CN115786269A - 一种胎盘类器官模型的构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种胎盘类器官模型的构建方法，属于生物和医药领域，尤其涉及早期胎盘发育与类器官研究。本发明所述构建方法包括提取纯化牛胎盘滋养层细胞，获得永生化牛胎盘滋养层细胞系以及构建永生化牛胎盘类器官。本发明利用永生化的牛胎盘滋养层细胞系构建胎盘类器官，与传统的原代细胞相比功能一致，但克服了胎盘难以获取、原代细胞量不足的缺陷，本发明使用的细胞系取之不尽且构建成本低，可以在大部分动物类器官构建中推广应用。

Description

一种胎盘类器官模型的构建方法

技术领域

本发明涉及生物和医药领域，尤其涉及一种胎盘类器官模型的构建方法。

背景技术

日前，胎盘滋养层类器官在人类胎盘中母-胎相互作用中的研究已日渐成熟。相关研究一般都是利用酶解制备的原代滋养层细胞的分离株为富集EPCAM+细胞的细胞簇，该细胞簇接种到基质胶中并能在胎盘滋养细胞类器官培养液中生长，第一次传代后，出现类器官结构，2次传代(10-14d)即可建立细胞分布均匀的滋养层类器官。类器官中能够检测到单核的细胞滋养层细胞(CTB细胞)和多核的合体滋养层细胞(经CTB细胞融合形成的，STB)，然后使用EVT分化培养基(EVTM)成功完成EVT细胞的分化。滋养层类器官在结构上和表型上都高度类似胎盘绒毛组织。

然而，胎盘滋养层细胞的培养比较困难，要选取妊娠早期胎盘作为试验材料，此时滋养细胞活力强，易生长。胎盘随着妊娠月份的增加而逐渐老化，这时滋养层细胞也随之老化，且细胞数量少、活力低，很难获得满足试验所需的、性状稳定的原代滋养层细胞。而且目前用来培养胎盘类器官的细胞只能是取自胎盘原代细胞中富含EPCAM+细胞的细胞簇，细胞获取难度大，鉴定难度也大。

因此，获得一种细胞获取操作简单，可获取的细胞数量多，可以在大部分动物类器官构建中推广应用的类器官构建方法是非常必要的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种胎盘类器官模型的构建方法，利用永生化的牛胎盘滋养层细胞系构建类似于妊娠3月的牛胎盘组织的类器官，该类器官与传统的原代细胞构建的类器官相比功能一致，但本发明构建方法能够克服胎盘难以获取、原代细胞量不足的缺陷。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种胎盘类器官模型的构建方法，包括以下步骤：

(1)将纯化后的牛胎盘滋养层细胞通过pCI-neo-hTERT质粒进行转染、培养，获得永生化牛胎盘滋养层细胞系；

(2)将获得的永生化牛胎盘滋养层细胞系在培养基中洗涤、离心后重悬于基质胶中；

(3)向混有所述永生化牛胎盘滋养层细胞系的基质胶上添加TOM培养液进行培养，即获得永生化牛胎盘类器官。

作为优选，步骤(2)所述培养基为AdvancedDMEM/F12培养基；所述基质胶为液体状态的基质胶。

作为优选，步骤(2)所述永生化牛胎盘滋养层细胞系和基质胶的体积比为1：(0.5-2)。

作为优选，步骤(3)所述混有永生化牛胎盘滋养层细胞系的基质胶在添加TOM培养液之前还包括凝固处理，所述凝固处理的温度为32-39℃，所述凝固处理的时间为10-20min。

作为优选，步骤(3)所述混有永生化牛胎盘滋养层细胞系的基质胶与TOM培养液的体积比为1：(2-4)。

作为优选，步骤(3)所述培养过程中的温度为32-39℃，所述培养过程中的相对饱和湿度为90-96％，所述培养过程中的CO₂含量为3-6％。

作为优选，步骤(3)所述TOM培养液的配方为：

通过采用上述技术方案，本发明具有如下有益效果：

1.本发明中以奶牛胎盘滋养层细胞作为宿主细胞，转染pCI-neo-hTERT真核表达载体，经过G418筛选得到的永生化奶牛胎盘滋养层细胞系均一性好、稳定性强且培养方便。

