JP2012000107A - バイオマーカーとしての新規スモールｒｎａを用いた腫瘍の診断 - Google Patents
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Abstract
【課題】特定のスモールＲＮＡを腫瘍のバイオマーカーとして使用する方法、腫瘍の判定方法、腫瘍の判定キット等を提供する。
【解決手段】特定の配列のポリリボヌクレオチド又はその変異体からなるスモールＲＮＡからなる群から選ばれる１又は２種以上のスモールＲＮＡを腫瘍のバイオマーカーとして使用する。腫瘍（特に頭頸部腫瘍）の診断や、腫瘍（特に頭頸部腫瘍）の治療薬のスクリーニングの分野において特に有用に利用することができる。
【選択図】図１
【解決手段】特定の配列のポリリボヌクレオチド又はその変異体からなるスモールＲＮＡからなる群から選ばれる１又は２種以上のスモールＲＮＡを腫瘍のバイオマーカーとして使用する。腫瘍（特に頭頸部腫瘍）の診断や、腫瘍（特に頭頸部腫瘍）の治療薬のスクリーニングの分野において特に有用に利用することができる。
【選択図】図１
Description
本発明は、腫瘍における新規スモールＲＮＡの発現プロファイルとその用途に関する。より詳細には、特定のスモールＲＮＡを腫瘍のバイオマーカーとして使用する方法、腫瘍の判定方法、腫瘍の判定キット等に関する。
ノンコーディングＲＮＡ（non-coding RNA：ｎｃＲＮＡ）は、タンパク質をコードしないＲＮＡ分子の総称であり、その中には、transfer RNA（ｔＲＮＡ）、ribosomal RNA（ｒＲＮＡ）、small nuclear RNA（ｓｎＲＮＡ：核内低分子ＲＮＡ）、small nucleolar RNA（ｓｎｏＲＮＡ：核小体低分子ＲＮＡ）、signal recognition particle RNA（ＳＲＰ ＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ、Piwi-interacting RNA（ｐｉＲＮＡ）などが含まれている。ノンコーディングＲＮＡの機能については、以前はそれほど注目されていなかったが、近年、ノンコーディングＲＮＡが様々な生理的機能を発揮していることが知られるにつれて、その重要性が認識されるようになってきている。
ノンコーディングＲＮＡには、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、あるいはｐｉＲＮＡなどの１９−３０塩基程度のスモールＲＮＡ（small RNA）と呼ばれているものがあるが、これらは、その生成において２重鎖ＲＮＡ特異的ＲＮＡ分解酵素に依存し、またArgonaute familyタンパクと結合、ガイド役を果たすことで、標的遺伝子の発現を抑制する。ヒトの既知のマイクロＲＮＡのうち（９００種類程度）のいくつかは、がんとの関連が示唆されている。例えば特許文献１には、マイクロＲＮＡ３４ａ（ｍｉＲ−３４ａ）の他、ｍｉＲ−１５、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１４５等とがんとの関連が示唆されている（非特許文献１参照）。しかし、患者臨床検体を用いた、未知のスモールＲＮＡの網羅的解析についての報告は現在まで行われていない。
Croce CM. Causes and consequences of microRNA dysregulation in cancer. Nat Rev Genet. 2009; 10(10): 704-714.
本発明の課題は、特定のスモールＲＮＡを腫瘍のバイオマーカーとして使用する方法、腫瘍の判定方法、腫瘍の判定キット等を提供することにある。
本発明者らは、これまでに、頭頸部腫瘍や婦人科がんと既知のマイクロＲＮＡとの関連を調べるために、頭頸部腫瘍の臨床検体や婦人科がんの臨床検体における、既知のマイクロＲＮＡの発現を解析し、特定のマイクロＲＮＡが頭頸部腫瘍において異常発現していること（特願２００９−０９９８４９号参照）や、特定のマイクロＲＮＡが婦人科がんにおいて異常発現していること（特願２００９−１５０９８６号）を見出した。また、本発明者らは、頭頸部腫瘍において異常発現しているマイクロＲＮＡについて、その異常発現を正常化する方向に変化させ得る物質が、頭頸部腫瘍の治療効果や転移抑制効果を発揮することをｉｎ ｖｉｖｏの解析により見出している（特願２００９−２７０１５７号）。
今回、発明者らは、次世代シークエンサーＳＯＬｉＤ（登録商標）システム（Applied Biosystems社製）を利用して、喉頭がん（悪性腫瘍）及び喉頭乳頭腫（良性腫瘍）の両臨床検体細胞中のスモールＲＮＡについて、未知のものも含めて網羅的に解析を行い、各スモールＲＮＡの発現量の測定及びそのリボヌクレオチド配列の決定を行った。次いで、本発明者らは、その解析結果から既知のスモールＲＮＡのデータを除き、喉頭乳頭腫における新規スモールＲＮＡの発現プロファイルと、喉頭がんにおける新規スモールＲＮＡの発現プロファイルを対比し、特定のスモールＲＮＡが喉頭がん組織において異常発現していることを見出した。さらに、本発明者らは、同一患者の喉頭癌組織及び喉頭非癌組織中の特定のスモールＲＮＡの発現を、リアルタイムＰＣＲにて定量、比較したところ、癌組織において、前述の発現プロファイルと同様の異常発現していることを見いだし、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、（１）配列番号１〜１３５のいずれかに示されるポリリボヌクレオチド又はその変異体からなるスモールＲＮＡからなる群から選ばれる１又は２種以上のスモールＲＮＡを腫瘍のバイオマーカーとして使用する方法や、（２）腫瘍が頭頸部腫瘍であることを特徴とする上記（１）に記載の方法や、（３）頭頸部腫瘍が頭頸部がんであることを特徴とする上記（２）に記載の方法や、（４）以下の工程を備えたことを特徴とする腫瘍の判定方法：（Ａ）検体組織中又は被検体の血液中のＲＮＡを抽出する工程：（Ｂ）抽出したＲＮＡ中の、配列番号１〜１３５のいずれかに示されるポリリボヌクレオチド又はその変異体からなるスモールＲＮＡからなる群から選ばれる１又は２種以上のスモールＲＮＡの発現量を測定する工程：（Ｃ）コントロールとしての、検体組織と同種の非がん組織又は被検体と同種の非がん被検体の血液におけるスモールＲＮＡの発現量と比較・評価する工程：や、（５）抽出したＲＮＡ中の、配列番号１〜７、１０〜５６のいずれかに示されるポリリボヌクレオチド又はその変異体からなるスモールＲＮＡからなる群から選ばれる１又は２種以上のスモールＲＮＡの発現量が、コントロールと比較して増加している場合に腫瘍であると評価することを特徴とする上記（４）に記載の腫瘍の判定方法や、（６）抽出したＲＮＡ中の、配列番号８〜９、５７〜１３５のいずれかに示されるポリリボヌクレオチド又はその変異体からなるスモールＲＮＡからなる群から選ばれる１又は２種以上のスモールＲＮＡの発現量が、コントロールと比較して低下している場合に腫瘍であると評価することを特徴とする上記（４）に記載の腫瘍の判定方法や、（７）腫瘍が頭頸部腫瘍であり、検体組織が頭頸部の検体組織であることを特徴とする上記（４）〜（６）のいずれかに記載の腫瘍の判定方法に関する。
また、本発明は、（８）配列番号１〜１３５のいずれかに示されるポリリボヌクレオチド又はその変異体からなるスモールＲＮＡからなる群から選ばれるスモールＲＮＡの発現量を測定することができる、前記スモールＲＮＡの配列に相補的な核酸配列からなるポリヌクレオチド又はその一部を備えたマイクロアレイを腫瘍の判定に使用する方法や、（９）腫瘍が頭頸部腫瘍であることを特徴とする上記（８）に記載の方法や、（１０）配列番号１〜１３５のいずれかに示されるポリリボヌクレオチド又はその変異体からなるスモールＲＮＡからなる群から選ばれるスモールＲＮＡの配列を増幅し得るプライマーセットと、前記スモールＲＮＡの配列に相補的な核酸配列からなるポリヌクレオチド又はその一部を含む蛍光プローブとを、腫瘍の判定に使用する方法や、（１１）腫瘍が頭頸部腫瘍であることを特徴とする上記（１０）に記載の方法に関する。
さらに、本発明は、（１２）配列番号１〜１３５のいずれかに示されるポリリボヌクレオチド又はその変異体からなるスモールＲＮＡからなる群から選ばれるスモールＲＮＡの発現量を測定することができる、前記スモールＲＮＡの配列に相補的な核酸配列からなるポリヌクレオチド又はその一部を備えたマイクロアレイを含んでいることを特徴とする腫瘍の判定キットや、（１３）腫瘍が頭頸部腫瘍であることを特徴とする上記（１２）に記載の判定キットや、（１４）配列番号１〜１３５のいずれかに示されるポリリボヌクレオチド又はその変異体からなるスモールＲＮＡからなる群から選ばれるスモールＲＮＡの配列を増幅し得るプライマーセットと、前記スモールＲＮＡの配列に相補的な核酸配列からなるポリヌクレオチド又はその一部を含む蛍光プローブとを備えたことを特徴とする腫瘍の判定キットや、（１５）腫瘍が頭頸部腫瘍であることを特徴とする上記（１４）に記載の判定キットに関する。
また、本発明は、（１６）以下の工程を含むことを特徴とする腫瘍治療薬のスクリーニング方法：（Ａ）腫瘍に罹患した非ヒト動物に被検物質を投与する工程：（Ｂ）前記非ヒト動物における腫瘍組織中又は血液中の、配列番号１〜１３５のいずれかに示されるポリリボヌクレオチド又はその変異体からなるスモールＲＮＡからなる群から選ばれる１又は２種以上のスモールＲＮＡの発現量を測定する工程：（Ｃ）コントロールとしての、被検物質を未投与の場合におけるスモールＲＮＡの発現量と比較・評価する工程：や、（１７）腫瘍が頭頸部腫瘍であることを特徴とする上記（１６）に記載のスクリーニング方法に関する。
本発明の特定のスモールＲＮＡを腫瘍のバイオマーカーとして使用する方法や、腫瘍の判定方法や、判定キットによると、迅速かつ正確に腫瘍を判定することができる。また、本発明の腫瘍治療薬のスクリーニング方法によると、腫瘍治療薬を効率的にスクリーニングすることができる。特に、被検体が腫瘍に罹患している場合に、被検体の血液中の濃度も変化するスモールＲＮＡの場合は、採取がきわめて容易な血液サンプルを利用することができるため、腫瘍のバイオマーカーとして使用する方法や、腫瘍の判定方法等における迅速性や簡便性に特に優れている。なお、本発明におけるスモールＲＮＡ等についてさらに研究が進めば、腫瘍の発症・進展・予後予測や治療が可能となることで、現在の腫瘍臨床のさまざまな問題点を解決する突破口となることが期待できる。さらに治療に際しては、薬剤や放射線治療への抵抗性が診断できれば、患者個人ごとに有効な治療法を選択する個別化治療にまで発展させ得る可能性を含んでいる。正確な診断や予後の予測は、余計な検査や患者の必要以上の通院を減らすことが期待でき、医療経済効果も大きいと予想される。
１．本発明の特定のスモールＲＮＡを腫瘍のバイオマーカーとして使用する方法
本発明における特定のスモールＲＮＡ（以下、単に「本発明におけるスモールＲＮＡ」とも表示する。）を腫瘍のバイオマーカーとして使用する方法としては、本発明におけるスモールＲＮＡ、すなわち、配列番号１〜１３５のいずれかに示されるポリリボヌクレオチド又はその変異体からなるスモールＲＮＡを、腫瘍のバイオマーカーとして使用する方法である限り特に制限はされず、具体的には、本発明の腫瘍の判定方法や、本発明のマイクロアレイを腫瘍の判定に使用する方法や、本発明のプライマーセットと蛍光プローブとを腫瘍の判定に使用する方法や、腫瘍治療薬のスクリーニング方法を例示することができる。
本発明における特定のスモールＲＮＡ（以下、単に「本発明におけるスモールＲＮＡ」とも表示する。）を腫瘍のバイオマーカーとして使用する方法としては、本発明におけるスモールＲＮＡ、すなわち、配列番号１〜１３５のいずれかに示されるポリリボヌクレオチド又はその変異体からなるスモールＲＮＡを、腫瘍のバイオマーカーとして使用する方法である限り特に制限はされず、具体的には、本発明の腫瘍の判定方法や、本発明のマイクロアレイを腫瘍の判定に使用する方法や、本発明のプライマーセットと蛍光プローブとを腫瘍の判定に使用する方法や、腫瘍治療薬のスクリーニング方法を例示することができる。
