JP2010094122A - バイオマーカーとしてのマイクロrnaを用いた頭頸部腫瘍の診断・治療選択 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】miR-455-3p、miR-455-5p、miR-130b、miR-130b*、miR-801、miR-196a、miR-21、miR-31、miR-133b、miR-145及びmiR-375からなるマイクロRNA群から選ばれる1又は2種以上のマイクロRNAを頭頸部腫瘍のバイオマーカーとして使用することを特徴とする。
【選択図】なし
Description
慶應義塾大学医学部ならびに佐野厚生総合病院の倫理委員会の承認のもと、慶應義塾大学病院又は佐野厚生総合病院の耳鼻咽喉科外来を受診した患者を選定し、サンプル提供の依頼対象者とした。その上で、その対象者からインフォームド・コンセントを得た後、6人の各対象者から、8種類のサンプル組織(図1の“sample ID 1-8”)を採取した。なお、sample ID 1と6は、同一患者であり、sample ID 2と7は、同一患者である。これら8種類のサンプル組織における組織の種類(図1の“tissues”の項目)としては、喉頭(larynx)、声帯(vocal cord)の2種類であり、組織の状態(図1の“cancer”の項目)としては、正常(normal)、ポリープ(polyp)、中程度異形成(moderate dysplasia)、高度異形成(severe dysplasia)、がん(cancer)の5種類であり、また、がんの種類としては、cancer 1-2は初発(incipient)のがん、cancer 3は再発がん(recurrence;rec)の2種類であった。
後述のマイクロアレイに用いるため、実施例1で冷凍保存した各組織からRNAを抽出した。具体的には、mirVana miRNAIsolation Kit(Applied Biosystems社製)を添付のプロトコールにしたがって用いて、前述の各組織から、マイクロRNAを含むトータルRNAを抽出した。
Agilent Human miRNA V2 (Agilent Technologies社製)を用いて、ヒトのマイクロRNA723種につき網羅的解析を行った。前述のAgilent Human miRNA V2のマイクロアレイは、miR-455-3p、miR-455-5p、miR-130b、miR-130b*、miR-801、miR-196a、miR-21、miR-31、miR-133b、miR-145及びmiR-375用のプローブとして、それぞれ配列番号1〜11に示されるヌクレオチド配列に相補的なDNA配列を有している。解析の方法は、Agilent Technologies社のmiRNA Microarray protocol Version 1.5に記載の方法にしたがった。具体的には、以下のような方法で解析を行った。なお、試薬の量は1サンプル用の分量で記載する。
慶應義塾大学医学部ならびに佐野厚生総合病院の倫理委員会の承認のもと、慶應義塾大学病院あるいは佐野厚生総合病院の耳鼻咽喉科外来を受診した患者を選定し、サンプル提供の依頼対象者とした。その上で、その対象者からインフォームド・コンセントを得た後、6人の各対象者(患者1〜6)から、喉頭がん組織(喉頭癌)と、その隣接部であって病理学的に非がん部と認められた組織(非癌部)とをそれぞれ採取し、12種類のサンプル組織を入手した。
後述のリアルタイムPCRに用いるため、実施例4で冷凍保存した各組織からRNAを抽出した。具体的には、mirVana miRNAIsolation Kit(Applied Biosystems社製)を添付のプロトコールにしたがって用いて、前述の各組織から、マイクロRNAを含むトータルRNAを抽出した。