2.本发明利用永生化的牛胎盘滋养层细胞系，成功构建的类似于妊娠3月的牛胎盘组织的类器官，与传统的原代细胞构建的类器官相比功能一致。

3.本发明中所述构建步骤对应参数条件是探究得到的，只有在本发明特定条件下类器官才能正常健康的长成。

4.本发明的胎盘类器官构建方法克服了胎盘难以获取，原代细胞量不足的缺陷，且构建成本低，可以在大部分动物类器官构建中推广应用。

附图说明

图1为纯化后的BTCs的形态特征(标尺＝1mm)；

图2为免疫荧光检测CK-7、波形蛋白、E-钙粘蛋白和CD90在原代BTC中的表达(×40，标尺＝50μm)；

图3为免疫荧光检测CK-7、波形蛋白、E-钙粘蛋白和CD90在FBFs中的表达(×40，标尺＝50μm)；

图4为对奶牛胎盘滋养层细胞的吉姆萨染色结果；

图5为TERT在蛋白和mRNA上的表达水平；

图6为标志蛋白在奶牛胎盘滋养层细胞中的表达情况；

图7为BTCs的生长曲线：

图8为BTCs分泌PL的能力；

图9为BTCs的迁移能力(×40，标尺＝50μm)；

图10为软琼脂实验检测细胞致瘤性结果；

图11为HE染色下牛胎盘滋养层组织结构(A、B、C分别展示妊娠2、3、4月奶牛胎盘滋养层组织的HE染色结果；黑色箭头标记滋养层双核细胞)；

图12为牛妊娠2、3、4月胎盘滋养层组织Ki67蛋白表达对比；

图13为原代细胞生成类器官生长形态；

图14为永生化的BTCs生成类器官生长形态；

图15为牛胎盘滋养层组织与类器官的CSH1蛋白表达定位情况(图中的A为妊娠三月滋养层组织；图中的B为原代细胞衍生类器官；图中的C为BTCs衍生类器官)；

图16为牛胎盘滋养层组织与类器官的CD71、CD46蛋白表达定位情况(图中的A为妊娠三月滋养层组织；图中的B为原代细胞衍生类器官；图中的C为BTCs衍生类器官)；

图17为EECs与类器官共培养前后容受性相关因子的差异表达情况(图中的A为共培养前后αVβ3、wnt7a、HOXA10、IFNAR-1和IFNAR-2的WB检测结果；图中的B为WB结果图的灰度分析结果，其中Control表示共培养前EECs蛋白表达量，Co-culure1表示与原代细胞来源类器官共培养后EECs蛋白表达量，Co-culure2表示与BTCs来源类器官共培养后EECs蛋白表达量)；

图18为胎盘类器官发育与妊娠2、3月份胎盘组织发育RNA测序分析。

具体实施方式

本发明提供了一种胎盘类器官模型的构建方法，包括以下步骤：

(1)将纯化后的牛胎盘滋养层细胞通过pCI-neo-hTERT质粒进行转染、培养，获得永生化牛胎盘滋养层细胞系；

(2)将获得的永生化牛胎盘滋养层细胞系在培养基中洗涤、离心后重悬于基质胶中；

(3)向混有所述永生化牛胎盘滋养层细胞系的基质胶上添加TOM培养液进行培养，即获得永生化牛胎盘类器官。

在本发明中，所述牛胎盘滋养层细胞采集于妊娠45-90d的早期妊娠荷斯坦奶牛子宫。

在本发明中，所述纯化后的牛胎盘滋养层细胞以每孔加入1×10⁵个细胞传入六孔板中，12h后观察细胞密度为80％-90％时可进行转染。所述转染的具体操作为：用无血清OPTI-MEM分别稀释质粒和lipofectamine2000转染试剂，然后将稀释后的质粒加入到稀释后的转染试剂中，再将混合后的质粒和转染试剂添加到六孔板中，并放入CO₂培养箱中继续培养。所述加入过程要缓慢，逐滴加入。其中，培养3-4h后进行换液，更换为含有400mg/mLG418的DMEM/F12完全培养基进行筛选，持续两周，从而筛选出永生化牛胎盘滋养层细胞系。

在本发明中，将获得的永生化牛胎盘滋养层细胞系在Advanced DMEM/F12培养基中洗涤1次，并以200-350g离心力离心2-8min后用提前预冷的移液枪枪头在冰上重悬于基质胶中。所述离心力进一步的优选为250-320g，更进一步的优选为300g；所述离心的时间进一步的优选为3-7min，更进一步的优选为5min。所述永生化牛胎盘滋养层细胞系和基质胶的体积比为1：(0.5-2)，进一步的优选为1：(0.8-1.5)，更进一步的优选为1：1。其中所述基质胶需要放置在4℃环境中至液体状态；所述移液枪枪头预冷是在冰上进行的，预冷的目的基质胶在低温下是液体，在高温下凝固成固体，保证基质胶呈液体状。

在本发明中，将所述混有永生化牛胎盘滋养层细胞系的基质胶滴加到提前预冷的96孔板中，每孔优选的滴加40-60μL，进一步的优选为45-55μL，更进一步的优选为50μL，且每孔细胞量控制在2×10²个。然后放入培养箱中进行凝固处理，所述凝固处理的温度优选为32-39℃，进一步的优选为35-38℃，更进一步的优选为37℃；所述凝固处理的时间优选为10-20min，进一步的优选为12-17min，更进一步的优选为15min。

在本发明中，将凝固后的混有永生化牛胎盘滋养层细胞系的基质胶每孔上添加提前预热的TOM培养液，所述混有永生化牛胎盘滋养层细胞系的基质胶与TOM培养液的体积比优选为1：(2-4)，进一步的优选为1：(2.5-3.5)，更进一步的优选为1:3。然后放置在培养箱中进行培养，且每3d更换一次培养液，所述培养的温度优选为32-39℃，进一步的优选为35-38℃，更进一步的优选为37℃；所述培养的相对饱和湿度优选为90-96％，进一步的优选为93-95.5％，更进一步的优选为95％；所述培养过程中的CO₂含量优选为3-6％，进一步的优选为4-5.5％，更进一步的优选为5％。

