JP2002082026A - 標本作製法 - Google Patents
標本作製法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】様々な物質の影響により引き起こされた全身諸
臓器又は組織（硬組織を除く）の病変の解析が可能とな
る全身諸臓器又は組織（硬組織を除く）の形態学的、免
疫組織化学的ならびに酵素組織化学的解析に有用な標本
作製法の確立を目的とする。 【解決手段】本発明は、以下の工程： １）目的とする臓器又は組織をPLP液で固定する； ２）AMeX法によるパラフィン包埋を行う、 を含む全身諸臓器又は組織（硬組織を除く）の標本作製
法、ならびに上記方法で得られた全身諸臓器又は組織
（硬組織を除く）の標本に関する。さらに本発明は、以
下の工程： １）動物をPLP液で全身灌流して固定する； ２）目的とする臓器又は組織を動物から摘出し、AMeX法
によりパラフィン包埋を行う、 を含む動物の全身諸臓器又は組織の標本作製法、ならび
に上記方法で得られた全身諸臓器又は組織の標本に関す
る。
臓器又は組織（硬組織を除く）の病変の解析が可能とな
る全身諸臓器又は組織（硬組織を除く）の形態学的、免
疫組織化学的ならびに酵素組織化学的解析に有用な標本
作製法の確立を目的とする。 【解決手段】本発明は、以下の工程： １）目的とする臓器又は組織をPLP液で固定する； ２）AMeX法によるパラフィン包埋を行う、 を含む全身諸臓器又は組織（硬組織を除く）の標本作製
法、ならびに上記方法で得られた全身諸臓器又は組織
（硬組織を除く）の標本に関する。さらに本発明は、以
下の工程： １）動物をPLP液で全身灌流して固定する； ２）目的とする臓器又は組織を動物から摘出し、AMeX法
によりパラフィン包埋を行う、 を含む動物の全身諸臓器又は組織の標本作製法、ならび
に上記方法で得られた全身諸臓器又は組織の標本に関す
る。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、免疫組織化学的お
よび酵素組織化学的解析に有用な全身諸臓器又は組織の
標本作製法に関する。さらに詳しくは、本発明は、PLP
液による固定とAMeX法によるパラフィン包埋法を併用し
た全身諸臓器又は組織の標本作製法に関する。さらに
は、PLP液による全身灌流固定とAMeX法によるパラフィ
ン包埋法を併用した動物の全身諸臓器又は組織の標本の
作製法に関する。
よび酵素組織化学的解析に有用な全身諸臓器又は組織の
標本作製法に関する。さらに詳しくは、本発明は、PLP
液による固定とAMeX法によるパラフィン包埋法を併用し
た全身諸臓器又は組織の標本作製法に関する。さらに
は、PLP液による全身灌流固定とAMeX法によるパラフィ
ン包埋法を併用した動物の全身諸臓器又は組織の標本の
作製法に関する。
【０００２】
【従来の技術】免疫組織化学的染色は、病理学的研究に
広く用いられている染色法であり、組織又は細胞に存在
する特定の抗原を標識抗体を用いて可視化し、光学顕微
鏡あるいは電子顕微鏡下で観察するために考案された染
色法である。通常のホルマリン固定パラフィン切片で
は、その標本作製過程において、抗原の免疫反応性が失
われることがしばしば経験される。そのため、免疫組織
化学的染色には凍結切片がよく用いられている。しかし
ながら、例えば肺組織などでは他の組織に比べ、その解
剖学的特徴から凍結切片の作製が技術的に難しい。すな
わち、肺組織は肺胞腔を有するため実質細胞が疎に分布
しており、そのために凍結切片の作製が困難となる。さ
らに、凍結切片はパラフィン切片に比べ組織形態の保持
が劣るため、組織学的および細胞学的な観察から得られ
る情報量が乏しくなるのが現状である。従って、免疫組
織化学的および酵素組織化学的解析に有用な肺組織の標
本作製方法が求められてきた。さらには、肺組織以外の
全身諸臓器又は組織、特に免疫系の臓器や組織について
も、免疫組織化学的および酵素組織化学的解析に有用な
標本作製法が求められていた。
広く用いられている染色法であり、組織又は細胞に存在
する特定の抗原を標識抗体を用いて可視化し、光学顕微
鏡あるいは電子顕微鏡下で観察するために考案された染
色法である。通常のホルマリン固定パラフィン切片で
は、その標本作製過程において、抗原の免疫反応性が失
われることがしばしば経験される。そのため、免疫組織
化学的染色には凍結切片がよく用いられている。しかし
ながら、例えば肺組織などでは他の組織に比べ、その解
剖学的特徴から凍結切片の作製が技術的に難しい。すな
わち、肺組織は肺胞腔を有するため実質細胞が疎に分布
しており、そのために凍結切片の作製が困難となる。さ
らに、凍結切片はパラフィン切片に比べ組織形態の保持
が劣るため、組織学的および細胞学的な観察から得られ
る情報量が乏しくなるのが現状である。従って、免疫組
織化学的および酵素組織化学的解析に有用な肺組織の標
本作製方法が求められてきた。さらには、肺組織以外の
全身諸臓器又は組織、特に免疫系の臓器や組織について
も、免疫組織化学的および酵素組織化学的解析に有用な
標本作製法が求められていた。
【０００３】近年、冷アセトン固定、アセトンによる脱
水、安息香酸メチルとキシレンによる透徹を一連の操作
とする、新規のパラフィン包埋法であるAMeX法（aceton
e, methyl benzoate and xylene-method: Sato Y et a
l., Am J Pathol 1986; 125:431-35; Sato Y et a., Am
J Pathol 1992; 140: 775-79)が、免疫組織化学的染色
に利用されつつある。AMeX法は、通常のパラフィン切片
では検出することが困難な抗原も検出することが可能で
あると報告されている（前出：Sato Y et al.,Am J Pat
hol 1986; 125: 431-35）。病理学的解析においては、
組織中に存在する様々な内因性酵素を検出する酵素組織
化学的染色も有用な方法である。AMeX法ではアルカリホ
スファターゼ(ALP)、酸ホスファターゼおよび種々のエ
ステラーゼなどの酵素組織化学的染色が可能であるとの
報告もなされている（前出：SatoY et al., Am J Patho
l 1986; 125: 431-35）。
水、安息香酸メチルとキシレンによる透徹を一連の操作
とする、新規のパラフィン包埋法であるAMeX法（aceton
e, methyl benzoate and xylene-method: Sato Y et a
l., Am J Pathol 1986; 125:431-35; Sato Y et a., Am
J Pathol 1992; 140: 775-79)が、免疫組織化学的染色
に利用されつつある。AMeX法は、通常のパラフィン切片
では検出することが困難な抗原も検出することが可能で
あると報告されている（前出：Sato Y et al.,Am J Pat
hol 1986; 125: 431-35）。病理学的解析においては、
組織中に存在する様々な内因性酵素を検出する酵素組織
化学的染色も有用な方法である。AMeX法ではアルカリホ
スファターゼ(ALP)、酸ホスファターゼおよび種々のエ
ステラーゼなどの酵素組織化学的染色が可能であるとの
報告もなされている（前出：SatoY et al., Am J Patho
l 1986; 125: 431-35）。
【０００４】一方、肺の病理組織学的変化を解析する場
合、詳細な形態観察を可能とするための注入固定が推奨
されており、採取した肺は通常、気管から１０％あるい
は２０％（中性緩衝）ホルマリン固定液を注入する。PL
P（periodate-lysine-paraformaldehyde）固定液は免疫
反応性に影響を与えることなく組織形態を保持するため
（McLean IW et al., J Histochem Cytochem 1974; 22:
1077-83; Sisson SPet al., J Histochem Cytochem 19
80; 28: 441-52; Rantala I et al., J Histochem Cyto
chem 1982; 30: 932-37）、免疫組織化学的染色を目的
に凍結切片を作製する場合などに用いられる固定液であ
る。
合、詳細な形態観察を可能とするための注入固定が推奨
されており、採取した肺は通常、気管から１０％あるい
は２０％（中性緩衝）ホルマリン固定液を注入する。PL
P（periodate-lysine-paraformaldehyde）固定液は免疫
反応性に影響を与えることなく組織形態を保持するため
（McLean IW et al., J Histochem Cytochem 1974; 22:
1077-83; Sisson SPet al., J Histochem Cytochem 19
80; 28: 441-52; Rantala I et al., J Histochem Cyto
chem 1982; 30: 932-37）、免疫組織化学的染色を目的
に凍結切片を作製する場合などに用いられる固定液であ
る。
【０００５】本発明者らは、PLP固定液による固定（McL
ean IW et al., J Histochem Cytochem 1974; 22: 1077
-83）、EDTA-glycerol液による低温脱灰（Mori S et a
