CN116492348A - 靶向htr2b基因的化合物在制备治疗肿瘤的药物中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了靶向HTR2B基因的化合物在制备治疗无功能垂体腺瘤、胃癌、葡萄膜黑色素瘤、或者肾透明细胞癌的药物中的用途。本发明还提供了HTR2B基因的抑制剂在制备治疗无功能垂体腺瘤(NFPA)、胃癌、葡萄膜黑色素瘤、或者肾透明细胞癌的药物中的用途。所述的HTR2B基因的抑制剂为PRX‑08066。本发明发现HTR2B基因在NFPA中高表达，因此可以作为肿瘤治疗的靶点。同时我们发现采用HTR2B特异性的抑制剂PRX‑08066，可以单独或者联合卡麦角林抑制无功能垂体腺瘤的体内外生长；PRX‑08066可以体外抑制NFPA、胃癌、葡萄膜黑色素瘤、或者肾透明细胞癌的原代肿瘤细胞的生长，有望成为其治疗新药。

Description

靶向HTR2B基因的化合物在制备治疗肿瘤的药物中的用途
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及HTR2B基因，具体来说是靶向HTR2B基因的化合物在制备治疗无功能垂体腺瘤、胃癌、葡萄膜黑色素瘤、或者肾透明细胞癌的药物中的用途。
背景技术
垂体腺瘤(pitNETs)为颅内第二常见肿瘤，人群年发病率高达7.5-15/10万人，无功能垂体腺瘤(NFPA)是一种没有垂体激素分泌过多的垂体腺瘤亚型，占垂体腺瘤的14％-54％。NFPA包括零细胞腺瘤和具有激素表达的临床无功能垂体腺瘤，特别是转录因子SF-1阳性的NFPA。NFPA的主要临床表现包括头痛、视力障碍和垂体功能减退，50％的NFPA是无症状的。经蝶手术是NFPA的首选治疗方法。有经验的神经外科医生可以在60-73％的病例中实现肿瘤完全切除。然而，6.9％的完全切除肿瘤的患者和40.3％-45.8％的存在肿瘤残余的患者术后出现肿瘤复发。术后放疗作为一种替代疗法，可将5年无进展生存率从70％提高到95％，而80％的患者在放疗后10-15年出现垂体功能减退。由于NFPA表达多巴胺受体和SSTR，有报道用多巴胺受体激动剂(DA)以及生长抑素类似物(SSA)来治疗复发性NFPA。Greenman等人的研究表明，87％的NFPA患者术后在接受预防性DA治疗后出现了肿瘤稳定或缩小，而对照组则为46.7％。在肿瘤残留明显的患者中，这一比例为58.5％，仍然高于对照组。关于SSA，一项研究表明，奥曲肽(一种长期SSA)将SSTR阳性NFPA的肿瘤控制率从47％提高到81％，然而这些患者均未观察到肿瘤缩小。由于经蝶手术后残留肿瘤较为常见，因此迫切需要新的药物治疗来控制复发性NFPA。
5-羟色胺(5-HT)，又称血清素，是在外周和中枢神经系统中研究的最广泛的一种神经递质，其受体具有多种不同受体亚型，其中13种属于G蛋白偶联受体(GPCRs)，其参与中枢神经系统中调节睡眠-觉醒周期、呕吐、食欲、情绪、记忆、认知和许多其他功能的调节。除此之外，5-羟色胺受体参与了胃肠蠕动和心脏生理和病理的多重作用。五羟色胺2B受体(HTR2B)作为一种典型的G蛋白偶联受体，过去的研究中已经证实了其与Gs和Gi蛋白间存在偶联，且能激活Gβγ-PI3K-Akt通路，参与细胞生存信号的相关调节,后续的研究发现HTR2B以及其他5-HT家族的受体参与调控了多种细胞的增值，并可促进多种恶性肿瘤的发生发展，但同时也有研究证实其在几种人类肿瘤中起到了抑制作用，HTR2B在不同肿瘤中的表达存在较大的差异，其对垂体肿瘤的影响尚未见报道。具体调控细胞生长与增值的机制需要更进一步的研究。HTR2B(5-HT2B)基因，在NCBI数据库中有记载，具体见：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/3357。
目前已公开PRX-08066Maleic acid是一种选择性的5-HT2B受体拮抗剂，IC50为3.4nM，作用于MCT大鼠模型，其体外研究和体内研究表明该药物可以明显降低肺动脉压，抑制血管重塑及改善心功能。
发明内容
针对现有技术中的上述技术问题，1)本发明提供了靶向HTR2B基因的化合物在制备治疗无功能垂体腺瘤的药物中的用途，所述的这种用途要解决现有技术中的药物对于治疗NFPA的效果不佳的技术问题。2)本发明提供了靶向HTR2B基因的化合物在制备治疗胃癌、葡萄膜黑色素瘤、或者肾透明细胞癌的药物中的用途。3)本发明提供了HTR2B基因的抑制剂在制备抑制无功能垂体腺瘤、胃癌、葡萄膜黑色素瘤、或者肾透明细胞癌的生长的药物中的用途。具体的，所述的HTR2B基因抑制剂为PRX-08066。4)本发明提供了HTR2B基因抑制剂PRX-08066与卡麦角林联合应用在制备治疗无功能垂体腺瘤的药物中的用途。
进一步的，PRX-08066的结构式为：
本发明还提供了检测HTR2B的试剂在制备诊断无功能垂体腺瘤、胃癌、葡萄膜黑色素瘤、或者肾透明细胞癌的试剂盒中的应用。
本发明通过实验证明，HTR2B基因抑制剂PRX-08066通过HTR2B受体抑制Gaq/PLC/PKC/stat3信号通路，抑制了pSTAT3(Tyr705)的核转移，从而抑制细胞增值。