在本发明中，所述TOM培养液的配方为：

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1奶牛胎盘滋养层原代细胞的分离和纯化

(一)奶牛胎盘滋养层原代细胞的获取

本试验按照北京农学院动物伦理委员会的指导方针进行。采集妊娠45-90d的早期妊娠荷斯坦奶牛子宫，胎牛冠臀长为7cm。使用含有1％双抗的钙镁水冲洗子宫表面，在无菌条件下打开子宫并将胎盘与子宫阜分离。胎盘组织先浸泡于含有2％双抗的无菌DPBS缓冲液中，之后在75％酒精中浸泡15-30s，立即放入DPBS缓冲液内清洗。用无菌手术剪刀将胎盘组织分成1mm³组织块，接种到10cm²的培养皿中，在5％CO₂、37℃培养箱中培养30min，直到组织块贴附在培养皿上。然后加入含1％双抗、10％EXO-FBS的DMEM/F12培养基，37℃，5％CO₂的培养箱中培养。分别于24h和48h时进行细胞换液，之后每3d更换一次培养基，直至在倒置显微镜下观察到细胞爬出。

(二)奶牛胎盘滋养层原代细胞的纯化

弃去培养上清，用DPBS清洗2遍后，加入胰蛋白酶消化，观察到细胞变圆且部分漂浮，加入完全DMEM/F12培养基终止消化，并用移液枪吹打使其全部漂浮，收集细胞至15mL离心管，1500r/min离心5min，弃上清，用完全培养基将细胞重悬，重新种入培养瓶中培养20min后吸出上清液种入新培养瓶内。如此重复传代培养5次，可获得较高纯度的奶牛胎盘滋养层细胞(如图1)。

实施例2鉴定纯化后的奶牛胎盘滋养层细胞

(一)免疫荧光鉴定

在铺板之前将细胞爬片放置在24孔板板底，将细胞爬片从75％酒精里拿出，待酒精挥发干将其放于细胞板中。将奶牛胎盘滋养层细胞细胞以每孔1×10⁵个细胞传入24孔板中，同时接种胎牛成纤维细胞(Fetalbovine fibroblasts,FBF)于24孔板中作为成纤维样细胞的阳性对照。培养10-12h，显微镜下观察细胞密度在80％-90％，弃去培养上清并用PBS润洗三遍，用4％多聚甲醛固定液室温下固定细胞40min，弃去固定液并用PBS润洗三遍，加入0.1％TritionX-100室温下通透30min，PBS润洗三遍后加入封闭液(1％BSA-PBS)室温下封闭1h，弃去封闭液，按实验设计每孔分别加入200μLCK-7抗体(1:100)，vimentin(波形蛋白)抗体(1:100)，E-cadherin(E-钙粘蛋白)抗体(1:100)和CD90抗体(1:100)并将培养板置于湿盒内，4℃孵育过夜后PBS润洗3遍，加入FITC标记的二抗(1:50)，置于湿盒中37℃避光孵育1h，PBS润洗三遍后滴加DAPI避光孵育5min，PBS润洗3遍。吸取5μL防荧光淬灭封片剂滴加在干净载玻片上，将细胞爬片从细胞板中取出，放置时细胞面朝下，荧光显微镜观察，拍照。

以同等体积的PBS代替一抗孵育细胞，作为阴性对照，其余步骤同上。结果见图2-3，可以看出分别检测BTCs和FBFs中CK-7、Vimentin、CD90/Thy1、E-Cadherin的蛋白表达，以PBS作为阴性对照，发现BTCs中表达CK-7、Vimentin、E-Cadherin蛋白且表达率高于95％，而不表达成纤维细胞标志蛋白CD90/Thy1；FBF中表达Vimentin、CD90/Thy1、E-Cadherin，而不表达胎盘滋养层细胞标志蛋白CK-7。

(二)吉姆萨染色

在铺板之前将细胞爬片放置在24孔板板底，将奶牛胎盘滋养层细胞以每孔1×10⁴个细胞传入24孔板中。培养10-12h，显微镜下观察细胞密度在50％-60％，弃去培养上清并用PBS润洗三遍，用4％多聚甲醛固定细胞40min，弃去固定液并用PBS润洗三遍。吉姆萨染色Ⅰ液用PBS稀释10倍，然后滴加在爬片上，染色10min，吸弃染色Ⅰ液并用PBS洗三遍。然后滴加稀释10倍的吉姆萨染色Ⅱ液，染色10min，吸弃染色Ⅱ液并用PBS洗三遍。将细胞爬片从细胞板中取出，放置时细胞面朝下，然后在倒置光学显微镜下观察。

