CN111808823B - 一种绵羊子宫内膜上皮细胞系的建立方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种绵羊子宫内膜上皮细胞系的建立方法及应用。本发明通过PB转座载体将hTERT基因导入绵羊子宫内膜上皮细胞，实现细胞的永生化，并提供一种易于培养，生长速度快，操作方法简便的绵羊子宫内膜上皮细胞系及其建立方法。本发明使用的PiggyBac转座子转基因载体，能够定点插入到细胞基因组“TTAA”位点，可以有效避免基因组表观遗传修饰和位置效应对目的基因的影响，使目的基因稳定持续地表达。以致更高效的获得永生化细胞，并保障转染后的细胞与原代细胞的生理特性更为接近。

Description

一种绵羊子宫内膜上皮细胞系的建立方法及应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种绵羊子宫内膜上皮细胞系的建立方法及应用。
背景技术
子宫内膜上皮细胞在胚胎与母体“对话”的过程中充当了极其重要的角色，对动物繁育至关重要。作为卵巢激素作用的靶组织，子宫内膜与胚胎附植密切相关，在胚胎着床和子宫内膜容受性建立的过程中，发生了重要的形态和功能变化，在生殖生理的研究中占重要地位。子宫内膜在妊娠过程中受各种因素调节的复杂机制仍未研究清楚，因此需要建立一个体外模型来研究其复杂的内膜功能。
永生化细胞系概念的提出为模型的建立提供理论基础，在体外实现细胞的永生化有多种方法，但最为研究者所接受的方法是通过导入外源hTERT来实现细胞的永生化，并且该方法已经得到大量基础实验的验证，但各个试验在导入外源基因的方式和方法上各不相同，其中大都使用商品化的真核表达载体携带外源hTERT基因来转染细胞。而使用普通商品化载体转染细胞不仅整合效率低且载体和外源基因容易被沉默，导致目的基因不能正常表达，并且会影响细胞正常的生理状态。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种绵羊子宫内膜上皮细胞系的建立方法及应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。
本发明通过PB转座载体将hTERT基因导入绵羊子宫内膜上皮细胞，实现细胞的永生化，并提供一种易于培养，生长速度快，操作方法简便的绵羊子宫内膜上皮细胞系及其建立方法。
本发明是这样实现的，一种绵羊子宫内膜上皮细胞系的建立方法，包括利用通用PB转座子载体将hTERT基因导入绵羊子宫内膜上皮细胞中。
进一步地，所述导入方法包括脂质体转染法。
进一步地，待细胞转染2–4天后，用嘌呤霉素筛选阳性克隆，当未转染质粒细胞完全死亡且出现阳性克隆细胞团后，挑取暗视野下激发绿色荧光的细胞单克隆，于嘌呤霉素浓度减半、37℃、5％的CO2培养箱内进行扩大培养；选取阳性克隆细胞培养、分选，获取传代50次以上的永生化绵羊子宫内膜上皮细胞系。
进一步地，所述嘌呤霉素浓度为5μg /mL。
进一步地，所述脂质体转染的具体方法包括：
（1）转染前接种第3代原代培养的绵羊子宫内膜上皮细胞于24孔板中，待细胞融合度为70-90%进行转染；
（2）按每孔的量，用25µL Opti-MEM培养基稀释1.5µL Lipofectamine 3000试剂，充分混匀，制备Lipofectamine 3000稀释液；
（3）在新的EP管中加入25µL Opti-MEM培养基，2µL 1μg/μL载体质粒pTP-hTERT和1µL P3000试剂，充分混匀，制备DNA预混液；
（4）将上述DNA预混液与Lipofectamine 3000稀释液按1：1比例混匀，总体积50µL，室温孵育10-15分钟；
（5）逐滴将所得混合物加入到细胞培养孔中，边加边摇动培养板，轻轻混匀，同时设立2孔未转染空白对照；
（6）于37 ℃、5%的CO2培养箱中孵育细胞2-4天，然后分析转染细胞。
进一步地，细胞孵育使用含10%胎牛血清的完全D-MEM/F-12培养液。
如上述的一种绵羊子宫内膜上皮细胞系的建立方法在制备绵羊子宫内膜上皮细胞系中的应用。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：