配列番号１は、chr2_207683032-の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号２は、chr7_36343030-、chr14_101596693+、chr15_67507851+、chr16_67565867+、chr18_66266580+、chr3_72191016+、chr6_28718144+、chr7_36343030+、chr7_73459867+又はchr8_101124981+の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号３は、chr4_159841311-の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号４は、chr5_54503922-の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号５は、chr9_90179002+の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号６は、chr15_81221854+の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号７は、chr18_41923331-の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号８は、chr4_56991616-又はchr4_56991638+の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号９は、chr4_30588363+の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号１０は、chr10_20112541+の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号１１は、chr13_31633612+の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号１２は、chr21_22980685-の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号１３は、chr12_76362038-の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号１４は、chr5_40434928-の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号１５は、chr18_4062216+の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号１６は、chr7_3809680-の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号１７は、chr20_35192920+の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号１８は、chr5_100470010+の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号１９は、chrX_123771048+の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号２０は、chr4_116312290-の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号２１は、chr1_156317610+の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号２２は、chr5_63701264-の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号２３は、chr3_73146433+の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号２４は、chr16_67383847-又はchr21_42904480-の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号２５は、chr1_19721746-、chr12_129789723-、chr2_217084552-又はchrX_8751220-の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号２６は、chr8_12727029-の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号２７は、chr19_23230662+又はchr19_21821648+の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号２８は、chr3_111130631+の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号２９は、chr2_101579062+、chr20_50197765+又はchr3_194722220+の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号３０は、chr1_36224681+の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号３１は、chr13_19205704+の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号３２は、chr4_61605850+の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号３３は、chr19_57796219-の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号３４は、chr9_80531106+の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号３５は、chr1_31069387-の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号３６は、chr14_95988605+、chr17_77533020+、chr6_162162960+、chr7_68077544+、chrX_68077544+、chr1_243042506+、chr18_17499093+、chr20_29665815+、chr3_152747438+、chr4_108412614+、chr6_46898430+又はchr6_86176534+の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号３７は、chr13_101895663+、chr12_109426460+又はchr2_122088345+の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号３８は、chr17_45622764-の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号３９は、chr5_12903733-の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号４０は、chr14_105016753+の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号４１は、chr17_56759632+の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号４２は、chr7_158573832-の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号４３は、chr18_56821334-の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号４４は、chr14_35974023-又はchr20_55147622-の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号４５は、chr17_44935494-の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号４６は、chr2_96517928-の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号４７は、chr5_150592162-の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号４８は、chr12_80798194+の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号４９は、chr14_44686123+の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号５０は、chr6_100553953-の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号５１は、chr13_58552205-の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号５２は、chr12_56726499-の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号５３は、chr1_26315983+の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号５４は、chr3_102802629-の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号５５は、chr2_88095951+の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号５６は、chr20_5593536+の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号５７は、chr4_80722625-の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号５８は、chr18_52159944+の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号５９は、chr2_116291799+の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号６０は、chr12_43586396+の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号６１は、chrY_13903890+の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号６２は、chr11_112899263-の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号６３は、chr7_125532232-の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号６４は、chr8_3706415+の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号６５は、chr10_97280927-の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号６６は、chr14_101141137-の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号６７は、chr1_59372670-の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号６８は、chr9_126381650-の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号６９は、chr6_32480269-の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号７０は、chr3_51938784+の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号７１は、chr13_58381244+の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号７２は、chr11_64299436-の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号７３は、chr2_135492728+の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号７４は、chr9_24002277+の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号７５は、chr3_45733243+の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号７６は、chr10_17892682+又はchr10_18139672+の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号７７は、chr7_155835128+の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号７８は、chr14_79906621-の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号７９は、chr6_113313108-の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号８０は、chr1_25272290+の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号８１は、chr18_32960249-の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号８２は、chr6_30433838+の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号８３は、chr16_81421137-の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号８４は、chrX_128924858-の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号８５は、chr16