RU2689337C1 - Способ определения количества коллагена в ткани - Google Patents

Способ определения количества коллагена в ткани Download PDF

Info

Publication number
RU2689337C1
RU2689337C1 RU2018124160A RU2018124160A RU2689337C1 RU 2689337 C1 RU2689337 C1 RU 2689337C1 RU 2018124160 A RU2018124160 A RU 2018124160A RU 2018124160 A RU2018124160 A RU 2018124160A RU 2689337 C1 RU2689337 C1 RU 2689337C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
collagen
tissue
weighed
amount
frozen
Prior art date
Application number
RU2018124160A
Other languages
English (en)
Inventor
Светлана Ивановна Малявская
Сергей Леонидович Кашутин
Никита Алексеевич Шутинский
Леонид Леонидович Шагров
Денис Владимирович Мизгирёв
Андрей Сергеевич Аксенов
Дмитрий Германович Чухчин
Original Assignee
федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Северный государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Северный государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации filed Critical федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Северный государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации
Priority to RU2018124160A priority Critical patent/RU2689337C1/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2689337C1 publication Critical patent/RU2689337C1/ru

Links

Classifications

    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Sampling And Sample Adjustment (AREA)

Abstract

Изобретение относится к биотехнологии, гистологии и может быть использовано для количественного определения коллагена в ткани. Способ определения количества коллагена в ткани заключается в многократной гомогенизации материала, полученного путем замораживания, лиофильного высушивания, измельчения предварительно взвешенного кусочка ткани, с последующим ресуспендированием материала с помощью дозатора и центрифугированием, далее подготовленный материал замораживают при -80°С и лиофильно высушивают, полученный безводный материал взвешивают, определяют массу материала m1, разводят материал в 900 мкл буферного раствора с рН 7,0 и добавляют 100 мкл раствора коллализина, который заранее приготовляют путем растворения содержимого одной ампулы коллализина, содержащей коллагеназу в виде лиофилизата в количестве 1000 КЕ, в 2 мл буферного раствора с рН 7,0, пробирку с содержимым перемешивают в течение 2 часов, три раза проводят цикл гомогенизации, центрифугирования при 13400 оборотов в минуту и ресуспендирования материала, материал замораживают при -80°С, лиофильно высушивают и взвешивают, определяют массу материала m2, по разнице масс m1-m2 определяют массу коллагена.