l., JHistochem Cytochem 1988; 36: 111-14.）およびA
MeX法によるパラフィン包埋法を組み合わせた骨組織の
パラフィン切片標本において、破骨細胞のマーカーとな
る酒石酸抵抗性酸ホスファターゼを検出することができ
た（Suzuki M et al.,Histol Histopathol 1999; 46: 6
79-86; Suzuki M et al., Exp Anim 1998; 47: 211-1
4）。従って、PLP固定液による固定操作は、AMeX法で作
製したパラフィン切片上の免疫反応性や酵素活性に影響
を与えることなく、骨組織の標本作製に用いることがで
きたが、この方法を骨組織以外の全身諸臓器又は組織の
標本作製に使用できるかどうかは全く不明であった。
ean IW et al., J Histochem Cytochem 1974; 22: 1077
-83）、EDTA-glycerol液による低温脱灰（Mori S et a
l., JHistochem Cytochem 1988; 36: 111-14.）およびA
MeX法によるパラフィン包埋法を組み合わせた骨組織の
パラフィン切片標本において、破骨細胞のマーカーとな
る酒石酸抵抗性酸ホスファターゼを検出することができ
た（Suzuki M et al.,Histol Histopathol 1999; 46: 6
79-86; Suzuki M et al., Exp Anim 1998; 47: 211-1
4）。従って、PLP固定液による固定操作は、AMeX法で作
製したパラフィン切片上の免疫反応性や酵素活性に影響
を与えることなく、骨組織の標本作製に用いることがで
きたが、この方法を骨組織以外の全身諸臓器又は組織の
標本作製に使用できるかどうかは全く不明であった。
【０００６】
【発明が解決すべき課題】本発明は、様々な物質、原因
の影響により引き起こされた全身諸臓器又は組織の病変
の解析が可能となる全身諸臓器又は組織の形態学的、免
疫組織化学的ならびに酵素組織化学的解析に有用な標本
作製法の確立を目的とする。
の影響により引き起こされた全身諸臓器又は組織の病変
の解析が可能となる全身諸臓器又は組織の形態学的、免
疫組織化学的ならびに酵素組織化学的解析に有用な標本
作製法の確立を目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的
を達成するために鋭意研究した結果、PLP液による固定
とAMeX法によるパラフィン包埋法を併用することによっ
て、骨組織以外の全身諸臓器又は組織についても種々の
研究に使用可能な標本を作製できることを発見した。
を達成するために鋭意研究した結果、PLP液による固定
とAMeX法によるパラフィン包埋法を併用することによっ
て、骨組織以外の全身諸臓器又は組織についても種々の
研究に使用可能な標本を作製できることを発見した。
【０００８】すなわち、本発明は、以下の工程を含む全
身諸臓器又は組織（硬組織を除く）の標本作製法： １）目的とする臓器又は組織をPLP液で固定する； ２）AMeX法によるパラフィン包埋を行うを提供する。
身諸臓器又は組織（硬組織を除く）の標本作製法： １）目的とする臓器又は組織をPLP液で固定する； ２）AMeX法によるパラフィン包埋を行うを提供する。
【０００９】本発明の標本作製法が使用できる動物は、
その種類を問わず、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳類など
幅広く使用でき、特に哺乳類が好ましい。本発明におい
て、「全身諸臓器又は組織（硬組織を除く）」とは、上
記動物の全身に分布するあらゆる臓器又は組織であって
骨組織などの硬組織を除いたものをいう。本発明の方法
に特に適した臓器又は組織は、肺又は肺組織、ならびに
免疫応答に関与する臓器又は組織である。免疫応答に関
与する臓器又は組織には、リンパ節、脾臓、胸腺、骨髄
又はその組織などを含むが、脾臓及び胸腺又はその組織
が特に好ましい。
その種類を問わず、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳類など
幅広く使用でき、特に哺乳類が好ましい。本発明におい
て、「全身諸臓器又は組織（硬組織を除く）」とは、上
記動物の全身に分布するあらゆる臓器又は組織であって
骨組織などの硬組織を除いたものをいう。本発明の方法
に特に適した臓器又は組織は、肺又は肺組織、ならびに
免疫応答に関与する臓器又は組織である。免疫応答に関
与する臓器又は組織には、リンパ節、脾臓、胸腺、骨髄
又はその組織などを含むが、脾臓及び胸腺又はその組織
が特に好ましい。
【００１０】本発明の方法では、動物から摘出した臓器
又は組織をまずPLP固定液で固定する。PLP固定液は、過
ヨウ素酸塩−リジン−パラホルムアルデヒドからなる固
定液をいう。一般的組成は、McLean IW et al., J Hist
ochem Cytochem 1974; 22:1077-83に記載された組成、
すなわち、0.01M NaIO4 - 0.075M リジン - 0.0375M リ
ン酸緩衝液 - 2% パラホルムアルデヒドであるが、パラ
ホルムアルデヒド濃度は抗原性のパラホルムアルデヒド
固定に対する安定性に応じて適宜調節することができ、
一般には１〜６％の範囲で使用する。
又は組織をまずPLP固定液で固定する。PLP固定液は、過
ヨウ素酸塩−リジン−パラホルムアルデヒドからなる固
定液をいう。一般的組成は、McLean IW et al., J Hist
ochem Cytochem 1974; 22:1077-83に記載された組成、
すなわち、0.01M NaIO4 - 0.075M リジン - 0.0375M リ
ン酸緩衝液 - 2% パラホルムアルデヒドであるが、パラ
ホルムアルデヒド濃度は抗原性のパラホルムアルデヒド
固定に対する安定性に応じて適宜調節することができ、
一般には１〜６％の範囲で使用する。
【００１１】本発明におけるPLP固定液による固定は、
目的とする臓器又は組織を２〜５％、好ましくは４％の
パラホルムアルデヒドを含むPLP固定液に、０〜８℃、
好ましくは約４℃の温度で、２〜１８時間、好ましくは
６〜８時間浸漬することにより行うことができる。ま
た、肺、消化管、膀胱、子宮などのように腔があって、
実質細胞が疎に分布している臓器又は組織の標本作製で
は、浸漬による固定に先だって、臓器又は組織にPLP固
定液を注入固定することが好ましい。これによって、肺
組織の場合であれば、細気管支、肺胞管、肺胞嚢などが
適切に拡張した標本を得ることができる。注入固定は、
気管支からPLP固定液を注入することにより行うが、そ
の際１０〜３０ｃｍ水柱圧、好ましくは２０ｃｍ水柱圧
で注入する。また、圧力にこだわらず、細気管支、肺胞
管、肺胞嚢などが適切に拡張するまでシリンジなどを用
いて用手的に注入してもよい。消化管、膀胱、子宮など
については、シリンジなどを用いて用手的に腔が適切に
拡張するように注入する。
目的とする臓器又は組織を２〜５％、好ましくは４％の
パラホルムアルデヒドを含むPLP固定液に、０〜８℃、
好ましくは約４℃の温度で、２〜１８時間、好ましくは
６〜８時間浸漬することにより行うことができる。ま
た、肺、消化管、膀胱、子宮などのように腔があって、
実質細胞が疎に分布している臓器又は組織の標本作製で
は、浸漬による固定に先だって、臓器又は組織にPLP固
定液を注入固定することが好ましい。これによって、肺
組織の場合であれば、細気管支、肺胞管、肺胞嚢などが
適切に拡張した標本を得ることができる。注入固定は、
気管支からPLP固定液を注入することにより行うが、そ
の際１０〜３０ｃｍ水柱圧、好ましくは２０ｃｍ水柱圧
で注入する。また、圧力にこだわらず、細気管支、肺胞
管、肺胞嚢などが適切に拡張するまでシリンジなどを用
いて用手的に注入してもよい。消化管、膀胱、子宮など
については、シリンジなどを用いて用手的に腔が適切に
拡張するように注入する。
【００１２】次いで、臓器又は組織をリン酸緩衝食塩水
などで洗浄する。このとき、観察したい臓器又は組織の
部分を切り出した後、洗浄してもよい。このようにして
調製した臓器又は組織を次にAMeX法でパラフィン包埋を
行う。AMeX法は、冷アセトン固定、アセトンによる脱
水、安息香酸メチルとキシレンによる透徹及びパラフィ
ン包埋を一連の操作とする、新規のパラフィン包埋法で
ある。具体的には、−２５〜８℃、好ましくは−２０〜
６℃のアセトンに２〜２４時間、好ましくは４〜１６時
間浸漬し、次に組織を入れたアセトンを室温に戻す、あ
るいは室温のアセトンに臓器又は組織を移した後、室温
で０．５〜５時間、好ましくは１〜４時間脱水する。次
に、安息香酸メチル中に室温で０．５〜３時間、好まし
くは０．５〜２時間浸漬、キシレン中に室温で０．５〜
３時間、好ましくは０．５〜２時間浸漬して透徹を行
い、その後５５〜６５℃、好ましくは５８〜６２℃のパ
ラフィンに１〜４時間、好ましくは１〜３時間浸透して
包埋する。このようにしてPLP-AMeX法で得られた臓器又
は組織のパラフィンブロックは使用時まで低温で保存す
る。尚、室温でも抗原性、酵素活性が低下しない抗原あ
るいは酵素を染色する場合には室温に保存してもよい。
などで洗浄する。このとき、観察したい臓器又は組織の
部分を切り出した後、洗浄してもよい。このようにして