_69993560+の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号８６は、chr16_47548696+の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号８７は、chr5_147459156-の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号８８は、chr5_81565927-の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号８９は、chr17_64785401-の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号９０は、chr7_1677442+の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号９１は、chr5_154945381+の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号９２は、chr6_165090018+の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号９３は、chr3_48962778+又はchr3_48962296+の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号９４は、chr12_114668994+の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号９５は、chr12_65009031+の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号９６は、chr5_132978063+の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号９７は、chr11_86193869+の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号９８は、chr16_15746666-の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号９９は
、chr16_53649542+の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号１００は、chr1_45480552-の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号１０１は、chr12_42928769+の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号１０２は、chrX_47388240-の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号１０３は、chr11_37781434-の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号１０４は、chr10_80302437-の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号１０５は、chr19_14839510-の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号１０６は、chr4_82522273+の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号１０７は、chr11_30355663+の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号１０８は、chr2_171442461-の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号１０９は、chr7_15682704-の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号１１０は、chr10_87326332-の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号１１１は、chr15_91176756-の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号１１２は、chr11_49328346-の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号１１３は、chr15_69806720-の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号１１４は、chr3_38725780+の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号１１５は、chr1_239235411+の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号１１６は、chr9_132742582+の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号１１７は、chr2_147679179-の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号１１８は、chr1_231289111-の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号１１９は、chr11_26311952-の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号１２０は、chr14_36146417+の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号１２１は、chr6_14585267-の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号１２２は、chr16_53731358+の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号１２３は、chr19_6925359+の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号１２４は、chr8_133963297+の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号１２５は、chrX_112049432-の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号１２６は、chr15_32166220-の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号１２７は、chr13_72312801+の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号１２８は、chr6_158836211+の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号１２９は、chr3_107317523-の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号１３０は、chr6_75848122+の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号１３１は、chr2_179055758+の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号１３２は、chr1_202037610+の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号１３３は、chrY_8804566+の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号１３４は、chrX_139050490+の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号１３５は、chr18_64836428-の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドである。本発明における好適なポリリボヌクレオチドとして、配列番号１、５２、３６、２を好適に例示することができ、中でも配列番号１をより好適に例示することができる。なお、chr番号の最後の「＋」は、ポジティブストランドであることを示し、「−」はネガティブストランドであることを示す。
、chr16_53649542+の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号１００は、chr1_45480552-の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号１０１は、chr12_42928769+の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号１０２は、chrX_47388240-の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号１０３は、chr11_37781434-の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号１０４は、chr10_80302437-の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号１０５は、chr19_14839510-の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号１０６は、chr4_82522273+の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号１０７は、chr11_30355663+の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号１０８は、chr2_171442461-の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号１０９は、chr7_15682704-の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号１１０は、chr10_87326332-の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号１１１は、chr15_91176756-の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号１１２は、chr11_49328346-の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号１１３は、chr15_69806720-の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号１１４は、chr3_38725780+の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号１１５は、chr1_239235411+の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号１１６は、chr9_132742582+の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号１１７は、chr2_147679179-の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号１１８は、chr1_231289111-の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号１１９は、chr11_26311952-の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号１２０は、chr14_36146417+の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号１２１は、chr6_14585267-の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号１２２は、chr16_53731358+の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号１２３は、chr19_6925359+の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号１２４は、chr8_133963297+の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号１２５は、chrX_112049432-の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号１２６は、chr15_32166220-の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号１２７は、chr13_72312801+の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号１２８は、chr6_158836211+の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号１２９は、chr3_107317523-の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号１３０は、chr6_75848122+の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号１３１は、chr2_179055758+の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号１３２は、chr1_202037610+の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号１３３は、chrY_8804566+の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号１３４は、chrX_139050490+の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドであり、配列番号１３５は、chr18_64836428-の位置のヌクレオチドを開始位置として含むポリリボヌクレオチドである。本発明における好適なポリリボヌクレオチドとして、配列番号１、５２、３６、２を好適に例示することができ、中でも配列番号１をより好適に例示することができる。なお、chr番号の最後の「＋」は、ポジティブストランドであることを示し、「−」はネガティブストランドであることを示す。
