TW201833335A - 用於評估子宮內膜癌的發展風險或診斷子宮內膜癌的方法及套組 - Google Patents

Abstract

本揭露提供一種用於對需要診斷或風險預測的個體診斷子宮內膜癌或預測子宮內膜癌發展風險的方法，其包含測量個體的樣品中的本文所揭露的一種或多種miRNA表現量，以及比較測試樣品與無子宮內膜癌樣品中的至少一種miRNA的表現量。亦提供用於診斷子宮內膜癌或預測子宮內膜癌的發展風險的套組，其包含用於定序或測量本文所揭露之一種或多種miRNA表現量的試劑。

Description

用於評估子宮內膜癌的發展風險或診斷子宮內膜癌的方法及套組

本申請案主張於2017年3月10日提出之美國臨時申請案第62/469724號之優先權的效益，其全部內容併入本文作為參考。

子宮內膜癌是工業化國家主要的婦科惡性腫瘤。世界衛生組織的分類基於結構壅擠度(architectural crowding)及核異型(nuclear atypia)將子宮內膜增生分類成單純性增生、無異型的複雜性增生、單純性非典型增生或複雜性非典型增生。子宮內膜增生的嚴重性反應了子宮內膜癌的發展風險。根據Kurman等人((The behavior of endometrial hyperplasia. A long-term study of "untreated" hyperplasia in 170 patients. Cancer 56: 403-412)，在單純性增生中發展成惡性腫瘤的風險低於1%。然而，在具有單純性增生或無異型的複雜性增生的患者中有例外，其子宮內膜癌的進程在短期間內發生。

微小RNA(miRNA)為演化上保守、非編碼的RNA分子，其長度通常為21-25個核苷酸，且藉由結合至mRNAs的3’-非轉譯區(3’-UTRs)達到抑制蛋白質轉譯或促進mRNA降解的作用(參見Griffiths-Jones S (2004). The microRNA Registry. Nucleic acids research 32: D109-111)。近來多數對miRNAs的研究係在基礎層次且需要進一步的作業以建立其在子宮內膜癌的臨床上應用。

由於如CA-125之對子宮內膜癌的癌症生物標記的低敏感度及特異性，而使這些生物標記在臨床上的應用有限。因此，需要一種用於預測子宮內膜癌之風險及/或診斷子宮內膜癌的非侵入式且便利的診斷方法，而本發明能夠滿足此以及其他需求。

因此，本發明提供一種用於在個體中檢測子宮內膜癌或預測子宮內膜癌發展風險的方法，其包含測量在個體樣品中選自由miR10a、 miR25、miR28-3p、miR29a、miR30a*、miR30b、miR30e、miR146a、miR146b-5p、miR451、miR660、miR3613-5p及miR4487所組成的群組中之至少一miRNA的表現量之步驟，當樣品中的至少一種下列miRNA表現量相對於無子宮內膜癌樣品中的至少一種相應的miRNA之表現量較高，指示該個體具有子宮內膜癌或具有發展子宮內膜癌的風險：miR10a、 miR25、 miR28-3p、 miR29a、 miR30a*、miR30b、miR30e、miR146a、 miR146b-5p、 miR451或miR660，以及當測試樣品中的至少一種下列miRNA表現量相對於無子宮內膜癌樣品中的至少一種相應的miRNA之表現量較低時，指示該個體具有子宮內膜癌或具有發展子宮內膜癌的風險：miR-3613-5P或miR4487。

本發明進一步提供一種用於在個體中檢測子宮內膜癌或預測子宮內膜癌發展風險的套組，其包含：用於定序或測量在個體的測試樣品中的選自由miR10a、miR25、miR28-3p、miR29a、miR30a*、miR30b、miR30e、miR146a、miR146b-5p、miR451、miR660、miR3613-5p及miR4487所組成的群組中的至少一種miRNA表現量。

在一例示性實施例中，套組進一步包含一標記說明(label stating)，其中在測試樣品中的至少一種下列miRNA表現量相對於無子宮內膜癌樣品中至少一種相應miRNA之表現量較高，指示個體具有子宮內膜癌或具有發展子宮內膜癌的風險：miR10a、miR25、miR28-3p、miR29a、miR30a*、miR30b、miR30e、miR146a、miR146b-5p、miR451或miR660，以及當測試樣品中的至少一種下列miRNA表現量相對於無子宮內膜癌樣品中的至少一種相應的miRNA之表現量較低，指示該個體具有子宮內膜癌或具有發展子宮內膜癌的風險：miR-3613-5P或miR4487。

亦提供一種用於鑑定用以抑制子宮內膜癌細胞的測試治療劑的方法，其包含：a)在測試治療劑與一個或多個子宮內膜癌細胞接觸之前，測定選自由miR10a、miR25、miR28-3p、miR29a、miR30a*、miR30b、miR30e、miR146a、miR146b-5p、miR451、miR660、miR3613-5p及miR4487所組成之群組中的至少一種miRNA的表現量；以及b)在測試治療劑與一個或多個子宮內膜癌細胞接觸之後，測定於步驟(a)中的至少一種相應miRNA之表現量，其中在測試治療劑與一個或多個子宮內膜癌細胞接觸之後的一種或多種下列miRNA表現量相對於測試治療劑與一個或多個子宮內膜癌細胞接觸之前的相應 miRNA表現量下降，指示該測試治療劑對子宮內膜癌的抑制有效：miR10a、miR25、miR28-3p、miR29a、miR30a*、miR30b、miR30e、miR146a、miR146b-5p、miR451或miR660，以及在測試治療劑與一個或多個子宮內膜癌細胞接觸之後的一種或多種下列miRNA表現量相對於測試治療劑與一個或多個子宮內膜癌細胞接觸之前的相應 miRNA表現量上升，指示該測試治療劑對子宮內膜癌的抑制有效：miR3613-5p或miR4487。