从图4可以看出，原代细胞具有较大的细胞核，少数细胞为双核或为多核，它们可能通过它们延伸的伪足相互通信。

实施例3建立永生化奶牛胎盘滋养层细胞系

(一)G418最佳筛选浓度的确定

接种纯化后的奶牛胎盘滋养层细胞于96孔板中，当细胞汇合度达到80％时加入含有不同浓度G418的完全培养基培养(20μM，40μM，80μM，100μM，200μM，400μM，800μM，1000μM)，每3d换液一次，观察细胞状态。结果发现，细胞在G418浓度高于400μM处理12-15d时完全死亡，G418浓度在20μM-400μM范围内处理12-15d，细胞死亡率逐渐增多，即细胞在12-15d时完全死亡所对应的G418浓度即为G418最佳浓度。

(二)pCI-neo-hTERT质粒转染原代奶牛胎盘滋养层细胞

pCI-neo-hTERT质粒采用OMEGA公司生产的Endo-freeplasmidmidikit按照说明书操作步骤进行质粒提取。

(1)细胞铺板：将奶牛胎盘滋养层细胞以每孔加入约1×10⁵个细胞传入六孔板中，12h后观察细胞密度应为80％-90％，方可进行转染。

(2)配制质粒DNA和转染试剂复合物：在1.5mL离心管中，准备1.5mL无菌离心管，分别稀释质粒和转染试剂。再各离心管中先加入250μL无血清OPTI-MEM。之后将4μg质粒，10μLlipofectamine2000转染试剂加入离心管中。加入过程要缓慢，逐滴加入。室温静置5min。静置过后，将稀释后的质粒缓慢滴入稀释后转染试剂中，室温静置20min。将六孔板标记好各实验分组，将混合后的质粒DNA和转染试剂缓慢滴入六孔板中。轻轻摇匀后，放入CO₂培养箱中继续培养。4h后进行换液，更换为含有400mg/mLG418的DMEM/F12完全培养基进行筛选，持续两周。两周后能够存活的细胞即为阳性细胞，消化后接种到加入DMEM/F12完全培养基的6mm培养皿中。

(3)连续传代50次以上。

实施例4外源性hTERT基因在转染后奶牛胎盘滋养层细胞中的表达

(一)RT-PCR检测外源性hTERTmRNA在转染后奶牛胎盘滋养层细胞中的表达

(1)引物设计

在NCBI上查找所需基因的序列，并运用NCBIPrimer-BLAST工具进行荧光定量引物设计，引物由上海生工合成。基因hTERT的引物序列包括SEQ ID NO.1：5’-TATGCCGTGGTCCAGAAGG-3’和SEQ ID NO.2：5’-CAAGAAATCATCCACCAAACG-3’；基因GAPDH的引物序列包括SEQ ID NO.3：5’-CGGCACAGTCAAGGCAGAGAAC-3’和SEQ ID NO.4：5’-CCACATACTCAGCACCAGCATCAC-3’。相关引物的具体信息见表1。

表1引物序列

(2)cDNA的合成

a.RNA的提取

采用TRIzol提取试剂进行提取，具体步骤如下：

细胞分组培养于6mm培养皿内，弃掉培养皿中细胞培养液，用预冷的PBS2-3mL洗两次，将培养基洗净，最后将PBS吸干净。加入1mLTRIzol Reagent于培养皿中，用细胞刮刀将细胞从培养皿上刮下，并进行简单吹打，加入到1.5mL离心管内，室温放置5min。每个离心管中加入200μL氯仿，上下快速晃动，剧烈震荡15s，室温放置5min；

12000r/min，4℃离心15min，离心后会出现分层，吸取上层无色透明水相，置于干净1.5mL离心管中，加入500μL异丙醇，混匀后室温放置10min；

12000r/min，4℃离心10min，离心后观察管底，可见白色沉淀，小心弃去上清，加入1mL75％乙醇，7500r/min，4℃离心5min，弃去上清。将离心管倒扣在干净台面上，室温风干15min，直到离心管底的水蒸汽和乙醇完全挥发干净，用30-40μLDEPC水溶解管底的RNA，并进行RNA浓度和纯度的测定。

b.反转录具体操作如下：按照HiFi-MMMLVcDNA第一链合成试剂盒说明书进行(所述该试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司)，分别取dNTP Mix4μL，PrimerMix2μL，RNATemplate3μL，5×RTBuffer4μL，1×DTT2μL，HiFi-MmlV1μL，置于PCR仪，RNase-FreeWater4μL补齐体系至20μL，漩涡震荡混匀，短暂离心，42℃45min，85℃5min，得到mRNA逆转录产物产物cDNA，-80℃保存。

(3)RT-PCR扩增

根据UltraSYBR一步法荧光定量PCR试剂盒说明书配制PCR反应组分(所述该试剂盒购自北京百奥莱博科技有限公司)，取2×UltraSYBRMixture12.5μL、上下引物各0.5μL、TemplateDNA2μL、ddH₂O4.5μL于RT-qPCR管中，反应条件为95℃30s，95℃5s，56℃30s，95℃15s，60℃1min，95℃15s，共30个循环；采用AgilentAria1.5软件分析数据，按2^-ΔΔCt法计算基因相对表达量。