本发明使用的PiggyBac转座子转基因载体pTP-hTERT，能够定点插入到细胞基因组“TTAA”位点，可以有效避免基因组表观遗传修饰和位置效应对目的基因的影响，使目的基因稳定持续地表达。以致更高效地获得永生化细胞，并保障转染后的细胞与原代细胞的生理特性更为接近。
（1）本发明的绵羊子宫内膜上皮细胞系的营养条件要求低，原先需要10%的胎牛血清，肝素、谷氨酰胺等各种营养物质，而现在的细胞只要求10%的血清，大大降低了培养的成本。
（2）本发明的绵羊子宫内膜上皮细胞系通过应用PB转座载体将hTERT基因导入绵羊子宫内膜上皮细胞，实现细胞的永生化，转染后的细胞传代时间大大缩短，且细胞生命力强，为规模化的应用于实验室研究提供保障。
（3）本发明的绵羊子宫内膜上皮细胞系在体外传染50代以上仍然能够保持分裂增殖，不发生衰老和死亡，是一种永生化的细胞系，现已传至70代，为研究绵羊胚胎着床机制和预防妊娠疾病提供了基本的实验材料。
附图说明
图1是原代第3代绵羊子宫内膜上皮细胞倒置显微镜观察图（×200）；
图2是转染后60代绵羊子宫内膜上皮细胞倒置显微镜观察图（×200）；
图3是通过RT-PCR检测转染细胞中外源性hTERT的表达结果琼脂糖凝胶电泳图；
图4是免疫组化法检测转染细胞hTERT蛋白表达图（阳性）；
图5是免疫组化法检测转染细胞hTERT蛋白表达图（阴性）；
图6是免疫组化法检测原代细胞hTERT蛋白表达图；
图7是Western Blot 检测细胞hTERT基因的蛋白表达结果图；
图8是流式细胞仪检测原代细胞细胞周期图；
图9是流式细胞仪检测转染细胞第60代细胞周期图；
图10是流式细胞仪检测原代细胞细胞凋亡图；
图11是流式细胞仪检测转染细胞第60代细胞凋亡图；
图12是转染细胞的生长曲线测定图；
图13是pTP-hTERT基因整合效率鉴定图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
根据本申请包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。
为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本申请中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。本发明中，“约”指给定值或范围的10％以内，优选为5％以内。
本发明下述各实施例中所述常温是指四季中自然室温条件，不进行额外的冷却或加热处理，一般常温控制在10～30°C，最好是15～25°C。
本发明披露了一种绵羊子宫内膜上皮细胞系的建立方法及应用，具体如下实施例所示。
实施例1绵羊子宫内膜上皮细胞系的建立
1、采集绵羊子宫角，用组织块培养法分离培养子宫内膜上皮细胞，于37 ℃、5％的CO2培养箱内培养7～12天。
2、采用脂质体转染法，将携带hTERT基因的通用PB转座子载体pTP-hTERT导入原代培养的绵羊子宫内膜上皮细胞进行转染，具体步骤如下：
1）转染前接种第3代原代培养的绵羊子宫内膜上皮细胞于24孔板中，待细胞融合度为70-90%进行转染。
2）按每孔的量，用25µL Opti-MEM培养基稀释1.5µL Lipofectamine 3000试剂，充分混匀，制备Lipofectamine 3000稀释液。
3）在新的EP管中加入25µL Opti-MEM培养基，2µL 1μg/μL质粒和1µL P3000试剂，充分混匀，制备DNA预混液。
4）将上述DNA预混液与Lipofectamine 3000稀释液按1：1比例混匀，总体积50µL，室温孵育10-15分钟。
5）逐滴将所得混合物加入到细胞培养孔中，边加边摇动培养板，轻轻混匀，同时设立2孔未转染空白对照。
6）于37 ℃、5%的CO2培养箱中孵育细胞2-4天，然后分析转染细胞。所用完全D-MEM/F-12培养液：购买自invitrogen公司GIBCO的Dulbecco’s Modified Eagle Medium:Nutrient Mixture F-12(Ham) (1:1) 培养基，加入10%胎牛血清。