亦提供一種用於測定療法在個體中抑制子宮內膜癌細胞的效果的方法，該方法包含：a)在對個體提供至少一部份療法之前，從個體所得到的第一樣品中的選自由iR10a、miR25、miR28-3p、miR29a、miR30a*、miR30b、miR30e、miR146a、miR146b-5p、miR451、miR660、miR3613-5p及miR4487所組成之群組中的至少一miRNA表現量，以及b)在對個體提供至少一部份療法之後，從個體所得到的第二樣品中，於步驟(a)中的至少一相應miRNA之表現量，其中當第二樣品中的一種或多種下列miRNA表現量相對於在第一樣品中相應的miRNA表現量下降，指示該療法對子宮內膜癌的抑制有效：miR10a、miR25、miR28-3p、miR29a、miR30a*、miR30b、miR30e、miR146a、miR146b-5p、miR451或miR660，以及其中第二樣品中的一種或多種下列miRNAs表現量相對於在第一樣品中的相應的miRNA表現量上升，指示該療法對子宮內膜癌的抑制有效：miR3613-5p或miR4487。

本文所使用的冠詞「一(a)」及「一(an)」指的是冠詞之文法主體的一個或一個以上(即，至少一個)。

儘管本揭露支持意指為僅替代方案以及「及/或(and/or)」的定義，但除非明顯地指出僅指替代方案或該替代方案係為互斥的，否則在申請專利範圍中使用的用語「或(or)」用於表示「及/或(and/or)」。

在本說明書及申請專利範圍中所使用的字詞「包括(comprising)」(以及任何包括(comprising)的形式，如「包括(comprise)」及「包括(comprises)」)、「具有(having)」(以及任何具有(having)的形式，如「具有(have)」及「具有(has)」)、「包含(including)」(以及任何包含(including)的形式，如「包含(includes)」及「包含(include)」)或「含有(containing)」(以及任何含有(containing)的形式，如「含有(contains)」及「含有(contain)」)係為包含或開放式的，且不排除其他所述的元件或方法步驟。

本文中所使用的「患者(Patient)」或「個體(subject)」指的是被診斷患有或被懷疑具有子宮內膜癌或具有子宮內膜癌的發展風險的哺乳動物個體。例示性個體可為人類、人猿、狗、豬、牛、貓、馬、山羊、綿羊、囓齒類及可發展子宮內膜癌的其他哺乳動物。

如本文中可替換使用的「微小RNA(microRNA)」、「微小RNA(miR)」或「微小RNA(miRNA)」指的是從miR基因轉錄之未加工(如前驅物)或加工(如成熟的)的RNA轉錄本。微小RNA為在真核生物中負調控基因表現並構成新穎類基因調節子的內源非編碼單股RNA(Chua, et al. (2009) Curr. Opin. Mol. Ther. 11:189-199)。個別的miRNAs在不同生物體中被鑑別與定序並給予名稱。本文提供miRNAs的名稱及其序列。

本文的所有數字可被理解成藉由「大約 (about)」修飾。除非另有說明，當本文所使用的用語「大約 (about)」涉及可測量的值、持續時間(temporal duration)及其類似值或範圍時，意指涵蓋特定值± 10%的變異、較佳為± 5%、更佳為± 1%以及再更佳為± 0.1%，例如這些變異適合為miRNA量的表現。

「較高(higher)」或「較低(lower)」miRNA表現為相對的用語，且可藉由比較在測試樣品與已知無子宮內膜癌個體(即，對照個體)的參考池(referenced pool)的miRNA表現量來定義。

本文所使用的用語「樣品 (sample)」指的是包含miRNA的樣品。樣品可利用來偵測感興趣miRNA的存在及/或表現量。儘管預測含有miRNA的差別表現的生物液體與器官最適合與正常對照組相較，但任何細胞、細胞族、細胞片段或細胞產物可與本發明主張的申請標的的方法使用。在一些實施例中，例如像是血液或其成分的樣品相對容易取得。樣品的非限制例例包含體液(例如，血清或血液)、細胞(例如，血球細胞或子宮內膜細胞)及組織(子宮內膜切片)。

在另一實施例中，可建立預測或診斷一或多個miRNA量的改變量之閾值程度，且在患者樣品中指示劑改變量的程度可與改變量之閾值程度簡單地比較。在本揭露的申請標的的miRNA量之較佳閾值變化為大約5%、大約10%、大約15%、大約20%、大約25%、大約30%、大約50%、大約60%、大約75%、大約100%及大約150%。

miRNA的表現量的測量指的是量化存在樣品中miRNA的數量。特定或任何miRNA的表現量的測量可使用任何本發明技術領域中具有通常知識者所習知或本文所述的方法達成，如藉由即時聚合酶連鎖反應(real-time PCR)、北方墨點法(Northern blot)分析。miRNA的表現量的測量包含測量成熟形式的miRNA或與miRNA的表現相關之前驅物形式的表現。