(二)Wseternblot检测TERT蛋白在转染后奶牛胎盘滋养层细胞中的表达

分别收取第五代原代奶牛胎盘滋养层细胞，转染后第30代、第50代的奶牛胎盘滋养层细胞和HeLa细胞，将细胞裂解液与PMSF以100:1的比例混合，置于冰上备用；用1mL已预冷的PBS清洗细胞2-3次，最后一次吸净；每孔加入150μL细胞裂解液来裂解细胞。加入后将细胞培养板放置冰上30min，用移液枪将蛋白样转移至已预冷的1.5mL离心管中；12000r/min，4℃离心20min。离心后小心吸取上清，转移至另一个预冷的离心管中。取50μL蛋白进行BCA蛋白浓度测定。其余蛋白按比例加入5×蛋白上样缓冲液，混合均匀。将蛋白用金属浴进行煮沸10min，放置冰上待其降至室温，混合均匀后进行分装。做好标记，蛋白可保存于-80℃冰箱中。

(1)SDS-PAGE电泳：用移液枪将分离胶加进玻璃板中，加到2/3处，并用无水乙醇进行液封，采用表2所述配方的12％浓度的分离胶，配制15mL。等待20-30min分离胶凝固后，配制5％浓缩胶(如表3)。

表212％分离胶配方

表35％浓缩胶配方

(2)转膜：转膜仪参数设置为200mA，转膜时间为1.5h。

(3)封闭：转膜后，将PVDF膜放入有5％脱脂牛奶的塑料自封袋中，放置在摇床上，封闭2h，将转速调整为40r/min。

(4)一抗孵育：封闭完成后，将PVDF膜用PBST洗2次，一次5min。放置于摇床上进行洗涤，转速约为60r/min。根据Marker条带，剪下相应大小的目的蛋白。在抗体孵育盒中，分别用hTERT抗体(1:1000)和GAPDH(1:2000)抗体进行一抗过夜孵育。

(5)二抗孵育：第二天回收一抗，将PVDF膜，用PBST洗3遍，一次30min。洗涤后用抗一抗种属的HRP标记的二抗进行孵育，二抗的稀释为1:3000。于摇床上室温孵育2h。

(6)显色曝光：二抗孵育完成后，回收二抗，4℃保存，PBST洗3遍，一次10min。配制曝光液，用ECL化学发光试剂盒，A液和B液1:1混合，现配现用。将蛋白条带放置于曝光仪上，加入适量曝光液充分浸湿PVDF膜，进行曝光，保存图片，使用ImageJ软件进行灰度值分析。

通过向BTC细胞(胎盘滋养层细胞)转入外源TERT使其永生化，利用G418进行连续两周的药物筛选稳定表达株并检测不同代次BTC细胞中TERT表达量。在连续传代培养50代以上时未见转入TERT的BTC细胞发生大规模老化、死亡的现象。如图5所示，通过Westernblot法检测细胞TERT蛋白表达，发现在未转入外源TERT的细胞中，TERT仅有极低水平的表达，而进行TERT转导并连续传代30代、50代的细胞均可检测到较高水平的TERT蛋白表达，较原代BTCs(胎盘滋养层细胞系)呈极显著差异(P<0.01)，且其表达程度高于已知的表达TERT蛋白的Hela永生细胞。利用RT-qPCR检测细胞TERTmRNA表达量，其结果与蛋白表达相符。结果表明通过转入外源性TERT可使BTC细胞稳定的高水平表达TERT蛋白，并实现BTC细胞的永生化。

(三)Wseternblot检测标志蛋白在奶牛胎盘滋养层细胞中的表达

通过Wseternblot方法，使用CK-7抗体(1:1000)、Vimentin(波形蛋白)抗体(1:1000)、E-cadherin(E-钙粘蛋白)抗体(1:1000)以及CD90抗体(1:1000)来检测奶牛胎盘滋养层细胞标志蛋白，具体操作方法同上述(二)，结果见图6。

实施例5奶牛胎盘滋养层细胞的生物学特性

(一)细胞生长曲线

制备第5代原代奶牛滋养层细胞及转染后第50代奶牛胎盘滋养层细胞的细胞悬液，用血细胞计数仪进行细胞计数。以每孔1×10⁴个细胞接种到96孔板中，每个时间点设3个平行孔，设置空白对照孔，只加入细胞培养基，在加入培养基的孔外围一周加入PBS，防止最外一圈孔内液体挥发，37℃培养箱中培养4h，等细胞贴壁后，现配含10％CCK-8的完全培养基，弃掉96孔板中的细胞培养基，加入110μL含10％CCK-8的完全培养基，放回37℃培养箱中继续培养1、2、4、6、8、10d，测定每个时间点在450nm的吸光度值。相对细胞活力的计算公式如下：

结果发现，相对于原代BTCs，转染后第50代的BTCs在TERT的作用下更明显的提高BTCs的生长速度(见图7)。

(二)ELISA检测奶牛胎盘滋养层细胞PL的分泌

制备第5代原代奶牛滋养层细胞、转染后第50代奶牛胎盘滋养层细胞的细胞悬液，用血细胞计数仪进行细胞计数。以每孔1×10⁵个细胞接种到6孔板中，24h后弃去上清，用PBS清洗一遍，加入无血清DMEM-F12培养基，放回37℃培养箱中继续培养48h，48h后收取细胞培养上清，按照说明书测定相关数据OD。以无血清培养基作为阴性对照，重复上述试验。

