JPWO2009078386A1 - 組織形態保持および核酸品質保持に優れた新規標本作製法 - Google Patents
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Abstract
Description
(1)以下の工程を含む凍結または未凍結の全身諸臓器又は組織(硬組織を除く)の標本作製方法:
1)目的とする臓器または組織をPFA液で固定する;
2)AMeX法によるパラフィン包埋を行う。
(2)PFA液による固定を浸漬により行う(1)記載の方法。
(3)AMeX法によるパラフィン包埋を行った後に、薄切切片を作製する工程をさらに含む(1)または(2)記載の方法。
(4)得られた薄切切片の脱パラフィンおよび親水化の工程をさらに含む(3)記載の方法。
(5)組織染色、免疫組織化学的染色又は酵素組織化学的染色をさらに行う(4)記載の方法。
(6)前立腺組織の標本作製方法である(1)〜(5)のいずれかに記載の方法。
(7)前立腺癌組織の標本作製方法である(1)〜(5)のいずれかに記載の方法。
(8)(1)〜(5)のいずれかに記載の方法によって得られる、全身諸臓器又は組織(硬組織を除く)の標本。
(9)前立腺組織標本である(8)記載の標本。
(10)前立腺癌組織標本である(8)記載の標本。
(11)以下の工程を含む臓器又は組織標本中の細胞におけるmRNAの品質検定方法:
1)(1)〜(7)のいずれかに記載の方法によって得られる臓器又は組織標本より所望の細胞を採取する;
2)採取した所望の細胞からtotal RNAを抽出する;
3)抽出されたtotal RNAより逆転写反応を行いcDNAを合成する;
4)合成したcDNAを鋳型としてβ-アクチンの5末端側と3末端側の領域をPCRにより増幅する;
5)増幅されたβ-アクチンの5末端側と3末端側の領域の産物量比を算出して、3 末端側領域/5 末端側領域のPCR産物の比が一定値以下となるものを良好なmRNAの品質を有すると判断する。
(12)臓器又は組織標本より所望の細胞をマイクロダイセクションによって採取する(11)記載の方法。
(13)以下の工程を含むDNAマイクロアレイ用サンプルの作製方法:
1)(1)〜(7)のいずれかに記載の方法によって得られる臓器又は組織標本より所望の細胞を採取する;
2)採取した所望の細胞から以下の方法によって細胞中のmRNAの品質検定を行う;
a)採取した所望の細胞からtotal RNAを抽出する;
b)抽出されたtotal RNAより逆転写反応を行いcDNAを合成する;
c)合成したcDNAを鋳型としてβ-アクチンの5末端側と3末端側の領域をPCRにより増幅する;
d)増幅されたβ-アクチンの5末端側と3末端側の領域の産物量比を算出して、3 末端側領域/5 末端側領域のPCR産物の比が一定値以下となるものを良好なmRNAの品質を有すると判断する;
3)ステップ2)の方法で良好なmRNAの品質を有すると判断された細胞からtotal RNAを抽出し、これからcDNAを合成し、さらに cRNAを合成する。
(14)(12)の方法で得られたサンプルを用いて、DNAマイクロアレイで階層的クラスタリング解析を行う方法。
実施例1:標本作製
(1)PLP-AMeX Paraffin法もしくはPFA-AMeX Paraffin法による標本作製および組織形態の観察
摘出した組織を研究目的に使用することを同意した前立腺癌もしくは前立腺肥大症の患者の組織を使用した。入手したサンプルは、約5mm3大にトリミングし、4℃のPLP固定液(0.01 M 過ヨウ素酸塩 , 0.075 M リジン、0.0375M リン酸緩衝液、4%パラホルムアルデヒド)、もしくは4% PFA固定液(4%パラホルムアルデヒド/0.01M PBS(pH7.4))中で16時間から24時間固定した。固定したサンプルは、0.01M PBS溶液で洗浄処理(4℃、2時間)した後に、アセトンによる脱水処理(4℃、overnightおよび室温、30分4回)を行い、メチルベンゾエートによる処理(室温、30分2回)、キシレンによる透徹処理(室温、30分2回)を行った。その後、60℃のパラフィン液に浸漬(40分3回)し、パラフィン包埋処理を行い、4℃で保存した。
(2)PFA-Paraffin法による標本作製
