CN114652738B

CN114652738B - miR-1285-5p在薄型子宫内膜中的应用

Info

Publication number: CN114652738B
Application number: CN202210213644.3A
Authority: CN
Inventors: 王含必; 邓成艳; 刘思邈; 张婉玉; 孔令印
Original assignee: Peking Union Medical College Hospital Chinese Academy of Medical Sciences
Current assignee: Peking Union Medical College Hospital Chinese Academy of Medical Sciences
Priority date: 2022-03-04
Filing date: 2022-03-04
Publication date: 2022-11-18
Anticipated expiration: 2042-03-04
Also published as: CN114652738A

Abstract

本发明公开了miR‑1285‑5p在制备诊断、预防、治疗薄型子宫内膜的产品中的应用，miR‑1285‑5p可以抑制子宫内膜腺上皮细胞(EEC)的凋亡和上皮间质转化，miR‑1285‑5p还可以促进EEC的细胞增殖活性。还公开了miR‑1285‑5p抑制剂在制备促进EEC凋亡的产品中的应用。miR‑1285‑5p何其抑制剂分别具有抑制EEC凋亡和促进EEC凋亡的作用，故可制成相应的试剂，为薄型子宫内膜的治疗提供了新的思路。

Description

miR-1285-5p在薄型子宫内膜中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及miR-1285-5p在制备诊断、预防、治疗薄型子宫内膜的产品中的应用。

背景技术

薄型子宫内膜是女性常见病症，女性在有一定雌激素的作用下，做超声检查时子宫内膜不能达到8毫米的厚度就判断为薄型子宫内膜。导致子宫内膜薄的原因有全身性的，常见的原因有雌激素水平低、孕激素水平不足和存在排卵障碍和缺乏生长激素等，也有局部的原因，例如内膜损伤，粘连和缺失等，有一部分患者在人工流产后，子宫内膜尚未恢复，也会导致子宫内膜薄。通常认为，子宫内膜的厚度为8-10mm比较适宜受孕，专家表示，如果做过人流刮宫手术、有子宫息肉、做过宫腔电切手术，或者有子宫内膜炎、多囊卵巢综合征，都有可能破坏子宫内膜的生长。现有研究发现，内膜内血管缺血或血流减慢是引起薄型子宫内膜的重要因素，而通过缺氧对子宫内膜腺上皮细胞(EEC)进行损伤建模可模拟薄型子宫内膜的病变细胞，已有研究表明，在薄型子宫内膜病例中LIF、整合素β3和VEGF等分子的表达显著下调，而干细胞外泌体可以逆转表达下调的LIF、整合素β3和VEGF等分子，使其表达上调至正常组织水平。

miRNA是真核生物中一类长度约为22个核苷酸的参与基因转录后水平调控的非编码单链RNA.miRNA表达改变与多种疾病的发生发展密切相关,其作用具有广泛性和复杂性，已经发现的人类miRNA大部分(52％)位于已知的肿瘤相关基因组区域内或已知的基因脆性位点，可能同时具有癌基因和抑癌基因的双重作用，越来越多的与细胞分化成熟障碍、增殖失控、细胞永生化为本质的疾病密切相关的miRNA被发现，人类病变细胞和病变组织内miRNA的表达水平和类型都与正常细胞和组织的miRNA表达水平明显不同，miRNA及其调控的编码基因产物控制着多种疾病发生发展的基本信号通路，初步揭示了miRNA在阐明疾病发生机制、诊断和预后的生物学标记和治疗靶点等方面发挥着重要作用，进而可能为薄型子宫内膜的治疗提供一个新的切入点。因此本发明深入探究了miRNA对薄型子宫内膜的作用，为薄型子宫内膜的治疗提供了思路。