在一特定的實施例中，使用北方墨點法分析量化至少一種miRNA的量。例如，可藉由在核酸萃取緩衝液的存在下均質化，然後離心以從細胞中純化出總細胞RNA。沉澱核酸，且DNA藉由以DNA分解酶(DNase)處理並沉澱來移除。接著，RNA分子根據標準技術藉由在瓊脂糖凝膠(agarose gels)上的膠體電泳(gel electrophoresis)分離並轉移至硝化纖維素濾紙。之後，RNA藉由加熱固定化(immobilized)於濾紙上。特定RNA的偵測及量化使用適合的標定DNA或RNA探針互補至所討論的RNA而完成。參見例如Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook et al., eds., 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Chapter 7，其揭露的全文與此併入作為參考。

在一些實施例中，微陣列(microarray)的使用為可行的。微陣列是核酸、蛋白質、小分子、細胞或可對複合生物樣品平行分析的其他物質的微觀、序化陣列。該技術提供許多具有已知序列資訊的寡核苷酸或多核苷酸作為探針，以找尋並與樣品中的互補股雜交，因此藉由選擇性結合捕獲互補股。探針包含對目標miRNA序列的至少一部分互補或實質上互補的寡核苷酸或多核苷酸序列。「互補(complementary)」指的是在兩個核酸股的區域之間序列互補的廣義概念。已知若殘基為胸腺嘧碇(thymine)或脲嘧啶(uracil)，則第一核酸區域的腺嘌呤殘基(adenine residue)可與反向平行於第一區域的第二核酸區域的殘基形成特定的氫鍵(「鹼基對(base pairing)」)。相似地，已知若殘基為鳥嘌呤(guanine)，則第一核酸區域的胞嘧啶殘基(cytosine residue)可與反向平行於第一股的第二核酸股的殘基鹼基配對。當如果兩個區域以反向平行形式排列，第一區域的至少一核苷酸殘基可與第二區域的殘基鹼基配對時，核酸的第一區域互補於相同或不同核酸的第二區域。較佳地，第一區域包含第一部份且第二區域包含第二部分，因此當第一部份及第二部分以反向平行形式排列，第一部分的核苷酸殘基的至少大約50%及較佳為至少大約75%、至少大約90%或至少大約95%可與第二部分中的核苷酸殘基鹼基配對。更佳地，所有第一部份的核苷酸殘基可與第二部分中的核苷酸殘基鹼基配對。

例如，miRNAs的微陣列分析可根據任何所屬技術領域習知方法完成。在一個實施例中，RNA從如白血球細胞的細胞或樣品進行萃取，使用變性聚丙烯醯胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis)從所有RNA中尺寸選擇(size-selected)小RNA(18~26個核苷酸)。寡核苷酸連接子附著於小RNA的5’及3’端並產生的接合產物作為模板以用於10個放大循環的RT-PCR反應。有義股(sense strand)PCR引子具有附著其5’端的螢光團，因而螢光標記PCR產物的有義股。該PCR產物變性，接著雜交至微陣列。PCR產物指的是作為與陣列上相應的miRNA捕獲探針序列互補的目標核酸，其將經由鹼基配對雜交至固定有捕獲探針的點。之後，當該點使用微陣列雷射掃瞄器激發時發出螢光。各點的螢光強度是使用數個陽性及陰性對照組及陣列數據標準化方法來評估特定miRNA的複製數量，其將產生特定miRNA的表現量之評估。關於本文所揭露的miRNA，探針可以與目標miRNA或多核苷酸序列100%互補。然而，由於探針可以特異性結合並從樣品捕獲目標多核苷酸，因而該探針不需必須沿著目標多核苷酸的全長完全互補至目標多核苷酸。

在一些實施例中，定量反轉錄聚合酶鏈鎖反應(quantitative RT-PCR)的使用為可行的。定量反轉錄聚合酶鏈鎖反應(qRT-PCR)為用來快速測定聚合酶鏈鎖反應的產物量之聚合酶鏈鎖的修改。qRT-PCR的目的通常為用於測定如miRNA的基因序列是否存在於樣品中，以及若存在時，則定義在該樣品中的複製量。可測定核酸分子，包含miRNA的表現的PCR之任何方法落在本揭露的範圍中。在所屬技術領域中已知的qRT-PCR方法的數種變化包含但不限制於經由瓊酯醣膠體電泳分析(agarose gel electrophoresis)、SYBR Green的使用(雙股DNA染劑)以及螢光報導探針(fluorescent reporter probe)的使用。

在子宮內膜癌及無子宮內膜癌的個體中區別表現的miRNA的鑑別允許以多種方式使用這些資訊。例如，可評估特定的治療方案(例如，測定治療在具有子宮內膜癌的個體中是否有效)。相似地，這些miRNA表現圖譜允許候選藥物的篩選，該候選藥物抑制子宮內膜癌中的miRNA表現，或將不良的預後狀態(prognosis profile)轉化成較佳的預後狀態。子宮內膜癌的診斷可藉由比較測試樣品與來自於非子宮內膜癌樣品的已知表現突譜的miRNA表現量來進行或確認。進一步地，可進行一個或多個診斷或預測miRNA量的多重測定，且在量的時間變化可被用於測定、診斷、預後或復發。例如，可在起始時間測定一或多個特定的miRNA量，並在第二時間再次測定。在一些實施例中，從起始時間到第二時間的一或多個miRNA量的增加可診斷為子宮內膜癌或給出預後(given prognosis)。相同地，從起始時間到第二時間的一或多個miRNA量的減少可指示子宮內膜癌或給出預後。進一步地，一個或多個miRNA量的改變程度可關於癌症的嚴重性或癌症進程。