調製した臓器又は組織を次にAMeX法でパラフィン包埋を
行う。AMeX法は、冷アセトン固定、アセトンによる脱
水、安息香酸メチルとキシレンによる透徹及びパラフィ
ン包埋を一連の操作とする、新規のパラフィン包埋法で
ある。具体的には、−２５〜８℃、好ましくは−２０〜
６℃のアセトンに２〜２４時間、好ましくは４〜１６時
間浸漬し、次に組織を入れたアセトンを室温に戻す、あ
るいは室温のアセトンに臓器又は組織を移した後、室温
で０．５〜５時間、好ましくは１〜４時間脱水する。次
に、安息香酸メチル中に室温で０．５〜３時間、好まし
くは０．５〜２時間浸漬、キシレン中に室温で０．５〜
３時間、好ましくは０．５〜２時間浸漬して透徹を行
い、その後５５〜６５℃、好ましくは５８〜６２℃のパ
ラフィンに１〜４時間、好ましくは１〜３時間浸透して
包埋する。このようにしてPLP-AMeX法で得られた臓器又
は組織のパラフィンブロックは使用時まで低温で保存す
る。尚、室温でも抗原性、酵素活性が低下しない抗原あ
るいは酵素を染色する場合には室温に保存してもよい。
【００１３】使用時には、上記で得られたパラフィンブ
ロックを、ミクロトームなどを用いて薄切切片を作製
し、さらに薄切切片の脱パラフィン及び親水化を行う。
脱パラフィン及び親水化は公知の方法により実施するこ
とができる。例えば、脱パラフィンはキシレン、トルエ
ンにより実施し、また親水化はアルコール、アセトンに
より実施することができる。免疫組織化学染色の場合に
は、抗原性保持の点から、キシレンによる脱パラフィン
とアセトンによる親水化を実施することが好ましい。
ロックを、ミクロトームなどを用いて薄切切片を作製
し、さらに薄切切片の脱パラフィン及び親水化を行う。
脱パラフィン及び親水化は公知の方法により実施するこ
とができる。例えば、脱パラフィンはキシレン、トルエ
ンにより実施し、また親水化はアルコール、アセトンに
より実施することができる。免疫組織化学染色の場合に
は、抗原性保持の点から、キシレンによる脱パラフィン
とアセトンによる親水化を実施することが好ましい。
【００１４】このようにして得られた薄切切片はさらに
必要に応じて組織染色、免疫組織化学的染色又は酵素組
織化学的染色を行って観察に供する。本発明の方法で作
製した標本を組織染色（特殊染色）するときには、通常
のパラフィン包埋切片で可能な染色は何でも使用するこ
とができる（例えば、PAS染色、ギムザ染色、トルイジ
ンブルー染色など）。また、免疫組織化学的染色に適し
た抗体は全て使用可能である（例えば、細胞表面抗原、
細胞骨格、細胞外マトリックス、サイトカイン、接着分
子などに対する各種抗体）。酵素組織化学的染色は、切
片上で可能な染色が使用できる（例えば、ALP、ACP、TR
AP、エステラーゼなどの種々の染色）。
必要に応じて組織染色、免疫組織化学的染色又は酵素組
織化学的染色を行って観察に供する。本発明の方法で作
製した標本を組織染色（特殊染色）するときには、通常
のパラフィン包埋切片で可能な染色は何でも使用するこ
とができる（例えば、PAS染色、ギムザ染色、トルイジ
ンブルー染色など）。また、免疫組織化学的染色に適し
た抗体は全て使用可能である（例えば、細胞表面抗原、
細胞骨格、細胞外マトリックス、サイトカイン、接着分
子などに対する各種抗体）。酵素組織化学的染色は、切
片上で可能な染色が使用できる（例えば、ALP、ACP、TR
AP、エステラーゼなどの種々の染色）。
【００１５】本発明はまた、上記方法により得られる全
身諸臓器又は組織（硬組織を除く）の標本を提供する。
好ましい標本は肺組織標本、脾臓組織標本、及び胸腺組
織標本を含むが、これに限定されない。
身諸臓器又は組織（硬組織を除く）の標本を提供する。
好ましい標本は肺組織標本、脾臓組織標本、及び胸腺組
織標本を含むが、これに限定されない。
【００１６】本発明のPLP-AMeX法にて作製した肺組織切
片をヘマトキシリン-エオジン（HE）染色し形態を観察
したところ、細気管支、肺胞管および肺胞嚢は適切に拡
張しており、通常のホルマリン注入固定パラフィン包埋
した肺とほぼ同様に形態が良好に保持されていた。さら
に、ブレオマイシン（BLM）誘発肺障害モデルでは肺病
変の詳細な病理組織所見の観察が可能であった。これら
のことから、PLP-AMeX切片は凍結切片に比べ形態の保持
が極めてよく、PLP-AMeX法は病理組織学的解析に有用な
方法と考えられた。
片をヘマトキシリン-エオジン（HE）染色し形態を観察
したところ、細気管支、肺胞管および肺胞嚢は適切に拡
張しており、通常のホルマリン注入固定パラフィン包埋
した肺とほぼ同様に形態が良好に保持されていた。さら
に、ブレオマイシン（BLM）誘発肺障害モデルでは肺病
変の詳細な病理組織所見の観察が可能であった。これら
のことから、PLP-AMeX切片は凍結切片に比べ形態の保持
が極めてよく、PLP-AMeX法は病理組織学的解析に有用な
方法と考えられた。
【００１７】PLP-AMeX切片を用いた肺組織の免疫組織化
学的染色では、使用したすべての抗体において良好な染
色結果が得られた。特に、通常のパラフィン切片では検
出されないCD3およびCD45RAが、PLP-AMeX切片において
明瞭に検出されたことは注目すべき点である。また、酵
素組織化学的染色では、アルカリホスファターゼ（AL
P）活性も良好に保持されていた。
学的染色では、使用したすべての抗体において良好な染
色結果が得られた。特に、通常のパラフィン切片では検
出されないCD3およびCD45RAが、PLP-AMeX切片において
明瞭に検出されたことは注目すべき点である。また、酵
素組織化学的染色では、アルカリホスファターゼ（AL
P）活性も良好に保持されていた。
【００１８】また、本発明の方法で作製した脾臓組織及
び胸腺組織でも形態学的、免疫組織化学的および酵素組
織化学的解析に適した標本が得られた。すなわち、脾臓
組織のHE標本においては、脾臓の赤脾髄および白脾髄構
造は適切に保持されていた。また、白脾髄を構成するリ
ンパ球の組織形態も良好であった。胸腺組織のHE標本に
ついても、皮質および髄質の構造は適切に保持されてお
り、リンパ球の組織形態も良好であった。脾臓組織標本
及び胸腺組織標本のいずれにおいても、免疫組織化学的
解析で、使用した全ての抗体において特異的陽性反応が
得られた。さらに、酵素組織化学的染色では、アルカリ
ホスファターゼ（ALP）活性も良好に保持されていた。
び胸腺組織でも形態学的、免疫組織化学的および酵素組
織化学的解析に適した標本が得られた。すなわち、脾臓
組織のHE標本においては、脾臓の赤脾髄および白脾髄構
造は適切に保持されていた。また、白脾髄を構成するリ
ンパ球の組織形態も良好であった。胸腺組織のHE標本に
ついても、皮質および髄質の構造は適切に保持されてお
り、リンパ球の組織形態も良好であった。脾臓組織標本
及び胸腺組織標本のいずれにおいても、免疫組織化学的
解析で、使用した全ての抗体において特異的陽性反応が
得られた。さらに、酵素組織化学的染色では、アルカリ
ホスファターゼ（ALP）活性も良好に保持されていた。
【００１９】これらの結果から、PLP-AMeX切片における
免疫反応性や酵素活性は通常のホルマリン固定パラフィ
ン切片よりも優れており、凍結切片と比較しても遜色な
く保持されているものと考えられた。したがって、PLP-
AMeX法は形態学的、免疫組織化学的および酵素組織化学
的解析に有用な方法であるといえる。
免疫反応性や酵素活性は通常のホルマリン固定パラフィ
ン切片よりも優れており、凍結切片と比較しても遜色な
く保持されているものと考えられた。したがって、PLP-
AMeX法は形態学的、免疫組織化学的および酵素組織化学
的解析に有用な方法であるといえる。
【００２０】免疫組織化学的染色においては、加熱や蛋
白分解酵素を用いた前処理が抗原賦活法としてよく用い
られている。実施例で用いた1次抗体の多くは、このよ
うな前処理なく充分な染色性が得られたため、PLP-AMeX
切片では多くの場合、前処理として抗原賦活を行う必要
はない。一方、CD3の染色性はマイクロウェーブ（MW）
処理を行うことで染色性が増強することから、抗原賦活
を行わずに染色し充分な染色強度が得られなかった場合
や、抗原が全く検出されない場合には、MW処理などの前
処理を試みる価値がある。
白分解酵素を用いた前処理が抗原賦活法としてよく用い
られている。実施例で用いた1次抗体の多くは、このよ
うな前処理なく充分な染色性が得られたため、PLP-AMeX
切片では多くの場合、前処理として抗原賦活を行う必要
はない。一方、CD3の染色性はマイクロウェーブ（MW）
処理を行うことで染色性が増強することから、抗原賦活
を行わずに染色し充分な染色強度が得られなかった場合
や、抗原が全く検出されない場合には、MW処理などの前
処理を試みる価値がある。
【００２１】AMeX法にて作製したブロックは4℃にて24
カ月間は免疫反応性が良好に保持されているとの報告が
ある（Sato Y et al., Am J Pathol 1992; 140: 775-7
9）。したがって、PLP-AMeX法にて作製したブロックも4
℃に保管することで、免疫反応性や酵素活性は長期保持
されるのもと考えられる。
カ月間は免疫反応性が良好に保持されているとの報告が
ある（Sato Y et al., Am J Pathol 1992; 140: 775-7