发明内容

基于此，有必要提供了miR-1285-5p在制备诊断、预防、治疗薄型子宫内膜的产品中的应用。

为实现上述目的，本发明具体技术方案如下：

本发明提取了子宫内膜腺上皮细胞(EEC)，随后对EEC细胞进行缺氧处理，成功造模出缺氧EEC模型，随后将人脐静脉间充质干细胞-外泌体(HuMSC-Exosome，HuMSC-EX)与缺氧损伤后的EEC共培养，通过转录组测序技术对EEC、缺氧损伤EEC和HuMSC-EX共培养EEC这三组细胞进行测序，从中筛选出差异表达的miR-1258-5p，将miR-1285-5p mimic与缺氧损伤后的EEC共培养，检测受损EEC细胞的增殖与凋亡功能，使用Western Blot(WB)技术检测细胞凋亡的关键信号分子表达差异，从而明确miR-1285-5p对EEC损伤细胞的功能影响，明确miR-1285-5p调控薄型子宫内膜的功能。

首先，提供了miR-1285-5p在制备诊断、预防、治疗薄型子宫内膜的产品中的应用。

优选的，所述miR-1285-5p通过抑制子宫内膜腺上皮细胞凋亡治疗所述薄型子宫内膜。

优选的，所述miR-1285-5p通过抑制p53、Caspase3、Bax的表达及促进Bcl-2的表达抑制所述子宫内膜腺上皮细胞凋亡。

优选的，所述miR-1285-5p通过提高子宫内膜腺上皮细胞增殖活性治疗所述薄型子宫内膜。

优选的，与正常健康人相比，所述薄型子宫内膜患者miR-1285-5p显著下调。

进一步地，还提供了miR-1285-5p在制备抑制子宫内膜腺上皮细胞上皮间质转化的产品中的应用。

优选的，所述miR-1285-5p通过促进E-Cadherin表达及抑制N-Cadherin表达抑制子宫内膜腺上皮细胞上皮间质转化。

进一步地，还提供了miR-1285-5p抑制剂在制备促进子宫内膜腺上皮细胞凋亡的产品中的应用。

进一步地，还提供了miR-1285-5p抑制剂在制备降低子宫内膜腺上皮细胞增殖活性的产品中的应用。

进一步地，还提供了miR-1285-5p抑制剂在制备促进子宫内膜腺上皮细胞上皮间质转化的产品中的应用。

基于上述技术方案，本发明具有以下有益效果：

本发明通过转录组测序技术(RNA-Sequence)筛选出miR-1285-5p，细胞功能实验和WB实验显示，miR-1285-5p可通过显著抑制EEC缺氧损伤发生治疗薄型子宫内膜，为薄型子宫内膜的诊断、预防及治疗提供了新的思路。miR-1285-5p及其抑制剂还可应用于抑制或促进EEC凋亡的基础医学研究中。

附图说明

图1对EEC、缺氧损伤EEC以及HuMSC-EX共培养EEC的RNA-seq测序结果热图；

图2EEC、缺氧损伤EEC以及HuMSC-EX中hsa-miR-1285-5p的qPCR验证结果；

图3has-miR-1285-5p mimic瞬时转染缺氧损伤模型细胞结果；

图4qPCR验证缺氧损伤EEC、没有转染miR-1285-5p mimic的缺氧损伤EEC、转染了miR-1285-5p mimic的缺氧损伤EEC中p53、Caspase3以及Bax的表达情况；

图5qPCR验证缺氧损伤EEC、没有转染miR-1285-5p mimic的缺氧损伤EEC、转染了miR-1285-5p mimic的缺氧损伤EEC中E-Cadherin、N-Cadherin表达情况；

图6WB验证缺氧损伤EEC、没有转染miR-1285-5p mimic的缺氧损伤EEC、转染了miR-1285-5p mimic的缺氧损伤EEC中Bax、p53、Caspase3、Bcl-2、E-Cadherin、N-Cadherin蛋白表达水平；

图7缺氧损伤EEC、没有转染miR-1285-5p mimic的缺氧损伤EEC、转染了miR-1285-5p mimic的缺氧损伤EEC的CCK8增殖实验结果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

下述实施例所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所有的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

抗体及其购买信息

Cadherin(Abcam ab40772),

anti-Bax抗体(Abcam ab182734),

Cleaved-Caspase3抗体(Abcam ab32042),

p53抗体(Abcam ab26),

Bcl-2抗体(Abcam ab182858),

E-cadherin抗体(Abcam ab40772),

N-Cadherin抗体(Abcam ab76011),

β-actin抗体(Cwbio CW0096)

