 일 실시양태에서, 알콜 용해성 퍼옥시다제 기질, 3-아미노-9-에틸카르바졸 (AEC)을 사용하고, 이어서 AEC 침전물을 제거하고, 임의로, 온화한 과산화물 처리를 이용하여 퍼옥시다제를 추가로 불활성화시키고, 염색을 반복할 수 있다. 다른 실시양태에서, 형광 프로브는 화학적 처리, 열처리 또는 그의 조합을 통하여 스트리핑될 수 있다.
샘플링 취급 기구는 하나의 조직 섹터 또는 세포 샘플에서 다수의 마커의 지도화를 돕기 위하여 그리고 샘플의 변위를 최소화하기 위하여 다수의 사이클이 원위치에서 일어날 수 있도록 자동화될 수 있다.
실험
방법
시스템의 민감성을 반영하는 신호 대 노이즈의 비에 영향을 주는 변수를 실험 디자인 (design of experiment, DOE) 접근법을 이용하여 분석하였다. 변수는 온도, 노출 시간, pH, 및 세척 순서를 포함하였다. 영상은 20배 또는 63배 배율로 자이스 악실마거 (Zeiss Axilmager) Z1 현미경을 이용하여 획득하였다. 영상의 정량화를 GNU 영상 조작 프로그램 (GNU Image Manipulation Program, GIMP) 소프트웨어를 사용하여 행하여, 비-염색 면적으로부터 배경 픽셀 강도를 차감한 후 면적당 평균 픽셀 강도를 계산하였다. 평균 픽셀 강도를 동일 조직의 10개의 영상의 평균으로 계산하였다.
하기 재료를 본 연구에 사용하였다: 인간 보관 조직은 다양한 공급원으로부터의 것이었으며, 이는 유방, 전립선, 폐, 결장, 태반, 타액선, 림프절, 뇌 및 피부의 샘플을 포함하였다. 모든 샘플은 조직 보관소로부터의 것이었다. 사용한 고정에 대한 명세사항은 공지되어 있지 않으며, 표준의 병리학적 실무에 따른 것으로 생각하였다. AR에 대한 항체를 랩 비전 코포레이션 (Lab Vision Corporation) (서모 피셔 사이언티픽 (Thermo Fisher Scientific)의 일부)으로부터 획득하였으며, 이는 표준 절차를 이용하여 사내에서 Cy3 및 Cy5 형광 색소로 콘쥬게이션된 것이었다. 시트레이트 기반의 항원 복원 용액을 벡터 래보러토리즈 (Vector Laboratories)로부터 획득하고, 최종 pH 값을 6.0으로 하여 1:20으로 희석시켰다. 트리스 기반의 완충제는 10 mM 트리스 (트리스(히드록시메틸)아미노메탄), 1 mM EDTA (에틸렌디아민테트라아세트산), 1% 트윈 (Tween)-20 (폴리옥시에틸렌소르비탄 모노라우레이트)로 이루어져서 8의 pH 값을 제공하였다 (신선하게 제조한 10배 원액으로부터 제조). 가정용 표준 압력솥은 HI 파워에 설정하여 20분 동안 가열에 사용하고, 수동으로 모니터링하였다.
포르말린 고정되고 파라핀 매립된 조직 절편은 슬라이드를 65℃에서 1시간 동안 베이킹하고 히스토초이스 (histochoice) 세정제 (clearing agent)를 이용하여 샘플 절편으로부터 왁스를 제거함으로써 프로세싱하였다. 샘플 베이킹은 필요하지 않음이 밝혀졌지만, 이를 표준 실무로서 시종 사용하였다.
그 후 샘플을 감소하는 농도 (전형적으로 100, 95, 70, 50%)의 일련의 알콜 세척 - 각각 2회의 10분간 세척 - 을 통하여 프로세싱하고, 그 후 PBS 용액에서 10분 동안 염수 조건에 처하였다. 그 후 샘플을 0.3% 트리톤 (Triton) X-100을 함유하는 PBS에서 잠깐 처리하여 투과되게 하고, 이어서 복원 공정을 하였다.