9）。したがって、PLP-AMeX法にて作製したブロックも4
℃に保管することで、免疫反応性や酵素活性は長期保持
されるのもと考えられる。
【００２２】全身あるいは特定器官への灌流固定は、実
験動物を用いた病理学的研究に有用でありしばしば応用
されている。本発明者は、PLP-AMeX法の全身灌流固定へ
の応用を試みたところ、各種染色において多数の抗原や
内因性酵素が特異的に観察された。
験動物を用いた病理学的研究に有用でありしばしば応用
されている。本発明者は、PLP-AMeX法の全身灌流固定へ
の応用を試みたところ、各種染色において多数の抗原や
内因性酵素が特異的に観察された。
【００２３】従って、本発明は、以下の工程を含む動物
の全身諸臓器又は組織の標本作製法： １）動物をPLP液で全身灌流して固定する； ２）目的とする臓器又は組織を動物から摘出し、AMeX法
によりパラフィン包埋を行う。
の全身諸臓器又は組織の標本作製法： １）動物をPLP液で全身灌流して固定する； ２）目的とする臓器又は組織を動物から摘出し、AMeX法
によりパラフィン包埋を行う。
【００２４】本発明はさらに、上記方法で作成した動物
の全身諸臓器又は組織の標本を提供する。灌流固定は例
えば、以下のようにして実施することができる。ラッ
ト、マウスなどの動物をエーテル吸入又はバルビツール
系麻酔薬の静脈内あるいは腹腔内投与により麻酔し、ヘ
パリン（１００ＩＵ／匹程度）を静脈内投与する。な
お、ヘパリンの静脈内投与に関しては省略してもよい。
胸腔を開胸し、心臓の心尖部より左心室にカニューレを
挿入し、鉗子固定あるいは結紮などにより固定する。カ
ニューレよりヘパリンを含む（５ＩＵ／ｍｌ）生理食塩
液を灌流し、それと同時に、右心房を切開し血液を洗い
流す。ラットでは約２００ｍｌ、マウスでは約１００ｍ
ｌを灌流し、右心房から流れ出す生理食塩液が透明にな
った後、生理食塩液に代わりPLP固定液を灌流する。灌
流圧はラットでは約１３０ｃｍ水柱圧、マウスでは約８
０〜１３０ｃｍ水柱圧とし、ラットでは約２００ｍｌ、
マウスでは約１００ｍｌの灌流により固定を終了する。
その後、目的とする臓器、組織を採取し、さらにPLP固
定液で浸漬固定し、AMeX法でパラフィン包埋を行う。本
発明の方法では、全身の臓器、組織への適応が可能であ
る。
の全身諸臓器又は組織の標本を提供する。灌流固定は例
えば、以下のようにして実施することができる。ラッ
ト、マウスなどの動物をエーテル吸入又はバルビツール
系麻酔薬の静脈内あるいは腹腔内投与により麻酔し、ヘ
パリン（１００ＩＵ／匹程度）を静脈内投与する。な
お、ヘパリンの静脈内投与に関しては省略してもよい。
胸腔を開胸し、心臓の心尖部より左心室にカニューレを
挿入し、鉗子固定あるいは結紮などにより固定する。カ
ニューレよりヘパリンを含む（５ＩＵ／ｍｌ）生理食塩
液を灌流し、それと同時に、右心房を切開し血液を洗い
流す。ラットでは約２００ｍｌ、マウスでは約１００ｍ
ｌを灌流し、右心房から流れ出す生理食塩液が透明にな
った後、生理食塩液に代わりPLP固定液を灌流する。灌
流圧はラットでは約１３０ｃｍ水柱圧、マウスでは約８
０〜１３０ｃｍ水柱圧とし、ラットでは約２００ｍｌ、
マウスでは約１００ｍｌの灌流により固定を終了する。
その後、目的とする臓器、組織を採取し、さらにPLP固
定液で浸漬固定し、AMeX法でパラフィン包埋を行う。本
発明の方法では、全身の臓器、組織への適応が可能であ
る。
【００２５】
【発明の効果】PLP液を用いた注入固定法とAMeX法によ
るパラフィン包埋法の組み合わせであるPLP-AMeX法は、
全身諸臓器又は組織（硬組織を除く）の病理組織学的解
析、免疫組織化学的および酵素組織化学的解析に極めて
有用であることが示された。さらに、灌流固定などを行
うことによってもPLP-AMeX法は様々な臓器、組織の解析
に、幅広く応用ができる。本発明の方法及び標本は、種
々の疾患の診断などにも広く利用できる。
るパラフィン包埋法の組み合わせであるPLP-AMeX法は、
全身諸臓器又は組織（硬組織を除く）の病理組織学的解
析、免疫組織化学的および酵素組織化学的解析に極めて
有用であることが示された。さらに、灌流固定などを行
うことによってもPLP-AMeX法は様々な臓器、組織の解析
に、幅広く応用ができる。本発明の方法及び標本は、種
々の疾患の診断などにも広く利用できる。
【００２６】本発明を以下の実施例によりさらに詳しく
説明するが、実施例の態様に限定されず、さまざまな変
更、修飾が当業者には可能である。本発明はこれらの変
更、修飾を含むことを意図する。
説明するが、実施例の態様に限定されず、さまざまな変
更、修飾が当業者には可能である。本発明はこれらの変
更、修飾を含むことを意図する。
【００２７】
【実施例】実施例１：使用動物（ラット） 8週齢のSD系雄性ラットをJapan SLC Inc.(Shizuoka, Ja
pan)から購入した。動物は、温度24±2℃、湿度55%±10
%、換気回数14〜16回/時、照明時間14時間の動物室で飼
育し、固形飼料(CE-2; Clea Japan Inc., Tokyo, Japa
n)と水道水を不断給与した。正常な無処置ラットは、11
週齢でエーテル麻酔下にて放血し、解剖を行った。
pan)から購入した。動物は、温度24±2℃、湿度55%±10
%、換気回数14〜16回/時、照明時間14時間の動物室で飼
育し、固形飼料(CE-2; Clea Japan Inc., Tokyo, Japa
n)と水道水を不断給与した。正常な無処置ラットは、11
週齢でエーテル麻酔下にて放血し、解剖を行った。
【００２８】また、肺障害モデルとしてブレオマイシン
(BLM)処置ラットを用いた（ThrallRS et al., Am J Pat
hol 1979; 95: 117-30; Kawamoto M et al., Acta Path
olJpn 1990; 40: 227-38; Zhang K et al., Am J Patho
l 1994; 145: 114-25）。10週齢ラットに、エーテル麻
酔下で頸部の腹側中央線を切開し、2 mg/200μl/匹のBL
M(Nippon Kayaku., Tokyo, Japan)を気管内投与した。
投与7日後に、エーテル麻酔下にて放血し、解剖を行っ
た。
(BLM)処置ラットを用いた（ThrallRS et al., Am J Pat
hol 1979; 95: 117-30; Kawamoto M et al., Acta Path
olJpn 1990; 40: 227-38; Zhang K et al., Am J Patho
l 1994; 145: 114-25）。10週齢ラットに、エーテル麻
酔下で頸部の腹側中央線を切開し、2 mg/200μl/匹のBL
M(Nippon Kayaku., Tokyo, Japan)を気管内投与した。
投与7日後に、エーテル麻酔下にて放血し、解剖を行っ
た。
【００２９】実施例２：PLP-AMeX法による標本作製 解剖時に各動物から肺を採取し、4%パラホルムアルデヒ
ドを含むPLP固定液を20cm水柱圧で気管から肺内に注入
した。さらに同固定液で4℃、6時間浸漬固定を行った。
右肺後葉および左肺中央部を切り出し、4℃でリン酸緩
衝食塩水(PBS; 0.01M, pH 7.4)にて洗浄した。
ドを含むPLP固定液を20cm水柱圧で気管から肺内に注入
した。さらに同固定液で4℃、6時間浸漬固定を行った。
右肺後葉および左肺中央部を切り出し、4℃でリン酸緩
衝食塩水(PBS; 0.01M, pH 7.4)にて洗浄した。
【００３０】切り出した組織は、AMeX法に準じて以下の
操作を行った。アセトンに4℃、一晩浸漬し、その後室
温にて2時間の脱水を行った。安息香酸メチルに1時間
（室温）、キシレンに１時間（室温）浸漬して透徹を行
い、その後パラフィンに2時間（60℃）浸透し、包埋し
た。PLP-AMeX法にて作製したパラフィンブロックは、4
℃にて保存した。
操作を行った。アセトンに4℃、一晩浸漬し、その後室
温にて2時間の脱水を行った。安息香酸メチルに1時間
（室温）、キシレンに１時間（室温）浸漬して透徹を行
い、その後パラフィンに2時間（60℃）浸透し、包埋し
た。PLP-AMeX法にて作製したパラフィンブロックは、4
℃にて保存した。
【００３１】薄切切片を作製し、キシレンとアセトンを
用いて脱パラフィン・親水化を行い、以下の実施例に示
すようにしてヘマトキシリン-エオジン(HE)染色標本に
よる組織形態の観察、免疫組織化学的および酵素組織化
学的染色を行った。
用いて脱パラフィン・親水化を行い、以下の実施例に示
すようにしてヘマトキシリン-エオジン(HE)染色標本に
よる組織形態の観察、免疫組織化学的および酵素組織化
学的染色を行った。
【００３２】実施例３：組織形態 キシレン、アルコールによる脱パラフィン・親水化を行
い、水洗後、ヘマトキシリン液（マイヤー又はカラッ
チ）で核染色を行う。その後マイヤーのヘマトキシリン
を使用した場合には水洗して色出しを行う、カラッチの
ヘマトキシリンの場合には、塩酸アルコールなどで分別
し、水洗して色出しを行う。エオジンで後染色し、アル
コールで分別脱水、キシレンで透徹し、非水溶性封入剤
にて封入した。
い、水洗後、ヘマトキシリン液（マイヤー又はカラッ
チ）で核染色を行う。その後マイヤーのヘマトキシリン
を使用した場合には水洗して色出しを行う、カラッチの