实施例1 EEC细胞缺氧模型的构建

(1)EEC在常氧条件下培养，细胞生长到大约60-70％密度/容片率。

(2)缺氧处理时，细胞在加湿的缺氧空气(1％O₂,94％N₂,5％CO₂)下，置于恒温箱(Thermo)，37℃条件下培养1h、4h、8h、16h和24h；以常氧条件下培养的EECs为对照组。

实施例2 RNA-Seq

由于现有研究已经发现HuMSC-Exosome能够修复EEC的缺氧损伤，因此对EEC、缺氧损伤EEC以及HuMSC-EX共培养EEC进行RNA的提取，并通过RNA测序分析miRNAs表达谱，结果如图1所示，根据RNA-seq测序结果热图heatmap分析比较，miR-1285-5p在缺氧EEC中显著下调，加入HuMSC-Exosome共培养后miR-1285-5p表达又回升，猜测miR-1285-5p对缺氧EEC有治疗作用。

实施例3 miR-1285-5p qPCR表达验证

RNA-Seq测序得到miRNA差异基因表达谱，发现hsa-miR-1285-5p表达趋势符合干细胞外泌体表达趋势，即在EEC-Hypoxia中表达下调，而外泌体共培养EEC-Hypoxia后，hsa-miR-1285-5p表达再次上调，因此将hsa-miR-1285-5p作为研究靶点；随后将测序返样进行了qPCR验证，验证结果如图2所示，qPCR结果与测序结果一致，说明hsa-miR-1285-5p可能在EEC缺氧损伤中发挥关键调控作用。hsa-miR-1285-5p序列如SEQ ID NO:1所示，hsa-miR-1285-5p引物如下：

Forward：CGCGTACCTGGGAGACTGAG(SEQ ID NO:2)

Reverse：AGTGCAGGGTCCGAGGTATT(SEQ ID NO:3)

RT-Primer：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGA TACGACTCCAAC(SEQ IDNO:4)

实施例4过表达has-miR-1285-5p的缺氧损伤模型

合成has-miR-1285-5p mimic瞬时转染缺氧损伤模型细胞，转染结果如图3所示，结果显示，相较于缺氧损伤EEC和没有转染miR-1285-5p mimic的缺氧损伤EEC，转染了miR-1285-5p mimic的缺氧损伤EEC中has-miR-1285-5p的表达显著升高，提示转染成功，随后对缺氧损伤EEC、没有转染miR-1285-5p mimic的缺氧损伤EEC以及转染了miR-1285-5p mimic的缺氧损伤EEC进行qPCR实验，实验结果如图4-5所示，图4A-C显示，相较于缺氧损伤EEC和没有转染miR-1285-5p mimic的缺氧损伤EEC，转染了miR-1285-5p mimic的缺氧损伤EEC中p53、Caspase3以及Bax的表达显著下调，而p53、Caspase3以及Bax均为促进凋亡调控因子，提示miR-1285-5p能够抑制缺氧造成的EEC的凋亡；图5A-B显示，相较于缺氧损伤EEC和没有转染miR-1285-5p mimic的缺氧损伤EEC，转染了miR-1285-5p mimic的缺氧损伤EEC中E-Cadherin表达上调，N-Cadherin表达下调，而E-Cadherin是上皮细胞指标，N-Cadherin是间质细胞因子，揭示miR-1285-5p能够抑制缺氧造成的EEC的上皮间质转化。合成has-miR-1285-5p mimic及NC序列如下表所示：

实施例5 WB实验

对缺氧损伤的EEC、没有转染miR-1285-5p mimic的缺氧损伤EEC、转染了miR-1285-5p mimic的缺氧损伤EEC进行进行WB实验，实验步骤如下：

一.提取蛋白

接种细胞铺至6孔板内，待细胞长至95％以上，收样。

收取上清，放入1.5ml进口EP管，标注信息，冻存于-80℃冰箱。用预冷的氯化钠1ml/次，清洗两次。加入WB裂解液150μl/每孔(WB裂解液＝M2RIPA裂解液+蛋白酶抑制剂+磷酸酶抑制剂＝100:1:1)冰浴，摇床混匀25min，用黄枪头(大头)刮下蛋白(从外向里，“井”刮法，最后点两下，点下枪头上沾的蛋白)，吸出放至1.5ml进口EP管，标注信息，冻存于-80℃冰箱。