本明細書中の「腫瘍」としては、がん（悪性腫瘍）を好適に例示することができ、中でも、頭頸部がん、胃がん、虫垂がん、大腸がん、肝がん、胆嚢がん、胆管がん、膵臓がん、副腎がん、腎臓がん、中皮腫、肺がん、骨肉腫、横紋筋肉腫、前立腺がん、腎臓がん、膀胱がん、皮膚がん、肛門がん、乳がん、子宮体がん、子宮頚がん、卵巣がん、脳腫瘍、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫をより好適に例示することができ、中でも、頭頸部がんを特に好適に例示することができる。「頭頸部」としては、口唇・口腔、鼻・副鼻腔、唾液腺、耳・側頭骨、頭蓋底等の頭部や、咽頭、喉頭、食道、甲状腺等の頸部を例示することができ、中でも、頸部を好適に例示することができ、中でも喉頭をより好適に例示することができる。
本発明におけるスモールＲＮＡの由来となる生物としては、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、サル、ウシ、ブタ、ウマ、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、イヌ等の哺乳動物を好適に例示することができ、中でもヒト、マウスをより好適に例示することができ、特にヒトを好適に例示することができる。なお、配列番号１〜１３５のいずれかに示されるポリリボヌクレオチドからなるスモールＲＮＡは、ヒト由来のスモールＲＮＡである。スモールＲＮＡの配列は特に哺乳動物間では保存性が高く、上記の本発明におけるスモールＲＮＡはヒト以外の哺乳動物においてもヒトと同様の発現プロファイルを示すと考えられる。ヒト由来のこのリボヌクレオチド配列の情報に基づいて、ヒト以外の哺乳動物からも、本発明におけるスモールＲＮＡに相当するスモールＲＮＡを単離及び同定することができる。
前述の配列番号１〜１３５のいずれかに示されるポリリボヌクレオチドの変異体としては、
（ｉ）配列番号１〜７、１０〜５６のいずれかに示されるポリリボヌクレオチドに対して８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の同一性を有するポリリボヌクレオチドからなり、かつ、腫瘍又は腫瘍被検体の血液においてコントロールと比較して発現が増加するスモールＲＮＡ：
や配列番号８〜９、５７〜１３５のいずれかに示されるポリリボヌクレオチドに対して８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の同一性を有するポリリボヌクレオチドからなり、かつ、腫瘍又は腫瘍被検体の血液においてコントロールと比較して発現が低下するスモールＲＮＡ：
（ii）配列番号１〜７、１０〜５６のいずれかに示されるポリリボヌクレオチドにおいて１若しくは２個以上のリボヌクレオチドが欠失、置換、若しくは付加されたポリリボヌクレオチドからなり、かつ、腫瘍又は腫瘍被検体の血液においてコントロールと比較して発現が増加するスモールＲＮＡ：や
配列番号８〜９、５７〜１３５のいずれかに示されるポリリボヌクレオチドにおいて１若しくは２個以上のリボヌクレオチドが欠失、置換、若しくは付加されたポリリボヌクレオチドからなり、かつ、腫瘍又は腫瘍被検体の血液においてコントロールと比較して発現が低下するスモールＲＮＡ：
（iii）配列番号１〜７、１０〜５６のいずれかに示されるポリリボヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリリボヌクレオチドからなり、かつ、腫瘍又は腫瘍被検体の血液においてコントロールと比較して発現が増加するスモールＲＮＡ：や
配列番号８〜９、５７〜１３５のいずれかに示されるポリリボヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリリボヌクレオチドからなり、かつ、腫瘍又は腫瘍被検体の血液においてコントロールと比較して発現が低下するスモールＲＮＡ：
（ｉ）配列番号１〜７、１０〜５６のいずれかに示されるポリリボヌクレオチドに対して８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の同一性を有するポリリボヌクレオチドからなり、かつ、腫瘍又は腫瘍被検体の血液においてコントロールと比較して発現が増加するスモールＲＮＡ：
や配列番号８〜９、５７〜１３５のいずれかに示されるポリリボヌクレオチドに対して８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の同一性を有するポリリボヌクレオチドからなり、かつ、腫瘍又は腫瘍被検体の血液においてコントロールと比較して発現が低下するスモールＲＮＡ：
（ii）配列番号１〜７、１０〜５６のいずれかに示されるポリリボヌクレオチドにおいて１若しくは２個以上のリボヌクレオチドが欠失、置換、若しくは付加されたポリリボヌクレオチドからなり、かつ、腫瘍又は腫瘍被検体の血液においてコントロールと比較して発現が増加するスモールＲＮＡ：や
配列番号８〜９、５７〜１３５のいずれかに示されるポリリボヌクレオチドにおいて１若しくは２個以上のリボヌクレオチドが欠失、置換、若しくは付加されたポリリボヌクレオチドからなり、かつ、腫瘍又は腫瘍被検体の血液においてコントロールと比較して発現が低下するスモールＲＮＡ：
（iii）配列番号１〜７、１０〜５６のいずれかに示されるポリリボヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリリボヌクレオチドからなり、かつ、腫瘍又は腫瘍被検体の血液においてコントロールと比較して発現が増加するスモールＲＮＡ：や
配列番号８〜９、５７〜１３５のいずれかに示されるポリリボヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリリボヌクレオチドからなり、かつ、腫瘍又は腫瘍被検体の血液においてコントロールと比較して発現が低下するスモールＲＮＡ：
上記（ii）における「１若しくは２個以上のリボヌクレオチドが欠失、置換、若しくは付加されたポリリボヌクレオチド」とは、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個の任意の数のリボヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加されたポリリボヌクレオチドを意味する。
上記（iii）における「ストリジェントな条件下」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、具体的には、８０％以上、好ましくは８５％以上の同一性を有するＤＮＡ同士（又はＤＮＡとＲＮＡ）がハイブリダイズし、それより同一性が低いＤＮＡ同士（又はＤＮＡとＲＮＡ）がハイブリダイズしない条件あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６５℃、１×ＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）、０．１％ＳＤＳ、又は０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件を挙げることができる。ハイブリダイゼーションは、モレキュラークローニング第２版等に記載されている方法に準じて行うことができる。上記（iii）における「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリリボヌクレオチド」としては、プローブとして使用するポリヌクレオチドの相補配列と、一定以上の同一性を有するポリリボヌクレオチドが挙げることができ、例えば８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の同一性を有するポリヌクレオチドを好適に例示することができる。
上記（ｉ）の配列番号１〜１３５のいずれかに示されるポリリボヌクレオチドは、そのリボヌクレオチド配列が明らかとなったので、例えば、鋳型としてヒトのゲノムＤＮＡを用い、該リボヌクレオチド配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドをプライマーに用いるＰＣＲ反応によって、または該リボヌクレオチド配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドをプローブとして用いるハイブリダイゼーションによっても得ることができる。なお、染色体ＤＮＡは、常法に開示された方法により取得できる。
オリゴヌクレオチドの合成は、例えば、市販されている種々のＤＮＡ合成機を用いて常法に従って合成できる。また、ＰＣＲ反応は、アプライドバイオシステムズ社（Applied Biosystems）製のサーマルサイクラーＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ２４００を用い、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）やＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）などを使用して常法に従って行なうことができる。
また、前述のポリリボヌクレオチドの変異体は、化学合成、遺伝子工学的手法、突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法により作製することもできる。具体的には、配列番号１〜１３５のいずれかに示されるポリリボヌクレオチドに対し、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、遺伝子工学的な手法等を用いて、これらポリリボヌクレオチドに変異を導入することにより、ポリリボヌクレオチドの変異体を取得することができる。遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、モレキュラークローニング第２版、Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38,John Wiley & Sons (1987-1997)等に記載の方法に準じて行うことができる。
なお、前述のポリリボヌクレオチドの変異体からなるスモールＲＮＡが、腫瘍又は腫瘍被検体の血液においてコントロールと比較して発現が増加又は低下するかどうかは、後述のＳＯＬｉＤ（登録商標）システム（Applied Biosystems社製）を用いた解析法の他、マイクロアレイ法や定量ＰＣＲ法により容易に確認することができる。また、上記の腫瘍被検体とは、腫瘍に罹患した被検体を意味する。本明細書における「被検体」としては、対象となるヒト、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、サル、ウシ、ブタ、ウマ、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、イヌ等の哺乳動物を好適に例示することができ、中でもヒト、マウスをより好適に例示することができ、特にヒトを好適に例示することができる。
２．本発明の腫瘍の判定方法
本発明の腫瘍の判定方法としては、（Ａ）検体組織中又は被検体の血液中のＲＮＡを抽出する工程：（Ｂ）抽出したＲＮＡ中の、配列番号１〜１３５のいずれかに示されるポリリボヌクレオチド又はその変異体からなるスモールＲＮＡからなる群から選ばれる１又は２種以上のスモールＲＮＡの発現量を測定する工程：（Ｃ）コントロールとしての、検体組織と同種の非がん組織又は被検体と同種の非がん被検体の血液におけるスモールＲＮＡの発現量と比較・評価する工程：を備えている限り特に制限されないが、抽出したＲＮＡ中の、配列番号１〜７、１０〜５６のいずれかに示されるポリリボヌクレオチド又はその変異体からなるスモールＲＮＡからなる群から選ばれる１又は２種以上のスモールＲＮＡの発現量が、コントロールと比較して増加している場合に腫瘍であると評価し、及び／又は、配列番号８〜９、５７〜１３５のいずれかに示されるポリリボヌクレオチド又はその変異体からなるスモールＲＮＡからなる群から選ばれる１又は２種以上のスモールＲＮＡの発現量が、コントロールと比較して低下している場合に腫瘍であると評価する方法を好適に例示することができる。