ヘマトキシリンの場合には、塩酸アルコールなどで分別
し、水洗して色出しを行う。エオジンで後染色し、アル
コールで分別脱水、キシレンで透徹し、非水溶性封入剤
にて封入した。
【００３３】PLP-AMeX切片のHE染色標本において、正常
ラットの細気管支、肺胞管および肺胞嚢は適切に拡張し
ていた（図１）。また、細気管支上皮、肺胞上皮および
肺胞壁の細胞ならびに組織形態も良好に保持されてい
た。
ラットの細気管支、肺胞管および肺胞嚢は適切に拡張し
ていた（図１）。また、細気管支上皮、肺胞上皮および
肺胞壁の細胞ならびに組織形態も良好に保持されてい
た。
【００３４】BLM処置ラットでは、肺病変の詳細な病理
組織所見の観察が可能であった（図２：図２ａは３０
倍、図２ｂは１１５倍の倍率）。すなわち、出血、肺胞
上皮の剥離、II型肺胞上皮の過形成、マクロファージ、
好中球ならびにリンパ球を主体とする炎症性細胞の浸
潤、線維芽細胞様間質細胞の増殖および気管支上皮化生
などが観察された。
組織所見の観察が可能であった（図２：図２ａは３０
倍、図２ｂは１１５倍の倍率）。すなわち、出血、肺胞
上皮の剥離、II型肺胞上皮の過形成、マクロファージ、
好中球ならびにリンパ球を主体とする炎症性細胞の浸
潤、線維芽細胞様間質細胞の増殖および気管支上皮化生
などが観察された。
【００３５】実施例４：免疫組織化学的染色 （１）肺組織標本の免疫組織化学的染色 実施例２で作製した肺組織のPLP-AMeX切片を免疫組織化
学的染色に付した。免疫組織化学的染色は、LSABキット
(Dako, Carpinteria, CA, USA)を用いて、標識ストレプ
トアビジン−ビオチン（LSAB）法（Giorno R., Diagn I
mmunol. 1984,2:161-6; Elias JM et al., Am J Clin P
athol 1989, 92:62-7）にて実施した。1次抗体として、
Tリンパ球マーカーのCD3 (clone: G4.18, Pharmingen,
San Diego, CA, USA)（Nicolls MR et al., Transplant
ation 1993; 55: 459-68; Nelson DJ et al., J Exp Me
d 1994; 179: 203-12）、Bリンパ球マーカーのCD45RA
(clone: OX-33, Pharmingen)（Woollett GR et al., Eu
r J Immunol 1985; 15: 168-73）、ラット単球、マクロ
ファージ系マーカーのED-1(BMA Biomedicals Ltd.,Augu
st, Switzerland)（Dijkstra CD et al., Immunology 1
985; 54: 589-99;Beelen RHJ et al., Transplant Proc
1987; 19: 3166-70）、α-SMA(Progen Biotechnik Gmb
H, Heidelberg, Germany)に対する抗体を用いた。発色
はペルオキシダーゼ-DAB反応にて行い、ヘマトキシリン
で対比染色を行った。
学的染色に付した。免疫組織化学的染色は、LSABキット
(Dako, Carpinteria, CA, USA)を用いて、標識ストレプ
トアビジン−ビオチン（LSAB）法（Giorno R., Diagn I
mmunol. 1984,2:161-6; Elias JM et al., Am J Clin P
athol 1989, 92:62-7）にて実施した。1次抗体として、
Tリンパ球マーカーのCD3 (clone: G4.18, Pharmingen,
San Diego, CA, USA)（Nicolls MR et al., Transplant
ation 1993; 55: 459-68; Nelson DJ et al., J Exp Me
d 1994; 179: 203-12）、Bリンパ球マーカーのCD45RA
(clone: OX-33, Pharmingen)（Woollett GR et al., Eu
r J Immunol 1985; 15: 168-73）、ラット単球、マクロ
ファージ系マーカーのED-1(BMA Biomedicals Ltd.,Augu
st, Switzerland)（Dijkstra CD et al., Immunology 1
985; 54: 589-99;Beelen RHJ et al., Transplant Proc
1987; 19: 3166-70）、α-SMA(Progen Biotechnik Gmb
H, Heidelberg, Germany)に対する抗体を用いた。発色
はペルオキシダーゼ-DAB反応にて行い、ヘマトキシリン
で対比染色を行った。
【００３６】CD3およびCD45RAは、通常のホルマリン固
定パラフィン切片では検出されないため、対照として正
常ラット脾臓のPLP-AMeX切片とPLP凍結切片を作製し、C
D3およびCD45RAの免疫組織化学的染色を行った。さらに
CD3の抗原賦活として、1次抗体反応の前に、マイクロウ
ェーブオーブン(H2800; Energy Beam Sciences, Agawa
m, MA, USA, 出力780W)と0.01M Citrate Buffer (pH7.
6)を用いて、98℃、5分間のマイクロウェーブ(MW)処理
を行った。
定パラフィン切片では検出されないため、対照として正
常ラット脾臓のPLP-AMeX切片とPLP凍結切片を作製し、C
D3およびCD45RAの免疫組織化学的染色を行った。さらに
CD3の抗原賦活として、1次抗体反応の前に、マイクロウ
ェーブオーブン(H2800; Energy Beam Sciences, Agawa
m, MA, USA, 出力780W)と0.01M Citrate Buffer (pH7.
6)を用いて、98℃、5分間のマイクロウェーブ(MW)処理
を行った。
【００３７】その結果、PLP-AMeX切片では、今回用いた
全ての抗体において良好な染色結果が得られた。対照と
して用いた脾臓のCD3およびCD45RAの染色では、動脈周
囲リンパ組織鞘のリンパ球がCD3に（図３ａ）、リンパ
濾胞の大部分のリンパ球がCD45RAに（図３ｂ）それぞれ
陽性を示した。 PLP-AMeX切片とPLP凍結切片とでCD3な
らびにCD45RAそれぞれの染色態度を比較したところ、CD
45RAの分布および染色強度は、PLP-AMeX切片とPLP凍結
切片とで違いは認められなかった。CD3の分布は両切片
ともに同様であったが、染色強度はPLP凍結切片に比べP
LP-AMeX切片でやや減弱していた。CD3の染色強度を高め
るために、PLP-AMeX切片にMW処理による抗原賦活を行っ
たところ、CD3の染色性が増強し、PLP凍結切片と遜色な
い染色強度が得られた。
全ての抗体において良好な染色結果が得られた。対照と
して用いた脾臓のCD3およびCD45RAの染色では、動脈周
囲リンパ組織鞘のリンパ球がCD3に（図３ａ）、リンパ
濾胞の大部分のリンパ球がCD45RAに（図３ｂ）それぞれ
陽性を示した。 PLP-AMeX切片とPLP凍結切片とでCD3な
らびにCD45RAそれぞれの染色態度を比較したところ、CD
45RAの分布および染色強度は、PLP-AMeX切片とPLP凍結
切片とで違いは認められなかった。CD3の分布は両切片
ともに同様であったが、染色強度はPLP凍結切片に比べP
LP-AMeX切片でやや減弱していた。CD3の染色強度を高め
るために、PLP-AMeX切片にMW処理による抗原賦活を行っ
たところ、CD3の染色性が増強し、PLP凍結切片と遜色な
い染色強度が得られた。
【００３８】正常な肺組織では、気管支や細気管支の周
囲に存在するリンパ小節にCD3およびCD45RAに陽性のリ
ンパ球が観察された。さらに、BLM誘発肺障害モデルで
は病変部に浸潤したいくつかの単核球が、これらのリン
パ球表面マーカーに陽性を示した（図４ａ、ｂ）。
囲に存在するリンパ小節にCD3およびCD45RAに陽性のリ
ンパ球が観察された。さらに、BLM誘発肺障害モデルで
は病変部に浸潤したいくつかの単核球が、これらのリン
パ球表面マーカーに陽性を示した（図４ａ、ｂ）。
【００３９】ED-1陽性細胞は、正常肺組織においてはご
くまれに、BLM誘発肺障害モデルでは病変部に多数観察
された（図４ｃ）。α-SMAの染色では、気管支、細気管
支および血管を取り囲む平滑筋や肺胞壁内の平滑筋が陽
性を示した。さらに、BLM誘発肺障害モデルでは病変部
に存在する線維芽細胞様間質細胞も陽性を示した（図４
ｄ）。 （２）脾臓組織及び胸腺組織の免疫組織化学的染色 実施例１に記載の正常無処置ラットから脾臓及び胸腺を
摘出し、実施例２と同様の方法でPLP-AMeX法による標本
作製を行った。
くまれに、BLM誘発肺障害モデルでは病変部に多数観察
された（図４ｃ）。α-SMAの染色では、気管支、細気管
支および血管を取り囲む平滑筋や肺胞壁内の平滑筋が陽
性を示した。さらに、BLM誘発肺障害モデルでは病変部
に存在する線維芽細胞様間質細胞も陽性を示した（図４
ｄ）。 （２）脾臓組織及び胸腺組織の免疫組織化学的染色 実施例１に記載の正常無処置ラットから脾臓及び胸腺を
摘出し、実施例２と同様の方法でPLP-AMeX法による標本
作製を行った。
【００４０】免疫組織化学的染色は、LSABキット（Dak