摘出した組織を研究目的に使用することを同意した前立腺癌もしくは前立腺肥大症の患者の組織を使用した。入手したサンプルは、約5mm3大にトリミングし、4℃のPFA固定液中で16時間から24時間固定した。固定したサンプルは、エタノールによる段階的な脱水処理(70% エタノール 室温2 時間、80% エタノール 室温1.5 時間、90% エタノール 室温 1.5 時間、95% エタノール 室温1.5 時間、100% エタノール 室温2 時間3回)およびキシレンによる透徹処理(キシレン 室温1時間2回、室温1.5時間1回)を行った。その後、60℃のパラフィン液に浸漬(1.5時間1回、2時間2回)し、パラフィン包埋処理を行い、室温で保存した。
(3)NBF-Paraffin法による標本作製
摘出した組織を研究目的に使用することを同意した前立腺癌もしくは前立腺肥大症の患者の組織を使用した。入手したサンプルは、約5mm3大にトリミングし、4℃の20%NBF固定液(20%ホルマリン/0.1M PB(pH7.4))中で16時間から24時間固定した。固定したサンプルは、エタノールによる段階的な脱水処理(70% エタノール 室温2 時間、80% エタノール 室温1.5 時間、90% エタノール 室温 1.5 時間、95% エタノール 室温1.5 時間、100% エタノール 室温2 時間3回)およびキシレンによる透徹処理(キシレン 室温1時間2回、室温1.5時間1回)を行った。その後、60℃のパラフィン液に浸漬(1.5時間1回、2時間2回)し、パラフィン包埋処理を行い、室温で保存した。
(4)凍結標本作製
摘出した組織を研究目的に使用することを同意した前立腺癌もしくは前立腺肥大症の患者の組織を使用した。入手したサンプルは、約5mm3大にトリミングし、プラスティック製皿(クリオモルド(登録商標)、サクラファインテック社製)に充たしたOCTコンパウンド(サクラファインテック社製)中に埋め、ドライアイスおよびアセトンで周囲を満たし冷却したヘキサン液面に浮かべ、OCTコンパウンドを冷却し固めた。作製した凍結ブロックはプラスティック製皿ごとヘキサンを入れたプラスティック製容器に移し、−80℃に保管した。
(5)ヒト前立腺癌培養細胞(LNCaP細胞)組織よりの標本作製
超免疫不全マウス(NOG マウス)にLNCap細胞(ヒト前立腺癌in vitro/in vivo細胞株)を移植し、移植後54日から67日目にマウスより採取し、約5mm3にトリミングした後、前述の4つの標本作製方法(PFA-AMeX-Paraffin法、PFA-Paraffin法、NBF-Paraffin法、未固定凍結法)に従って処理を行い、それぞれの標本を作製した。
実施例2:組織形態の観察
PFA-AMeX-paraffin法により作製したパラフィンブロックよりの薄切切片作製および染色には市販されている一般的な機器、試薬類を使用した。具体的にはパラフィン薄切切片は、一般的な方法に従ってパラフィンブロックより4 μm厚のパラフィン切片を作製し、AS-LMDシステム(Leica Microsystems社製)用のフォイル付フレームにマウント後、乾燥させた。キシレンによる脱パラフィン処理(室温15 秒 2回)およびアセトンによる親水処理(室温15 秒2回)を行った後、RNase-free水で水洗し、マイヤー・ヘマトキシリン液(室温 10秒)に浸漬した。再度RNase-free水で水洗し、エオジン液(室温10秒)に浸漬後、エタノールによる脱水処理(100% エタノール、室温10秒)を行った。ヘマトキシリン-エオジン(HE)染色を行った切片を乾燥後に、AS-LMDシステムの顕微鏡下で組織形態を観察した。
実施例3:4種の標本作製法により作製した標本からのtotal RNA抽出、定量およびmRNA品質の比較
NOGマウスに移植したヒト前立腺癌培養細胞(LNCaP細胞)の同一腫瘍組織を用いて前述の4つの標本作製方法(未固定凍結法、PFA-AMeX-Praffin法、PFA-Paraffin法、NBF-Paraffin法)で標本を作製し、その薄切切片からtotal RNAを抽出し、mRNA品質の比較を行った。
(1)薄切切片よりのtotal RNAの抽出