在一個實施例中，提供一種用於鑑定測試治療劑抑制子宮內膜癌細胞的體外方法，該方法包含：a)在測試治療劑與一個或多個子宮內膜癌細胞接觸之前，測定選自由miR10a、miR25、miR28-3p、miR29a、miR30a*、miR30b、miR30e、miR146a、miR146b-5p、miR451、miR660、miR3613-5p及miR4487 所組成之群組中的至少一種miRNA的表現量；以及b)在測試治療劑與一個或多個子宮內膜癌細胞接觸之後，測定步驟(a)中的至少一種相應的miRNA之表現量，其中在測試治療劑與一個或多個子宮內膜癌細胞接觸之後的一種或多種下列miRNA表現量相對於測試治療劑與一個或多個子宮內膜癌細胞接觸之前的相應miRNA的表現量下降係指示測試治療劑對子宮內膜癌的抑制有效：miR10a、miR25、miR28-3p、miR29a、miR30a*、miR30b、miR30e、miR146a、miR146b-5p、miR451或miR660，以及在測試治療劑與一個或多個子宮內膜癌細胞接觸之後的一種或多種下列miRNA表現量相對於在測試治療劑與一個或多個子宮內膜癌細胞接觸之前的相應 miRNA的表現量上升係指示該測試治療劑對子宮內膜癌的抑制有效：miR3613-5p或miR4487。

在另一個實施例中，提供一種用於測定療法在個體中對抑制子宮內膜癌細胞的效果之方法，該方法包含下列步驟：a)在對個體提供至少一部份療法之前，測定從個體所得到的第一樣品中選自由miR10a、 miR25、 miR28-3p、miR29a、miR30a*、miR30b、miR30e、miR146a、miR146b-5p、miR451、miR660、miR3613-5p及miR4487所組成之群組中的至少一miRNA的表現量，以及b)在對個體提供至少一部份療法之後，測定從個體所得到的第二樣品中的步驟(a)的至少一種相應miRNA之表現量，其中第二樣品中一種或多種下列miRNA表現量相對於在第一樣品中相應的miRNA表現量下降係指示該療法對子宮內膜癌的抑制有效：miR10a、miR25、miR28-3p、miR29a、miR30a*、miR30b、miR30e、miR146a、miR146b-5p、miR451或miR660，以及其中第二樣品中一種或多種下列miRNA表現量相對於在第一樣品中相應的miRNA表現量上升降係指示該療法對子宮內膜癌的抑制有效：miR3613-5p或miR4487。

在一實施例中，套組包含用於定序或測量於需要診斷或預測子宮內膜癌發展風險之個體的樣品中的選自由：miR10a、miR25、miR28-3p、miR29a、miR30a*、miR30b、miR30e、miR146a、miR146b-5p、miR451及miR660所組成的群組中的至少一miRNA表現量的至少一試劑。

在另一實施例中，套組包含用於定序或測量在需要診斷或預測子宮內膜癌的發展風險之個體的樣品中中的選自由：MiR21、miR283p、miR29a、miR141、miR200a、miR200b、miR451及miR660所組成的群組中的至少兩種miRNA表現量的至少兩種試劑。

在又另一實施例中，套組進一步包含用於使用該套組診斷或評估子宮內膜癌發展風險的指示。

在一例示性實施例中，該試劑為RT-PCR。在另一例示性實施例中，該套組包含至少一種miRNA特異性的寡核苷酸探針，其至少90%、 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同於選自由：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16及SEQ ID NO：17所組成之群組的核苷酸序列。

本文所使用的「相同(identical)」指的是在相同核酸股的兩個區域之間或兩個不同核酸股的區域之間的核苷酸序列相似度。當兩個區域的核苷酸殘基位置由相同的核苷酸殘基佔據，在該位置的區域為同源(homologous)。若各區域的至少一個核苷酸殘基位置由相同的殘基佔據時，第一區域係同源於第二區域。兩區域之間的同源性以藉由相同核苷酸殘基佔據之兩個區域的核苷酸殘基位置的比例來表示。作為實例，具有核苷酸序列5'- ATTGCC-3'的區域與具有核苷酸序列5'-TATGGC-3'的區域共享50%的同源性。較佳地，第一區域包含第一部份且第二區域包含第二部分，因此各部分的核苷酸殘基位置的至少大約50%及較佳為至少大約75%、至少大約90%或至少大約95%藉由相同的核苷酸殘基佔據。更佳地，各部分的所有核苷酸殘基位置藉由相同的核苷酸殘基佔據。