根据图8可以看出，TERT-BTCs具有与原代细胞相似的PL激素分泌能力。

(三)奶牛胎盘滋养层细胞迁移特性的检测

利用Transwell实验检测TERT-BTCs是否具有迁移性。制备第5代原代奶牛滋养层细胞及转染后第50代奶牛胎盘滋养层细胞及Hela细胞的细胞悬液，用血细胞计数仪进行细胞计数。以每孔1×10⁴个细胞接种到Matrigel包被的Transwell细胞小室上，下孔加入500μL完全培养基。将培养皿在37℃的5％二氧化碳气氛中孵育24h。用棉签去除上表面的非侵入性细胞，用4％多聚甲醛固定基底膜的下表面30min。然后，用PBS洗涤基底三次，并用结晶紫染色。用倒置光学显微镜观察细胞并拍照。

结果如图9所示，以具有迁移性的宫颈癌细胞Hela作为阳性对照，发现原代BTCs和永生的TERT-BTCs均具有一定的迁移性。

(四)转染后奶牛胎盘滋养层恶性转化特征的检测

软琼脂克隆形成试验：将2mL含有1.2％软琼脂的DMEM/F12培养基加入到六孔板作为底层，然后放置在4℃，直到琼脂凝固。随后，分别用1mL0.6％软琼脂的DMEM/F12培养基将5×10⁴个转染后第50代奶牛胎盘滋养层细胞及Hela细胞重新悬浮，并放置于孔中。细胞在5％CO₂的37℃培养箱中过夜。每周用完全培养基处理一次，并评估接下来两周的集落生长情况。大于100μm的细胞团块被认为是一个克隆，用倒置光学显微镜拍照。

从图10可以看出，永生化的TERT-BTCs不具有体外致瘤性。

实施例6分别利用原代胎盘滋养层细胞和永生化细胞系构建奶牛胎盘类器官

本实施例中需要如下实验试剂，如表4：

表4实验试剂

(一)原代胎盘滋养层细胞的获取与培养

1.妊娠早期2、3、4月牛胎盘的提取

同样是按照北京农学院动物伦理委员会的指导进行的。奶牛均来自屠宰场，并在屠宰前确认没有乳腺炎、胎盘发育障碍、宫内生长迟缓和先兆子痫等妊娠相关疾病。而后收集已屠宰奶牛中妊娠牛子宫，通过胎牛头颈比和体长筛选出妊娠2月(55-65d，胎牛体长2-3cm)、3月(85-95d，胎牛体长7-8cm)、4月(115-125d，胎牛体长15-18cm)子宫，尽快送至实验室进行后续工作，运输途中加入冰块保鲜。子宫先清水冲洗至无血水异物，钙镁水(添加1％双抗)浸洗4次，75％酒精浸洗1次，后钙镁水再次浸洗，控干水份。然后沿后正中心小心剖开子宫，暴露胎膜，尽量保持绒毛膜的完整性。小心剥离胎盘绒毛组织，修剪后放到4％多聚甲醛中备用。

2.牛胎盘石蜡切片的制备

(1)修剪：将固定的胎盘滋养层组织从4％多聚甲醛中取出，用剪刀和手术刀片适当修剪成0.5cm的小块。

(2)脱水：进行乙醇梯度脱水处理。

(3)透明：将组织块从酒精中取出后放入二甲苯，10min×2次。

(4)浸蜡包埋：将滋养层组织块完全浸入至溶化的石蜡中，而后放置于溶蜡箱中防止石蜡固化。接着将溶化的石蜡倾入包埋盒中，然后用镊子快速夹起已浸蜡过的组织块放置液体石蜡当中，最终将包埋盒放置于速冻台上让石蜡固化。

(5)切片：首先进行蜡块的整修，使得组织暴露于切面，然后将修整好的蜡块固定于石蜡切片机进行切片，厚度5μm。

(6)捞片：将切下的切片用镊子轻轻展开夹起，而后漂浮于摊片机40℃温水中，将组织展平，载玻片将组织片捞起(注意切片不要产生褶皱)。

(7)烤片：60℃烘箱内烤片。将蜡烤化后取出常温放置。

3.HE染色

(1)脱蜡：切片放入二甲苯中10min后取出，以清除切片中石蜡。

(2)复水：酒精梯度处理后，蒸馏水清洗2min。

(3)细胞核染色：将切片放入苏木精染液中核染6-8min，自来水冲洗。而后浸入1％盐酸酒精中分化25-30s，最后流水冲洗蓝化。

(4)细胞质染色；切片置于1％伊红染液染细胞质1-2min。

(5)脱水、透明：同石蜡切片制备中的脱水透明步骤。

(6)封片：切片上滴加溶化的中性树脂后盖上盖玻片封固。

(7)镜下观察并拍摄图片。

由图11可以看出，妊娠前期牛胎盘滋养层组织中，含有滋养层单核细胞与双核细胞。单核细胞与双核细胞没有明显的分层界限，大约以8：2的比例交相排列，且比例不受妊娠时间长短的影响。单核细胞核呈现矮柱状、球形或不规则形。核内有一个大的核仁，染色质呈分散状。双核细胞中，未成熟的双核细胞核大、核质比例大、含多个核仁且着色较浅，胞质内可见紫红色颗粒；成熟的双核细胞核较小，呈圆形或椭圆形且着色深，胞质内可见大量深紫色颗粒。