将裂解完的蛋白冰上解冻，4℃，12000rpm离心15分钟，将上清移至新管，从新管中取出2μl蛋白定量。

二.BCA蛋白定量(以赛默飞试剂盒BCA，货号23227)

配制工作液：根据标准品和样品数量，按50体积A试剂和1体积B试剂(50:1)配制成BCA工作液，充分混匀(混匀时可能会有浑浊，但混匀后就会消失)。

稀释标准品：取10μl赛默飞标准品(母液浓度2mg/ml)用10μl蛋白裂解液梯度稀释5次(第一个孔为母液不需要稀释，最后一个孔为蛋白裂解液)。

样品孔：8μl蛋白裂解液+2μl蛋白。

各孔加入200μl工作液，37℃放置25-30min。然后用酶标仪A562nm测定，根据标准曲线计算出蛋白浓度。

三.制备SDS-PAGE

1.根据蛋白大小及样品数量选择制作胶。制胶时，在固定好夹板后用双蒸水检漏10min，确定密封性良好后，先配制分离胶。将检漏完的双蒸水缓慢倒出，并用蓝枪头吸出剩余的水，在配制分离胶时最后加入过硫酸铵与TEMED，将配制好的分离胶沿玻璃板左侧缓慢加入，加至玻璃板的4/5处，用双蒸水进行液封，双蒸水使用蓝枪头戳黄枪头的方法，缓慢地，平移着加到分离胶上方，室温凝固45min以上。在确定分离胶凝固后，配制浓缩胶，同样的方法去除双蒸水，在配置完浓缩胶后需立即加入，否则会在离心管中凝固。加完浓缩胶后，按照实验需求插上对应规格的梳子，梳子要缓慢插入避免产生气泡。插完梳子后，室温放置40min以上。制胶成功后，拆下玻璃板，用带水的保鲜膜包裹，放至4℃冰箱备用。

四.蛋白样品变性

1.确定实验蛋白浓度，上样质量为20μg/well，将计算好的蛋白与加完β-巯基乙醇的2x Loading buffer混匀，沸水煮10min，瞬时离心冷却至室温进行实验。

五.电泳

1.加电泳液时一定要将胶板之间加满，短玻璃面朝里、相对，竖直向上，轻轻拔去梳子，竖直点样，核对电极，80V，跑至marker全出现转120V跑浓缩胶。

2.电泳跑上浓缩胶时，将转膜液放至4℃冰箱预冷，转膜液＝1x转膜液+20％甲醇，跑至marker条带明显拉开，开始转印。

六.转印

1.转印前的PVDF膜事先用甲醇浸泡，PVDF膜裁剪大小为8.5cm*5.5cm，用镊子拿取，起胶后，marker位置在右。如有气泡，用海绵蘸水滴在胶上，同时用塑料铲，轻轻赶走气泡。夹板放入电泳槽前核对电极和颜色，同时在电泳槽中加入伯乐自带的冰袋。将电泳槽包裹在冰水混合物的泡沫箱中，60V转印3h，也可在电泳槽和泡沫箱的间隙中加入-20℃的冰袋。

七.孵育一抗和二抗

1.转印结束后，将转印成功的PVDF膜放在1x TBST中洗去剩余的甲醇，清洗三次，每次5-10分钟。然后转至用1x TBST配制的5％的牛奶摇床孵育1h，用3％BSA配制一抗。

2.将剪好的膜从牛奶中取出放入1x TBST中清洗，用镊子夹出膜并沥干水分，放至剪好的杂交袋中，使用封膜机进行封口，在封膜机上压实封膜处，每侧封两道，将配制好的一抗加至杂交袋中，轻轻弹出杂交袋中的气泡，用移液枪吸去多余的一抗并回收，封口在杂交袋上标明加入的一抗名称。将封好的一抗一起放入大小适应的自封袋中，绑在摇床上，4℃混匀过夜。