PFA-AMex-Paraffin法、PFA-Paraffin法、NBF-Paraffin法で作製した標本のパラフィン薄切切片をそれぞれ別々のチューブ(0.2mL)に回収し、脱パラフィン処理(キシレン、室温15秒3回)および親水処理(100%エタノール、室温15秒)を行った後、薄切切片を乾燥させた。その後Lysis buffer 205 μL(溶解バッファー、20 mM Tris-HCl, 20mM EDTA, 1% SDS, 500 μg/mL Proteinase K)を加え、採取組織を回収したチューブを加熱処理(60℃、16時間および95℃、10分)をした後に、冷却し、45μLのRNase-free waterを加え、さらに750 μLのTrizol-LS (invitrogen社)を加えた。Trizol-LS添加後、室温で5分間放置し、200 μLのChloroform-Isoamyl alcohol液を加え、10分間室温で放置後遠心した。上清を回収し、50μLの 3M NaOAcと4μLの5 mg/mLのグリコーゲンを加え、攪拌後500 μLのイソプロピルアルコールを加え、10分間室温で放置後、遠心した。上清を除き、1 mLの75%エタノールを加えペレットをリンスした。さらに100%エタノールでリンスした後、ペレットを風乾後、14 μLのRNase-free waterを加え、RNAペレットを融解し、−80℃で保存した。
(2)total RNAの定量とmRNA品質の検定
total RNA量はRiboGreen RNA Quantification Kit (Molecular Probes社)を用いて定量した。RNA定量後、5 ngのRNAを別のチューブへ小分けしDNase処理し混入しているDNAを分解した後、オリゴdTプライマーと逆転写酵素(Superscript II RNase H- reverse Transcriptase; Invitorogen社)を用いてmRNAを逆転写し、ヒトβ-actin mRNA(X00351,1761bp)(cDNAの配列を配列番号1に示す)の5プライムサイド(増幅領域:1369位-1521位,153bp)と3プライムサイド(増幅領域:1600位-1758位、159bp)のプライマーを用いて増幅し、サイバーグリーンを用いて双方のPCR産物を定量した。
5'-TGTGTGGACTTGGGAGAGGA-3' (1521-1502, 20mer)(配列番号:3)
3'側(1600-1758、159bp)のPCRを行うプライマーとして以下のものを用いた。
5'-GGTGTGCACTTTTATTCAACTGGTC-3' (1758-1734, 25mer)(配列番号:5)
基礎検討から、5プライム領域の増幅産物が1ユニット以上、3プライム領域の増幅産物が15 ユニット以上、3 プライム領域/5 プライム領域のPCR産物の比が20以下のRNAサンプルは信頼性の高いGene Chipデータ(Affymetrix Human X3P arrayで% present-call 値(array上に搭載されている遺伝子のうち何%の遺伝子が“発現している”と判断されたかを示す値)が30%以上となるもの)が取得できる事が確認されており、これらの値を基準値として、サンプルの良否を判定した。
(3)4種の標本作製方法で作製した標本におけるmRNA品質の比較
4種の標本作製方法で作製した標本におけるmRNA品質の比較の結果を表1に示す。
実施例4:PFA-AMeX-Paraffin法とPFA-Paraffin法で作製したヒト前立腺癌組織標本のmRNA品質の比較
PFA-AMeX-Paraffin法またはPFA-Paraffin法により作製されたヒト前立腺癌組織標本のmRNA品質比較を行うため、ヒト前立腺癌組織PFA-AMeX-Paraffin標本79検体、ヒト前立腺癌組織PFA-Paraffin69検体より薄切切片を作製し、実施例3に記載の方法でtotal RNAの抽出、定量およびmRNA品質の検定を行った。その結果を表2に示す。
実施例5:薄切切片からのAS-LMDシステムによる組織の採取および採取組織からのtotal RNA抽出、定量、mRNA品質の検定およびGeneChipデータの取得
(1)AS-LMDシステムによる組織の採取
ヒト前立腺組織については実施例2に記載の方法でPFA-AMeX-paraffin標本を作成し、HE染色を行った薄切切片を乾燥後にAS-LMDシステム(Leica Microsystems社製)によるサンプル採取を行い目的とする細胞を採取した。具体的には、AS-LMDシステムのモニター上に映し出される画像から前立腺癌部および前立腺過形成部を識別し、レーザーで癌部および過形成部をそれぞれ別々のチューブ(0.2 mL)に回収した。チューブにはサンプル(採取組織)よりのtotal RNA 抽出のために、サンプル回収前に30 μLのLysis buffer(溶解バッファー、20 mM Tris-HCl, 20mM EDTA, 1% SDS, 500 μg/mL Proteinase K)を加えておき、サンプル回収後にさらに175 μLの溶解バッファーを加えた。