前述の実施例5で抽出した各RNA及びTaqMan(登録商標)MicroRNA Assays(AppliedBiosystems社製)を用いて、リアルタイムPCR法により、miR-455-5p、miR-196a、miR-130b*、miR-133b、miR-375の発現量の定量を行なった。定量の方法は、添付のプロトコールに記載の方法にしたがった。患者1〜2、4、6由来のサンプルについてmiR-455-5pを定量した結果を図10に、患者1、4〜6由来のサンプルについてmiR-130b*を定量した結果を図11に、患者1〜6由来のサンプルについてmiR-196aを定量した結果を図12に、患者1〜5由来のサンプルについてmiR-133bを定量した結果を図13に、患者1〜2、4、6由来のサンプルについてmiR-375を定量した結果を図14にそれぞれ示す。図10〜12に示されるように、miR-455-5p、miR-130b*、miR-196aについてはそれぞれ、非癌部における発現と比較して喉頭がん組織における発現の増加が確認でき、図13〜14に示されるように、miR-133b、miR-375についてはそれぞれ、非癌部における発現と比較して喉頭がん組織における発現の低下が確認できた。
本発明におけるマイクロRNAが、喉頭がん以外の頭頸部腫瘍のバイオマーカーとしても用い得ることを実証するために、ヒト扁平上皮がん細胞株(HSC2、HSC3、HSC4、SAS、CA922)の各細胞からトータルRNAを抽出した。具体的には、mirVana miRNA Isolation Kit(Applied Biosystems社製)を添付のプロトコールにしたがって用いて、前述の各細胞から、マイクロRNAを含むトータルRNAを抽出した。
前述の実施例7で抽出した各RNA及びTaqMan(登録商標)MicroRNA Assays(Applied Biosystems社製)を用いて、リアルタイムPCR法により、miR-455-5p、miR-130b*、miR-196a、miR-133b、miR-375の発現量の定量を行なった。定量の方法は、添付のプロトコールに記載の方法にしたがった。リアルタイムPCRに用いたTaqMan probeとしては、miR-455-5p、miR-130b*、miR-196a、miR-133b、miR-375につき、それぞれPart Number 4378098、4395225、4373104、4373172、4373027のプローブ(Applied Biosystems社製)を用いた。コントロールとして、上記実施例5で抽出した正常組織(normal)のトータルRNA中のマイクロRNAも同様に定量した。ヒト扁平上皮がん(SCC)細胞由来のサンプル及び正常組織細胞由来のサンプルについて、miR-455-5p、miR-130b*、miR-196a、miR-133b、miR-375の発現量の定量を行なった結果をそれぞれ図15〜19に示す。図15〜17に示されるように、miR-455-5p、miR-130b*、miR-196aについてはそれぞれ、非癌部(normal)における発現と比較してヒト扁平上皮がん(SCC)細胞における発現の増加が確認でき、図18〜19に示されるように、miR-133b、miR-375についてはそれぞれ、非癌部(normal)における発現と比較してヒト扁平上皮がん(SCC)細胞における発現の低下が確認できた。
前述の実施例4〜6におけるマイクロRNAの発現解析の方法と同様の方法にしたがって、喉頭における良性疾患(benign)(サンプル数16)、前がん病変(dysplasia) (サンプル数10)、がん(cancer)(サンプル数16)の各組織において、miR-455-5p、miR-196a、miR-133bの発現解析を行なった。各サンプルの結果を各組織ごとに平均した結果を、各マイクロRNAごとにそれぞれ図20(miR-455-5p)、図21(miR-196a)、22(miR-133b)に示す。図20及び21に示されるように、miR-455-5p、miR-196aではそれぞれ、良性疾患、前がん病変、がんとなるにつれ、発現量が次第に増加する傾向が見られ、図22に示されるように、miR-133bでは、良性疾患、前がん病変、がんとなるにつれ、発現量が次第に低下する傾向が見られた。また、同様の発現解析の結果、miR-130b*についてはmiR-455-5p、miR-196aと同様の傾向が見られ、miR-375についてはmiR-133bと同様の傾向が見られた。このように、これらのマイクロRNA(特にmiR-455-5p、miR-196a、miR-133b)は、がんの悪性度に伴って発現量が変化していく傾向が見られたため、頭頸部腫瘍の判定に特に好適に用いることができることが判明した。