4.免疫组化染色

(1)脱蜡复水：试验步骤同HE染色部分。

(2)抗原修复：将滋养层组织切片浸入0.01mol的枸橼酸钠缓冲液中，放置于微波炉中高火加热至沸腾，然后切换至中火再加热10min，拿出后静置冷却至室温。

(4)染色：使用免疫组化试剂盒进行后续染色。

①滴加3％双氧水至组织切片孵育5min后倾去，以消除内源性过氧化物酶活性，PBS洗5min×3次。

②添加试剂A(封闭用正常山羊血清工作液)室温孵育15-20min后倾去。滴加一抗Ki67(1：100比例稀释)4℃过夜孵育后，PBS冲洗3min×3次。

③滴加试剂B(生物素标记山羊抗兔、大鼠、小鼠和豚鼠lgG)室温孵育15-20min。PBS冲洗，3min×3次。

④滴加试剂C(S-A/HRP)室温孵育15-20min，PBS冲洗，3min×3次。

⑤滴加DAB显色剂(5％溶液A+5％溶液B+90％PBS)染色30s-2min后将切片放入自来水中浸泡。

⑥切片滴加苏木素复染5min后自来水冲洗染液，然后盐酸酒精分化5s，后放入自来水中浸泡5min，换水浸泡第二遍10min，显微镜下观察复染结果。

⑦最后梯度酒精脱水，二甲苯透明后采用中性树脂封片。

结果显示，妊娠3月牛胎盘滋养层组织中标记Ki67比例显著高于4月胎盘，略高于2月胎盘(Ki67标记增殖细胞)，见图12。

5.妊娠3月牛胎盘滋养层细胞的原代培养

(1)牛胎盘滋养层组织的提取：步骤同1，但剥离胎盘绒毛组织后不是放到4％多聚甲醛中，而是分别放入DPBS(添加10％双抗)中1min、DPBS(添加5％双抗)1min和DPBS(添加2％双抗)1min。清洗后使用无菌刀片刮取滋养层绒毛至小颗粒状。

(2)组织贴壁培养：用灭菌镊子夹取刮取的滋养层绒毛组织放置于细胞培养瓶底壁进行贴壁培养，组织块间相互间隙5mm。贴壁后静置30min至组织块黏附到培养瓶底壁无脱落，小心加入添加预热的10％血清的DMEM/F12和TOM培养基分别培养，每隔三天更换培养液。

(3)结果观察与照相分析：在倒置显微镜下观察并拍摄细胞培养结果。

(二)原代细胞与永生化BTCs免疫荧光染色

(1)原代细胞固定：爬片玻片提前纯水清洗，75％酒精浸泡。细胞在DMEM+10％FBS培养液中混悬后，将玻片用消毒镊子从酒精中夹出，酒精灯外焰烤干后放入24孔板中，每孔加入细胞混悬液1ml，注意控制每孔细胞量在2×10⁵个左右。细胞放入培养箱中爬片24h左右取出，吸出培养液，PBS清洗3遍后至4％多聚甲醛中固定30min。PBS清洗3min×5次。

(2)永生化BTCs细胞固定：同上。

(3)通透：将清洗过的原代细胞与BTCs分别滴加0.2％Trion-X100通透10min，PBS清洗3min×5次。

(4)封闭：分别滴加封闭液(1％BSA-PBS)封闭30min，弃液后勿洗。

(5)一抗孵育：一抗1：200稀释(稀释液为0.1％BSA-PBS)后分别滴加，湿盒中4℃过夜孵育。PBS清洗5min×5次。

(6)二抗孵育：抗兔FITC1:200稀释(稀释液为0.1％BSA-PBS)后分别滴加，避光室温孵育1h，PBS清洗5min×5次。

(7)核染：分别滴加Hoechst33342避光染色10min，PBS清洗5min×3次。保留最后一遍PBS，避光保存。

(8)照相：原代细胞与永生化BTCs滴加抗荧光淬灭剂，盖玻片封片后分别使用共聚焦显微镜上机拍摄。

(三)胎盘滋养层类器官的培养

(1)将96孔培养板与移液枪枪头提前放置于冰上预冷，从-80℃取出基质胶放置于4℃至呈液体状。

(2)分别将培养的滋养层原代细胞与永生化BTCs在Advanced DMEM/F12培养基中洗涤，然后采用低速离心机以300g转速离心5min，再用提前预冷的枪头在冰上重悬于基质胶中，每0.5mL滋养层原代细胞或永生化BTCs需要0.5mL基质胶。

(3)96孔板每孔滴加50μL混合细胞的基质胶(细胞量控制在2×10²每孔)。放入37℃培养箱中15min，待基质胶凝固后每孔覆盖150μL预热过的TOM培养基，放置于5％CO₂的37℃加湿培养箱中培养，每3天更换一次培养液。