本発明の腫瘍の判定方法としては、（Ａ）検体組織中又は被検体の血液中のＲＮＡを抽出する工程：（Ｂ）抽出したＲＮＡ中の、配列番号１〜１３５のいずれかに示されるポリリボヌクレオチド又はその変異体からなるスモールＲＮＡからなる群から選ばれる１又は２種以上のスモールＲＮＡの発現量を測定する工程：（Ｃ）コントロールとしての、検体組織と同種の非がん組織又は被検体と同種の非がん被検体の血液におけるスモールＲＮＡの発現量と比較・評価する工程：を備えている限り特に制限されないが、抽出したＲＮＡ中の、配列番号１〜７、１０〜５６のいずれかに示されるポリリボヌクレオチド又はその変異体からなるスモールＲＮＡからなる群から選ばれる１又は２種以上のスモールＲＮＡの発現量が、コントロールと比較して増加している場合に腫瘍であると評価し、及び／又は、配列番号８〜９、５７〜１３５のいずれかに示されるポリリボヌクレオチド又はその変異体からなるスモールＲＮＡからなる群から選ばれる１又は２種以上のスモールＲＮＡの発現量が、コントロールと比較して低下している場合に腫瘍であると評価する方法を好適に例示することができる。
なお、上記工程（Ａ）において検体組織を用いた場合は、上記工程（Ｃ）におけるコントロールとして、検体組織と同種の非がん組織を用い、上記工程（Ａ）において被検体の血液を用いた場合は、上記工程（Ｃ）におけるコントロールとして、被検体と同種の非がん被検体の血液を用いる。また、本明細書におけるスモールＲＮＡの発現量としては、サンプル間のばらつきを補正するために適切な内部標準遺伝子で補正した相対発現量を用いることがより正確な判定を行なう観点から好ましい。内部標準遺伝子としては特に制限されないが、ＲＮＵ４８、ＲＮＵ６ｂ、ｓｎＲＮＡ（核内低分子ＲＮＡ）、及び、ｓｎｏＲＮＡ（核小体低分子ＲＮＡ）からなる群から選ばれる１種又は２種以上の遺伝子を例示することができる。
上記（Ａ）工程におけるＲＮＡを抽出する方法としては、検体組織中又は被検体の血液中から、スモールＲＮＡを含むＲＮＡを抽出する方法である限り特に制限されず、例えば、mirVana miRNA Isolation Kit（Applied Biosystems社製）を添付のプロトコールにしたがって用いることによって、スモールＲＮＡを含むトータルＲＮＡを抽出する方法を好適に例示することができる。上記の検体組織としては、腫瘍の判定の対象となる生物由来の組織である限り特に制限されず、上記生物としては、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、サル、ウシ、ブタ、ウマ、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、イヌ等の哺乳動物を好適に例示することができ、中でもヒト、マウスをより好適に例示することができ、特にヒトを好適に例示することができる。
上記（Ｂ）工程における本件スモールＲＮＡの発現量を測定する方法としては、スモールＲＮＡを含むＲＮＡ中の本件スモールＲＮＡ量を同定し得る方法である限り特に制限されず、本発明の腫瘍の判定キットを用いる方法を例示することができる。かかる方法については、後述の３．の本発明の腫瘍の判定に使用する方法、及び、本発明の判定キットの項目において詳述する。
上記（Ｃ）工程のコントロールとしての、検体組織と同種の非がん組織（例えば検体組織が喉頭組織である場合は、非がん喉頭組織）におけるスモールＲＮＡの発現量と比較・評価する方法におけるコントロールとしては、より正確な評価が可能となることから、検体組織と同一個体の組織（非がん部位）であることが好ましい。なお、コントロールとしての検体組織と同種の非がん組織又は被検体と同種の非がん被検体の血液は、検体組織又は被検体の血液を採取する際にかならずしも採取する必要はなく、非がん組織中又は非がん被検体の血液中の本件スモールＲＮＡの発現量についてあらかじめ検量線を作成し、それとの比較・評価を行なってもよい。
このように検体組織中又は被検体の血液中のＲＮＡに含まれるスモールＲＮＡの発現量に基づいて、その検体組織又はその被検体が腫瘍であるかどうかを判定することができる。前記のように、本件スモールＲＮＡのうち配列番号１〜７、１０〜５６のいずれかに示されるポリリボヌクレオチド又はその変異体からなるスモールＲＮＡついては、コントロールと比較してその発現量が増加している場合に腫瘍であると判定することができ、配列番号８〜９、５７〜１３５のいずれかに示されるポリリボヌクレオチド又はその変異体からなるスモールＲＮＡについては、コントロールと比較してその発現量が低下している場合に腫瘍であると判定することができる。
腫瘍であると判定する場合の本件スモールＲＮＡの発現量の増加の程度としては、例えば、コントロールに対する割合として８倍以上、より好ましくは１０倍以上、さらに好ましくは１２倍以上の増加を好適に例示することができ、腫瘍であると判定する場合の本件スモールＲＮＡの発現量の低下の程度としては、例えば、コントロールに対する割合として好ましくは８倍以上、より好ましくは１０倍以上、さらに好ましくは１２倍以上の低下を好適に例示することができる。
３．本発明の腫瘍の判定に使用する方法、及び、本発明の腫瘍の判定キット
本発明の腫瘍の判定に使用する方法は、以下の（１）〜（３）のいずれかの本発明の腫瘍の判定キットを腫瘍の判定に使用する方法である限り特に制限されない。
（１）配列番号１〜１３５のいずれかに示されるポリリボヌクレオチド又はその変異体からなるスモールＲＮＡからなる群から選ばれるスモールＲＮＡの発現量を測定することができる、前記スモールＲＮＡの配列に相補的な核酸配列からなるポリヌクレオチド又はその一部を備えたマイクロアレイを含んでいることを特徴とする腫瘍の判定キット：
（２）配列番号１〜１３５のいずれかに示されるポリリボヌクレオチド又はその変異体からなるスモールＲＮＡからなる群から選ばれるスモールＲＮＡの配列を増幅し得るプライマーセットを備えたことを特徴とする腫瘍の判定キット：
（３）配列番号１〜１３５のいずれかに示されるポリリボヌクレオチド又はその変異体からなるスモールＲＮＡからなる群から選ばれるスモールＲＮＡの配列を増幅し得るプライマーセットと、前記スモールＲＮＡの配列に相補的な核酸配列からなるポリヌクレオチド又はその一部を含む蛍光プローブとを備えたことを特徴とする腫瘍の判定キット：
本発明の腫瘍の判定に使用する方法は、以下の（１）〜（３）のいずれかの本発明の腫瘍の判定キットを腫瘍の判定に使用する方法である限り特に制限されない。
（１）配列番号１〜１３５のいずれかに示されるポリリボヌクレオチド又はその変異体からなるスモールＲＮＡからなる群から選ばれるスモールＲＮＡの発現量を測定することができる、前記スモールＲＮＡの配列に相補的な核酸配列からなるポリヌクレオチド又はその一部を備えたマイクロアレイを含んでいることを特徴とする腫瘍の判定キット：
（２）配列番号１〜１３５のいずれかに示されるポリリボヌクレオチド又はその変異体からなるスモールＲＮＡからなる群から選ばれるスモールＲＮＡの配列を増幅し得るプライマーセットを備えたことを特徴とする腫瘍の判定キット：
（３）配列番号１〜１３５のいずれかに示されるポリリボヌクレオチド又はその変異体からなるスモールＲＮＡからなる群から選ばれるスモールＲＮＡの配列を増幅し得るプライマーセットと、前記スモールＲＮＡの配列に相補的な核酸配列からなるポリヌクレオチド又はその一部を含む蛍光プローブとを備えたことを特徴とする腫瘍の判定キット：
上記マイクロアレイを腫瘍の判定に使用する方法としては、マイクロアレイ法を好適に例示することができ、上記プライマーセットを腫瘍の判定に使用する方法としては、定量ＰＣＲ法を好適に例示することができ、上記プライマーセットと蛍光プローブとを腫瘍の判定に使用する方法としては、定量ＰＣＲ法（蛍光プローブ法）を好適に例示することができる。
上記のマイクロアレイ法としては、本件スモールＲＮＡの発現量を測定することが可能である限り特に制限されないが、組織から抽出したＲＮＡをラベル（好ましくは蛍光ラベル）で標識し、そのＲＮＡを、同定対象とするスモールＲＮＡに相補的な核酸配列からなるポリヌクレオチド（好ましくはＤＮＡ）又はその一部からなるプローブが固定されたマイクロアレイに接触させてハイブリダイゼーションを行った後、マイクロアレイを洗浄して、マイクロアレイ上に残ったスモールＲＮＡの発現量を測定する方法を例示することができる。
上記の核酸配列のヌクレオチドの種類としては、本発明における所定のスモールＲＮＡに特異的にハイブリダイズし得る限り特に制限されないが、安定性が高いことからＤＮＡであることが好ましい。また、上記のポリヌクレオチドの一部の長さとしては、本発明における所定のスモールＲＮＡに特異的にハイブリダイズし得る限り特に制限されないが、ハイブリダイゼーションの安定性を確保する観点から、１０〜１００ｍｅｒであることが好ましく、１０〜４０ｍｅｒであることがより好ましい。なお、上記のポリヌクレオチド又はその一部は、当該技術分野において周知の方法を用いて化学合成等することにより得ることができる。
上記のポリヌクレオチド又はその一部を固定するアレイとしては特に制限されないが、ガラス基板やシリコン基板等を好適に例示することができ、ガラス基板をより好適に例示することができる。上記のポリヌクレオチド又はその一部をアレイに固定する方法としては特に制限されず、公知の方法を用いることができる。
また、本発明のマイクロアレイを含んでいる腫瘍の判定キットには、前述のマイクロアレイの他に、例えばＲＮＡのラベル化反応に用いる試薬、ハイブリダイゼーション反応に用いる試薬、洗浄に用いる試薬、組織からのＲＮＡ抽出に用いる試薬等の、マイクロアレイ法に用いる試薬などの任意の要素をさらに含んでいてもよい。
そして、マイクロアレイ法としては、Agilent Human miRNAV2 (Agilent Technologies社製)をAgilent Technologies社のmiRNA Microarray protocol Version 1.5に記載の方法に従って用い、DNA Microarray Scanner (Agilent Technologies社製)でスモールＲＮＡの発現量を測定する方法をより具体的に例示することができる。上記のポリヌクレオチド又はその一部からなるプローブが固定されたマイクロアレイは、測定対象とする本件スモールＲＮＡの配列情報に基づいてポリヌクレオチドを合成し、それを市販のアレイに固定するなどして作製することができる。
上記の定量ＰＣＲ法としては、本件スモールＲＮＡの配列を増幅し得るプライマーセットを用いる方法であり、かつ、本件スモールＲＮＡの発現量を測定することが可能である限り特に制限されず、アガロース電気泳動法、ＳＹＢＲグリーン法、蛍光プローブ法等の通常の定量ＰＣＲ法を用いることができるが、定量の精度や信頼性の点で、蛍光プローブ法が最も好ましい。
定量ＰＣＲ法におけるプライマーセットとは、本件スモールＲＮＡの配列を増幅し得るプライマー（ポリヌクレオチド）の組合せを意味する。上記プライマーとしては、本件スモールＲＮＡの配列を増幅し得る限り特に制限されないが、本発明における所定のスモールＲＮＡの配列の５’側の一部の配列からなるプライマー（フォワードプライマー）と、そのスモールＲＮＡの配列の３’側の一部の配列に相補的な配列からなるプライマー（リバースプライマー）とからなるプライマーセットを例示することができる。ここで、５’側とは、成熟型スモールＲＮＡの配列において比較した場合に、リバースプライマーに対応する配列よりも、５’側であることを意味し、３’側とは、成熟型スモールＲＮＡの配列において比較した場合に、フォワードプライマーに対応する配列よりも、３’側であることを意味する。
スモールＲＮＡの５’側の配列として、好ましくは、そのスモールＲＮＡの配列の中央の核酸よりも５’側の配列を例示することができ、スモールＲＮＡの３’側の配列として、好ましくは、そのスモールＲＮＡの配列の中央の核酸よりも３’側の配列を例示することができる。また、それぞれのプライマーの長さとしては、スモールＲＮＡを増幅し得る限り特に制限されないが、７〜１０ｍｅｒのポリヌクレオチドであることが好ましい。なお、上記プライマーであるポリヌクレオチドのヌクレオチドの種類としては、安定性が高いことからＤＮＡであることが好ましい。
上記の蛍光プローブとしては、本件スモールＲＮＡの配列に相補的な核酸配列からなるポリヌクレオチド又はその一部を含んでいる限り特に制限されず、TaqMan（登録商標）プローブ法（ＦＲＥＴ原理を利用したものも含む）や、サイクリングプローブ法に用いうる蛍光プローブを好適に例示することができ、特にTaqMan（登録商標）プローブ法（ＦＲＥＴ原理を利用したものも含む）に用いうる蛍光プローブをより好適に例示することができる。TaqMan（登録商標）プローブ法（ＦＲＥＴ原理を利用したものを除く）や、サイクリングプローブ法に用いうる蛍光プローブとしては、５’側に蛍光色素を標識し、３’側に消光物質を標識した蛍光プローブを例示することができ、ＦＲＥＴ原理を利用した蛍光プローブとしては、５’側と３’側に、それぞれドナー色素とアクセプター色素を標識した蛍光プローブを例示することができる。上記の蛍光色素、消光物質、ドナー色素、アクセプター色素等は、市販のものを適宜使用することができる。