提供用於檢測個體中的子宮內膜癌的方法，其包含下列步驟：測量在個體的測試樣品中至少一種下列miRNA之表現量：在個體的測試樣品中的miR10a、miR25、miR28-3p、miR29a、miR30a*、miR30b、miR30e、miR146a、miR146b-5p、miR451、miR660、miR3613-5p及miR4487，當測試樣品中至少一種下列miRNA的表現量相對於無子宮內膜癌樣品中至少一種相應的miRNA的表現量較高時，指示該個體具有子宮內膜癌或具有發展子宮內膜癌之風險：miR10a、miR25、miR28-3p、miR29a、miR30a*、miR30b、miR30e、miR146a、miR146b-5p、miR451或miR660，以及當在測試樣品中至少一種下列miRNA的表現量相對於無子宮內膜癌樣品中至少一種相應的miRNA之表現量較低時，指示該個體具有子宮內膜癌或具有發展子宮內膜癌的風險： miR-3613-5P或miR4487。

亦提供用於檢測個體中的子宮內膜癌的方法，其包含下列步驟：測量個體的測試樣品中的至少兩種下列miRNA表現量：MiR21、 miR283p、miR29a、miR141、miR200a、miR200b、miR451或miR660，當測試樣品中至少兩種miRNA的表現量相對於無子宮內膜癌樣品中相應兩種miRNA的表現量較高時，指示該個體具有子宮內膜癌。在一實施例中，該方法包含測量第一miRNA及第二miRNA的表現量，其中第一miRNA為miR660以及第二miRNA為miR451或miR29a。在另一實施例中，第一miRNA為miR451以及第二miRNA為miR 21、miR 28-3p、miR141、miR200a或miR200b。在又另一實施例中，第一miRNA為miR200b以及第二miRNA為miR21、 miR28-3、miR29a或miR141。在又另一實施例中，第一miRNA為miR141以及第二miRNA為miR29a。在又另一實施例中，第一miRNA為miR28-3p以及第二miRNA為miR21。

本發明之實施例藉由下列實例說明，其不應以任何方式解釋為對其範圍強加限制。相反地，應被清楚理解的是在不脫離本發明的精神下，所屬技術領域具有通常知識者在閱讀本文說明書之後，可採取各種其他實施例、修改及其相效物。除非另有指出，在描述下列實例的研究中，將遵循習知程序。一些程序將在以下描述以用於說明目的。在實例中使用的材料與方法之敘述

研究參與：進行病例對照研究，以調查在具有發展子宮內膜癌(病例)以及不發展子宮內膜癌(對照)的子宮內膜單純性增生或無異型的複雜性增生(SH/CH-nonA)的病史的患者中的各種miRNA的表現。此研究規程由台灣長庚紀念醫院的人體試驗倫理委員會核准(Institutional Review Board)(IRB#100-4355A3)。

病例組在長庚紀念醫院癌症資料庫中被鑑別具有SH或CH-nonA的病史且之後發展成子宮內膜癌(EC)的病史(n=9，見表1)。當對照組中的患者歷經子宮內膜病變的子宮鏡切除並證實有SH或CH-nonA病變但在至少四年的追蹤之後沒有進展為子宮內膜癌時，預先招募(n = 27)(表 2)。從長庚紀念醫院的組織銀行取得的來自健康捐贈者的血清亦作為正常對照組。自2012年至2016年的子宮內膜癌病例預先地收集的血清及組織作為測試組。兩位病理學家(RCW 及 SMJ)獨立地檢視所有組織學幻燈片且任何不符(discrepancies)藉由共識解決。患者的臨床資訊從台灣長庚紀念醫院的電子病歷資訊系統檢索。

表1，具有非異型SH/CH的病史且之後發展成子宮內膜癌的人口統計及患者(SH/CH-nonA發展成 EC 的病例)

表2，具有非異型SH/CH的病史但沒有發展成子宮內膜癌的人口統計及患者(SH/CH-nonA 對照)

從福馬林固定石蠟包埋組織塊 (formalin fixed paraffin embedded (FFPE) tissue blocks) 的 RNA 萃取

選用5片厚度10μm的FFPE組織塊。使用脫蠟溶液(QiAGEN，德國)將石蠟移除，接著根據製造商的說明書使用miRNAeasy FFPE套組(QiAGEN)進行RNA萃取及DNase處理。使用生化分析儀(Agilent Technology，美國)定量RNA。

miRNA 的 MiRNA 3.0 陣列及目標預測

為了研究在病例組及對照組中 miRNA表現的不同，根據製造商的說明書進行具有2578個人類成熟miRNA探針組的Affymetrix miRNA 3.0陣列(Thermo Fisher Scientific，美國)。簡而言之，根據製造商的說明書，將各樣品的1 μg的全RNA進行以Flashtag RNA標記套組(Genisphere，美國)標記的尾端黏接反應(tailing reaction)，接著將生物素化信號分子(biotinylated signal molecule)連接至RNA樣品。各樣品在48°C下與3.0 miRNA陣列雜交16小時，接著清洗，並在Fluidics Station 450上染色。染色之後，藉由GeneChip Scanner 3000 7G (Thermo Fisher Scientific)掃描晶片。經由Command Console 3.2(Affymetrix，美國)設置的探針捕獲miRNA轉錄的表現量。Affymetrix® 總轉錄本分析控制台軟體(Affymetrix® Transcriptome Analysis Console Software) (TAC)免費下載來分析miRNA 3.0陣列，且miRbase(http://www.mirbase.org)用以鑑定miRNA的潛在目標位置。