(4)分别在培养的第3、7、15d拍摄类器官生长状况(见图13-14)。

同时，还检测到妊娠三月滋养层组织与原代细胞衍生类器官、永生化BTCs衍生类器官均表达CSH1蛋白，也均表达CD71、CD46这两种合胞体标记蛋白，结果见图15-16。

(四)建立滋养层类器官与EECs共培养系统

(1)EECs细胞复苏：EECs从液氮罐中取出后快速置于37℃水浴锅中解冻融化，1000rpm离心5min。小心弃去上清后加入DMEM/F12(添加10％FBS)重悬细胞。

(2)EECs铺板：将Transwell嵌套(Corning，3421)内含小室取出，将EECs混悬液平铺于孔板内，每孔控制细胞量在2×10⁵个左右。

(3)类器官的处理：分别将原代培养类器官与BTCs培养类器官中TOM培养液弃掉，而后加入PBS并放置4℃3min，使得基质胶溶解。将类器官取出后PBS清洗3遍。

(4)类器官与EECs共培养：将原代培养类器官与BTCs类器官分别放入Transwell小室中嵌套至培养EECs小孔上方，小室中再加入适量培养液。而后放置培养箱中培养36h。

两种类器官共培养后，发现EECs容受性调节因子Integrinαvβ3、Wnt7a、HOXA10和IFNAR-2的蛋白表达量均极显著增高，具有一样的调节作用(见图17)。

(三)胎盘类器官与不同妊娠月份胎盘组织RNA测序分析

(1)总RNA的提取与质控：胎盘类器官与妊娠2、3月份滋养层组织分别加入Trizol震荡3min，冰上静置5min。而后加入氯仿(与Trizol比例5：1)震荡15s，冰上静置3min。离心机提前开启，设置4℃，12000r/min，15min。吸出上清液后放置于新管，加入0.5mL异丙醇混匀，静置后4℃离心，14000r/min，10min。取出弃液后85％冰乙醇洗涤两次后加入40μLRNase-free Water吹打混匀，而后进行质检。结果发现，260nm和280nm下吸光光度比值OD260/280在1.8-2.0之间。

(2)测序文库的构建：

a.mRNA的分离纯化：使用oligodT磁珠和mRNA的poly(A)尾进行特异性结合以纯化mRNA。

b.RNA片段化：使用试剂fragmentationreagent将纯化的mRNA片段化。

c.cDNA的合成：以mRNA为模板，添加六碱基随机引物，逆转录酶作用下上机合成cDNA。

d.双链cDNA使用Taq聚合酶进行末端修复，而后3’端加入碱基A，使用测序接头连接DNA片段两端，最后高保真聚合酶参与扩增文库。

(3)DNA成簇扩增：将DNA文库种植到flowcell上，而后进行PCR扩增。

(4)上机测序

a.将扩增DNA双链变成单链，即加入可以将特定集团切断的引物，而后加入碱性溶液使得双链解开，得到单链。

b.加入测序引物开始测序。测序结果数据预处理后进行后续数据分析。

结果发现，永生化胎盘滋养层细胞类器官表达因子与妊娠3月胎盘组织有共同表达基因，如图18。

由以上实施例可知，本发明提供了一种利用永生化的牛胎盘滋养层细胞系构建胎盘类器官，与传统的原代细胞构建胎盘类器官相比获得的类器官功能一致。但本发明中所述细胞系非常丰富，克服了原代细胞量不足以及难以获取的缺陷，而且构建过程相对简便、成本较低，可以在大部分动物类器官构建中推广应用。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种胎盘类器官模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将纯化后的牛胎盘滋养层细胞通过pCI-neo-hTERT质粒进行转染、培养，获得永生化牛胎盘滋养层细胞系；

(2)将获得的永生化牛胎盘滋养层细胞系在培养基中洗涤、离心后重悬于基质胶中；

(3)向混有所述永生化牛胎盘滋养层细胞系的基质胶上添加TOM培养液进行培养，即获得永生化牛胎盘类器官。

2.根据权利要求1所述构建方法，其特征在于，步骤(2)所述培养基为Advanced DMEM/F12培养基；所述基质胶为液体状态的基质胶。

3.根据权利要求1所述构建方法，其特征在于，步骤(2)所述永生化牛胎盘滋养层细胞系和基质胶的体积比为1：(0.5-2)。

4.根据权利要求1所述构建方法，其特征在于，步骤(3)所述混有永生化牛胎盘滋养层细胞系的基质胶在添加TOM培养液之前还包括凝固处理，所述凝固处理的温度为32-39℃，所述凝固处理的时间为10-20min。

5.根据权利要求1所述构建方法，其特征在于，步骤(3)所述混有永生化牛胎盘滋养层细胞系的基质胶与TOM培养液的体积比为1：(2-4)。

6.根据权利要求1所述构建方法，其特征在于，步骤(3)所述培养过程中的温度为32-39℃，所述培养过程中的相对饱和湿度为90-96％，所述培养过程中的CO₂含量为3-6％。

7.根据权利要求1所述构建方法，其特征在于，步骤(3)所述TOM培养液的配方为：

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