복원 공정은 샘플을 압력솥 또는 마이크로웨이브에서 대략 20분 동안 용액 A (1% 트윈 20을 포함하는 트리스, pH 8.0) 내에 넣는 것을 포함하였다. 가열 사이클의 마지막에, 샘플을 추가의 가열 없이 가열 챔버 내의 예열된 용액 B (시트레이트 용액, pH 6) 내에 넣었다. 샘플은 고온의 두 용액들 사이에서 냉 PBS로 이전시키지도 않았고, 제2 용액에서 추가의 가열에 노출시키지도 않았다. 제2 용액 중 샘플을 실온으로 되게 한 후 (대략 20분), 샘플은 차단 또는 퍼옥시다제 처리 (내인성 퍼옥시다제 불활성화를 위하여)와 같은 임의의 추가의 프로세싱 단계 전에 PBS에서 광범위하게 헹구었다.
그 후 샘플을 면역검출할 수 있다. 면역검출 검출법의 제1 라운드 후, 샘플에서 신호를 없애고 추가의 항원에 대하여 재프로빙할 수 있다.
대안적으로, 슬라이드를 수동 공정 조건과 유사한 프로그램 설정을 이용하여 디스커버리 (Discovery®) XT 자동염색기 (벤타나 메디칼 시스템즈, 인크. (Ventana Medical Systems, Inc.))를 사용하여 프로세싱하였다. 샘플을 바코딩하고 시약을 준비한 후, 슬라이드를 자동염색기 내에 로딩하고 하기와 같이 프로세싱하였다: 샘플을 가열하고 EZ-프렙 시약 (벤타나 디스커버리 XT를 위한 왁스 제거 용액)에서 샘플을 헹굼으로써 왁스를 제거하였다. 항원 복원은 각각 트리스 및 시트르산 기반의 용액인 CC1 및 CC2 (디스커버리 XT 자동염색기에서 사용하기 위한, 벤타나에 의해 공급된 항원 복원을 위한 두 용액)를 사용하여 수행하였다. 수동 2단계 방법과 비교할 목적으로, 짧은 그리고 중간 정도의 시간의 항원 복원을 행하였으며, 이는 디스커버리 XT 자동염색기 프로그램에서 온화한 그리고 표준인 것으로 언급되었다. 자동화 시스템에서, 조직 샘플을 두 항원 복원 단계들 사이에 헹굼을 알아야 하는데, 이는 본원에 기술된 수동 공정과 자동화 공정 사이의 핵심 차이점이다. 그 후 2단계의 수동식 방법으로 프로세싱한 샘플 옆쪽에서 슬라이드를 수동으로 염색하였다.
결과 및 관찰
인간 보관 전립선 조직 절편에서 AR을 검출하기 위한 안드로겐 수용체 항체의 사용을 분석용으로 처음에 선택하였다. 이 조합은 염색이 에피토프 비차폐 (예시하지 않음)의 부재하에 행해질 경우 생성되는 검출가능한 신호의 결여로 인하여 선택하였다. 항원 비차폐용의 2가지 일반적인 완충제, 시트레이트 또는 트리스를 사용하고 압력솥에서 20분 동안 샘플을 처리하면 중간 정도의 강도의 염색이 형광 염료를 이용하여 생성되었다. 사용한 시트레이트 비차폐 조건은 다양한 항체에 의한 AR의 검출을 위한 일반적으로 사용되는 프로토콜을 나타낸다. 다양한 조건을 시험하였으며, 이는 시트레이트 단독 (세트 1), 트리스 단독 (세트 2), 트리스, 그 후 시트레이트 (세트 3) 및 시트레이트, 그 후 트리스 (세트 4)를 포함하였다. 기저선 측정을 확립하기 위하여 10개의 슬라이드를 염색한 대조 샘플은 제외하고, 모든 조건을 삼중으로 슬라이드 상에서 시험하였다.