(2)採取組織からのtotal RNA抽出、定量およびmRNA品質の検定
マイクロダイセクションにより採取した組織からのtotal RNA抽出、定量およびmRNA品質の検定は実施例3に記載の方法と同様に行った。
(3)GeneChipデータの取得
mRNA品質検定において5プライム領域の増幅産物が1ユニット以上、3プライム領域の増幅産物が15ユニット 以上、3 プライム領域/5 プライム領域のPCR産物の比が20以下のRNAサンプルは信頼性の高いGene Chipデータ(Affymetrix Human X3P arrayで% present-call 値が30%以上となるもの)が取得できる事が基礎検討より確認されており、これらの値を基準値として、サンプルの良否を判定した。基準値を満たし、良い品質のmRNAが含まれることを確認したサンプルのtotal RNAからAffymetrix社の提供する標準的な方法でラベル化cRNAプローブを作製し、Human X3P array(Affymetrix社)を用いて遺伝子発現データを取得した。取得した遺伝子発現データのうちPresent-call値が30%以上となるデータを信頼性の高いデータとし、これらについてクラスタリング解析を行った。
実施例6:前立腺癌組織および前立腺過形成組織における遺伝子発現データの解析
実施例5において取得された前立腺癌および前立腺過形成組織における遺伝子発現データについて階層的クラスタリング解析(Hierarchical clustering)を行ない、遺伝子発現パターンの類似性を検討した。具体的にはGeneChipの遺伝子発現においてpresent-call値が30%以上を示した前立腺癌組織11検体および前立腺過形成組織42検体の遺伝子発現データについてGC-RMA法で、シグナル値(遺伝子の発現量を示す値)を算出し、これを対数値に変換し, mean center化(平均化:平均化とはデータセットの中心にプロットの原点を移動することであり、つまり各変数の平均値はゼロとなる。)を行った後、階層的クラスタリングを行なった。階層的クラスタリングはRパッケージ(Rは統計的な計算およびグラフィックのためのフリーソフトウェア)のpvclustパッケージを用いて行った。
実施例7:PFA-AMeX法により処理したSNAP-Frozenサンプルの組織形態およびRNA品質
一般的な組織バンクにおいて、組織サンプルは凍結保存されたもの (SNAP-Frozenサンプル)が主流であり、これらは主に核酸やタンパク質の抽出に用いられてきた。また組織形態観察についてはSNAP-Frozen サンプルを用いた凍結切片の作製が一般的には可能であるが、通常のパラフィン切片に比べて組織形態の保持に難点があった。このため、SNAP-Frozenサンプル(凍結組織)についてPFA-AMeX-Paraffin法により標本を作製し、該標本の組織形態保持およびmRNA品質について評価を行った。
(1)SNAP-Frozen組織からのPFA-AMeX-Paraffin標本作製
摘出した組織を研究目的に使用することを同意した前立腺癌もしくは前立腺肥大症の患者の凍結組織(SNAP-Frozen組織)を使用した。SNAP-Frozenサンプルは、約5mm3大にトリミングし、実施例1のPFA-AMeX-Paraffin法により、標本を作製した。
(2)組織形態の比較
SNAP-Frozen(凍結) サンプルからPFA-AMeX-Praffin法によって作製された標本のパラフィン薄切切片では、HE染色後の形態観察においてわずかに核の空胞化が認められたものの、未凍結組織より作製されたPFA-AMeX-Praffin標本のパラフィン薄切切片とほぼ同等の組織形態識別が可能であった。(図4)
(3)mRNAの品質検定
SNAP Frozen(凍結)サンプルからPFA-AMeX-Paraffin法で作製された標本より、実施例4に記載の方法でtotal RNA抽出、定量およびmRNAの品質検定を行った。その結果を表3に示す。
Claims (14)
- 以下の工程を含む凍結または未凍結の全身諸臓器又は組織(硬組織を除く)の標本作製方法:
1)目的とする臓器または組織をPFA液で固定する;
2)AMeX法によるパラフィン包埋を行う。 - PFA液による固定を浸漬により行う請求項1記載の方法。
- AMeX法によるパラフィン包埋を行った後に、薄切切片を作製する工程をさらに含む請求項1または2記載の方法。
