JP4856569B2 - 染色組織標本の陽性細胞の計数方法 - Google Patents
染色組織標本の陽性細胞の計数方法 Download PDFInfo
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Description
本発明においては、まず、組織標本を固定し、薄切することでスライドグラス等に貼り付ける。固定は、細胞が染色性を失わないような何れの方法によっても行なうことが可能である。ここで、組織標本としては、ヒトを含む動物、植物等の生体組織から採取した組織標本が用いられる。例えば、臓器全体像の凍結切片、手術により摘出した組織の切片等が挙げられる。切片厚は、染色性の観点から、細胞径以上であることが好ましく、20μm〜30μm程度であることがより好ましい。
また、前記特異的結合物質としては、マーカーに特異的に結合する物質であればよく、例えば、核酸プローブ、抗体等が挙げられる。抗体としては、その由来、種類(モノクローナル、ポリクローナル)および形状を問わないが、核染色性を持つ物質が好ましい。例えば、マウス抗体、ラット抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト型化抗体などの公知の抗体を用いることができる。抗体はモノクローナル抗体であることが好ましい。
初回の染色と2回目の染色で用いられる標識物質は、互いに識別可能な標識である。互いに異なる標識を用いることで、それぞれの染色を分離検出できる。ここで、例えば標識物質として蛍光色素を用いる場合、初回の染色と2回目の染色として、相違する波長の蛍光色素を用いればよい。
本発明の方法に基づいて、神経細胞に特異的な標識タンパクNeuNに対する免疫染色を行い、組織標本(マウス脳)における神経細胞核の自動検出を行った。
1)抗体浸透処理前の初回抗体反応で、レーザー共焦点顕微鏡による断層撮影を行い、片断端に接した細胞のみが染色されているかを実際に検証した。切片の厚み方向から観察した結果、スライドグラスの反対の片断端に接した細胞のみが染色されていることを確認した(図3B)。他方、通常の染色手順に従い抗体浸透処理を行った切片では全層にわたって細胞が染色されていた(図3A)。
この結果、浸透処理前は表層側の断端に接した細胞のみが染色されていたのに対して、処理後に染色した標識では全層にわたって標識されていたことが確認できた。
図5に示すとおり、初回の染色で明確に染色された細胞は8個である(図5;緑)。一方、2回目の染色で明確に染色された細胞は12個であり(図5;赤)、初回の染色でも染まった5個の細胞を除いた7個を陽性細胞数とした。
Claims (3)
- 組織標本における染色陽性細胞を計数する方法であって、(1)スライドグラスに貼り付けられた組織標本を染色剤浸透促進処理する前に染色する工程、(2)染色剤浸透促進処理工程、(3)次いで、組織標本を初回染色と分離検出可能な手段で再度染色する工程、(4)前記工程(3)でのみ染色された細胞のみを陽性細胞として選択し計数する工程を含むことを特徴とする染色された組織標本の陽性細胞の計数方法。
- 染色剤浸透促進処理が、細胞内の標的物質を露出させ、外部から供給する特異的結合物質との反応を促進するための浸透処理である請求項1記載の染色された組織標本の陽性細胞の計数方法。
- 組織標本の染色を、該組織標本中の標的物質に対する特異的結合物質を用いた免疫染色法により行う請求項1又は2記載の染色された組織標本の陽性細胞の計数方法。
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