첫 번째 시리즈의 실험에서는 랩 비전 AR 항체를 사용하였고, 이어서 당나귀 항-토끼 Cy3 이차 항체로 검출하였다. 모든 데이타 획득에서는 동일한 노출 시간을 이용하였으며, 영상을 염색 직후 수집하였다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 2단계 공정은 시트레이트 또는 트리스 단독과 비교할 때 AR에 대한 염색을 유의하게 향상시켰다. 도 2는 2단계 절차를 사용할 경우 우측에 향상된 염색을 나타내는 염색의 단색 영상이다.
일반적으로, 각각의 세트의 슬라이드에 있어서, 2단계 방법을 이용하면 대조 샘플과 비교하여 2배 이상의 염색 강도 증가가 AR에 대하여 관찰되었다. 가열된 용액에의 노출 시간을 조절하였으며, 이때 모든 슬라이드는 총 50분의 시간을 받았다. 제1 가열 단계는 모든 실험 슬라이드에 있어서 가정용 압력솥에서의 가압 하에 행하였다. 25분 후, 세트 1 및 2로부터의 슬라이드를 예열된 용액 (제1 단계의 진행 중에 별도의 병에서 가열한, 제1 단게에서와 동일한 용액)의 새로운 병 내에 넣고, 추가로 25분 동안 압력솥 (가압하지 않음)에서 냉각시켰다. 그 후 슬라이드를 PBS에서 세척하고, 일차 항체를 이용하여 4℃에서 하룻밤 염색하였다. 세트 3 및 4로부터의 슬라이드의 경우, 후자의 25분간의 처리 동안 상기에 기술한 바와 같이 용액을 각각의 조건으로 변화시키고, 다른 세트와 병행하여 프로세싱하였다.
2단계 절차에 대한 몇몇 변경을 또한 시험하였다. 한 가지 변경에서, 두 용액을 사용하는 순서는 결과에 영향을 주지 않았다. 산성 용액을 먼저 사용하고, 이어서 염기성 용액을 사용할 경우, 또는 그 반대의 경우 결과의 차이는 관찰되지 않았다.
본 방법의 다른 변경은 당해 공정에 유해한 것으로 입증되었다. 이는 제2 가열 기간 동안 샘플을 재가압하고, 제1 단계와 제2 단계 사이에 PBS에서 세척하는 것을 포함하였다. 이들 변화 둘 모두는 슬라이드로부터의 조직의 극적인 손실을 생성하였으며, 따라서 회피하였다.
AR에 대한 일차 항체에서의 시험 및 이차 항체를 이용한 검출 후, Cy5가 직접적으로 콘쥬게이션된 AR 항체를 시험하였다. 다른 구매가능한 항체의 광범위한 샘플링의 시험에서 향상된 염색이 관찰된 직접적 콘쥬게이트를 사용하면 유사한 결과가 발견되었다. 또한 본 공정은 흔히 불안정하고 복원 공정에서 분해되기 쉬운 상업적 등급의 다수의 포스포-에피토프를 사용할 경우 염색을 향상시켰다.
이 절차는 또한 항원 복원 방법이 단백질 추출 및 회수를 향상시키는 것으로 밝혀진 FFPE 조직으로부터의 단백질 단리와 같은 다른 응용에 응용될 수 있다. 본 절차는 또한 프로테옴 분석용 단백질원으로서의 FFPE 조직으로부터의 레이저 포착 마이크로 절개에서 유용할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 FISH 또는 CISH 분석 전에 FFPE 샘플에서 사용될 수 있다. 전형적으로, FISH 또는 CISH 분석을 겪는 FFPE 샘플은 DNA 변형 및 프로브 혼성화 이전에 가열 전처리 단계에 노출시킨다. 일 실시양태에 따르면, 2단계 절차는 FISH 또는 CISH 분석 이전에 조직 샘플을 준비하기 위하여 사용하는 다른 절차 또는 가열 전처리 단계를 대체할 수 있다. 도 3은 다양한 항체를 이용한 BrCA 종양의 다중 FISH 분석에서 2단계 절차를 사용할 경우 염색 향상을 나타내는 단색 현미경 사진 (20배 및 63배 배율)을 나타낸다.