3.次日从杂交袋中取出孵育完一抗的PVDF膜，口诀：“一剪，二倒，三四吸”回收一抗，将PVDF膜放至1x TBST中，摇床清洗10分钟，三次。

4.将清洗完的PVDF膜，放至5％牛奶配制的二抗中，摇床孵育1h，孵育结束后，回收二抗，将PVDF膜放至1x TBST中，摇床清洗10分钟，三次。

配制好显影液，显影和结果分析。

WB结果如图6所示，相较于缺氧损伤EEC和没有转染miR-1285-5pmimic的缺氧损伤EEC，转染了miR-1285-5p mimic的缺氧损伤EEC的细胞中促进凋亡调控因子Bax，p53，Caspase3蛋白表达水平下降，并抑制细胞凋亡调控因子Bcl-2蛋白表达水平上升，揭示miR-1285-5p能够抑制缺氧导致的EEC的细胞凋亡，并且上皮细胞指标E-Cadherin蛋白表达水平上升，间质细胞因子N-Cadherin蛋白表达水平下降，揭示miR-1285-5p能够抑制缺氧造成的EEC的上皮间质转化。

实施例6 CCK8增殖实验

对缺氧损伤的EEC、没有转染miR-1285-5p mimic的缺氧损伤EEC、转染了miR-1285-5p mimic的缺氧损伤EEC进行CCK8实验，实验步骤如下：

一.细胞准备

将细胞培养液收集在无菌15ml离心管中，用3ml Nacl清洗1遍，清洗后每瓶T25加入1ml胰酶，消化至细胞呈流沙状滑落，随即加入旧培养液终止消化。用1ml移液枪，吹吸混匀，转移至15ml离心管中，1000rpm离心5分钟。

将离心完的细胞，倒去上清，并加1-3ml无血清培养基重悬细胞，胎盘蓝1：1计数，调整细胞密度1E4(1*10^4)/ml。

二.铺板

1.将离心完的细胞，倒去上清，并加1-3ml新鲜培养基重悬细胞，胎盘蓝1：1计数，按2000cell/well将其铺至96孔板中，每孔200μl，37℃培养箱培养，每种细胞4复孔。

三.CCK8增殖检测

1.次日或细胞贴壁后计算为细胞增殖0d，开始加入CCK8试剂(索莱宝，货号CA1210-500)，步骤如下：

①配制CCK8使用液(10μl CCK8原液+100μl无血清培养基)X孔数(多配)

②吸去96孔板中的旧培养基，换上新配制的①，每孔加液110μl

③将加完①的96孔板和剩余的①37℃培养箱孵育1.5h

④将孵育完的CCK8吸出95μl至新的96孔板中，加上孵育的①做空白

⑤将新的96孔板用酶标仪450nm读取吸光值

注：CCK8全程避光操作

CCK8结果如图7所示，图7结果显示，相较于缺氧损伤EEC和没有转染miR-1285-5pmimic的缺氧损伤EEC，转染了miR-1285-5p mimic的缺氧损伤EEC的细胞增殖活性显著升高，揭示miR-1285-5p能够修复缺氧损伤EEC的细胞增殖活性。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国医学科学院北京协和医院

<120> miR-1285-5p在薄型子宫内膜中的应用

<130> P220019

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 1

gaucucacuu uguugcccag g 21

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 2

cgcgtacctg ggagactgag 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 3

agtgcagggt ccgaggtatt 20

<210> 4

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 4

gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgactccaac 50

<210> 5

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 5

gaucucacuu uguugcccag g 21

<210> 6

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 6

agaccgagac aagugcaaug uu 22

<210> 7

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 7

uuguacuaca caaaaguacu g 21

<210> 8

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 8

guacuuuugu guaguacaau u 21

Claims

1.miR-1285-5p在制备治疗薄型子宫内膜的医药产品中的应用；所述miR-1285-5p的序列如SEQ ID NO:1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述miR-1285-5p通过抑制子宫内膜腺上皮细胞凋亡治疗所述薄型子宫内膜。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述miR-1285-5p通过抑制p53、Caspase3、Bax的表达及促进Bcl-2的表达抑制所述子宫内膜腺上皮细胞凋亡。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述miR-1285-5p通过提高子宫内膜腺上皮细胞增殖活性治疗所述薄型子宫内膜。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，与正常健康人相比，所述薄型子宫内膜患者miR-1285-5p显著下调。