3、待转染细胞2–4天后，用浓度为5μg /mL的嘌呤霉素进行筛选阳性克隆，每3天换一次液，当阴性对照细胞（未转染质粒）完全死亡且出现阳性克隆细胞团后，将暗视野下激发绿色荧光的细胞单克隆挑至48孔板，嘌呤霉素浓度减半，在37℃、5％的CO2培养箱内进行扩大培养。
4、将筛选到的阳性克隆细胞在37 ℃、5%的CO2培养箱内连续培养，分选后细胞呈现铺路石样单层贴壁生长，细胞间存在接触抑制，培养超过50代次以上即可以确定获得永生化的绵羊子宫内膜上皮细胞系。
实施例2 细胞形态学特征鉴定
细胞经转染后于相差显微镜下观察形态变化，并与原代绵羊子宫内膜上皮细胞（如图1）进行比较。
结果显示，转染后的绵羊子宫内膜上皮细胞（图2）与原代细胞形态相似，细胞中央核明显，核仁清晰可见。大多数细胞形态呈多角形或卵圆形，细胞呈典型的鹅卵石铺路石状排列，细胞间存在接触抑制。
实施例3 RT-PCR检测转染细胞中的hTERT表达
（1）引物的设计与合成
根据GenBank中已发表的人端粒酶反转录酶基因参考序列（登录号NM_001193376）设计1对特异性检测引物，上下游引物分别为Forward: 5ˊ-AGAGGTCAGGCAGCATCGG-3ˊ，见SEQ ID NO.1；Reverse:5ˊ-TGCGTTCTTGGCTTTCAGG-3ˊ，见SEQ ID NO.2，扩增片段大小为1156 bp，引物由上海生工生物工程有限公司合成。
（2）细胞总RNA的提取
①将转染细胞和原代细胞接种于6孔板中，待细胞铺满后，吸弃培养液，PBS冲洗2次。
②每孔加入750μL Trizol试剂，吹打混匀，4 ℃静置5min。
③将细胞裂解液吸到DEPC水处理过的1.5 mL灭菌EP管中，12000 rpm离心5 min，取上清。
④加入200 μL氯仿，振荡混匀后，4 ℃静置15min。
⑤4 ℃ 12000 rpm/min离心15min，轻轻吸取上层水相转移入另一新的DEPC水处理过的1.5 mL灭菌EP管，加入500μL冰冷异丙醇（-20 ℃贮存），轻轻颠倒混匀，置-20 ℃过夜。
⑥在4 ℃以12000 rpm/min离心10min，弃上清，加入1 mL冰冷的75%乙醇（DEPC水配制），轻轻颠倒几次，4 ℃ 8000 rpm/min离心10min。
⑦弃上清，倒置EP管，室温干燥6min。
⑧加入20 μL DEPC水溶解RNA。
（3）第一链cDNA合成（反转录实验流程参照TaKaRa PrimeScript™RT reagentKit with gDNA Eraser试剂盒）
在0.5mL PCR反应管中加入如下溶液和试剂进行反转录：
5×AMV buffer 4.0 µL
dNTP （10 mmol/L） 4.0 µL
随机引物 （50 pmol/µL） 1 µL
RNA模板 9.5 µL
RNase Inhibitor 0.5 µL
吹打混匀，稍离心，加入AMV反转录酶1.0 µL，于42 ℃水浴作用1h。
（4）PCR扩增双链cDNA
在PCR反应管中配制如下反应体系：
反转录产物（cDNA） 10 µL
10×PCR buffer（Mg2+ free） 5 µL
dNTP 4 µL
上游引物 0.5 µL
下游引物 0.5 µL
MgCl<sub>2 </sub> 3 µL
灭菌去离子水 26.5µL
Taq DNA聚合酶 0.5 µL
混匀后置于PCR扩增仪中，95 ℃预变性5 分钟；94 ℃，30秒，58 ℃，30 秒，72 ℃，30 秒，进行30个循环；最后72 ℃延伸10分钟。扩增完成后，PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳观察结果（图3，M:DNA Maker；1:永生化细胞；2:质粒；3:原代细胞）。
实施例4 免疫组化法检测细胞中hTERT的表达
将转染后培养至第15代的绵羊子宫内膜上皮细胞接种于24孔板，待细胞融合度达到50-60%既可以进行染色。操作步骤如下：
（1）弃去细胞培养液，用PBS小心清洗3次后，加入300µL 4%多聚甲醛固定细胞30min。
（2）弃去多聚甲醛，用PBS小心清洗3次，用0.2% Triton X-100 (PBS配制) 对细胞透膜处理10 min。