上記の蛍光プローブにおける核酸配列のヌクレオチドの種類としては、本件スモールＲＮＡに特異的にハイブリダイズし得る限り、特に制限されないが、安定性が高いことからＤＮＡであることが好ましい。また、上記のポリヌクレオチドの一部の長さとしては、本発明における所定のスモールＲＮＡに特異的にハイブリダイズし得る限り、特に制限されないが、ハイブリダイゼーションの安定性を確保する観点から、１０ｍｅｒ以上であることが好ましく、１５ｍｅｒ以上であることがより好ましく、対象とするスモールＲＮＡの全長のヌクレオチド数から１〜３ｍｅｒ少ないヌクレオチド数であることがさらに好ましい。
上記プライマーセットや、上記の蛍光プローブは、その配列情報に基づき当該技術分野において周知の方法を用いて化学合成等することにより得ることができる。上記のプライマーセットや蛍光プローブを用いた定量ＰＣＲの方法としては、周知の方法を用いることができる。また、プライマーセットと蛍光プローブとを備えた本発明の腫瘍の判定キットには、前述のプライマーセットの他に、例えばポリメラーゼ等の定量ＰＣＲ反応に用いる試薬などの任意の要素をさらに含んでいてもよい。
４．本発明の腫瘍治療薬のスクリーニング方法
本発明の腫瘍治療薬のスクリーニング方法としては、（ａ）腫瘍に罹患した非ヒト動物に被検物質を投与する工程：（ｂ）前記非ヒト動物における腫瘍組織中又は血液中の、本件スモールＲＮＡの発現量を測定する工程：（ｃ）コントロールとしての、被検物質を未投与の場合における本件スモールＲＮＡの発現量と比較・評価する工程：を含んでいる限り特に制限されず、上記非ヒト動物の種類としては、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、サル、ウシ、ブタ、ウマ、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、イヌ等の非ヒト哺乳動物を好適に例示することができ、中でもマウス、ラットをより好適に例示することができる。また、腫瘍に罹患した非ヒト動物としては、腫瘍を自然に罹患した非ヒト動物であってもよいし、発がん物質で腫瘍を誘導した非ヒト動物であってもよい。
本発明の腫瘍治療薬のスクリーニング方法としては、（ａ）腫瘍に罹患した非ヒト動物に被検物質を投与する工程：（ｂ）前記非ヒト動物における腫瘍組織中又は血液中の、本件スモールＲＮＡの発現量を測定する工程：（ｃ）コントロールとしての、被検物質を未投与の場合における本件スモールＲＮＡの発現量と比較・評価する工程：を含んでいる限り特に制限されず、上記非ヒト動物の種類としては、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、サル、ウシ、ブタ、ウマ、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、イヌ等の非ヒト哺乳動物を好適に例示することができ、中でもマウス、ラットをより好適に例示することができる。また、腫瘍に罹患した非ヒト動物としては、腫瘍を自然に罹患した非ヒト動物であってもよいし、発がん物質で腫瘍を誘導した非ヒト動物であってもよい。
上記（ｂ）工程における本件スモールＲＮＡの発現量を測定する方法としては、前述の本件スモールＲＮＡの発現量を測定する方法を用いればよく、また、上記（ｃ）工程において比較・評価する方法としては、本件スモールＲＮＡのうち、配列番号１〜７、１０〜５６のいずれかに示されるポリリボヌクレオチド又はその変異体からなるスモールＲＮＡについては、コントロールと比較して低下している場合に、その被検物質が腫瘍治療薬である可能性が高いと判定することができ、配列番号８〜９、５７〜１３５のいずれかに示されるポリリボヌクレオチド又はその変異体からなるスモールＲＮＡについては、コントロールと比較して増加している場合に、その被検物質が頭頸部腫瘍治療薬である可能性が高いと判定することができる。スモールＲＮＡは、遺伝子の発現を抑制するなどの性質が報告されているため腫瘍組織又は血液中における上記スモールＲＮＡの異常発現を正常化方向にシフトさせるような被検物質は、腫瘍治療薬として用いうる可能性が高いと考えられる。
なお、（ｃ）工程に代えて、（ｄ）コントロールとしての、腫瘍組織と同種の非がん組織又は被検体と同種の非がん被検体の血液におけるスモールＲＮＡの発現量と比較・評価する工程：を採用することができる。（ｄ）工程において比較・評価する方法としては、本件スモールＲＮＡの発現量が、コントロールと比較して有意差がない場合に、その被検物質が腫瘍治療薬である可能性が高いと判定することができる。
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
［サンプル組織の採取１］
慶應義塾大学医学部ならびに佐野厚生総合病院の倫理委員会の承認のもと、慶應義塾大学病院又は佐野厚生総合病院の耳鼻咽喉科外来を受診した患者を選定し、サンプル提供の依頼対象者とした。その上で、その対象者からインフォームド・コンセントを得た後、５人の各対象者の喉頭から、５種類のサンプル組織を採取した。これら５人の対象者の患者背景は以下の表１のとおりです。
慶應義塾大学医学部ならびに佐野厚生総合病院の倫理委員会の承認のもと、慶應義塾大学病院又は佐野厚生総合病院の耳鼻咽喉科外来を受診した患者を選定し、サンプル提供の依頼対象者とした。その上で、その対象者からインフォームド・コンセントを得た後、５人の各対象者の喉頭から、５種類のサンプル組織を採取した。これら５人の対象者の患者背景は以下の表１のとおりです。
これら５種類のサンプル組織における組織の種類としては、Ｔ４１６とＴ５０６については喉頭がん組織であり、Ｔ４２１、Ｔ５０２、Ｔ４８４については多発性の喉頭乳頭腫（喉頭パピローマ）組織であった。
採取したこれらの組織のそれぞれの一部を、RNAlater（登録商標）（Applied Biosystems社製）が分注されたチューブに入れて冷凍保存し、組織内のＲＮＡを安定化した。なお、各サンプルの組織の状態（がん、乳頭腫等）は、採取した組織の他の一部について病理学検査を実施し、確定診断を行った。
［サンプル組織からのＲＮＡの抽出及びその質的評価］
後述のＳＯＬｉＤ（登録商標）システム（Applied Biosystems社製）解析に用いるため、実施例１で冷凍保存した各組織からmirVana miRNA Isolation Kit（Applied Biosystems社製）にてトータルＲＮＡを抽出した。次に、この抽出したＲＮＡの質的評価を行った。具体的には、抽出したトータルＲＮＡのＲＩＮ（RNA Integrity Number）を、Bio-Analyzer RNA6000（Agilent Technologies社製）にて計測し、ＲＮＡの分解の程度を調べた。その結果、Ｔ４１６由来のトータルＲＮＡのＲＩＮは９．１であり、Ｔ５０６由来のＲＩＮは８．４であり、Ｔ４２１由来のトータルＲＮＡのＲＩＮは９．８であり、Ｔ５０２由来のトータルＲＮＡのＲＩＮは９．８であり、Ｔ４８４由来のトータルＲＮＡのＲＩＮは９．７であった。すなわち、各サンプルのＲＩＮは十分に高いレベルを保持しており、質の良いＲＮＡであることが分かった。
後述のＳＯＬｉＤ（登録商標）システム（Applied Biosystems社製）解析に用いるため、実施例１で冷凍保存した各組織からmirVana miRNA Isolation Kit（Applied Biosystems社製）にてトータルＲＮＡを抽出した。次に、この抽出したＲＮＡの質的評価を行った。具体的には、抽出したトータルＲＮＡのＲＩＮ（RNA Integrity Number）を、Bio-Analyzer RNA6000（Agilent Technologies社製）にて計測し、ＲＮＡの分解の程度を調べた。その結果、Ｔ４１６由来のトータルＲＮＡのＲＩＮは９．１であり、Ｔ５０６由来のＲＩＮは８．４であり、Ｔ４２１由来のトータルＲＮＡのＲＩＮは９．８であり、Ｔ５０２由来のトータルＲＮＡのＲＩＮは９．８であり、Ｔ４８４由来のトータルＲＮＡのＲＩＮは９．７であった。すなわち、各サンプルのＲＩＮは十分に高いレベルを保持しており、質の良いＲＮＡであることが分かった。
［トータルＲＮＡからのスモールＲＮＡの精製］
抽出したＲＮＡを、まず、flashPAGE（登録商標）Fractionator（Applied Biosystems社製）にアプライし、電気泳動によるＰＡＧＥ精製を行うことで、１０−４０塩基の低分子量のＲＮＡ（スモールＲＮＡを含む）を回収した。続いて、flashPAGE（登録商標）Reaction Clean-Up Kitを用いて、これらの核酸の精製、濃縮を行った。
抽出したＲＮＡを、まず、flashPAGE（登録商標）Fractionator（Applied Biosystems社製）にアプライし、電気泳動によるＰＡＧＥ精製を行うことで、１０−４０塩基の低分子量のＲＮＡ（スモールＲＮＡを含む）を回収した。続いて、flashPAGE（登録商標）Reaction Clean-Up Kitを用いて、これらの核酸の精製、濃縮を行った。
［各組織におけるスモールＲＮＡの配列決定及び発現解析］
各組織におけるスモールＲＮＡの配列決定及び発現を解析するために、実施例３で得られたスモールＲＮＡについて、ＳＯＬｉＤ（登録商標）システム（Applied Biosystems社製）を用いた解析を行った。このシステムは、次世代シークエンサーのひとつであり、two-base encodingという方法を利用している。このシステムを利用すると、例えば、ある組織におけるスモールＲＮＡ（配列未知のものを含む）の配列を網羅的に決定すると共に、そのスモールＲＮＡの発現解析も同時に行うことが可能となる。
各組織におけるスモールＲＮＡの配列決定及び発現を解析するために、実施例３で得られたスモールＲＮＡについて、ＳＯＬｉＤ（登録商標）システム（Applied Biosystems社製）を用いた解析を行った。このシステムは、次世代シークエンサーのひとつであり、two-base encodingという方法を利用している。このシステムを利用すると、例えば、ある組織におけるスモールＲＮＡ（配列未知のものを含む）の配列を網羅的に決定すると共に、そのスモールＲＮＡの発現解析も同時に行うことが可能となる。
実施例３で得られた各スモールＲＮＡについて、ＳＯＬｉＤ（登録商標）システムに付属のプロトコールに記載の方法にしたがって、同システムにより網羅的に解析を行った。その解析結果から、新規のスモールＲＮＡ（特にマイクロＲＮＡ）の解析結果のみを取り出すため、以下のフィルタリング処理（図１参照）を行った。
（１）解析結果のデータから、ＬＩＮＥ（Long interspersed nuclear element）、ＳＩＮＥ（Short interspersed nuclear element）(Alu配列等)、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、及び、シークエンスの人工物に相当する配列データを除去した。
（２）次いで、Sanger miRBase 13を利用して、既知のヒトマイクロＲＮＡに相当する配列データを除去した。
（３）次いで、残った配列データについて、Human Mar. 2006 (hg18) assemblyを用いて、ゲノムとのマッチングを調べて、マッチしない配列データを除去した。
（４）次いで、Tag counts（スモールＲＮＡの発現量に相当）の頻度に応じて、スモールＲＮＡのゲノム遺伝子座を図示した。Tag countsが１００以上のものを選択したところ、４５５６クローンのスモールＲＮＡが見出された。
（５）次いで、fRNAdbというノンコーディングＲＮＡの配列データベース（http://www.ncrna.org/frnadb/sitemap）を用いて、４５５６クローンのスモールＲＮＡを、既知のＲＮＡと照合した。その結果、４５５６クローンのうち、２０８クローンがＳＲＰであること、３２クローンがｓｎＲＮＡであること、１６６クローンがｓｎｏＲＮＡであること、３９８クローンがｔＲＮＡであること、１５８クローンがｒＲＮＡであること、１８１クローンがｎｃＲＮＡであること、３クローンがアンチセンスＲＮＡであること、２４５クローンがそれ以外のｎｃＲＮＡであることが判明し、残りの３１６５クローンは未知のスモールＲＮＡであることが判明した。
（６）次に、これらの中から、発現調節に関与している可能性が高い新規なスモールＲＮＡとして、前述の未知の３１６５クローンのスモールＲＮＡと、１８１クローンのｎｃＲＮＡと、２４５クローンのそれ以外のｎｃＲＮＡの合計３５９１クローンを選択した。
（７）上記の（６）で選択した３５９１クローンについて、それらの前駆体における二次構造の推定を行った。具体的には、現状で、世界最高の予測精度を有するCentroidFold（Bioinformatics. 2009 June 15; 25(12): i330-i338.）というソフトウェアを用いて、これらの各スモールＲＮＡの二次構造を解析し、前駆体がヘアピン構造を取るであろうクローンを選択した。ヘアピン構造を選択したのは、遺伝子の発現調節に関与することが知られるマイクロＲＮＡが、その生成過程において通常ヘアピン構造を取ることが知られているからである。二次構造解析の結果、３１６５クローンのスモールＲＮＡから、ヘアピン構造を取るであろう１２６クローンを選択し、１８１クローンのｎｃＲＮＡ及び２４５クローンのそれ以外のｎｃＲＮＡの中から、ヘアピン構造を取るであろう３１クローンを選択した。選択した合計１５７クローンについて、喉頭がん組織における平均発現量と乳頭腫組織における平均発現量を比較した。発現量としては、内在性コントロール（ＲＮＵ６Ｂ）にて補正した相対発現量を用いた。その結果、喉頭がん組織において特異的に発現上昇するクローンとして７つのスモールＲＮＡ（chr2_207683032-、chr7_36343030-、chr4_159841311-、chr5_54503922-、chr9_90179002+、chr15_81221854+、chr18_41923331-）を選択し、喉頭がん組織において特異的に発現抑制するクローンとして２つのスモールＲＮＡ（chr4_56991616-、chr4_30588363+）を選択した。上記の（１）〜（７）のフィルタリング処理（以下、「フィルタリング処理Ａ」とも表示する。）を通過したこれらの合計９クローンの新規スモールＲＮＡは、喉頭がん組織において特異的に発現上昇又は抑制されており、かつ、ヘアピン構造を取る可能性が特に高いため、喉頭がんの診断マーカーとして用いうる新規マイクロＲＮＡである可能性が特に高い。
