RU2689337C1 - Способ определения количества коллагена в ткани - Google Patents
Способ определения количества коллагена в ткани Download PDFInfo
- Publication number
- RU2689337C1 RU2689337C1 RU2018124160A RU2018124160A RU2689337C1 RU 2689337 C1 RU2689337 C1 RU 2689337C1 RU 2018124160 A RU2018124160 A RU 2018124160A RU 2018124160 A RU2018124160 A RU 2018124160A RU 2689337 C1 RU2689337 C1 RU 2689337C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- collagen
- tissue
- weighed
- amount
- frozen
- Prior art date
Links
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 title claims abstract description 18
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 title claims abstract description 18
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 title claims abstract description 18
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 18
- 239000000463 material Substances 0.000 claims abstract description 36
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 10
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims abstract description 8
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 claims abstract description 8
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 claims abstract description 4
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 239000003708 ampul Substances 0.000 claims abstract description 4
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 claims abstract description 4
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims abstract 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims abstract 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 claims 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 abstract description 3
- 238000001035 drying Methods 0.000 abstract 2
- 238000003801 milling Methods 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 9
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 239000000941 radioactive substance Substances 0.000 description 2
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Sampling And Sample Adjustment (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии, гистологии и может быть использовано для количественного определения коллагена в ткани. Способ определения количества коллагена в ткани заключается в многократной гомогенизации материала, полученного путем замораживания, лиофильного высушивания, измельчения предварительно взвешенного кусочка ткани, с последующим ресуспендированием материала с помощью дозатора и центрифугированием, далее подготовленный материал замораживают при -80°С и лиофильно высушивают, полученный безводный материал взвешивают, определяют массу материала m1, разводят материал в 900 мкл буферного раствора с рН 7,0 и добавляют 100 мкл раствора коллализина, который заранее приготовляют путем растворения содержимого одной ампулы коллализина, содержащей коллагеназу в виде лиофилизата в количестве 1000 КЕ, в 2 мл буферного раствора с рН 7,0, пробирку с содержимым перемешивают в течение 2 часов, три раза проводят цикл гомогенизации, центрифугирования при 13400 оборотов в минуту и ресуспендирования материала, материал замораживают при -80°С, лиофильно высушивают и взвешивают, определяют массу материала m2, по разнице масс m1-m2 определяют массу коллагена.
Description
Изобретение относится к биотехнологии, гистологии и может быть использовано для количественного определения коллагена в ткани.
Известен способ количественного определения содержания коллагена, заключающийся в проведении реакции антиген-антитело с использованием меченых радиоактивными изотопами реактивов [1]. Недостатками указанного способа являются невозможность исследования образцов тканей (способ применим только для растворов), необходимость применения радиоактивных веществ.
Прототипом заявленного изобретения является способ количественного определения коллагена в ткани [2]. Положительными в данном способе являются его возможность точного определения концентрации коллагена, широкий спектр применения. Недостатками указанного способа являются технологическая сложность процедуры, необходимость применения хроматографа высокого давления, высокая стоимость применяемого оборудования и расходных материалов, реактивов.
Задача предлагаемого изобретения: расширение лабораторных возможностей количественного определения коллагена в тканях. Технический результат предлагаемого изобретения: уменьшение материальных и временных затрат в процессе количественного определения коллагена в тканях.
Указанная задача в предлагаемом способе достигается тем, что предварительно взвешенный замороженный при температуре -80°С в 0,9% физиологическом растворе хлорида натрия кусочек ткани лиофильно высушивают, измельчают микротомным лезвием, заливают 1 мл 15% водного раствора гидроксида натрия на 24 часа при температуре 18-20°С, повторяют процедуру, включающую гомогенизацию путем ресуспендирования дозатором, центрифугирование, аспирацию надосадочной жидкости и добавление воды до объема 1 мл, до достижения уровня рН надосадочной жидкости 7,0, но не менее 5 раз, подготовленный материал замораживают при - 80°С и лиофильно высушивают, полученный безводный материал взвешивают, определяют массу материала m1, разводят материал в 900 мкл буферного раствора с рН 7,0 и добавляют 100 мкл раствора коллализина, который заранее приготавливают путем растворения содержимого одной ампулы коллализина, содержащей коллагеназу в виде лиофилизата в количестве 1000 КЕ, в 2 мл буферного раствора с рН 7,0, пробирку с содержимым перемешивают в течение 2 часов, три раза проводят цикл гомогенизации, центрифугирования при 13400 оборотов в минуту в течение 5 минут и ресуспендирования материала, материал замораживают при -80°С, лиофильно высушивают и взвешивают, определяют массу материала m2, по разнице масс m1-m2 определяют количество коллагена.