頭頸部腫瘍のバイオマーカーとして使用し得る本件マイクロRNAのうち、頭頸部組織サンプルを利用するのではなく、被検体の血液サンプルを利用することによって、頭頸部腫瘍か否かを判定し得るものがあるかどうかを調べるために、以下の測定実験を行なった。
Claims (18)
- miR-455-3p、miR-455-5p、miR-130b、miR-130b*、miR-801、miR-196a、miR-21、miR-31、miR-133b、miR-145及びmiR-375からなるマイクロRNA群から選ばれる1又は2種以上のマイクロRNAを頭頸部腫瘍のバイオマーカーとして使用する方法。
- miR-455-3p、miR-455-5p、miR-130b、miR-130b*、miR-801、miR-196a、miR-21、miR-31、miR-133b、miR-145及びmiR-375が、それぞれ配列番号1〜11に示されるヌクレオチド配列において1若しくは2個以上のヌクレオチドが欠失、置換、若しくは付加されたRNAからなり、かつ、頭頸部腫瘍組織又は頭頸部腫瘍被検体の血液においてコントロールと比較して発現が増加又は低下するRNAであることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 頭頸部腫瘍が喉頭がん又は扁平上皮がんであることを特徴とする請求項1又は2に記載の方法。
- 以下の工程を備えたことを特徴とする頭頸部腫瘍の判定方法:
(A)頭頸部の検体組織中又は被検体の血液中のRNAを抽出する工程:
(B)抽出したRNA中の、miR-455-3p、miR-455-5p、miR-130b、miR-130b*、miR-801、miR-196a、miR-21、miR-31、miR-133b、miR-145及びmiR-375から選択される1又は2種以上のマイクロRNAの発現量を測定する工程:
(C)コントロールとしての、検体組織と同種の正常組織又は被検体と同種の正常被検体の血液におけるマイクロRNAの発現量と比較・評価する工程: - miR-455-3p、miR-455-5p、miR-130b、miR-130b*、miR-801、miR-196a、miR-21、miR-31、miR-133b、miR-145及びmiR-375が、それぞれ配列番号1〜11に示されるヌクレオチド配列において1若しくは2個以上のヌクレオチドが欠失、置換、若しくは付加されたRNAからなり、かつ、頭頸部腫瘍組織又は頭頸部腫瘍被検体の血液においてコントロールと比較して発現が増加又は低下するRNAであることを特徴とする請求項4に記載の頭頸部腫瘍の判定方法。
- 抽出したRNA中の、miR-455-3p、miR-455-5p、miR-130b、miR-130b*、miR-801、miR-196a、miR-21及びmiR-31からなるマイクロRNA群から選ばれる1又は2種以上のマイクロRNAの発現量が、コントロールと比較して増加している場合に頭頸部腫瘍であると評価することを特徴とする請求項4又は5に記載の頭頸部腫瘍の判定方法。
- 抽出したRNA中の、miR-133b、miR-145及びmiR-375からなるマイクロRNA群から選ばれる1又は2種以上のマイクロRNAの発現量が、コントロールと比較して低下している場合に頭頸部腫瘍であると評価することを特徴とする請求項4又は5に記載の頭頸部腫瘍の判定方法。
- 頭頸部腫瘍が喉頭がん又は扁平上皮がんであることを特徴とする請求項4〜7のいずれかに記載の頭頸部腫瘍の判定方法。
- miR-455-3p、miR-455-5p、miR-130b、miR-130b*、miR-801、miR-196a、miR-21、miR-31、miR-133b、miR-145及びmiR-375からなるマイクロRNA群から選ばれる1又は2種以上のマイクロRNAの発現量を測定することができる、前記マイクロRNAの配列に相補的な核酸配列からなるポリヌクレオチド又はその一部を備えたマイクロアレイを頭頸部腫瘍の判定に使用する方法。