방법 비교
디스커버리 XT 자동염색기를 이용하여 자동화 공정을 또한 평가하였다. 기기의 작동에 관련된, 자동염색기와 수동식 2단계 공정 사이에서의 공정 조건 차이가 존재하였다. 예를 들어, 자동염색기는 가열 및 세제를 이용하여 샘플에서 왁스를 제거한 반면, 수동식 공정은 비-독성 히스토초이스TM 왁스 세정 시약 (암레스코 (Amresco))을 사용하였다.
포르말린 고정되고 파라핀 매립된 (FFPE) LNCaP 세포 (아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (American Type Culture Collection, ATCC, 미국 메릴랜드주)를 본원에 기술한 수동식 2단계 항원 복원법에 의해 준비한 후 또는 디스커버리 XT 자동염색기를 사용하여 두 가지 유사한 방법에 의해 S6, 포스포-S6 ser235/236, 또는 포스포-S6 ser240/244에 대하여 염색하였다. 항원 복원은 수동식 또는 자동화 공정을 이용하여 성취되었지만, 순차적 신호 제거/변형 및 재염색에 있어서 차이가 관찰되었다. 대부분의 경우, 자동화 시스템을 이용하면 염색 감소가 1 내지 5의 신호 변형 단계에서 생겼다. S6의 경우, 자동화 방법을 이용하면 단지 1라운드의 신호 변형 후 염색의 완전한 손실이 생겼다. 모든 경우, 수동식의 2단계 방법이 각각의 항윈의 최상의 보존을 제공하였다. 수동식 2단계 방법은 또한 포스포-에피토프를 염색할 경우 더 적은 민감성을 나타냈다.
차이가 도 4에 도시되어 있으며, 이는 두 가지 자동화 공정과 비교하여 수동식의 2단계 항원 복원 방법에 의해 제공된 더욱 큰 에피토프 안정성을 비교하는 정량적 분석을 나타내는 그래프이다. 평균 픽셀 강도가 나타내어져 있으며, 이는 항원-S6에 대한 표백 효과를 평가하는 것이다. 슬라이드를 세 가지의 상이한 왁스 제거 및 항원 복원 방법에 의해 준비하고, 0, 1 및 5라운드의 표백에 처한 후 염색하였다. 정량적 분석에 의하면, 수동식 2단계 방법이 항원을 최상으로 보존하였음이 나타났다. 동일한 단백질 상의 상이한 에피토프는 표백에 대하여 차별적으로 반응하였으며, 이는 단백질의 손실이 아닌 주로 에피토프 효과를 나타낼 수 있다. 이는 또한 도 5에 예시되어 있으며, 이는 수동식 2단계 항원 복원 방법을 두 가지 자동화 공정과 비교한, 항원-S6에 대한 표백 효과의 단색 현미경 사진이다 (20배 배율).
본 발명은 그의 사상 또는 본질적인 특징으로부터 벗어남이 없이 다른 특정 형태로 구현될 수 있다. 따라서, 전술한 실시형태는 모든 면에서 본원에 기술된 발명을 한정하는 것이라기보다는 오히려 예시하는 것으로 간주되어야 한다. 따라서, 본 발명의 범주는 전술한 설명에 의해서라기보다는 오히려 첨부된 특허청구범위에 의해 나타내어지고, 따라서 특허청구범위의 등가의 의미 및 범위 내에 있는 모든 변화는 본 발명에 포함시키고자 한다.