（3）3%H2O2处理（室温）15min，以消除内源性过氧化氢酶活性，PBS清洗3次，每次5min，封闭液封闭30min。
（4）PBS清洗3次，利用一抗稀释液按照1:750的比例将hTERT抗体稀释后，加入培养孔中，4℃过夜。
（5）PBS清洗3次，加入生物素标记山羊抗兔IgG，室温孵育1h，PBS冲洗3次，每次5min。
（6）滴加SABC，室温孵育30min。PBS冲洗3次，每次5min。
（7）除去PBS液，加入100μL新配的DAB工作液，立即在倒置显微镜下观察，照相。（永生化后的细胞呈棕黄色，见图4；图5阴性对照无明显变化；图6原代细胞与永生化细胞相比着色较浅，结果表明转染后培养的细胞表达hTERT基因）。
实施例5 Western Blot 检测hTERT表达
（1）蛋白样品的制备：弃掉培养液，用PBS轻轻冲洗3遍，加入胰酶消化，确定细胞消化下来后，向其中加入培养基轻轻吹洗底壁，将贴壁细胞吹洗下来，移入1.5mL EP管中，3000rpm离心5min，弃上清。取适当裂解液，在使用前数分钟内加入PMSF，按1ml裂解液加10µL PMSF（100mM），摇匀置于冰上。按照6孔板每孔加入150-250µL裂解液，用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触，冰上裂解30min。加等量2×蛋白Loading Buffer，100℃水浴10 min后12000 g离心5 min，吸取上清为蛋白样品。
（2）SDS-PAGE电泳：安装好电泳装置，用移液枪将配好的分离胶沿玻璃板一角缓慢注入，注意不要产生气泡，灌注到2/3处停止。后缓慢注入水封胶，注意直接加水至溢出。通过剩余的分离胶观测凝胶时间，当分离胶凝固后，直接将水倒出，并用滤纸轻轻吸掉分离胶表面未倒干净的水。现配浓缩胶，用移液枪灌注浓缩胶至溢出，可用移液枪吸掉溢出液体表面的气泡，然后插入梳子。待胶凝固后，拔掉梳子，在水龙头下缓缓冲洗上样孔。安装电泳槽，短板朝内，在内外倒入足量电泳缓冲液，注意槽内不要漏缓冲液。在靠近凝胶中间位置的孔中加样，先加蛋白Maker 4µL，后每孔上样20µL。上样结束后，盖上电泳槽盖，接通电源。浓缩胶80V，20min，分离胶120V，1h，电泳至溴酚蓝刚跑出，关闭电源，停止电泳。
（3）转膜：取下玻璃板，用塑料切胶器在玻璃板两边轻轻撬动，制造空隙，在水龙头缓慢流水下取掉小玻璃板，后轻轻刮去浓缩胶，根据目的条带大小，切所需分离胶，将胶置于纯水中5min（摇床），重复三次后，置于转膜液中10min。用尺子量取所切胶的大小并记录，根据胶的大小剪取PVDF膜和滤纸，预先将PVDF膜置于甲醇中5min，后将膜、滤纸置于转膜缓冲液中10min。按夹心板方式，三层滤纸→胶→膜→三层滤纸，放置于转膜装置中，放置过程中，每放置一层可适当滴上转膜缓冲液并用塑料切胶器缓缓顺势抚平并压实，盖上盖子，15V 20min进行转膜。
（4）封闭及杂交：转膜结束后取下膜，膜与胶接触那一面始终朝上，用TBS摇床漂洗5min，重复3次。用5%脱脂奶粉室温摇床孵育，封闭1h。TBST漂洗5min，重复3次，再用 TBS 洗1次，10min。剪取一次性塑料手套指头部分，将膜放入其中，将稀释好的一抗滴到膜上，然后用封口机封口，4℃过夜孵育。后将膜置于TBST中漂洗5min，重复3次，再用 TBS 洗1次，10min。向50mL离心管中加入稀释过的二抗，将膜放入其中，室温摇床孵育1h。将膜置于TBST中漂洗5min，重复3次，再用 TBS 洗1次，10min。在凝胶成像仪下观察目标条带（图7，与原代细胞相比，转染后的细胞hTERT蛋白表达水平明显升高）。
实施例6细胞周期和细胞凋亡检测
（1）将原代和待测永生化绵羊子宫内膜上皮细胞样本制成单细胞悬液，然后1000rpm/min离心8min，弃上清。
（2）用4 ℃预冷的700 mL/L冷乙醇固定，4 ℃保存 ，至少固定18h。
（3）调整细胞浓度为1×106个/mL，取1mL细胞悬液，用PBS洗3次，细胞重悬于1 mLPI染液(终浓度为50 μg/mL )中，37 ℃孵育30min，进行流式细胞仪分析（细胞周期见图8：原代细胞、图9：转染细胞，如图转染细胞S期数值显著高于原代细胞，表明其具有更高的增殖活性；细胞凋亡见图10：原代细胞、图11：转染细胞，二者差异不大）。