血清 RNA 萃取

使用Trizol試劑分離全RNA。簡而言之，250 μl的血清樣品與750 μL 的Trizol試劑及200μl的氯仿(chloroform)混合。1μl的0.05 nM 合成的秀麗隱桿線蟲特異性(Caenorhabditis elegans-specific)微小RNA cel-miR-39加入各血清試樣作為添加對照組。RNA遵循製造商的規程純化並溶解於15μL無RNase的水中。

反轉錄

從FFPE組織(350 ng)或血清(各4.0μL)萃取的RNA根據製造商的規程使用TaqMan miRNA反轉錄套組及TaqMan® MicroRNA 分析(Applied Biosystems，美國)進行反轉錄(RT)。簡而言之，將自TaqMan® MicroRNA分析(Applied Biosystems)的相應於miRNA的RT引子混合在一起，以將miRNA在單一反應中轉化成其相應的cDNAs，並使用以下循環條件進行單獨的PCR：16°C進行30分鐘，隨後為42°C進行30分鐘及85°C進行5分鐘。該產物在定量PCR (qPCR)之前以0.1X TE緩衝液稀釋。

定量即時 PCR(Quantitative real-time PCR)

即時定量反轉錄PCR(qRT-PCR)用於測定在FFPF組織或血清中的miR之表現量。TaqMan MicroRNA分析(Applied Biosystems)用於製備樣品。miR16及cel-miR39的表現量分別用於作為組織及血清的內部對照。即時PCR放大條件如下：起始在95°C變性10分鐘，接著為在95°C進行15秒的45個循環及60°C進行1分鐘。該反應藉由使用ABI PRISM 7900 HT儀器(Applied Biosystems)執行。計算每個重複測量的閾值(Ct)之平均循環。該分析偵測的限定義為40的Ct值；具有Ct＞40的miRNAs被認為是無法偵測的。

免疫組織化學

FFPE組織切片 (4-μm厚度)在二甲苯(xylene)中脫蠟並經由一系列的梯度乙醇浴進行復水(rehydrated)。該切片使用具有Ventana Basic DAB偵測套組(Tucson，美國)的自動化IHC染色儀(Automated IHC stainer)以抗兔磷酸酶(anti-rabbit Phosphatase)及張力蛋白(tensin homolog) (PTEN)單株抗體(Cell Signaling Technology，美國)染色。以蘇木素 (hematoxylin)執行對比染色(Counterstaining)。為了PTEN染色，陽性基質細胞被認為是內部陽性對照。用於良性及惡性組織兩者之IHC數據的部分檢索自先前研究 (Oncotarget, 2017 Aug 10;8(43):74434-74450)。

統計分析

使用下列統計測試及統計軟體套裝分析數據：無母數曼-惠特尼U檢定法(nonparametric Mann-Whitney U test)用於根據連續變數比較群組，費雪精確檢定(Fisher’s exact test)用於在增生患者中PTEN的蛋白質表現量，接受者操作曲線分析(Receiver Operating Curve)的曲線下面積用於發現之一或多個生物指標的最佳截取值(cutoff values)，以及SPSS (version 22，美國)。所有測試為雙尾(two-sided)，且P值小於0.05表示統計上顯著。

結果

以 miR 陣列的 miRNA 表現圖譜

如第1圖說明，來自病例組(即具有 SH 或 CH-nonA病史且之後發展成子宮內膜癌的患者)的6個病例之FFPE組織及來自對照組(即具有SH或CH-nonA病史但在4年的追蹤之後沒有發展成子宮內膜癌的患者)的12個病例之miRNA表現圖譜顯示20種miRNA(P ＜ 0.01，倍數改變值＞4)在對照組及病例組中顯著地不同。其中，相較於對照組，18種miRNA(miR10a、miR15a、miR21、miR25、miR28-3p、miR29a、miR30a*、miR30b、miR30e、miR141、miR146a、miR146b-5p、miR181d、miR194、miR200a、miR200b、miR451及miR660)在病例組中顯著地過度表現，以及相較於對照組，2種miRNA(miR-3613-5P或miR4487)在病例組中為低表現(underexpressed)。

藉由 TaqMan RT-qPCR 之另一組獨立群組的 miRNA 表現圖譜

在第1圖中，20種miRNA的表現圖譜進一步基於使用多重即時定量PCR(RT-qPCR)分析的另一個獨立的FFPE組織群組進行分析。該群組包含來自具有SH病史的病例組之9位患者及具有SH病史的對照組之28位患者。RT-qPCR分析顯示6種miRNA表現量(miR21、miR30*、miR141、miR200a、miR200b及miR660)在病例組中顯著高於對照組(p ＜0.05)，見表3。

對照組(n=28)及病例組(n=9)的miRNAs表現圖譜 - 無報告

在增生組織樣品中的 PTEN 狀態及 miRNAs 表現的相關性

調查在病例組及對照組中的PTEN腫瘤抑制因子的狀態。表4顯示在22個對照組中的5個(22.7%)，及在8個病例組中的4個(50%)之PTEN表現喪失。相較於對照組，在病例組中的PTEN喪失百分比顯著高於對照組(22.7% vs 50%，p = 0.016)。

表4，PTEN喪失的百分比在病例組中顯著高於對照組 費雪精確，p=0.016

血清 miRNA 量在子宮內膜癌患者中增加

多重RT-qPCR測試在使用來自癌症病例組及健康對照組的血清樣品的miRNA上執行，表5顯示下列四種miRNA在病例組中過度表現：miR21、miR141、miR200b及miR660，以及表6顯示在子宮內膜癌診斷中過度表現的miRNA的敏感性及特異性。