Указанный способ осуществляется следующим образом. Предварительно взвешенный и замороженный при -80°С в 1 мл 0,9% физиологического раствора хлорида натрия кусочек ткани лиофильно высушивают в лиофильной сушилке при температуре -46°С и давлении 0,040 мБар, измельчают путем нарезания микротомным лезвием (или микротомным ножом) на максимально мелкие фрагменты толщиной не более 3 мм, можно меньше, помещают полученные фрагменты в градуированную пробирку Eppendorf, вместимостью 1,5 мл. Заливают фрагменты 1 мл 15% водного раствора гидроксида натрия на 24 часа при температуре 18-20°С, после чего удаляют из пробирки раствор щелочи путем аспирации дозатором и наливают дистиллированную воду при температуре 18-20°С в объеме 1 мл. Гомогенизируют материал путем ресуспендирования при помощи дозатора, выполняя многократную последовательную аспирацию содержимого пробирки дозатором и обратного впрыскивания в пробирку из дозатора материала в течение 2-3 минут, центрифугируют гомогенизированный материал в течение 5 минут при 13400 оборотах в минуту. После центрифугирования аспирируют дозатором надосадочную жидкость из пробирки таким образом, чтобы осадок на дне пробирки находился в объеме жидкости, не превышающем 0,5 мл, можно меньше, добавляют дистиллированную воду до объема 1 мл и повторно гомогенизируют материал способом, описанным выше. Процедуру, включающую гомогенизацию путем ресуспендирования дозатором, центрифугирование, аспирацию надосадочной жидкости и добавление воды до объема 1 мл повторяют до достижения уровня рН надосадочной жидкости 7,0, но не менее 5 раз. После достижения целевого уровня рН в надосадочной жидкости 7,0 аспирируют надосадочную жидкость дозатором таким образом, чтобы количество осадка в пробирке не превышало 0,3 мл. Полученный материал замораживают при -80°С, лиофильно высушивают в лиофильной сушилке и взвешивают на аналитических весах, определяют массу материала m1. Затем полученный безводный осадок разводят в 900 мкл буферного раствора с рН 7,0 и добавляют 100 мкл раствора коллализина, который заранее приготавливают путем растворения содержимого одной ампулы коллализина (содержащей коллагеназу в виде лиофилизата для приготовления раствора в количестве 1000 КЕ) в 2 мл буферного раствора с рН 7,0. Затем пробирку с содержимым устанавливают в шейкер при температуре 37°С и перемешивают в течение 2 часов. После этого пробирку снимают, центрифугируют при 13400 оборотов в минуту в течение 5 минут, аспирируют дозатором надосадочную жидкость, добавляют дистиллированную воду до объема 1 мл, гомогенизируют полученный материал путем многократной аспирации содержимого пробирки дозатором и обратного впрыскивания в пробирку. Процедуру, включающую гомогенизацию путем ресуспендирования дозатором, центрифугирование, аспирацию надосадочной жидкости и добавление воды до объема 1 мл повторяют 3 раза. После этого материал замораживают при -80°С, лиофильно высушивают в лиофильной сушилке и взвешивают на аналитических весах, определяя массу материала m2. По разнице масс m1-m2 определяют массу коллагена, содержавшегося в исследуемой ткани. Процентное содержание коллагена в ткани определяют отношением определенной массы коллагена к массе образца ткани.
Способ позволяет определить количество коллагена в ткани, снизить материальные и временные затраты на проведение анализа, избежать использования радиоактивных веществ.
ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ
1. Земсков В.М., Смирнов М.Д., Алексеев А.Б., Масенко В.П. Способ количественного определения коллагена. Описание изобретения к авторскому свидетельству №935792, заявка 2966207/30-15, 15.06.1982, бюллетень №22.
2. Виллануэва Патриция А., Макналти Эми К., Беникер Герберт Д., Киесветтер Кристин. Способ количественного определения коллагена в ткани. Патент №2452956, заявка 2009109113/15, 21.09.2006.
Claims (1)
- Способ определения количества коллагена в ткани, заключающийся в многократной гомогенизации материала, полученного путем замораживания, лиофильного высушивания, измельчения предварительно взвешенного кусочка ткани с последующим ресуспендированием материала с помощью дозатора и центрифугированием, отличающийся тем, что подготовленный материал замораживают при -80°С и лиофильно высушивают, полученный безводный материал взвешивают, определяют массу материала m1, разводят материал в 900 мкл буферного раствора с рН 7,0 и добавляют 100 мкл раствора коллализина, который заранее приготовляют путем растворения содержимого одной ампулы коллализина, содержащей коллагеназу в виде лиофилизата в количестве 1000 КЕ, в 2 мл буферного раствора с рН 7,0, пробирку с содержимым перемешивают в течение 2 часов, три раза проводят цикл гомогенизации, центрифугирования при 13400 оборотов в минуту и ресуспендирования материала, материал замораживают при -80°С, лиофильно высушивают и взвешивают, определяют массу материала m2, по разнице масс m1-m2 определяют массу коллагена.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018124160A RU2689337C1 (ru) | 2018-07-02 | 2018-07-02 | Способ определения количества коллагена в ткани |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018124160A RU2689337C1 (ru) | 2018-07-02 | 2018-07-02 | Способ определения количества коллагена в ткани |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2689337C1 true RU2689337C1 (ru) | 2019-05-27 |