Claims (26)
- 90℃ 초과의 온도에서 제1 항원 복원 용액에서 포름알데히드-고정된 조직 샘플을 인큐베이션하는 단계,
포름알데히드-고정된 조직 샘플을 제2 항원 복원 용액으로 이전시키는 단계, 및
90℃ 초과의 온도에서 제2 항원 복원 용액에서 포름알데히드-고정된 조직 샘플을 인큐베이션하는 단계
를 포함하는, 포름알데히드-고정된 조직 샘플의 항원 복원 방법. - 제1항에 있어서,
제1 항원 복원 용액은 pH 범위가 약 5 내지 약 7인 완충 용액을 포함하며 제2 항원 복원 용액은 pH 범위가 약 7.5 내지 약 11인 완충 용액을 포함하거나,
제1 항원 복원 용액은 pH 범위가 약 7.5 내지 약 11인 완충 용액을 포함하며 제2 항원 복원 용액은 pH 범위가 약 5 내지 약 7인 완충 용액을 포함하는 것인 방법. - 제2항에 있어서, pH 범위가 약 5 내지 약 7인 완충 용액이 시트르산, 인산이수소칼륨, 붕산, 디에틸 바르비투르산, 피페라진-N,N'-비스(2-에탄술폰산), 디메틸아르신산, 2-(N-모르폴리노)에탄술폰산 또는 그의 조합을 포함하는 것인 방법.
- 제3항에 있어서, pH 범위가 약 5 내지 약 7인 완충 용액이 시트르산을 포함하는 것인 방법.
- 제2항에 있어서, pH 범위가 약 7.5 내지 약 11인 완충 용액이 트리스(히드록시메틸)메틸아민 (트리스 (TRIS)), 2-(N-모르폴리노)에탄술폰산 (TAPS), N,N-비스(2-히드록시에틸)글리신 (비신 (Bicine)), N-트리스(히드록시메틸)메틸글리신 (트리신 (Tricine)), 4-2-히드록시에틸-1-피페라진에탄술폰산 (HEPES), 2-{[트리스(히드록시메틸)메틸]아미노}에탄술폰산 (TES) 또는 그의 조합을 포함하는 것인 방법.
- 제5항에 있어서, pH 범위가 약 7.5 내지 약 11인 완충 용액이 트리스를 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 포름알데히드-고정된 조직 샘플이 파라핀 내에 매립되는 것인 방법.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 포름알데히드-고정된 조직 샘플이 기관 또는 조직의 절편 부분, 체액, 조직 또는 마이크로어레이 (microarray)인 방법.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 항원 복원 용액 및 제2 항원 복원 용액을 이용한 인큐베이션 단계가 10분 초과의 기간 동안 가열 기구에서 인큐베이션하는 것을 포함하는 방법.
- 제9항에 있어서, 가열 기구가 압력솥, 오토클레이빙, 수조, 핫플레이트, 마이크로웨이브, 스팀 히팅 또는 그의 조합인 방법.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 항원의 면역염색 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제11항에 있어서, 면역염색 단계가 순차적 면역퍼옥시다제 표지 및 소거를 포함하는 방법.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 포름알데히드-고정된 조직 샘플에서 FISH 또는 CISH 분석을 하는 방법.
- 샘플에서 복원되지 않은 항원의 적어도 일부분을 복원하는 제1 항원 복원 용액; 및
샘플에서 복원되지 않은 항원의 또 다른 부분의 적어도 일부를 복원하는 제2 항원 복원 용액
을 포함하는, 포름알데히드-고정된 조직 샘플에서 항원을 복원하기 위한 키트. - 제14항에 있어서, 제1 항원 복원 용액이 pH 범위가 약 5 내지 약 7인 완충 용액이며, 제2 항원 복원 용액이 pH 범위가 약 7.5 내지 약 11인 완충 용액인 키트.
- 제14항 또는 제15항에 있어서, 제1 항원 복원 용액이 시트르산, 인산이수소칼륨, 붕산, 디에틸 바르비투르산, 피페라진-N,N'-비스(2-에탄술폰산), 디메틸아르신산, 2-(N-모르폴리노)에탄술폰산 또는 그의 조합을 포함하는 것인 키트.
- 제15항 또는 제16항에 있어서, 제1 항원 복원 용액이 시트르산을 포함하는 것인 키트.
- 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 항원 복원 용액이 트리스(히드록시메틸)메틸아민 (트리스), 2-(N-모르폴리노)에탄술폰산 (TAPS), N,N-비스(2-히드록시에틸)글리신 (비신), N-트리스(히드록시메틸)메틸글리신 (트리신), 4-2-히드록시에틸-1-피페라진에탄술폰산 (HEPES), 2-{[트리스(히드록시메틸)메틸]아미노}에탄술폰산 (TES) 또는 그의 조합을 포함하는 것인 키트.