表5，在癌症病例組及健康對照組之間所選具有顯著不同表現的miRNA - 無報告

表6，用於子宮內膜癌診斷的miRNA之敏感性及特異性

此外，特定miRNA表現圖譜的組合導致在子宮內膜癌診斷的敏感性或特異性之非預期協同作用顯示於表7。

表7，miRNA組合的敏感性及特異性

無

本發明說明性的例示性實施例將參照下列圖式而於下文詳細描述：

第1圖係為在子宮內膜癌(EC)之前的單純性增生(SH)/無異型複雜性增生(CH-nonA)(參見SH-01P(SH)、SH-03P(SH)、SH-07P(SH)、SH-08P(SH)、SH-13P (SH)、SH-14P的病例組)以及無子宮內膜癌的SH/CH-nonA(參見SH-C1、SH-C2、SH-C3、SH-C4、SH-C5、SH-C8、SH-C9、SH-C10、SH-C12、SH-C17、SH-C23、SH-C29的對照組)的miRNA表現圖譜的階層式群集分析。向下調控的miRNAs以黑色顯示及向上調控的miRNAs以白色顯示。

＜110＞ 長庚紀念醫院，林口 ＜120＞ 用於評估子宮內膜癌的發展風險或診斷子宮內膜癌的方法及套組 ＜130＞ CGMH-LK-16013-TWI ＜140＞ TW 107107243 ＜141＞ 2018-03-05 ＜150＞ US 62/469,724 ＜151＞ 2017-03-10 ＜160＞ 17 ＜170＞ PatentIn version 3.5 ＜210＞ 1 ＜211＞ 45 ＜212＞ RNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ miR10a ＜400＞ 1 uacccuguag auccgaauuu guguagcuua ucagacugau guuga 45 ＜210＞ 2 ＜211＞ 22 ＜212＞ RNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ miR25 ＜400＞ 2 cauugcacuu gucucggucu ga 22 ＜210＞ 3 ＜211＞ 22 ＜212＞ RNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ miR28-3p ＜400＞ 3 cacuagauug ugagcuccug ga 22 ＜210＞ 4 ＜211＞ 22 ＜212＞ RNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ miR29a ＜400＞ 4 uagcaccauc ugaaaucggu ua 22 ＜210＞ 5 ＜211＞ 22 ＜212＞ RNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ miR30a* ＜400＞ 5 cuuucagucg gauguuugca gc 22 ＜210＞ 6 ＜211＞ 22 ＜212＞ RNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ miR30b ＜400＞ 6 uguaaacauc cuacacucag cu 22 ＜210＞ 7 ＜211＞ 22 ＜212＞ RNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ miR30e ＜400＞ 7 uguaaacauc cuugacugga ag 22 ＜210＞ 8 ＜211＞ 22 ＜212＞ RNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ miR146a ＜400＞ 8 ugagaacuga auuccauggg uu 22 ＜210＞ 9 ＜211＞ 22 ＜212＞ RNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ miR146b-5p ＜400＞ 9 ugagaacuga auuccauagg cu 22 ＜210＞ 10 ＜211＞ 22 ＜212＞ RNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ miR451 ＜400＞ 10 aaaccguuac cauuacugag uu 22 ＜210＞ 11 ＜211＞ 22 ＜212＞ RNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ miR660 ＜400＞ 11 uacccauugc auaucggagu ug 22 ＜210＞ 12 ＜211＞ 22 ＜212＞ RNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ miR3613-5p ＜400＞ 12 uguuguacuu uuuuuuuugu uc 22 ＜210＞ 13 ＜211＞ 19 ＜212＞ RNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ miR4487 ＜400＞ 13 agagcuggcu gaagggcag 19 ＜210＞ 14 ＜211＞ 22 ＜212＞ RNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ miR21 ＜400＞ 14 uagcuuauca gacugauguu ga 22 ＜210＞ 15 ＜211＞ 22 ＜212＞ RNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ miR141 ＜400＞ 15 uaacacuguc ugguaaagau gg 22 ＜210＞ 16 ＜211＞ 22 ＜212＞ RNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ miR200a ＜400＞ 16 uaacacuguc ugguaacgau gu 22 ＜210＞ 17 ＜211＞ 22 ＜212＞ RNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ miR200b ＜400＞ 17 uaauacugcc ugguaaugau ga 22

Claims (16)