Description

Изобретение относится к биотехнологии, гистологии и может быть использовано для количественного определения коллагена в ткани.
Известен способ количественного определения содержания коллагена, заключающийся в проведении реакции антиген-антитело с использованием меченых радиоактивными изотопами реактивов [1]. Недостатками указанного способа являются невозможность исследования образцов тканей (способ применим только для растворов), необходимость применения радиоактивных веществ.
Прототипом заявленного изобретения является способ количественного определения коллагена в ткани [2]. Положительными в данном способе являются его возможность точного определения концентрации коллагена, широкий спектр применения. Недостатками указанного способа являются технологическая сложность процедуры, необходимость применения хроматографа высокого давления, высокая стоимость применяемого оборудования и расходных материалов, реактивов.
Задача предлагаемого изобретения: расширение лабораторных возможностей количественного определения коллагена в тканях. Технический результат предлагаемого изобретения: уменьшение материальных и временных затрат в процессе количественного определения коллагена в тканях.
Указанная задача в предлагаемом способе достигается тем, что предварительно взвешенный замороженный при температуре -80°С в 0,9% физиологическом растворе хлорида натрия кусочек ткани лиофильно высушивают, измельчают микротомным лезвием, заливают 1 мл 15% водного раствора гидроксида натрия на 24 часа при температуре 18-20°С, повторяют процедуру, включающую гомогенизацию путем ресуспендирования дозатором, центрифугирование, аспирацию надосадочной жидкости и добавление воды до объема 1 мл, до достижения уровня рН надосадочной жидкости 7,0, но не менее 5 раз, подготовленный материал замораживают при - 80°С и лиофильно высушивают, полученный безводный материал взвешивают, определяют массу материала m1, разводят материал в 900 мкл буферного раствора с рН 7,0 и добавляют 100 мкл раствора коллализина, который заранее приготавливают путем растворения содержимого одной ампулы коллализина, содержащей коллагеназу в виде лиофилизата в количестве 1000 КЕ, в 2 мл буферного раствора с рН 7,0, пробирку с содержимым перемешивают в течение 2 часов, три раза проводят цикл гомогенизации, центрифугирования при 13400 оборотов в минуту в течение 5 минут и ресуспендирования материала, материал замораживают при -80°С, лиофильно высушивают и взвешивают, определяют массу материала m2, по разнице масс m1-m2 определяют количество коллагена.
Указанный способ осуществляется следующим образом. Предварительно взвешенный и замороженный при -80°С в 1 мл 0,9% физиологического раствора хлорида натрия кусочек ткани лиофильно высушивают в лиофильной сушилке при температуре -46°С и давлении 0,040 мБар, измельчают путем нарезания микротомным лезвием (или микротомным ножом) на максимально мелкие фрагменты толщиной не более 3 мм, можно меньше, помещают полученные фрагменты в градуированную пробирку Eppendorf, вместимостью 1,5 мл. Заливают фрагменты 1 мл 15% водного раствора гидроксида натрия на 24 часа при температуре 18-20°С, после чего удаляют из пробирки раствор щелочи путем аспирации дозатором и наливают дистиллированную воду при температуре 18-20°С в объеме 1 мл. Гомогенизируют материал путем ресуспендирования при помощи дозатора, выполняя многократную последовательную аспирацию содержимого пробирки дозатором и обратного впрыскивания в пробирку из дозатора материала в течение 2-3 минут, центрифугируют гомогенизированный материал в течение 5 минут при 13400 оборотах в минуту. После центрифугирования аспирируют дозатором надосадочную жидкость из пробирки таким образом, чтобы осадок на дне пробирки находился в объеме жидкости, не превышающем 0,5 мл, можно меньше, добавляют дистиллированную воду до объема 1 мл и повторно гомогенизируют материал способом, описанным выше. Процедуру, включающую гомогенизацию путем ресуспендирования дозатором, центрифугирование, аспирацию надосадочной жидкости и добавление воды до объема 1 мл повторяют до достижения уровня рН надосадочной жидкости 7,0, но не менее 5 раз. После достижения целевого уровня рН в надосадочной жидкости 7,0 аспирируют надосадочную жидкость дозатором таким образом, чтобы количество осадка в пробирке не превышало 0,3 мл. Полученный материал замораживают при -80°С, лиофильно высушивают в лиофильной сушилке и взвешивают на аналитических весах, определяют массу материала m1. Затем полученный безводный осадок разводят в 900 мкл буферного раствора с рН 7,0 и добавляют 100 мкл раствора коллализина, который заранее приготавливают путем растворения содержимого одной ампулы коллализина (содержащей коллагеназу в виде лиофилизата для приготовления раствора в количестве 1000 КЕ) в 2 мл буферного раствора с рН 7,0. Затем пробирку с содержимым устанавливают в шейкер при температуре 37°С и перемешивают в течение 2 часов. После этого пробирку снимают, центрифугируют при 13400 оборотов в минуту в течение 5 минут, аспирируют дозатором надосадочную жидкость, добавляют дистиллированную воду до объема 1 мл, гомогенизируют полученный материал путем многократной аспирации содержимого пробирки дозатором и обратного впрыскивания в пробирку. Процедуру, включающую гомогенизацию путем ресуспендирования дозатором, центрифугирование, аспирацию надосадочной жидкости и добавление воды до объема 1 мл повторяют 3 раза. После этого материал замораживают при -80°С, лиофильно высушивают в лиофильной сушилке и взвешивают на аналитических весах, определяя массу материала m2. По разнице масс m1-m2 определяют массу коллагена, содержавшегося в исследуемой ткани. Процентное содержание коллагена в ткани определяют отношением определенной массы коллагена к массе образца ткани.
Способ позволяет определить количество коллагена в ткани, снизить материальные и временные затраты на проведение анализа, избежать использования радиоактивных веществ.
ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ
1. Земсков В.М., Смирнов М.Д., Алексеев А.Б., Масенко В.П. Способ количественного определения коллагена. Описание изобретения к авторскому свидетельству №935792, заявка 2966207/30-15, 15.06.1982, бюллетень №22.
2. Виллануэва Патриция А., Макналти Эми К., Беникер Герберт Д., Киесветтер Кристин. Способ количественного определения коллагена в ткани. Патент №2452956, заявка 2009109113/15, 21.09.2006.

Claims (1)

  1. Способ определения количества коллагена в ткани, заключающийся в многократной гомогенизации материала, полученного путем замораживания, лиофильного высушивания, измельчения предварительно взвешенного кусочка ткани с последующим ресуспендированием материала с помощью дозатора и центрифугированием, отличающийся тем, что подготовленный материал замораживают при -80°С и лиофильно высушивают, полученный безводный материал взвешивают, определяют массу материала m1, разводят материал в 900 мкл буферного раствора с рН 7,0 и добавляют 100 мкл раствора коллализина, который заранее приготовляют путем растворения содержимого одной ампулы коллализина, содержащей коллагеназу в виде лиофилизата в количестве 1000 КЕ, в 2 мл буферного раствора с рН 7,0, пробирку с содержимым перемешивают в течение 2 часов, три раза проводят цикл гомогенизации, центрифугирования при 13400 оборотов в минуту и ресуспендирования материала, материал замораживают при -80°С, лиофильно высушивают и взвешивают, определяют массу материала m2, по разнице масс m1-m2 определяют массу коллагена.
RU2018124160A 2018-07-02 2018-07-02 Способ определения количества коллагена в ткани RU2689337C1 (ru)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2018124160A RU2689337C1 (ru) 2018-07-02 2018-07-02 Способ определения количества коллагена в ткани

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2018124160A RU2689337C1 (ru) 2018-07-02 2018-07-02 Способ определения количества коллагена в ткани