- 得られた薄切切片の脱パラフィンおよび親水化の工程をさらに含む請求項3記載の方法。
- 組織染色、免疫組織化学的染色又は酵素組織化学的染色をさらに行う請求項4記載の方法。
- 前立腺組織の標本作製方法である請求項1〜5のいずれかに記載の方法。
- 前立腺癌組織の標本作製方法である請求項1〜5のいずれかに記載の方法。
- 請求項1〜5のいずれかに記載の方法によって得られる、全身諸臓器又は組織(硬組織を除く)の標本。
- 前立腺組織標本である請求項8記載の標本。
- 前立腺癌組織標本である請求項8記載の標本。
- 以下の工程を含む臓器又は組織標本中の細胞におけるmRNAの品質検定方法:
1)請求項1〜7のいずれかに記載の方法によって得られる臓器又は組織標本より所望の細胞を採取する;
2)採取した所望の細胞からtotal RNAを抽出する;
3)抽出されたtotal RNAより逆転写反応を行いcDNAを合成する;
4)合成したcDNAを鋳型としてβ-アクチンの5末端側と3末端側の領域をPCRにより増幅する;
5)増幅されたβ-アクチンの5末端側と3末端側の領域の産物量比を算出して、3 末端側領域/5 末端側領域のPCR産物の比が一定値以下となるものを良好なmRNAの品質を有すると判断する。 - 臓器又は組織標本より所望の細胞をマイクロダイセクションによって採取する請求項11記載の方法。
- 以下の工程を含むDNAマイクロアレイ用サンプルの作製方法:
1)請求項1〜7のいずれかに記載の方法によって得られる臓器又は組織標本より所望の細胞を採取する;
2)採取した所望の細胞から以下の方法によって細胞中のmRNAの品質検定を行う;
a)採取した所望の細胞からtotal RNAを抽出する;
b)抽出されたtotal RNAより逆転写反応を行いcDNAを合成する;
c)合成したcDNAを鋳型としてβ-アクチンの5末端側と3末端側の領域をPCRにより増幅する;
d)増幅されたβ-アクチンの5末端側と3末端側の領域の産物量比を算出して、3 末端側領域/5 末端側領域のPCR産物の比が一定値以下となるものを良好なmRNAの品質を有すると判断する;
3)ステップ2)の方法で良好なmRNAの品質を有すると判断された細胞からtotal RNAを抽出し、これからcDNAを合成し、さらに cRNAを合成する。 - 請求項13の方法で得られたサンプルを用いて、DNAマイクロアレイで階層的クラスタリング解析を行う方法。
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JPN7014001159; Yuishi Sato, et al.: 'The AMeX method. A simplified technique of tissue processing and paraffin embedding with improved pr' Am. J. Pathol. Vol. 125, No. 3, 198612, pp. 431-435 * |
JPN7014001160; IAN W. McLEAN et al.: 'PERIODATE-LYSINE-PARAFORMALDEHYDE FIXATIVE A NEW FIXATIVE FOR IMMUNOELECTRON MICROSCOPY' THE JOURNAL OF HISTOCHEMISTRY AND CYTOCHEMISTRY Vol. 22, No. 12, 1974, pp. 1077-1083 * |
JPN7014001161; K Yoshinari et al.: 'Generation of human monoclonal antibodies recognising membranous antigens of the lung adenocarcinoma' British Journal of Cancer Vol. 74, 1996, pp. 359-367 * |
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---|---|
WO2009078386A1 (ja) | 2009-06-25 |
US20100267571A1 (en) | 2010-10-21 |
SG186660A1 (en) | 2013-01-30 |
EP2239555A1 (en) | 2010-10-13 |
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