Family
ID=66636689
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2018124160A RU2689337C1 (ru) | 2018-07-02 | 2018-07-02 | Способ определения количества коллагена в ткани |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2689337C1 (ru) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112007709A (zh) * | 2020-07-03 | 2020-12-01 | 浙江科恩实验设备有限公司 | 一种动态控制蒸发量的试管架 |
| RU2764514C1 (ru) * | 2020-12-23 | 2022-01-18 | федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Северный государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Способ выделения коллагеновых волокон дермы |
-
2018
- 2018-07-02 RU RU2018124160A patent/RU2689337C1/ru active
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| A. Nimptsch et al. Quantitative analysis of denatured collagen by collagenase digestion and subsequent MALDI-TOF mass spectrometry / Cell Tissue Res, 2011, 343, pages 605-617. * |
| H. Yasmin et al. Amplified and selective assay of collagens by enzymatic and fluorescent reactions / Sci Rep., 2014, 4, 8 pages [Найдено в Интернете он-лайн 26.03.2019 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4018762/]. * |
| В.К.ШОРМАНОВ и др. ФОТОМЕТРИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОЛЛАГЕНА ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ЦИРРОТИЧЕСКИХ ИЗМЕНЕНИЙ В ПЕЧЕНИ / Ученые записки Орловского государственного университета, 2013, N 6 (56), стр. 283-288. * |
| В.К.ШОРМАНОВ и др. ФОТОМЕТРИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОЛЛАГЕНА ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ЦИРРОТИЧЕСКИХ ИЗМЕНЕНИЙ В ПЕЧЕНИ / Ученые записки Орловского государственного университета, 2013, N 6 (56), стр. 283-288. A. Nimptsch et al. Quantitative analysis of denatured collagen by collagenase digestion and subsequent MALDI-TOF mass spectrometry / Cell Tissue Res, 2011, 343, pages 605-617. H. Yasmin et al. Amplified and selective assay of collagens by enzymatic and fluorescent reactions / Sci Rep., 2014, 4, 8 pages [Найдено в Интернете он-лайн 26.03.2019 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4018762/]. * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112007709A (zh) * | 2020-07-03 | 2020-12-01 | 浙江科恩实验设备有限公司 | 一种动态控制蒸发量的试管架 |
| CN112007709B (zh) * | 2020-07-03 | 2021-10-01 | 浙江科恩实验设备有限公司 | 一种动态控制蒸发量的试管架 |
| RU2764514C1 (ru) * | 2020-12-23 | 2022-01-18 | федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Северный государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Способ выделения коллагеновых волокон дермы |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4731330A (en) | Whole blood control sample | |
| Stark | GraFix: stabilization of fragile macromolecular complexes for single particle cryo-EM | |
| CN111830120B (zh) | 应用质谱系统鉴定新冠病毒的试剂盒及其使用方法 | |
| Zlonis | The mystique of the erythrocyte sedimentation rate: a reappraisal of one of the oldest laboratory tests still in use | |
| RU2689337C1 (ru) | Способ определения количества коллагена в ткани | |
| Arndt-Jovin et al. | Studies of cellular differentiation by automated cell separation. Two model systems: Friend virus-transformed cells and Hydra attenuata. | |
| CN1432814A (zh) | 对照组合物及其用于凝结实验的方法 | |
| Whaley et al. | Haemolytic assays for whole complement activity and individual components | |
| Sousa et al. | Serum total and bone alkaline phosphatase and tartrate-resistant acid phosphatase activities for the assessment of bone fracture healing in dogs | |
| CN103116030A (zh) | 一种检测i型糖尿病自身免疫抗体试剂盒及其检测方法 | |
| AU2004258113B2 (en) | Method and system for detection of von Willebrand factor (vWF) multimers | |
| Gui et al. | Influenza virus-liposome fusion studies using fluorescence dequenching and cryo-electron tomography | |
| RU2691413C1 (ru) | Способ определения бактериального эндотоксина в биологических жидкостях | |
| Kit | Instruction manual | |
| André-Grégoire et al. | Isolating plasma extracellular vesicles from mouse blood using size-exclusion chromatography, density gradient, and ultracentrifugation | |
| CN106596689A (zh) | 一种油佐剂疫苗的精确定性定量检测方法 | |
| JP5963984B2 (ja) | 甲状腺刺激抗体測定における試料の前処理方法 | |
| Hardy et al. | Purification and isolation of proteins from hyaline cartilage | |
| Hartwig et al. | Investigating the Adipose Tissue Secretome: A Protocol to Generate High-Quality Samples Appropriate for Comprehensive Proteomic Profiling | |
| Zhou et al. | Application of protein crystallization methodologies to enhance the solubility, stability and monodispersity of proteins | |
| RU2617237C2 (ru) | Способ получения препаратов изолированных клеток дермы | |
| Hoq et al. | Studies on a direct latex agglutination technique for the semiquantitation of fibrin/fibrinogen degradation products | |
| RU2764514C1 (ru) | Способ выделения коллагеновых волокон дермы | |
| Sumarsono et al. | Detection of Plasma Membrane Alpha Enolase (ENO1) and Its Relationship with Sperm Quality of Bali Cattle | |
| Watanabe et al. | Method comparison between tube and microcolumn techniques for the indirect antiglobulin test. |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| TC4A | Change in inventorship |
Effective date: 20190807 |