- 제18항에 있어서, 제2 항원 복원 용액이 트리스를 포함하는 것인 키트.
- 제14항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 면역염색 시약을 추가로 포함하는 키트.
- 샘플 취급 하위시스템 및 시약 분배 하위시스템을 포함하는, 제11항의 방법을 실시하기 위한 샘플 취급 기구.
- 제21항에 있어서, 시약 분배 하위시스템이 샘플을 제1 항원 복원 용액, 제2 항원 복원 용액 및 면역염색 시약 중 적어도 하나와 접촉시킬 수 있는 것인 기구.
- 제21항 또는 제22항에 있어서, 시약 분배 하위시스템이 샘플을 시약과 접촉시켜서 면역염색 시약을 제거할 수 있는 것인 기구.
- 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플 취급 기구가 1회 초과의 시약 분배 사이클을 실행할 수 있는 기구.
- 제21항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 신호 검출 하위시스템을 추가로 포함하는 기구.
- 제25항에 있어서, 샘플 취급 하위시스템, 시약 분배 하위시스템 또는 신호 검출 하위시스템 중 하나 이상이 자동화된 기구.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US12/547,768 | 2009-08-26 | ||
| US12/547,768 US8067241B2 (en) | 2009-08-26 | 2009-08-26 | Method and apparatus for antigen retrieval process |
| PCT/SE2010/050902 WO2011025442A1 (en) | 2009-08-26 | 2010-08-23 | Method and apparatus for antigen retrieval process |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20120049897A true KR20120049897A (ko) | 2012-05-17 |
| KR101823697B1 KR101823697B1 (ko) | 2018-01-30 |
Family
ID=43625473
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020127004876A KR101823697B1 (ko) | 2009-08-26 | 2010-08-23 | 항원 복원 공정을 위한 방법 및 장치 |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US8067241B2 (ko) |
| EP (1) | EP2470877B1 (ko) |
| JP (1) | JP5752688B2 (ko) |
| KR (1) | KR101823697B1 (ko) |
| CN (1) | CN102597740B (ko) |
| AU (1) | AU2010287027B2 (ko) |
| BR (1) | BR112012004141B1 (ko) |
| CA (1) | CA2769885C (ko) |
| HK (1) | HK1173494A1 (ko) |
| NZ (1) | NZ598084A (ko) |
| RU (1) | RU2538022C2 (ko) |
| SG (1) | SG178486A1 (ko) |
| WO (1) | WO2011025442A1 (ko) |
Families Citing this family (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8956859B1 (en) | 2010-08-13 | 2015-02-17 | Aviex Technologies Llc | Compositions and methods for determining successful immunization by one or more vaccines |
| US10203269B2 (en) | 2013-12-12 | 2019-02-12 | University Of Houston System | Method of retrieving elements from fixed tissue |
| US9506928B2 (en) * | 2013-12-12 | 2016-11-29 | University Of Houston System | Methods for retrieving antigens using aldehyde scavenging agents |
| CN103712837B (zh) * | 2013-12-29 | 2015-10-28 | 中国人民解放军成都军区总医院 | 悬浮脑片抗原修复压片夹 |
| EP3250902B1 (en) * | 2015-01-27 | 2024-05-08 | Ventana Medical Systems, Inc. | Methods for tissue sample fixation using an extended soak in aldehyde-based fixative solutions |
| FR3032797B1 (fr) | 2015-02-13 | 2017-03-03 | Cisbio Bioassays | Procede de quantification d'une proteine d'interet presente dans un echantillon biologique |
| EP3559672B1 (en) | 2016-12-21 | 2021-10-13 | Ventana Medical Systems, Inc. | Methods and systems for reagent delivery |
| EP3559271A1 (en) * | 2016-12-22 | 2019-10-30 | Ventana Medical Systems, Inc. | Fully automated nucleic acid extraction method for tissue samples |