实施例7 细胞生长曲线测定
将转染后第10、20、30、50代绵羊子宫内膜上皮细胞用培养基制成细胞悬液后计数。根据细胞计数结果按1×104个/mL接种于24孔板中，1ml/孔，共接种21孔细胞，余下三孔为传代培养的对照。培养24h后每天记录细胞数目，每次取3孔细胞，用胰酶消化后加入培养基，混匀制成细胞悬液，血细胞计数板计数，计算平均值。连续计数7d，制细胞的生长曲线。（见图12，细胞在第3天数量开始快速增长，到了第5、6天时达到增长的平台期）。
实施例8 质粒pTP-hTERT的基因整合效率鉴定
将pTP-hTERT（实验组）与普通过表达质粒载体pIRES-puro3（对照组）分别转染原代绵羊子宫内膜上皮细胞，经嘌呤霉素筛选后，统计细胞克隆数量，细胞克隆计数结果经非配对t检验(Student’s t-test)统计，结果如图13，实验组细胞克隆数极显著高于对照组。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 石河子大学
<120> 一种绵羊子宫内膜上皮细胞系的建立方法及应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Forward)
<400> 1
agaggtcagg cagcatcgg 19
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Reverse)
<400> 2
tgcgttcttg gctttcagg 19

Claims (2)

1.一种绵羊子宫内膜上皮细胞系的建立方法，其特征在于：包括利用通用PB转座子载体将hTERT基因导入绵羊子宫内膜上皮细胞中，所述导入方法为脂质体转染法；待细胞转染2–4天后，用嘌呤霉素筛选阳性克隆，当未转染质粒细胞完全死亡且出现阳性克隆细胞团后，挑取暗视野下激发绿色荧光的细胞单克隆，于嘌呤霉素浓度减半、37℃、5％的CO2培养箱内进行扩大培养；选取阳性克隆细胞培养、分选，获取传代50次以上的永生化绵羊子宫内膜上皮细胞系；所述嘌呤霉素浓度为5μg/mL；
所述脂质体转染的具体方法包括：(1)转染前接种第3代原代培养的绵羊子宫内膜上皮细胞于24孔板中，待细胞融合度为70-90％进行转染；
(2)按每孔的量，用25μL Opti-MEM培养基稀释1.5μL Lipofectamine 3000试剂，充分混匀，制备Lipofectamine 3000稀释液；
(3)在新的EP管中加入25μL Opti-MEM培养基，2μL 1μg/μL载体质粒pTP-hTERT和1μLP3000试剂，充分混匀，制备DNA预混液；
(4)将上述DNA预混液与Lipofectamine 3000稀释液按1：1比例混匀，总体积50μL，室温孵育10-15分钟；
(5)逐滴将所得混合物加入到细胞培养孔中，边加边摇动培养板，轻轻混匀，同时设立2孔未转染空白对照；
(6)于37℃、5％的CO2培养箱中孵育细胞2-4天，然后分析转染细胞；细胞孵育使用含10％胎牛血清的完全D-MEM/F-12培养液。
2.如权利要求1所述的一种绵羊子宫内膜上皮细胞系的建立方法在制备绵羊子宫内膜上皮细胞系中的应用。
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Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LipofectamineTM 3000 Reagent Protocol;Invitrogen;《ThermoFisher》;20160210;全文 *
一种通用型piggyBac转座子诱导细胞永生化载体的构建及其基本功能验证;黄惠 等;《生物工程学报》;20140825;第30卷(第8期);摘要、第1186页左栏第1-3段 *
绵羊高效转基因通用型piggyBac转座子载体构建及功能验证;胡广东 等;《遗传》;20180831;第40卷(第8期);第647-656页 *

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