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2689337C1 true RU2689337C1 (ru) 2019-05-27

Family

ID=66636689

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2018124160A RU2689337C1 (ru) 2018-07-02 2018-07-02 Способ определения количества коллагена в ткани

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2689337C1 (ru)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112007709A (zh) * 2020-07-03 2020-12-01 浙江科恩实验设备有限公司 一种动态控制蒸发量的试管架
RU2764514C1 (ru) * 2020-12-23 2022-01-18 федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Северный государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации Способ выделения коллагеновых волокон дермы

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A. Nimptsch et al. Quantitative analysis of denatured collagen by collagenase digestion and subsequent MALDI-TOF mass spectrometry / Cell Tissue Res, 2011, 343, pages 605-617. *
H. Yasmin et al. Amplified and selective assay of collagens by enzymatic and fluorescent reactions / Sci Rep., 2014, 4, 8 pages [Найдено в Интернете он-лайн 26.03.2019 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4018762/]. *
В.К.ШОРМАНОВ и др. ФОТОМЕТРИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОЛЛАГЕНА ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ЦИРРОТИЧЕСКИХ ИЗМЕНЕНИЙ В ПЕЧЕНИ / Ученые записки Орловского государственного университета, 2013, N 6 (56), стр. 283-288. *
В.К.ШОРМАНОВ и др. ФОТОМЕТРИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОЛЛАГЕНА ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ЦИРРОТИЧЕСКИХ ИЗМЕНЕНИЙ В ПЕЧЕНИ / Ученые записки Орловского государственного университета, 2013, N 6 (56), стр. 283-288. A. Nimptsch et al. Quantitative analysis of denatured collagen by collagenase digestion and subsequent MALDI-TOF mass spectrometry / Cell Tissue Res, 2011, 343, pages 605-617. H. Yasmin et al. Amplified and selective assay of collagens by enzymatic and fluorescent reactions / Sci Rep., 2014, 4, 8 pages [Найдено в Интернете он-лайн 26.03.2019 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4018762/]. *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112007709A (zh) * 2020-07-03 2020-12-01 浙江科恩实验设备有限公司 一种动态控制蒸发量的试管架
CN112007709B (zh) * 2020-07-03 2021-10-01 浙江科恩实验设备有限公司 一种动态控制蒸发量的试管架
RU2764514C1 (ru) * 2020-12-23 2022-01-18 федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Северный государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации Способ выделения коллагеновых волокон дермы

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US4731330A (en) Whole blood control sample
Stark GraFix: stabilization of fragile macromolecular complexes for single particle cryo-EM
CN111830120B (zh) 应用质谱系统鉴定新冠病毒的试剂盒及其使用方法
Zlonis The mystique of the erythrocyte sedimentation rate: a reappraisal of one of the oldest laboratory tests still in use
RU2689337C1 (ru) Способ определения количества коллагена в ткани
Arndt-Jovin et al. Studies of cellular differentiation by automated cell separation. Two model systems: Friend virus-transformed cells and Hydra attenuata.
CN1432814A (zh) 对照组合物及其用于凝结实验的方法
Whaley et al. Haemolytic assays for whole complement activity and individual components
Sousa et al. Serum total and bone alkaline phosphatase and tartrate-resistant acid phosphatase activities for the assessment of bone fracture healing in dogs
CN103116030A (zh) 一种检测i型糖尿病自身免疫抗体试剂盒及其检测方法
AU2004258113B2 (en) Method and system for detection of von Willebrand factor (vWF) multimers
Gui et al. Influenza virus-liposome fusion studies using fluorescence dequenching and cryo-electron tomography
RU2691413C1 (ru) Способ определения бактериального эндотоксина в биологических жидкостях
Kit Instruction manual
André-Grégoire et al. Isolating plasma extracellular vesicles from mouse blood using size-exclusion chromatography, density gradient, and ultracentrifugation
CN106596689A (zh) 一种油佐剂疫苗的精确定性定量检测方法
JP5963984B2 (ja) 甲状腺刺激抗体測定における試料の前処理方法
Hardy et al. Purification and isolation of proteins from hyaline cartilage
Hartwig et al. Investigating the Adipose Tissue Secretome: A Protocol to Generate High-Quality Samples Appropriate for Comprehensive Proteomic Profiling
Zhou et al. Application of protein crystallization methodologies to enhance the solubility, stability and monodispersity of proteins
RU2617237C2 (ru) Способ получения препаратов изолированных клеток дермы
Hoq et al. Studies on a direct latex agglutination technique for the semiquantitation of fibrin/fibrinogen degradation products
RU2764514C1 (ru) Способ выделения коллагеновых волокон дермы
Sumarsono et al. Detection of Plasma Membrane Alpha Enolase (ENO1) and Its Relationship with Sperm Quality of Bali Cattle
Watanabe et al. Method comparison between tube and microcolumn techniques for the indirect antiglobulin test.

Legal Events

Date Code Title Description
TC4A Change in inventorship

Effective date: 20190807