o, Carpinteria, CA, USA）を用いて、標識ストレプト
アビジン-ビオチン（LSAB）法（Giorno R., Diagn Immu
nol. 1984, 2: 161-6; Elias JM et al., Am J Clin pa
thol 1989, 92: 62-7）にて実施した。一次抗体とし
て、Tリンパ球マーカーのCD3（Mouse Anti-Rat CD3, cl
one: G4.18, Pharmingen）、CD4（Mouse Anti-Rat CD4,
clone: W3/25, Harlan）、CD8（Mouse Anti-Rat CD8a,
clone: OX8, Parmingen）、単球、マクロファージ系マ
ーカーのED-1（Mouse Anti-Rat ED1, BMA）、ED-2（Mou
se Anti-Rat ED-2, BMA）、に対する抗体を用いた。発
色は、ペルオキシダーゼ-DAB反応にて行い、ヘマトキシ
リンで対比染色を行った。
o, Carpinteria, CA, USA）を用いて、標識ストレプト
アビジン-ビオチン（LSAB）法（Giorno R., Diagn Immu
nol. 1984, 2: 161-6; Elias JM et al., Am J Clin pa
thol 1989, 92: 62-7）にて実施した。一次抗体とし
て、Tリンパ球マーカーのCD3（Mouse Anti-Rat CD3, cl
one: G4.18, Pharmingen）、CD4（Mouse Anti-Rat CD4,
clone: W3/25, Harlan）、CD8（Mouse Anti-Rat CD8a,
clone: OX8, Parmingen）、単球、マクロファージ系マ
ーカーのED-1（Mouse Anti-Rat ED1, BMA）、ED-2（Mou
se Anti-Rat ED-2, BMA）、に対する抗体を用いた。発
色は、ペルオキシダーゼ-DAB反応にて行い、ヘマトキシ
リンで対比染色を行った。
【００４１】CD4については、Catalyzed Signal Amplif
ication（CSA）System（Dako, Carpinteria, CA, USA）
を用いた増感法を行った。その結果、脾臓および胸腺の
PLP-AMeX切片で、今回用いた抗体において特異的陽性反
応が得られた。
ication（CSA）System（Dako, Carpinteria, CA, USA）
を用いた増感法を行った。その結果、脾臓および胸腺の
PLP-AMeX切片で、今回用いた抗体において特異的陽性反
応が得られた。
【００４２】すなわち、CD4およびCD8の染色では、脾臓
の動脈周囲リンパ組織鞘のリンパ球が陽性を示した。ま
た、CD3、 CD4およびCD8の染色では、胸腺の皮質および
髄質のリンパ球が陽性を示した。ED-1では、脾臓の赤脾
髄および胸腺髄質のマクロファージに陽性を示し、ED-2
では脾臓の赤脾髄、胸腺の皮質および髄質のマクロファ
ージに陽性を示した。PLP-AMeX切片とPLP凍結切片の染
色態度をそれぞれの抗体で比較したところ、CD3、CD8、
ED-1、ED-2では、分布、染色強度に違いは認められなか
った。CD4では、CSA Systemによる増感法により陽性像
が得られた。
の動脈周囲リンパ組織鞘のリンパ球が陽性を示した。ま
た、CD3、 CD4およびCD8の染色では、胸腺の皮質および
髄質のリンパ球が陽性を示した。ED-1では、脾臓の赤脾
髄および胸腺髄質のマクロファージに陽性を示し、ED-2
では脾臓の赤脾髄、胸腺の皮質および髄質のマクロファ
ージに陽性を示した。PLP-AMeX切片とPLP凍結切片の染
色態度をそれぞれの抗体で比較したところ、CD3、CD8、
ED-1、ED-2では、分布、染色強度に違いは認められなか
った。CD4では、CSA Systemによる増感法により陽性像
が得られた。
【００４３】実施例５：酵素組織化学的染色 実施例２で作製した肺組織のPLP-AMeX切片をアルカリホ
スファターゼ(ALP)を用いる酵素組織化学的染色に付し
た。ALP活性は、naphtol AS-BI phosphate (Sigma Chem
ical Co., St. Louis, MO, USA)を基質とし、カップラ
ーとしてfast red violet LB salt (Sigma Chemical C
o.)を用いて染色を行った（Watanabe K etal., J Histo
chem Cytochem 1964; 12: 252-60）。その後、ヘマトキ
シリンにて対比染色を行った。
スファターゼ(ALP)を用いる酵素組織化学的染色に付し
た。ALP活性は、naphtol AS-BI phosphate (Sigma Chem
ical Co., St. Louis, MO, USA)を基質とし、カップラ
ーとしてfast red violet LB salt (Sigma Chemical C
o.)を用いて染色を行った（Watanabe K etal., J Histo
chem Cytochem 1964; 12: 252-60）。その後、ヘマトキ
シリンにて対比染色を行った。
【００４４】ALP活性は、PLP-AMeX切片において明瞭に
検出された。II型肺胞上皮をはじめ、気管支、細気管支
および血管の周囲にもALP活性が観察された。これらの
所見に加え、BLM誘発肺障害モデルでは肺病変部に浸潤
した好中球ならびに気管支上皮化生した上皮にALP活性
が検出された（図４ｅ）。
検出された。II型肺胞上皮をはじめ、気管支、細気管支
および血管の周囲にもALP活性が観察された。これらの
所見に加え、BLM誘発肺障害モデルでは肺病変部に浸潤
した好中球ならびに気管支上皮化生した上皮にALP活性
が検出された（図４ｅ）。
【００４５】実施例６：使用動物（カニクイザル） 中国産カニクイザル5才齢の雄性カニクイザルを（株）C
SKリサーチパークより購入した。
SKリサーチパークより購入した。
【００４６】カニクザルを塩酸ケタミンおよびペントバ
ルビタールナトリウム麻酔下で放血して安楽死させ、解
剖を行った。 実施例６：PLP-AMeX法による脾臓及び胸腺の標本作製 解剖時に動物より脾臓、胸腺を採取し、4%パラホルムア
ルデヒドを含むPLP固定液で、4℃、6時間浸漬固定後、4
℃でリン酸緩衝食塩水（PBS；0.01M, pH 7.4）にて洗浄
した。
ルビタールナトリウム麻酔下で放血して安楽死させ、解
剖を行った。 実施例６：PLP-AMeX法による脾臓及び胸腺の標本作製 解剖時に動物より脾臓、胸腺を採取し、4%パラホルムア
ルデヒドを含むPLP固定液で、4℃、6時間浸漬固定後、4
℃でリン酸緩衝食塩水（PBS；0.01M, pH 7.4）にて洗浄
した。
【００４７】採取した組織は、AMeX法に準じて以下の操
作を行った。アセトンに4℃、一晩浸漬し、その後室温
にて2時間の脱水を行った。安息香酸メチルに1時間（室
温）、キシレンに1時間（室温）浸漬して透徹を行い、
その後パラフィンに2時間（60℃）浸透し、包埋した。P
LP-AMeX法にて作製したパラフィンブロックは、4℃にて
保存した。
作を行った。アセトンに4℃、一晩浸漬し、その後室温
にて2時間の脱水を行った。安息香酸メチルに1時間（室
温）、キシレンに1時間（室温）浸漬して透徹を行い、
その後パラフィンに2時間（60℃）浸透し、包埋した。P
LP-AMeX法にて作製したパラフィンブロックは、4℃にて
保存した。
【００４８】薄切切片を作製し、キシレンとアセトンを
用いて脱パラフィン・親水化を行い、以下に示すように
してヘマトキシリン-エオジン（HE）染色標本による組
織形態の観察、免疫組織化学的染色および酵素組織化学
的染色を行った。
用いて脱パラフィン・親水化を行い、以下に示すように
してヘマトキシリン-エオジン（HE）染色標本による組
織形態の観察、免疫組織化学的染色および酵素組織化学
的染色を行った。
【００４９】実施例７：組織形態 キシレン、アルコールによる脱パラフィン・親水化を行
い、水洗後、ヘマトキシリン液（カラッチ）で核染色を
行った。その後、塩酸アルコールで分別し、水洗して色
出しを行った。エオジンで後染色し、アルコールで分別
脱水、キシレンで透徹し、非水溶性封入剤にて封入し
た。
い、水洗後、ヘマトキシリン液（カラッチ）で核染色を
行った。その後、塩酸アルコールで分別し、水洗して色
出しを行った。エオジンで後染色し、アルコールで分別
脱水、キシレンで透徹し、非水溶性封入剤にて封入し
た。
【００５０】PLP-AMeX切片のHE標本において、脾臓の赤
脾髄および白脾髄構造は適切に保持されていた（図
５）。また、白脾髄を構成するリンパ球の組織形態も良
好であった。
脾髄および白脾髄構造は適切に保持されていた（図
５）。また、白脾髄を構成するリンパ球の組織形態も良
好であった。
【００５１】胸腺についても、皮質および髄質の構造は
適切に保持されており、リンパ球の組織形態も良好であ
った。 実施例８：免疫組織化学的染色 実施例６で作製したPLP-AMeX切片を免疫組織化学的染色
に付した。免疫組織化学的染色は、LSABキット（Dako,
Carpinteria, CA, USA）を用いて、標識ストレプトアビ
ジン-ビオチン（LSAB）法（Giorno R., Diagn Immunol.
1984, 2: 161-6; Elias JM et al., Am J Clin pathol
1989, 92: 62-7）にて実施した。一次抗体として、Tリ
ンパ球マーカーのCD3（Rabbit Anti-Human T Cell CD3,
polyclonal Antibody, Dako）、CD4（Mouse Anti-Huma
n T Cell, clone: OPD4, Biomeda）、CD8（Mouse Anti-
Human T Cell CD8, clone: DK25, Dako）、Bリンパ球マ
ーカーのCD20（Mouse Anti-Human B Cell CD20cy, clon
e: L26, Dako）、単球、マクロファージ系マーカーのCD
68（Mouse Anti-Human Macrophage CD68, clone:KP1, D
ako）に対する抗体を用いた。発色は、ペルオキシダー
ゼ-DAB反応にて行い、ヘマトキシリンで対比染色を行っ
た。
適切に保持されており、リンパ球の組織形態も良好であ
った。 実施例８：免疫組織化学的染色 実施例６で作製したPLP-AMeX切片を免疫組織化学的染色
に付した。免疫組織化学的染色は、LSABキット（Dako,
Carpinteria, CA, USA）を用いて、標識ストレプトアビ
ジン-ビオチン（LSAB）法（Giorno R., Diagn Immunol.
1984, 2: 161-6; Elias JM et al., Am J Clin pathol
1989, 92: 62-7）にて実施した。一次抗体として、Tリ
ンパ球マーカーのCD3（Rabbit Anti-Human T Cell CD3,
polyclonal Antibody, Dako）、CD4（Mouse Anti-Huma
n T Cell, clone: OPD4, Biomeda）、CD8（Mouse Anti-
Human T Cell CD8, clone: DK25, Dako）、Bリンパ球マ
ーカーのCD20（Mouse Anti-Human B Cell CD20cy, clon
e: L26, Dako）、単球、マクロファージ系マーカーのCD
68（Mouse Anti-Human Macrophage CD68, clone:KP1, D
ako）に対する抗体を用いた。発色は、ペルオキシダー
ゼ-DAB反応にて行い、ヘマトキシリンで対比染色を行っ
た。
【００５２】CD3およびCD4では、抗原賦活として、1次
抗体反応前に、マイクロウェーブオーブン（H2800; Ene
rgy Beam Sciences, Agawam, MA, USA, 出力780W）とTA
RGETRETRIEVAL SOLUTION（Dako, Carpinteria, CA, US
A）を用いて、90℃あるいは98℃、5分間×2回の マイク
ロウェーブ（MW）処理を行った。CD8については、Catal
yzed Signal Amplification（CSA）System（Dako, Carp
interia, CA, USA）を用いた増感法を行った。
抗体反応前に、マイクロウェーブオーブン（H2800; Ene
rgy Beam Sciences, Agawam, MA, USA, 出力780W）とTA
RGETRETRIEVAL SOLUTION（Dako, Carpinteria, CA, US
A）を用いて、90℃あるいは98℃、5分間×2回の マイク
ロウェーブ（MW）処理を行った。CD8については、Catal
yzed Signal Amplification（CSA）System（Dako, Carp
interia, CA, USA）を用いた増感法を行った。
【００５３】その結果、PLP-AMeX切片で、今回用いた全
ての抗体において特異的陽性反応が得られた。すなわち
CD3の染色では、脾臓の動脈周囲リンパ組織鞘のリンパ
球（図６）、胸腺の皮質および髄質のリンパ球が陽性を
示し、CD4およびCD8についても、ほぼ同様であった。CD
20の染色では、脾臓においてリンパ濾胞の大部分のリン
パ球が陽性を示した（図７）。CD68の染色では、脾臓の
胚中心および赤脾髄のマクロファージで（図８）、胸腺
の皮質および髄質のマクロファージが陽性を示した。PL
P-AMeX切片とPLP凍結切片の染色態度をそれぞれの抗体
で比較したところ、CD20およびCD68では、分布、染色強
度に違いは認められなかった。CD3およびCD4では、染色
強度の減弱がみられたが、MW処理による抗原の賦活化に
より染色性が増強し、PLP-凍結切片と同様の染色結果が
得られた。CD8では、Catalyzed Signal Amplification
（CSA）System（Dako, Carpinteria, CA, USA）による
増感法により陽性像が得られた。
ての抗体において特異的陽性反応が得られた。すなわち
CD3の染色では、脾臓の動脈周囲リンパ組織鞘のリンパ
球（図６）、胸腺の皮質および髄質のリンパ球が陽性を
示し、CD4およびCD8についても、ほぼ同様であった。CD
20の染色では、脾臓においてリンパ濾胞の大部分のリン
パ球が陽性を示した（図７）。CD68の染色では、脾臓の
胚中心および赤脾髄のマクロファージで（図８）、胸腺
の皮質および髄質のマクロファージが陽性を示した。PL
P-AMeX切片とPLP凍結切片の染色態度をそれぞれの抗体
で比較したところ、CD20およびCD68では、分布、染色強
度に違いは認められなかった。CD3およびCD4では、染色
強度の減弱がみられたが、MW処理による抗原の賦活化に
より染色性が増強し、PLP-凍結切片と同様の染色結果が
得られた。CD8では、Catalyzed Signal Amplification
（CSA）System（Dako, Carpinteria, CA, USA）による
増感法により陽性像が得られた。
【００５４】実施例９：酵素組織化学的染色 実施例６で作製した脾臓組織のPLP-AMeX切片をアルカリ
フォスファターゼ（ALP）を用いる酵素組織化学的染色
に付した。ALP活性は、naphtol AS-BI phosphate （Sig
ma Chemical Co., St. Louis, MO, USA）を基質とし、
カップラーとしてfast red violet LB salt（Sigma Che
mical Co.）を用いて染色を行った（Watanabe K et a
l.,J Histochem Cytochem 1964; 12: 252-60）。その
後、ヘマトキシリンにて対比染色を行った。
フォスファターゼ（ALP）を用いる酵素組織化学的染色
に付した。ALP活性は、naphtol AS-BI phosphate （Sig
ma Chemical Co., St. Louis, MO, USA）を基質とし、
カップラーとしてfast red violet LB salt（Sigma Che
mical Co.）を用いて染色を行った（Watanabe K et a
l.,J Histochem Cytochem 1964; 12: 252-60）。その
後、ヘマトキシリンにて対比染色を行った。
【００５５】ALP活性は、PLP-AMeX切片において明瞭に
検出され、好中球および血管にALP活性が検出された
（図９）。
検出され、好中球および血管にALP活性が検出された
（図９）。
【図１】正常な無処置ラットの肺組織から作製したPLP-
AMeX切片のHE染色標本を顕微鏡観察した写真を示す（３
０倍の倍率）（生物の形態を示す写真）。
AMeX切片のHE染色標本を顕微鏡観察した写真を示す（３
０倍の倍率）（生物の形態を示す写真）。
【図２】BLM処置ラットの肺組織から作製したPLP-AMeX
切片のHE染色標本を顕微鏡観察した写真を示す（図２ａ
は３０倍、図２ｂは１１５倍の倍率）（生物の形態を示
す写真）。
切片のHE染色標本を顕微鏡観察した写真を示す（図２ａ
は３０倍、図２ｂは１１５倍の倍率）（生物の形態を示
す写真）。
【図３】図３ａ、３ｂは、正常な無処置ラット脾臓のPL
P-AMeX切片を作製し、CD3（図３ａ）およびCD45RA（図
３ｂ）の免疫組織化学的染色を行った標本を顕微鏡観察
した写真を示す（生物の形態を示す写真）。
P-AMeX切片を作製し、CD3（図３ａ）およびCD45RA（図
３ｂ）の免疫組織化学的染色を行った標本を顕微鏡観察
した写真を示す（生物の形態を示す写真）。
【図４】図４ａ、ｂは、BLM処置ラット肺のPLP-AMeX切
片を作製し、CD3（図４ａ）およびCD45RA（図４ｂ）の
免疫組織化学的染色を行った標本を顕微鏡観察した写真
を示す。図４ｃは、BLM誘発肺障害モデルの病変部に観
察されるED-1陽性細胞を示す。図４ｄは、BLM誘発肺障
害モデルの病変部に存在する、α-SMAの染色に陽性な線
維芽細胞様間質細胞を示す。図４ｅは、BLM誘発肺障害
モデルの肺病変部に浸潤した好中球ならびに気管支上皮
化生した上皮にALP活性が検出されたことを示す写真で
ある。（いずれも生物の形態を示す写真）
片を作製し、CD3（図４ａ）およびCD45RA（図４ｂ）の
免疫組織化学的染色を行った標本を顕微鏡観察した写真
を示す。図４ｃは、BLM誘発肺障害モデルの病変部に観
察されるED-1陽性細胞を示す。図４ｄは、BLM誘発肺障
害モデルの病変部に存在する、α-SMAの染色に陽性な線
維芽細胞様間質細胞を示す。図４ｅは、BLM誘発肺障害
モデルの肺病変部に浸潤した好中球ならびに気管支上皮
化生した上皮にALP活性が検出されたことを示す写真で
ある。（いずれも生物の形態を示す写真）
【図５】正常カニクイザルの脾臓から作製したPLP-AMeX
切片のHE染色標本を顕微鏡観察した写真を示す（40倍の
倍率）（生物の形態を示す写真）。
切片のHE染色標本を顕微鏡観察した写真を示す（40倍の
倍率）（生物の形態を示す写真）。
【図６】正常カニクイザルの脾臓から作製したPLP-AMeX
切片を用いたCD3免疫組織化学的染色標本を顕微鏡観察
した写真を示す（100倍の倍率）（生物の形態を示す写
真）。
切片を用いたCD3免疫組織化学的染色標本を顕微鏡観察
した写真を示す（100倍の倍率）（生物の形態を示す写
真）。
【図７】正常カニクイザルの脾臓から作製したPLP-AMeX
切片を用いたCD20免疫組織化学的染色標本を顕微鏡観察
した写真を示す（100倍の倍率）（生物の形態を示す写
真）。
切片を用いたCD20免疫組織化学的染色標本を顕微鏡観察
した写真を示す（100倍の倍率）（生物の形態を示す写
真）。
【図８】正常カニクイザルの脾臓から作製したPLP-AMeX
切片を用いたCD68免疫組織化学的染色標本を顕微鏡観察
した写真を示す（100倍の倍率）（生物の形態を示す写
真）。
切片を用いたCD68免疫組織化学的染色標本を顕微鏡観察
した写真を示す（100倍の倍率）（生物の形態を示す写
真）。
【図９】正常カニクイザルの脾臓から作製したPLP-AMeX
切片を用いてALP酵素組織化学的染色を行った標本を顕
微鏡観察した写真を示す（400倍の倍率）（生物の形態
を示す写真）。
切片を用いてALP酵素組織化学的染色を行った標本を顕
微鏡観察した写真を示す（400倍の倍率）（生物の形態
を示す写真）。
フロントページの続き (72)発明者 小川 友美恵 静岡県御殿場市駒門１丁目135番地 中外 製薬株式会社内 (72)発明者 杉本 哲朗 静岡県御殿場市駒門１丁目135番地 中外 製薬株式会社内 (72)発明者 勝山 清加 静岡県御殿場市駒門１丁目135番地 中外 製薬株式会社内 Ｆターム(参考） 2G045 BA13 BA20 BB23 BB24 BB60 CB01 CB17 CB26 CB30 FA16 FA20 FB01 FB03 FB11 JA20 2G052 AA28 AD14 AD34 EB11 EC03 FA02 FA09 FC02 FC11 GA30 GA32 JA08
Claims (16)
- 【請求項１】以下の工程を含む全身諸臓器又は組織（硬
組織を除く）の標本作製法： １）目的とする臓器又は組織をPLP液で固定する； ２）AMeX法によるパラフィン包埋を行う。 - 【請求項２】PLP液による固定を浸漬により行う請求項
１記載の方法。 - 【請求項３】PLP液による浸漬固定を行う前に、PLP液に
よる注入固定を行うことをさらに含む請求項２記載の方
法。 - 【請求項４】AMeX法によるパラフィン包埋を行った後
に、薄切切片を作製する工程をさらに含む請求項１記載
の方法。 - 【請求項５】得られた薄切切片の脱パラフィン及び親水
化の工程をさらに含む請求項４記載の方法。 - 【請求項６】組織染色、免疫組織化学的染色又は酵素組
織化学的染色をさらに行う請求項５記載の方法。 - 【請求項７】免疫組織化学的染色を行う際に、抗原賦活
による前処理をさらに行う請求項６記載の方法。 - 【請求項８】肺組織の標本作製法である請求項１〜７の
いずれかに記載の方法。 - 【請求項９】脾臓組織の標本作製法である請求項１〜７
のいずれかに記載の方法。 - 【請求項１０】胸腺組織の標本作製法である請求項１〜
７のいずれかに記載の方法。 - 【請求項１１】請求項１〜７のいずれかに記載の方法に
より得られる全身諸臓器又は組織（硬組織を除く）の標
本。 - 【請求項１２】請求項８記載の方法によって得られる肺
組織標本。 - 【請求項１３】請求項９記載の方法によって得られる脾
臓組織標本。 - 【請求項１４】請求項１０記載の方法によって得られる
胸腺組織標本。 - 【請求項１５】以下の工程を含む動物の全身諸臓器又は
組織の標本作製法： １）動物をPLP液で全身灌流して固定する； ２）目的とする臓器又は組織を動物から摘出し、AMeX法
によりパラフィン包埋を行う。 - 【請求項１６】請求項１５記載の方法により得られる動
物の全身諸臓器又は組織の標本。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001136859A JP2002082026A (ja) | 2000-06-19 | 2001-05-08 | 標本作製法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000-182882 | 2000-06-19 | ||
| JP2000182882 | 2000-06-19 | ||
| JP2001136859A JP2002082026A (ja) | 2000-06-19 | 2001-05-08 | 標本作製法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002082026A true JP2002082026A (ja) | 2002-03-22 |
Family
ID=26594176
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001136859A Pending JP2002082026A (ja) | 2000-06-19 | 2001-05-08 | 標本作製法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2002082026A (ja) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009121906A (ja) * | 2007-11-14 | 2009-06-04 | Japan Health Science Foundation | 抗原賦活化方法 |
| WO2009078386A1 (ja) | 2007-12-14 | 2009-06-25 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | 組織形態保持および核酸品質保持に優れた新規標本作製法 |
| WO2013088693A1 (ja) * | 2011-12-14 | 2013-06-20 | 財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 | 染色キット及び染色方法 |
| JP2018511782A (ja) * | 2015-01-26 | 2018-04-26 | ベンタナ メディカル システムズ， インコーポレイテッド | 組織試料を移送するためのトランスポータシステム、組立体、および関連する方法 |
| CN113720669A (zh) * | 2021-08-27 | 2021-11-30 | 吴鸿雁 | 基于动物器官或组织构建的免疫组化质控品 |
| CN114689407A (zh) * | 2022-04-14 | 2022-07-01 | 四川大学华西医院 | 一种动物微小组织石蜡切片的制作方法 |
-
2001
- 2001-05-08 JP JP2001136859A patent/JP2002082026A/ja active Pending
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|---|
| JPN6010071497, 神谷博文， 今村正克, "新しく開発された高感度ＰＡＰ改良法ＰＡＰ−アビジン−ビオチン（ＰＡＢ）法およびＰＡＰくりかえし法について パラフィン", 臨床免疫, 198204, Ｖｏｌ．１４， Ｎｏ．ＳＵＰＰＬ ５, Ｐａｇｅ．１９１−２００, JP * |
| JPN6010071498, Ｍｉｃｈｉｏ ＳＵＺＵＫＩ， Ｍａｓａｍｉ ＳＵＺＵＫＩ， Ｋｏｊｉ ＵＥＴＳＵＫＡ， Ｊｕｎｋｏ ＳＨＩＮＯＺＵＫＡ， Ｈｉｒｏｙｕｋｉ ＮＡＫＡＹＡＭＡ ａｎｄ Ｋｕｎｉｏ ＤＯＩ, "Ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ Ｌｏｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ Ｔａｒｔｒａｔｅ−Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ａｃｉｄ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ （ＴＲＡＰ）−Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｃｅｌｌｓ Ｄｕｒｉｎｇ ｔ", Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ａｎｉｍａｌｓ, 1998, Ｖｏｌ．４７， Ｎｏ．３, Ｐａｇｅ．２１１−２１４, JP * |
| JPN6010071499, Ｙ Ｓａｔｏ， Ｋ Ｍｕｋａｉ， Ｓ Ｗａｔａｎａｂｅ， Ｍ Ｇｏｔｏ ａｎｄ Ｙ Ｓｈｉｍｏｓａｔｏ, "Ｔｈｅ ＡＭｅＸ ｍｅｔｈｏｄ． Ａ ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｏｆ ｔｉｓｓｕｅ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ａｎｄ ｐａｒａｆｆｉｎ ｅｍｂｅｄｄｉｎｇ ｗｉｔｈ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｐｒ", Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ, 1986, Ｖｏｌ．１２５， Ｎｏ．３, Ｐａｇｅ．４３１−４３５, US * |
| JPN6010071500, 鈴木貴， 金子智香， 笹野公伸, "免疫組織化学とｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎのすべて 免疫組織および細胞化学のための標本の作製法 １） 固定法", 病理と臨床, 20000327, Ｖｏｌ．１８， 臨時増刊号, Ｐａｇｅ．８−１０, JP * |
| JPN6010071501, 矢生健一， 円山英昭, "：ＰＬＰ固定，ビブラトーム薄切片を用いた免疫電顕試料作製法（包埋前免疫反応法，ｐｒｅ−ｅｍｂｅｄｄｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ）", 生理学技術研究会報告, 199311, Ｎｏ．１５, Ｐａｇｅ．５１−５３, JP * |
| JPN6010071502, 中村秀範， 高橋敬治， 外崎昭， 鷲岳宏, "：ハムスター肺表面活性物質の微細構造 Ｓｕｒｆａｃｅ ＦｉｌｍとＴｕｂｕｌａｒ Ｍｙｅｌｉｎ Ｆｉｇｕｒｅについて", 日本界面医学会雑誌, 19860825, Ｖｏｌ．１７， Ｎｏ．１／２, Ｐａｇｅ．８３−９１, JP * |
| JPN6010071503, 堤寛, "免疫組織化学とｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎのすべて 免疫組織および細胞化学のための標本の作製法 ２） パラフィ", 病理と臨床, 20000327, Ｖｏｌ．１８， 臨時増刊号, Ｐａｇｅ．１１−１６, JP * |
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| JPWO2009078386A1 (ja) * | 2007-12-14 | 2011-04-28 | 中外製薬株式会社 | 組織形態保持および核酸品質保持に優れた新規標本作製法 |
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| CN114689407A (zh) * | 2022-04-14 | 2022-07-01 | 四川大学华西医院 | 一种动物微小组织石蜡切片的制作方法 |
| CN114689407B (zh) * | 2022-04-14 | 2023-05-19 | 四川大学华西医院 | 一种动物微小组织石蜡切片的制作方法 |
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