（１）解析結果のデータから、ＬＩＮＥ（Long interspersed nuclear element）、ＳＩＮＥ（Short interspersed nuclear element）(Alu配列等)、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、及び、シークエンスの人工物に相当する配列データを除去した。
（２）次いで、Sanger miRBase 13を利用して、既知のヒトマイクロＲＮＡに相当する配列データを除去した。
（３）次いで、残った配列データについて、Human Mar. 2006 (hg18) assemblyを用いて、ゲノムとのマッチングを調べて、マッチしない配列データを除去した。
（４）次いで、Tag counts（スモールＲＮＡの発現量に相当）の頻度に応じて、スモールＲＮＡのゲノム遺伝子座を図示した。Tag countsが１００以上のものを選択したところ、４５５６クローンのスモールＲＮＡが見出された。
（５）次いで、fRNAdbというノンコーディングＲＮＡの配列データベース（http://www.ncrna.org/frnadb/sitemap）を用いて、４５５６クローンのスモールＲＮＡを、既知のＲＮＡと照合した。その結果、４５５６クローンのうち、２０８クローンがＳＲＰであること、３２クローンがｓｎＲＮＡであること、１６６クローンがｓｎｏＲＮＡであること、３９８クローンがｔＲＮＡであること、１５８クローンがｒＲＮＡであること、１８１クローンがｎｃＲＮＡであること、３クローンがアンチセンスＲＮＡであること、２４５クローンがそれ以外のｎｃＲＮＡであることが判明し、残りの３１６５クローンは未知のスモールＲＮＡであることが判明した。
（６）次に、これらの中から、発現調節に関与している可能性が高い新規なスモールＲＮＡとして、前述の未知の３１６５クローンのスモールＲＮＡと、１８１クローンのｎｃＲＮＡと、２４５クローンのそれ以外のｎｃＲＮＡの合計３５９１クローンを選択した。
（７）上記の（６）で選択した３５９１クローンについて、それらの前駆体における二次構造の推定を行った。具体的には、現状で、世界最高の予測精度を有するCentroidFold（Bioinformatics. 2009 June 15; 25(12): i330-i338.）というソフトウェアを用いて、これらの各スモールＲＮＡの二次構造を解析し、前駆体がヘアピン構造を取るであろうクローンを選択した。ヘアピン構造を選択したのは、遺伝子の発現調節に関与することが知られるマイクロＲＮＡが、その生成過程において通常ヘアピン構造を取ることが知られているからである。二次構造解析の結果、３１６５クローンのスモールＲＮＡから、ヘアピン構造を取るであろう１２６クローンを選択し、１８１クローンのｎｃＲＮＡ及び２４５クローンのそれ以外のｎｃＲＮＡの中から、ヘアピン構造を取るであろう３１クローンを選択した。選択した合計１５７クローンについて、喉頭がん組織における平均発現量と乳頭腫組織における平均発現量を比較した。発現量としては、内在性コントロール（ＲＮＵ６Ｂ）にて補正した相対発現量を用いた。その結果、喉頭がん組織において特異的に発現上昇するクローンとして７つのスモールＲＮＡ（chr2_207683032-、chr7_36343030-、chr4_159841311-、chr5_54503922-、chr9_90179002+、chr15_81221854+、chr18_41923331-）を選択し、喉頭がん組織において特異的に発現抑制するクローンとして２つのスモールＲＮＡ（chr4_56991616-、chr4_30588363+）を選択した。上記の（１）〜（７）のフィルタリング処理（以下、「フィルタリング処理Ａ」とも表示する。）を通過したこれらの合計９クローンの新規スモールＲＮＡは、喉頭がん組織において特異的に発現上昇又は抑制されており、かつ、ヘアピン構造を取る可能性が特に高いため、喉頭がんの診断マーカーとして用いうる新規マイクロＲＮＡである可能性が特に高い。
また、ＳＯＬｉＤ（登録商標）システムによる解析結果の中から、がんにおける異常発現の程度が特に顕著な新規スモールＲＮＡの解析結果を取り出すために、上記のフィルタリング処理Ａとは別の以下のようなフィルタリング処理を行った。
（ｉ）解析の生データにおいて一定の発現量（タグ数１００）未満のものを除去したところ、４９１４クローンが残った。
（ii）４９１４クローンの発現量を内在性コントロール（ＲＮＵ６Ｂ）にて補正した相対発現量について、喉頭がん（Ｔ４１６、Ｔ５０６）と、喉頭乳頭腫（Ｔ４２１、Ｔ４８４、Ｔ５０２）のそれぞれについて、平均値、最大値、最小値を算出した。
（iii）次に、喉頭がん、喉頭乳頭腫のそれぞれの最大値、最小値を並べたときに、「喉頭がんの最大値＞喉頭がんの最小値＞喉頭乳頭腫の最大値＞喉頭乳頭腫の最小値」、又は、「喉頭乳頭腫の最大値＞喉頭乳頭腫の最小値＞喉頭がんの最大値＞喉頭がんの最小値」となるように、（喉頭がんの最大値＞喉頭乳頭腫の最小値）かつ（喉頭がんの最小値＞喉頭乳頭腫の最大値）、又は、（喉頭乳頭腫の最大値＞喉頭がんの最小値）かつ（喉頭乳頭腫の最小値＞喉頭がんの最大値）となるクローンを選択した。
（iv）次に、選択したクローンについて、（喉頭がんの平均値／喉頭乳頭腫の平均値）の値を算出し、その算出値の小さい順に並べ替えた。
その結果を以下の表２に示す。
（ｉ）解析の生データにおいて一定の発現量（タグ数１００）未満のものを除去したところ、４９１４クローンが残った。
（ii）４９１４クローンの発現量を内在性コントロール（ＲＮＵ６Ｂ）にて補正した相対発現量について、喉頭がん（Ｔ４１６、Ｔ５０６）と、喉頭乳頭腫（Ｔ４２１、Ｔ４８４、Ｔ５０２）のそれぞれについて、平均値、最大値、最小値を算出した。
（iii）次に、喉頭がん、喉頭乳頭腫のそれぞれの最大値、最小値を並べたときに、「喉頭がんの最大値＞喉頭がんの最小値＞喉頭乳頭腫の最大値＞喉頭乳頭腫の最小値」、又は、「喉頭乳頭腫の最大値＞喉頭乳頭腫の最小値＞喉頭がんの最大値＞喉頭がんの最小値」となるように、（喉頭がんの最大値＞喉頭乳頭腫の最小値）かつ（喉頭がんの最小値＞喉頭乳頭腫の最大値）、又は、（喉頭乳頭腫の最大値＞喉頭がんの最小値）かつ（喉頭乳頭腫の最小値＞喉頭がんの最大値）となるクローンを選択した。
（iv）次に、選択したクローンについて、（喉頭がんの平均値／喉頭乳頭腫の平均値）の値を算出し、その算出値の小さい順に並べ替えた。
その結果を以下の表２に示す。
（v）喉頭乳頭腫の平均値と比較して、喉頭がんの平均値が１０倍以上低下しているもの
８１クローン、及び、１０倍以上向上している７７クローンを選択した。
８１クローン、及び、１０倍以上向上している７７クローンを選択した。
この７７クローンとして、chr10_20112541+、chr13_31633612+、chr21_22980685-、chr12_76362038-、chr5_40434928-、chr18_4062216+、chr7_3809680-、chr20_35192920+、chr5_100470010+、chrX_123771048+、chr4_116312290-、chr1_156317610+、chr5_63701264-、chr3_73146433+、chr16_67383847-、chr21_42904480-、chr1_19721746-、chr12_129789723-、chr2_217084552-、chrX_8751220-、chr8_12727029-、chr19_23230662+、chr3_111130631+、chr2_101579062+、chr20_50197765+、chr3_194722220+、chr1_36224681+、chr13_19205704+、chr14_101596693+、chr15_67507851+、chr16_67565867+、chr18_66266580+、chr3_72191016+、chr6_28718144+、chr7_36343030+、chr7_73459867+、chr8_101124981+、chr4_61605850+、chr19_57796219-、chr9_80531106+、chr1_31069387-、chr14_95988605+、chr17_77533020+、chr6_162162960+、chr7_68077544+、chrX_68077544+、chr19_21821648+、chr13_101895663+、chr12_109426460+、chr2_122088345+、chr17_45622764-、chr5_12903733-、chr14_105016753+、chr17_56759632+、chr7_158573832-、chr18_56821334-、chr14_35974023-、chr20_55147622-、chr17_44935494-、chr2_96517928-、chr5_150592162-、chr12_80798194+、chr14_44686123+、chr6_100553953-、chr13_58552205-、chr12_56726499-、chr1_26315983+、chr3_102802629-、chr2_88095951+、chr1_243042506+、chr18_17499093+、chr20_29665815+、chr3_152747438+、chr4_108412614+、chr6_46898430+、chr6_86176534+、chr20_5593536+を選択した。なお、この７７クローンのうち、chr21_42904480-、chr12_129789723-、chr2_217084552-、chrX_8751220-、chr20_50197765+、chr3_194722220+、chr17_77533020+、chr6_162162960+、chr7_68077544+、chrX_68077544+、chr19_21821648+、chr12_109426460+、chr2_122088345+、chr20_55147622-、chr1_243042506+、chr18_17499093+、chr20_29665815+、chr3_152747438+、chr4_108412614+、chr6_46898430+、chr6_86176534+の２１クローンは、最初のフィルタリング処理により残ったクローンと重複しているので、またchr14_101596693+、chr15_67507851+、chr16_67565867+、chr18_66266580+、chr3_72191016+、chr6_28718144+、chr7_36343030+、chr7_73459867+、chr8_101124981+の９クローンはフィルタリング処理Ａの（７）で選択したクローンと重複しているので、これらこのクローンを外し、４７クローンを選択した。
また、前述の８１クローンとして、chr4_80722625-、chr18_52159944+、chr2_116291799+、chr12_43586396+、chrY_13903890+、chr11_112899263-、chr7_125532232-、chr8_3706415+、chr10_97280927-、chr14_101141137-、chr1_59372670-、chr9_126381650-、chr6_32480269-、chr3_51938784+、chr13_58381244+、chr11_64299436-、chr2_135492728+、chr9_24002277+、chr3_45733243+、chr10_17892682+、chr10_18139672+、chr7_155835128+、chr14_79906621-、chr6_113313108-、chr1_25272290+、chr18_32960249-、chr6_30433838+、chr16_81421137-、chrX_128924858-、chr16_69993560+、chr16_47548696+、chr5_147459156-、chr5_81565927-、chr17_64785401-、chr7_1677442+、chr5_154945381+、chr6_165090018+、chr3_48962778+、chr3_48962296+、chr12_114668994+、chr12_65009031+、chr5_132978063+、chr11_86193869+、chr16_15746666-、chr16_53649542+、chr1_45480552-、chr12_42928769+、chrX_47388240-、chr11_37781434-、chr10_80302437-、chr19_14839510-、chr4_82522273+、chr11_30355663+、chr2_171442461-、chr7_15682704-、chr10_87326332-、chr15_91176756-、chr11_49328346-、chr15_69806720-、chr3_38725780+、chr1_239235411+、chr9_132742582+、chr2_147679179-、chr1_231289111-、chr11_26311952-、chr14_36146417+、chr6_14585267-、chr16_53731358+、chr19_6925359+、chr8_133963297+、chrX_112049432-、chr15_32166220-、chr13_72312801+、chr6_158836211+、chr3_107317523-、chr6_75848122+、chr2_179055758+、chr1_202037610+、chrY_8804566+、chrX_139050490+、chr18_64836428-を選択した。なお、この８１クローンのうち、chr10_18139672+、chr3_48962296+の２クローンは、最初のフィルタリング処理により残ったクローンと重複しているので、これらのクローンを外し、７９クローンを選択した。