| EP3427829A1 (en) | 2017-07-12 | 2019-01-16 | Lunaphore Technologies SA | Methods of in situ antigen retrieval of a biological sample & imaging thereof |
| US10330684B1 (en) | 2018-04-05 | 2019-06-25 | Rarecyte, Inc. | Analyte detection |
| US10274498B1 (en) | 2018-04-05 | 2019-04-30 | Rarecyte, Inc. | Analyte detection |
| CN112684178A (zh) * | 2021-01-06 | 2021-04-20 | 深圳市圣通生物科技有限公司 | 一种免疫组化抗原修复缓冲液及其使用方法 |
| WO2022217084A1 (en) | 2021-04-09 | 2022-10-13 | Neogenomics Laboratories, Inc. | Perivascular accumulation of immune cells in the diagnosis and treatment of cancer |
| CN113552362A (zh) * | 2021-07-23 | 2021-10-26 | 湖北百奥斯生物科技有限公司 | 一种新型信号放大的免疫荧光试剂盒 |
Family Cites Families (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1066502A1 (en) * | 1998-03-24 | 2001-01-10 | Biogenex Laboratories | Automated staining apparatus |
| US7951612B2 (en) * | 1999-07-08 | 2011-05-31 | Lee H. Angros | In situ heat induced antigen recovery and staining apparatus and method |
| WO2001004634A1 (en) | 1999-07-08 | 2001-01-18 | Lee Angros | Antigen recovery and/or staining apparatus and method |
| WO2001044783A1 (en) | 1999-12-14 | 2001-06-21 | University Of Miami | Rapid tissue processor |
| JP2002151473A (ja) | 2000-11-13 | 2002-05-24 | Tokyo Electron Ltd | プラズマ処理装置及びその組立方法 |
| JP3797418B2 (ja) * | 2001-05-29 | 2006-07-19 | 茂樹 並松 | 抗原賦活化法及びその抗原賦活剤 |
| US20040029184A1 (en) * | 2002-08-09 | 2004-02-12 | Pickcell Laboratories B.V. | Method for antigen retrieval and submersion fluid compositions for use therein |
| GB0304515D0 (en) | 2003-02-27 | 2003-04-02 | Dakocytomation Denmark As | Standard |
| JP3899407B2 (ja) * | 2003-06-26 | 2007-03-28 | 国立大学法人 鹿児島大学 | 免疫組織化学的染色方法による抗原の検出方法 |
| US20050053626A1 (en) * | 2003-09-05 | 2005-03-10 | Harrington John Ames | Grace process biotechnology patent the cure to the herpes virus |
| BRPI0511764B8 (pt) * | 2004-06-01 | 2021-05-25 | Avigen Inc | método de prevenção de agregação de vírions de vírus adeno-associado recombinante (raav) em uma preparação purificada de virions raav |
| US7867443B2 (en) | 2004-07-23 | 2011-01-11 | Dako Denmark A/S | Method and apparatus for automated pre-treatment and processing of biological samples |
| BRPI0609898A2 (pt) * | 2005-05-24 | 2011-10-11 | Lee H Angros | aparelho de recuperação e manchamento de antìgeno in situ, módulo de reação, método para tratar uma lámina de microscópio, e, tira de dispensação de reagente reconfigurável |
| PT1934607E (pt) | 2005-10-13 | 2013-11-13 | Fundacao D Anna Sommer Champalimaud E Dr Carlos Montez Champalimaud | Análise imuno-histoquímica in situ multiplex |
| US8048640B2 (en) * | 2007-01-30 | 2011-11-01 | Health Research, Inc. | Methods for evaluating and implementing prostate disease treatments |
| WO2008095501A1 (en) * | 2007-02-09 | 2008-08-14 | Dako Denmark A/S | Horizontal antigen retrieval |
| CN101387641B (zh) * | 2007-09-11 | 2013-11-27 | 深圳市康百得生物科技有限公司 | 一种淡水鱼类肝吸虫快速免疫检测试剂盒和检测方法 |