- miR-455-3p、miR-455-5p、miR-130b、miR-130b*、miR-801、miR-196a、miR-21、miR-31、miR-133b、miR-145及びmiR-375からなるマイクロRNA群から選ばれる1又は2種以上のマイクロRNAの配列を増幅し得るプライマーセットと、前記マイクロRNAの配列に相補的な核酸配列からなるポリヌクレオチド又はその一部を含む蛍光プローブとを、頭頸部腫瘍の判定に使用する方法。
- miR-455-3p、miR-455-5p、miR-130b、miR-130b*、miR-801、miR-196a、miR-21、miR-31、miR-133b、miR-145及びmiR-375が、それぞれ配列番号1〜11に示されるヌクレオチド配列において1若しくは2個以上のヌクレオチドが欠失、置換、若しくは付加されたRNAからなり、かつ、頭頸部腫瘍組織又は頭頸部腫瘍被検体の血液においてコントロールと比較して発現が増加又は低下するRNAであることを特徴とする請求項9又は10に記載の方法。
- 頭頸部腫瘍が喉頭がん又は扁平上皮がんであることを特徴とする請求項9〜11のいずれかに記載の方法。
- miR-455-3p、miR-455-5p、miR-130b、miR-130b*、miR-801、miR-196a、miR-21、miR-31、miR-133b、miR-145及びmiR-375からなるマイクロRNA群から選ばれる1又は2種以上のマイクロRNAの発現量を測定することができる、前記マイクロRNAの配列に相補的な核酸配列からなるポリヌクレオチド又はその一部を備えたマイクロアレイを含んでいることを特徴とする頭頸部腫瘍の判定キット。
- miR-455-3p、miR-455-5p、miR-130b、miR-130b*、miR-801、miR-196a、miR-21、miR-31、miR-133b、miR-145及びmiR-375からなるマイクロRNA群から選ばれる1又は2種以上のマイクロRNAの配列を増幅し得るプライマーセットと、前記マイクロRNAの配列に相補的な核酸配列からなるポリヌクレオチド又はその一部を含む蛍光プローブとを備えたことを特徴とする頭頸部腫瘍の判定キット。
- miR-455-3p、miR-455-5p、miR-130b、miR-130b*、miR-801、miR-196a、miR-21、miR-31、miR-133b、miR-145及びmiR-375が、それぞれ配列番号1〜11に示されるヌクレオチド配列において1若しくは2個以上のヌクレオチドが欠失、置換、若しくは付加されたRNAからなり、かつ、頭頸部腫瘍組織又は頭頸部腫瘍被検体の血液においてコントロールと比較して発現が増加又は低下するRNAであることを特徴とする請求項13又は14に記載の判定キット。
- 頭頸部腫瘍が喉頭がん又は扁平上皮がんであることを特徴とする請求項13〜15のいずれかに記載の判定キット。
- 以下の工程を含むことを特徴とする頭頸部腫瘍治療薬のスクリーニング方法:
(A)頭頸部腫瘍に罹患した非ヒト動物に被検物質を投与する工程:
(B)前記非ヒト動物における頭頸部腫瘍組織中又は血液中の、miR-455-3p、miR-455-5p、miR-130b、miR-130b*、miR-801、miR-196a、miR-21、miR-31、miR-133b、miR-145及びmiR-375からなるマイクロRNA群から選ばれる1又は2種以上のマイクロRNAの発現量を測定する工程:
(C)コントロールとしての、被検物質を未投与の場合におけるマイクロRNAの発現量と比較・評価する工程: - miR-455-3p、miR-455-5p、miR-130b、miR-130b*、miR-801、miR-196a、miR-21、miR-31、miR-133b、miR-145及びmiR-375が、それぞれ配列番号1〜11に示されるヌクレオチド配列において1若しくは2個以上のヌクレオチドが欠失、置換、若しくは付加されたRNAからなり、かつ、頭頸部腫瘍組織又は頭頸部腫瘍被検体の血液においてコントロールと比較して発現が増加又は低下するRNAであることを特徴とする請求項17に記載のスクリーニング方法。
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