以上のように、喉頭乳頭腫と比較して喉頭がんにおいて１０倍以上変化しているこれらの１２６クローン（４７＋７９）を選択した。
上記の（ｉ）〜（v）のフィルタリング処理（以下、「フィルタリング処理Ｂ」とも表示する。）を通過した１２６クローンのスモールＲＮＡは、喉頭がん組織において特異的に発現上昇又は抑制されているため、喉頭がんの診断マーカーとして用いうる新規スモールＲＮＡである可能性が特に高い。
以上のことから、前述のフィルタリング処理Ａを通過した９クローンの新規スモールＲＮＡと、前述のフィルタリング処理Ｂを通過した１２６クローンのスモールＲＮＡの合計１３５クローン（９＋１２６）のスモールＲＮＡは、喉頭がんの診断マーカーとして用いうる新規スモールＲＮＡである可能性が特に高い。
［リアルタイムＰＣＲによる発現解析］
実施例４でフィルタリングしたスモールＲＮＡが喉頭がんの診断マーカーとして実際に用い得ることを、リアルタイムＰＣＲによって検証した。リアルタイムＰＣＲは以下の方法で行った。実施例１の喉頭がん患者とは別の喉頭がん患者３名に、喉頭癌組織と、それに隣接する喉頭非癌組織をそれぞれ提供してもらった。３名の喉頭がん患者の臨床進行期はそれぞれ１ａ、１ｂ、２であった。臨床進行期が１ａの患者の喉頭癌組織をＴ５４１と命名し、その喉頭非癌組織をＴ５４２と命名し、臨床進行期が１ｂの患者の喉頭癌組織をＴ４７８と命名し、その喉頭非癌組織をＴ４７９と命名し、臨床進行期が２の患者の喉頭癌組織をＴ５２８と命名し、その喉頭非癌組織をＴ５２９と命名した。各組織検体からmirVana（登録商標）PARIS（登録商標）Kit (Ambion社製)を用いて、スモールＲＮＡ画分を含むトータルＲＮＡを抽出し、Nanodrop（登録商標）の吸光光度度計を用いた吸光度測定によってＲＮＡ濃度を測定した。
実施例４でフィルタリングしたスモールＲＮＡが喉頭がんの診断マーカーとして実際に用い得ることを、リアルタイムＰＣＲによって検証した。リアルタイムＰＣＲは以下の方法で行った。実施例１の喉頭がん患者とは別の喉頭がん患者３名に、喉頭癌組織と、それに隣接する喉頭非癌組織をそれぞれ提供してもらった。３名の喉頭がん患者の臨床進行期はそれぞれ１ａ、１ｂ、２であった。臨床進行期が１ａの患者の喉頭癌組織をＴ５４１と命名し、その喉頭非癌組織をＴ５４２と命名し、臨床進行期が１ｂの患者の喉頭癌組織をＴ４７８と命名し、その喉頭非癌組織をＴ４７９と命名し、臨床進行期が２の患者の喉頭癌組織をＴ５２８と命名し、その喉頭非癌組織をＴ５２９と命名した。各組織検体からmirVana（登録商標）PARIS（登録商標）Kit (Ambion社製)を用いて、スモールＲＮＡ画分を含むトータルＲＮＡを抽出し、Nanodrop（登録商標）の吸光光度度計を用いた吸光度測定によってＲＮＡ濃度を測定した。
次いで、Custom TaqMan（登録商標）Small RNA Assays（Applied Biosystems社製）及びTaqMan（登録商標）MicroRNA Assays（内部標準RNU6B）（Applied Biosystems社製）によって、ＲＮＡ発現の定量解析を行った。具体的には、以下のような方法で行った。TaqMan（登録商標）MicroRNA RT Kit（Applied Biosystems社製）を用い、以下の組成からなるRT reaction mix７μＬと、２ｎｇ／μＬに調整したトータルＲＮＡ５μＬ（計１０μｇ）とを氷上で混合した。
RT reaction mixの組成
DEPC-treated Water ４．１６２μＬ, 10×Reverse Transcription Buffer １．５μＬ, １００ｍＭ dNTPs ０．１５μＬ, RNase Inhibitor ０．１８８μＬ, MultiScribe Reverse Transcriptase １μＬ。
DEPC-treated Water ４．１６２μＬ, 10×Reverse Transcription Buffer １．５μＬ, １００ｍＭ dNTPs ０．１５μＬ, RNase Inhibitor ０．１８８μＬ, MultiScribe Reverse Transcriptase １μＬ。
さらにRT primer ３μＬを加え合計１５μＬの反応液とし、１６℃３０分間、４２℃３０分間、８５℃５分間からなる温度サイクルにてｃＤＮＡ合成を行った。ｃＤＮＡ合成後のＲＴ産物と、TaqMan（登録商標）Universal PCR Master Mix, No UNG（Applied Biosystems社製）とを用い、以下の組成からなるReal Time PCR反応液を氷上で調製した。
Real Time PCR反応液の組成
double distilled water ７．６７μＬ, 2×TaqMan（登録商標）Universal PCR Master Mix １０μＬ, 20×TaqMan（登録商標）MicroRNA Assay Mix １μＬ, ＲＴ産物 １．３３μＬ。
double distilled water ７．６７μＬ, 2×TaqMan（登録商標）Universal PCR Master Mix １０μＬ, 20×TaqMan（登録商標）MicroRNA Assay Mix １μＬ, ＲＴ産物 １．３３μＬ。
Real Time PCR反応液２０μＬをStepOne Plus（Applied Biosystems）にセットし、以下の温度サイクルでリアルタイムＰＣＲ解析を行った。
９５℃１０分間、（９５℃１５秒間、６０℃１分間）×５０サイクル
各スモールＲＮＡターゲットについて得られたＣＴ値、及び、内部標準としてのRNU6Bについて得られたＣＴ値を元に、ΔΔＣＴ法によって定量解析を行った。配列番号１のスモールＲＮＡをターゲットとした結果を図２に示し、配列番号５２のスモールＲＮＡをターゲットとした結果を図３に示し、配列番号３６のスモールＲＮＡをターゲットとした結果を図４に示し、配列番号２のスモールＲＮＡをターゲットとした結果を図５に示す。図２〜５から分かるように、いずれの患者においても、採取した喉頭癌組織とそれに隣接する喉頭非癌組織（コントロール）との検体ペアにおいて、喉頭癌組織での各スモールＲＮＡの発現の上昇が確認された。
９５℃１０分間、（９５℃１５秒間、６０℃１分間）×５０サイクル
各スモールＲＮＡターゲットについて得られたＣＴ値、及び、内部標準としてのRNU6Bについて得られたＣＴ値を元に、ΔΔＣＴ法によって定量解析を行った。配列番号１のスモールＲＮＡをターゲットとした結果を図２に示し、配列番号５２のスモールＲＮＡをターゲットとした結果を図３に示し、配列番号３６のスモールＲＮＡをターゲットとした結果を図４に示し、配列番号２のスモールＲＮＡをターゲットとした結果を図５に示す。図２〜５から分かるように、いずれの患者においても、採取した喉頭癌組織とそれに隣接する喉頭非癌組織（コントロール）との検体ペアにおいて、喉頭癌組織での各スモールＲＮＡの発現の上昇が確認された。
本発明は、腫瘍（特に頭頸部腫瘍）の診断や、腫瘍（特に頭頸部腫瘍）の治療薬のスクリーニングの分野において特に有用に利用することができる。
Claims (17)
- 配列番号１〜１３５のいずれかに示されるポリリボヌクレオチド又はその変異体からなるスモールＲＮＡからなる群から選ばれる１又は２種以上のスモールＲＮＡを腫瘍のバイオマーカーとして使用する方法。
- 腫瘍が頭頸部腫瘍であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
- 頭頸部腫瘍が頭頸部がんであることを特徴とする請求項２に記載の方法。
- 以下の工程を備えたことを特徴とする腫瘍の判定方法：
（Ａ）検体組織中又は被検体の血液中のＲＮＡを抽出する工程：
（Ｂ）抽出したＲＮＡ中の、配列番号１〜１３５のいずれかに示されるポリリボヌクレオチド又はその変異体からなるスモールＲＮＡからなる群から選ばれる１又は２種以上のスモールＲＮＡの発現量を測定する工程：
（Ｃ）コントロールとしての、検体組織と同種の非がん組織又は被検体と同種の非がん被検体の血液におけるスモールＲＮＡの発現量と比較・評価する工程： - 抽出したＲＮＡ中の、配列番号１〜７、１０〜５６のいずれかに示されるポリリボヌクレオチド又はその変異体からなるスモールＲＮＡからなる群から選ばれる１又は２種以上のスモールＲＮＡの発現量が、コントロールと比較して増加している場合に腫瘍であると評価することを特徴とする請求項４に記載の腫瘍の判定方法。
- 抽出したＲＮＡ中の、配列番号８〜９、５７〜１３５のいずれかに示されるポリリボヌクレオチド又はその変異体からなるスモールＲＮＡからなる群から選ばれる１又は２種以上のスモールＲＮＡの発現量が、コントロールと比較して低下している場合に腫瘍であると評価することを特徴とする請求項４に記載の腫瘍の判定方法。
- 腫瘍が頭頸部腫瘍であり、検体組織が頭頸部の検体組織であることを特徴とする請求項４〜６のいずれかに記載の腫瘍の判定方法。
- 配列番号１〜１３５のいずれかに示されるポリリボヌクレオチド又はその変異体からなるスモールＲＮＡからなる群から選ばれるスモールＲＮＡの発現量を測定することができる、前記スモールＲＮＡの配列に相補的な核酸配列からなるポリヌクレオチド又はその一部を備えたマイクロアレイを腫瘍の判定に使用する方法。
- 腫瘍が頭頸部腫瘍であることを特徴とする請求項８に記載の方法。
- 配列番号１〜１３５のいずれかに示されるポリリボヌクレオチド又はその変異体からなるスモールＲＮＡからなる群から選ばれるスモールＲＮＡの配列を増幅し得るプライマーセットと、前記スモールＲＮＡの配列に相補的な核酸配列からなるポリヌクレオチド又はその一部を含む蛍光プローブとを、腫瘍の判定に使用する方法。
- 腫瘍が頭頸部腫瘍であることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
- 配列番号１〜１３５のいずれかに示されるポリリボヌクレオチド又はその変異体からなるスモールＲＮＡからなる群から選ばれるスモールＲＮＡの発現量を測定することができる、前記スモールＲＮＡの配列に相補的な核酸配列からなるポリヌクレオチド又はその一部を備えたマイクロアレイを含んでいることを特徴とする腫瘍の判定キット。
- 腫瘍が頭頸部腫瘍であることを特徴とする請求項１２に記載の判定キット。
- 配列番号１〜１３５のいずれかに示されるポリリボヌクレオチド又はその変異体からなるスモールＲＮＡからなる群から選ばれるスモールＲＮＡの配列を増幅し得るプライマーセットと、前記スモールＲＮＡの配列に相補的な核酸配列からなるポリヌクレオチド又はその一部を含む蛍光プローブとを備えたことを特徴とする腫瘍の判定キット。
- 腫瘍が頭頸部腫瘍であることを特徴とする請求項１４に記載の判定キット。
- 以下の工程を含むことを特徴とする腫瘍治療薬のスクリーニング方法：
（Ａ）腫瘍に罹患した非ヒト動物に被検物質を投与する工程：
（Ｂ）前記非ヒト動物における腫瘍組織中又は血液中の、配列番号１〜１３５のいずれかに示されるポリリボヌクレオチド又はその変異体からなるスモールＲＮＡからなる群から選ばれる１又は２種以上のスモールＲＮＡの発現量を測定する工程：
（Ｃ）コントロールとしての、被検物質を未投与の場合におけるスモールＲＮＡの発現量と比較・評価する工程： - 腫瘍が頭頸部腫瘍であることを特徴とする請求項１６に記載のスクリーニング方法。
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| JP2011111206A JP2012000107A (ja) | 2010-05-18 | 2011-05-18 | バイオマーカーとしての新規スモールｒｎａを用いた腫瘍の診断 |
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| JP2010113856 | 2010-05-18 | ||
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2015522277A (ja) * | 2012-06-28 | 2015-08-06 | カルドラ ヘルス リミテッドＣａｌｄｅｒａ Ｈｅａｌｔｈ Ｌｔｄ | 前立腺癌の診断方法と診断用物質 |
-
2011
- 2011-05-18 JP JP2011111206A patent/JP2012000107A/ja not_active Withdrawn
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