| WO2009085574A2 (en) * | 2007-12-28 | 2009-07-09 | Spring Bioscience Corporation | Microwave antigen retrieval in non-aqueous solvents |
| WO2009110936A2 (en) | 2007-12-28 | 2009-09-11 | Spring Bioscience Corporation | Antigen retrieval methods for immunohistochemistry |
-
2009
- 2009-08-26 US US12/547,768 patent/US8067241B2/en active Active
-
2010
- 2010-08-23 CN CN201080038562.5A patent/CN102597740B/zh active Active
- 2010-08-23 CA CA2769885A patent/CA2769885C/en not_active Expired - Fee Related
- 2010-08-23 EP EP10812401.7A patent/EP2470877B1/en active Active
- 2010-08-23 NZ NZ598084A patent/NZ598084A/en not_active IP Right Cessation
- 2010-08-23 AU AU2010287027A patent/AU2010287027B2/en not_active Ceased
- 2010-08-23 KR KR1020127004876A patent/KR101823697B1/ko active IP Right Grant
- 2010-08-23 JP JP2012526689A patent/JP5752688B2/ja active Active
- 2010-08-23 WO PCT/SE2010/050902 patent/WO2011025442A1/en active Application Filing
- 2010-08-23 RU RU2012106199/05A patent/RU2538022C2/ru active
- 2010-08-23 SG SG2012011300A patent/SG178486A1/en unknown
- 2010-08-23 BR BR112012004141-0A patent/BR112012004141B1/pt not_active IP Right Cessation
-
2011
- 2011-09-22 US US13/239,918 patent/US20120009666A1/en not_active Abandoned
-
2013
- 2013-01-15 HK HK13100622.1A patent/HK1173494A1/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR101823697B1 (ko) | 2018-01-30 |
| BR112012004141A2 (pt) | 2016-03-22 |
| BR112012004141B1 (pt) | 2020-03-10 |
| NZ598084A (en) | 2014-06-27 |
| CA2769885C (en) | 2018-06-26 |
| EP2470877A1 (en) | 2012-07-04 |
| US20110053171A1 (en) | 2011-03-03 |
| WO2011025442A1 (en) | 2011-03-03 |
| CN102597740B (zh) | 2015-04-01 |
| AU2010287027B2 (en) | 2015-03-12 |
| JP2013503332A (ja) | 2013-01-31 |
| EP2470877A4 (en) | 2013-03-13 |
| JP5752688B2 (ja) | 2015-07-22 |
| US20120009666A1 (en) | 2012-01-12 |
| RU2538022C2 (ru) | 2015-01-10 |
| CA2769885A1 (en) | 2011-03-03 |
| CN102597740A (zh) | 2012-07-18 |
| SG178486A1 (en) | 2012-03-29 |
| US8067241B2 (en) | 2011-11-29 |
| RU2012106199A (ru) | 2013-10-10 |
| EP2470877B1 (en) | 2020-06-03 |
| HK1173494A1 (en) | 2013-05-16 |
| AU2010287027A1 (en) | 2012-03-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR101823697B1 (ko) | 항원 복원 공정을 위한 방법 및 장치 | |
| KR102073117B1 (ko) | 생물학적 샘플에서 dna, rna 및 단백질의 검출 방법 | |
| KR102046194B1 (ko) | 염료의 광활성화된 화학적 표백 | |
| Sanderson et al. | 19—Immunohistochemical and immunofluorescent techniques | |
| US20110074944A1 (en) | System and methods for generating a brightfield image using fluorescent images | |
| JP5323261B2 (ja) | 細胞又は組織試料の固定のためのビス−マレイン酸無水物架橋剤の使用 | |
| KR101969847B1 (ko) | 동일 검체에서 여러 항원을 검출하기 위한 순차적 다중 면역염색법 | |
| CN108603879B (zh) | 样品多重循环和原位成像的方法 | |
| US9176032B2 (en) | Methods of analyzing an H and E stained biological sample | |
| US20220155311A1 (en) | Multiplexed Imaging with Nanobody Probes | |
| Orchard | Immunocytochemical techniques and advances in dermatopathology |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant |