RU2764514C1

RU2764514C1 - Способ выделения коллагеновых волокон дермы

Info

Publication number: RU2764514C1
Application number: RU2020142837A
Authority: RU
Inventors: Любовь Николаевна Горбатова; Никита Алексеевич Шутский; Сергей Леонидович Кашутин; Светлана Ивановна Малявская; Леонид Леонидович Шагров; Денис Владимирович Мизгирев; Дмитрий Германович Чухчин
Priority date: 2020-12-23
Filing date: 2020-12-23
Publication date: 2022-01-18

Abstract

Изобретение относится к гистологии, дерматологии, а именно к способу выделения коллагеновых волокон дермы. Способ выделения коллагеновых волокон дермы, заключающийся в обработке фиксированных в формалине при температуре 18-20°С нарезанных микротомным ножом кусочков кожи 50% раствором гидроксида калия в течение 15 часов, материал гомогенизируют струёй дистиллированной воды из пипетки Пастера, с последующим суспендированием, с проведением не менее пяти циклов гомогенизации и центрифугирования материала при 1500 оборотов в минуту в течение 5 минут циклы гомогенизации и центрифугирования проводят до достижения уровня рН надосадочной жидкости 6,0, весь материал переносят в градуированные пробирки, замораживают при -80°С, лиофильно высушивают и переносят на двухсторонний скотч для дальнейшего электронно-сканирующего исследования. Вышеописанный способ заявитель усматривает в уменьшение материальных и временных затрат в процессе выделения коллагеновых волокон дермы, а также в расширение лабораторных возможностей определения коллагена в дерме.

Description

Изобретение относится к гистологии, дерматологии и может быть использовано для выделения отдельных волокон коллагена дермы.

Известен способ получения коллагеновых волокон из коллагенсодержащих тканей животных, заключающийся в том, что исходное сырье подвергают измельчению, сушке и повторному измельчению, при этом на всем протяжении обработки температуру сырья поддерживают не выше 75°С [1]. Недостатками указанного способа являются проведение отдельной процедуры пастеризации или стерилизации и двойной сушки материала, а также возможное присутствие карбогидратов в форме полисахаридов в конечном продукте. Также известен способ получения коллагеновых волокон, заключающийся в том, что коллагенсодержащее сырье после обеззоливания и мягчения обрабатывают раствором хлористого натрия и кальция, подвергают пролежке, промывают, дубят раствором формальдегида в присутствии жира и перекиси водорода, затем повышают основность карбонатом натрия, сушат и подвергают механической обработке для разъединения связей волокон и их извлечения [2]. Недостатками указанного способа являются применение токсичного формальдегида, проведение дубления, сушки и механической обработки.

Также известен способ получения препаратов изолированных клеток дермы [3]. Положительными в данном способе являются его возможность в отделении клеточных компонентов из дермы, широкий спектр применения. Недостатком указанного способа является то, что он позволяет выделять клеточные структуры, а не основной компонент межклеточного матрикса -коллаген.

Прототипом заявленного изобретения является способ получения коллагена из биологического материала [4], в котором раскрывается способ выделения коллагеновых волокон из биологического материала с высоким содержанием коллагена, в том числе нативной дермы, заключающийся в разрезании материала на кусочки, обработке раствором щёлочи (NaOH, КОН), с концентрацией в пределах от 10 до 20% в течение одного часа, что приводит к разрушению клеточного компонента биологического материала, экстракции из него внутриклеточных и экстрацеллюлярных неколлагеновых белков и разрыхлению коллагеновых волокон, что способствует быстрому растворению коллагена в кислоте. Затем обработанные щелочью фрагменты коллагенсодержащего материала тщательно промывают проточной водой и растворяют в 20% растворе уксусной кислоты, выделение коллагена из кислотного раствора производят осаждением его ацетоном, приливая раствор в ацетон при постоянном интенсивном перемешивании. Осажденный коллаген снимают с мешалки, и высушивают или лиофилизируют. Недостатками указанного способа является: применение для обработки материала растворов щелочи концентрацией 10-20% в течение небольшого промежутка времени (1 час), что не позволяет в достаточной степени разрушать неколлагеновые структуры в исследуемом материале; необходимость использования 20% уксусной кислоты и токсичного ацетона, отсутствие контроля рН среды при осуществлении способа.

Задача предлагаемого изобретения: расширение лабораторных возможностей определения коллагена в дерме. Технический результат предлагаемого изобретения: уменьшение материальных и временных затрат в процессе выделения коллагеновых волокон дермы.

Указанная задача в предлагаемом способе достигается тем, что фиксированные в формалине кусочки кожи нарезают микротомным ножом при температуре 18-20°С мелкими фрагментами, заливают 1 мл 50% гидроксида калия на 15 часов при температуре 18-20°С, промывают дистиллированной водой пятикратно при температуре 18-20°С, гомогенизируют материал струей воды из пипетки Пастера, с последующим суспендированием, с проведением не менее пяти циклов гомогенизации и центрифугирования материала при 1500 оборотов в минуту в течение 5 минут до достижения уровня рН надосадочной жидкости 6,0, весь материал переносят в градуированные пробирки, замораживают полученную суспензию при -80°С, лиофильно высушивают при 0,080 мбар и -40°С, высыпают и приклеивают лиофилизат на двухсторонний скотч для электронно-сканирующей микроскопии.

Указанный способ осуществляется следующим образом. Фиксированный в гистологическом забуференном 10% нейтральном формалине кусочек кожи, полученный путем панч-биопсии скальпелем №5, без предварительной заморозки нарезают микротомным ножом (или микротомным лезвием) на мелкие фрагменты толщиной не более 3 мм, помещают полученные фрагменты в центрифужную градуированную пробирку. Заливают фрагменты 1 мл 50% водного раствора гидроксида калия на 15 часов, после чего удаляют из пробирки раствор щелочи путем аспирации пипеткой Пастера и наливают дистиллированную воду при температуре 18-20°С в объеме 5 мл. Гомогенизируют материал при помощи струи воды из пипетки Пастера объемом 2 мл в течение 2-3 минут, доводят объем воды в пробирке до 10 мл и центрифугируют в течение 5 минут при 1500 оборотах в минуту. После центрифугирования аспирируют воду из пробирки таким образом, чтобы осадок на дне пробирки находился в объеме жидкости, не превышающем 0,5 мл, измеряют рН при помощи универсальной индикаторной бумаги, добавляют дистиллированную воду до объема 5 мл и повторно гомогенизируют материал способом, описанным выше. Цикл гомогенизации и центрифугирования повторяют до достижения уровня рН надосадочной жидкости 6,0, но не менее пяти раз. После достижения целевого уровня рН 6,0 в надосадочной жидкости суспендируют полученный материал путем многократного пассажа содержимого пробирки пипеткой Пастера, полученную суспензию переносят в градуированную пробирку Eppendorf, вместимостью 1,5 мл, и замораживают при -80°С и лиофильно высушивают. После полного высушивания лиофилизат переносят на двухсторонний скотч и приклеивают для дальнейшего исследования в электронно-сканирующем микроскопе.

Способ позволяет расширить возможности получения отдельных коллагеновых волокон для последующего изучения их морфологии, без применения гистологических красок. Заявленный способ позволяет снизить материальные и временные затраты на проведение анализа по сравнению с описанными ранее способами, позволяет выполнять приготовление материала без использования пастеризации или стерилизации, не требует применения микротома, дополнительной сушки и окрашивания конечного продукта. Кроме того, применение в заявленном способе этапа центрифугирования материала позволяет достичь более высокого содержания отдельных коллагеновых волокон в лиофилизате, избегая присутствия карбогидратов.

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ

1. Хэдден Ральф. Способ получения коллагеновых волокон из коллагенсодержащих тканей животных. Описание изобретения к авторскому свидетельству №2007926, заявка 4894610/13, 30.11.1990.

2. Окамура Хироси. Способ получения коллагеновых волокон. Патент №334723, заявка1311910/28-12, 07.11.1969, Бюллетень №12.

3. Кашутин С.Л., Журавлев Л.М., Вилова К.Г., Мизгирев Д.В., Зашихин А.Л. Способ получения препаратов изолированных клеток дермы. Патент №2617237, заявка 2015124695, 23.06.2015, Бюллетень №12.

4. Анфимов П.Е., Краснова Н.С. Способ получения коллагена из биологического материала. Патент № 2322249, заявка 2006138769/15, 02.11.2006.

Claims

Способ выделения коллагеновых волокон дермы, заключающийся в обработке фиксированных в формалине при температуре 18-20°С нарезанных микротомным ножом кусочков кожи раствором гидроксида калия, промывании материала струей воды с последующей лиофилизацией полученного материала для дальнейшего изучения, отличающийся тем, что для обработки дермы используют раствор гидроксида калия с концентрацией 50% в течение 15 часов, материал гомогенизируют струёй дистиллированной воды из пипетки Пастера, с последующим суспендированием, с проведением не менее пяти циклов гомогенизации и центрифугирования материала при 1500 оборотов в минуту в течение 5 минут циклы гомогенизации и центрифугирования проводят до достижения уровня рН надосадочной жидкости 6,0, весь материал переносят в градуированные пробирки, замораживают при -80°С, лиофильно высушивают и переносят на двухсторонний скотч для дальнейшего электронно-сканирующего исследования.