1. 一種在個體中檢測子宮內膜癌或預測發展成子宮內膜癌之風險的體外方法，其包含：測量一個體的測試樣品中選自由miR660、miR10a、miR25、miR28-3p、miR29a、miR30a*、miR30b、miR30e、miR146a、miR146b-5p、miR451、miR3613-5p及miR4487所組成之群組中的至少一miRNA表現量的步驟，其中當該測試樣品中下列miRNA的至少一種表現量相對於無子宮內膜癌樣品中至少一種相應的miRNA較高時，指示該個體具有子宮內膜癌或具有發展子宮內膜癌之風險：miR660、miR10a、miR25、miR28-3p、miR29a、miR30a*、miR30b、miR30e、miR146a、miR146b-5p或miR451，以及其中當在該測試樣品中的下列miRNA的至少一種表現量相對於無子宮內膜癌樣品中至少一種相應的miRNA之表現量較低時，指示該個體具有子宮內膜癌或具有發展子宮內膜癌的風險：miR-3613-5P或miR4487。
2. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該miRNA表現量藉由即時聚合酶連鎖反應(real-time PCR)測定。
3. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該miRNA表現量藉由特異於該miRNA的一寡核苷酸探針測定。
4. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該個體具有子宮內膜增生的病史。
5. 如申請專利範圍第4項所述之方法，其中該個體具有單純性增生或無異型的複雜性增生的病史。
6. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其進一步包含測量選自由miR21、miR141、miR200a及miR200b所組成之群組的至少一miRNA的表現量之步驟。
7. 如申請專利範圍第6項所述之方法，其包含測量一第一miRNA及一第二miRNA的表現量之步驟，其中該第一miRNA為miR660及該第二miRNA為miR21。
8. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其包含測量一第一miRNA及一第二miRNA的表現量之步驟，其中該第一miRNA為miR660及該第二miRNA為miR28-3p。
9. 一種用於在個體中檢測子宮內膜癌或預測發展成子宮內膜癌之風險的套組，其包含： 用於定序或測量在一個體的測試樣品中的選自由miR660、miR10a、miR25、miR28-3p、miR29a、miR30a*、miR30b、miR30e、miR146a、miR146b-5p、miR451、miR3613-5p及miR4487所組成的群組之至少一miRNA表現量的試劑， 其中在該測試樣品中至少一種下列miRNA表現量相對於無子宮內膜癌樣品中的至少一種相應的miRNA之表現量較高時，指示該個體具有子宮內膜癌或具有發展子宮內膜癌的風險：miR10a、miR25、miR28-3p、miR29a、miR30a*、miR30b、miR30e、miR146a、miR146b-5p、miR451或miR660，以及 當在該測試樣品中至少一種下列miRNA表現量相對於無子宮內膜癌樣品中至少一種相應的miRNA之表現量較低時，指示該個體具有子宮內膜癌或具有發展子宮內膜癌的風險：miR-3613-5P或miR4487。
10. 如申請專利範圍第9項所述之套組，其中該試劑為即時聚合酶連鎖反應(real-time PCR)。
11. 如申請專利範圍第9項所述之套組，其中該試劑為與至少SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:13的至少90%相同的miRNA互補之寡核苷酸探針。
12. 如申請專利範圍第9項所述之套組，其進一步包含用於定序或測量選自由：miR21、miR141、miR200a及miR200b所組成之群組中的至少一miRNA表現量的試劑。
13. 如申請專利範圍第12項所述之套組，其包含用於定序或測定miR660之表現量的第一試劑以及用於定序或測量miR21之表現量的第二試劑。
14. 如申請專利範圍第9項所述之套組，其包含用於定序或測定miR660之表現量的第一試劑以及用於定序或測量miR28-3p之表現量的第二試劑。
15. 一種用於鑑定用以抑制子宮內膜癌細胞的測試治療劑之體外方法，該方法包含：a)在一測試治療劑與一個或多個子宮內膜癌細胞接觸之前，測定選自由miR660、miR10a、miR25、miR28-3p、miR29a、miR30a*、miR30b、miR30e、miR146a、miR146b-5p、miR451、miR3613-5p及miR4487所組成之群組中的至少一miRNA表現量；以及b)在該測試治療劑與該一個或多個子宮內膜癌細胞接觸之後，測定步驟(a)中的至少一種相應的miRNA之表現量，其中在該測試治療劑與該一個或多個子宮內膜癌細胞接觸之後的一種或多種下列miRNA表現量相對於該測試治療劑與該一個或多個子宮內膜癌細胞接觸之前的相應miRNA的表現量下降時，指示該測試治療劑對子宮內膜癌的抑制有效：miR10a、miR25、miR28-3p、miR29a、miR30a*、miR30b、miR30e、miR146a、miR146b-5p、miR451或miR660，以及在該測試治療劑與該一個或多個子宮內膜癌細胞接觸之後的一種或多種下列miRNA表現量相對於該測試治療劑與該一個或多個子宮內膜癌細胞接觸之前的相應miRNA的表現量上升，指示該測試治療劑對子宮內膜癌的抑制有效：miR3613-5p或miR4487。
16. 一種用於測定一療法在所需個體中抑制子宮內膜癌細胞的效果的方法，該方法包含下列步驟：a)在對一個體提供至少一部份療法之前，從該個體所得到的一第一樣品中的選自由miR660、miR10a、miR25、miR28-3p、miR29a、miR30a*、miR30b、miR30e、miR146a、miR146b-5p、miR451、miR3613-5p及miR4487所組成之群組中的至少一miRNA表現量，以及b)在對該個體提供該至少一部份療法之後，從該個體所得到的一第二樣品中於步驟(a)中的至少一種相應miRNA之表現量，其中該第二樣品中一種或多種下列miRNA表現量相對於該第一樣品中的相應miRNA表現量下降，指示該療法對子宮內膜癌的抑制有效：miR10a、miR25、miR28-3p、miR29a、miR30a*、miR30b、miR30e、miR146a、miR146b-5p、miR451或miR660，以及其中該第二樣品中的一種或多種下列miRNA表現量相對於該第一樣品中的相應miRNA表現量上升降，指示該療法對子宮內膜癌的抑制有效：miR3613-5p或miR4487。