本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。本发明发现HTR2B(5-HT2B)基因在垂体神经内分泌腺瘤中高表达，因此可以作为肿瘤治疗的靶点。同时我们发现采用HTR2B(5-HT2B)治疗特异性的抑制剂PRX-08066，可以抑制无功能垂体腺瘤的体内外生长(细胞实验和动物实验)以及抑制胃癌、葡萄膜黑色素瘤、或者肾透明细胞癌的体外生长。
附图说明
图1：HTR2B在NFPA中高表达及其功能研究(干扰或药物抑制HTR2B抑制垂体肿瘤细胞增殖)。(A)对pitNETs患者组织与正常垂体组织(GTEX数据库)进行批量Bulk-mRNA测序。(B)临床PitNETs组织样本和正常垂体组织的免疫组化。(C)免疫组化统计结果。(D-F)将裸鼠分为两组，对照组在裸鼠两侧皮下注射GH3细胞，两侧均为1×106个细胞(n＝5)，实验组在裸鼠两侧皮下注射GH3-HTR2B细胞(n＝5)，待成瘤后每72h测量一次肿瘤体积。处死裸鼠后取瘤，拍照，称量肿瘤，取肿瘤组织进行免疫组织化学染色。发现过表达HTR2B的肿瘤的体积和重量都明显升高(p＜0.001)。对肿瘤免疫组织化学染色发现实验组裸鼠肿瘤Ki67表达增高。(D-E)平板克隆实验显示干扰HTR2B表达分别抑制GH3和MMQ细胞增殖。(L-K)在裸鼠两侧皮下注射GH3细胞，两侧均为1×106个细胞(n＝5)，待成瘤后将裸鼠分为两组，实验组每48h灌胃给药PRX-08066，对照组每48h灌胃给药等量的PBS溶液，每48h测量一次肿瘤体积和裸鼠体重。处死裸鼠后取瘤，拍照，称量肿瘤,取肿瘤组织进行免疫组织化学染色。发现PRX-08066灌胃明显抑制了GH3肿瘤的生长(p＜0.01)而且对裸鼠体重无明显影响。PRX-08066处理组裸鼠肿瘤Ki67表达下降。
图2：HTR2B上调STAT3磷酸化水平(Tyr705)。(A)对PRX-08066处理的细胞系GH3、MMQ和AtT20进行了Bulk-RNA测序。从GH3和AtT20细胞中找到了STAT3和ARRDC4两个交叉的基因。(B)对PRX-08066处理后的GH3与AtT20细胞进行RT-qPCR检验，发现PRX-08066处理后的GH3和AtT20细胞中STAT3和ARRDC4明显下调。(C)Western Blot验证AtT20细胞系中的PRX-08066时间梯度与浓度梯度对STAT3磷酸化的抑制作用。(D)Western Blot验证GH3细胞系中的PRX-08066时间梯度与浓度梯度对STAT3磷酸化的抑制作用。(E)Western Blot验证GH3细胞系和AtT20细胞系中HTR2B过表达对STAT3磷酸化的激活作用。(F)Western Blot验证GH3细胞系和AtT20细胞系中干预HTR2B对STAT3磷酸化的抑制作用。(G)取适量裸鼠荷瘤模型PRX-08066灌胃给药实验中实验组与对照组的GH3肿瘤组织，加入RIPA裂解液，用研磨仪研磨后吸取上清，通过Western Blot验证PRX-08066灌胃对裸鼠皮下GH3肿瘤STAT3激活的抑制作用。(H)Western Blot验证PitNETs原代细胞中的PRX-08066浓度梯度对STAT3磷酸化的抑制作用。
图3：PRX-08066通过HTR2B抑制Gaq/PLC/PKC信号轴从而抑制STAT3磷酸化(HTR2B通过Gαq-PLC-PKC通路上调STAT3磷酸化水平)。(A)Western Blot验证GH3细胞系中Alpha-ME激活下Gαq特异性抑制剂YM254890，Gβγ复合物特异性抑制剂gallein对STAT3磷酸化的抑制作用。(B)Western Blot验证AtT20细胞系中Alpha-ME激活下Gαq特异性抑制剂YM254890，Gβγ复合物特异性抑制剂gallein对STAT3磷酸化的抑制作用。(C)Western Blot验证GH3细胞系中Alpha-ME激活下PLC抑制剂U73122和PKC抑制剂Ro318220对STAT3磷酸化的抑制作用。(D)Western Blot验证AtT20细胞系中Alpha-ME激活下PLC抑制剂U73122和PKC抑制剂Ro318220对STAT3磷酸化的抑制作用。
图4：CAB上调垂体瘤细胞系GH3和AtT20的STAT3磷酸化水平；CAB与5HTR2B抑制剂PRX-08066合用可协同抑制垂体肿瘤细胞生长(A)Western Blot验证CAB作用下GH3-shCtrl细胞系与GH3-shHTRB-548中STAT3磷酸化激活的水平。(B)GH3细胞中CAB与PRX-08066的联合治疗与单药相比更进一步抑制了细胞活性。(C)平板克隆实验验证GH3细胞中联合治疗的抑制作用。(D)Western Blot验证CAB作用下AtT20-shCtrl细胞系与AtT20-shHTRB-548中STAT3磷酸化激活的水平。(E)AtT20细胞中CAB与PRX-08066的联合治疗与单药相比更进一步抑制了细胞活性。(F)平板克隆实验验证AtT20细胞中联合治疗的抑制作用。(G)GH3-shCtrl与GH3-shHTR2B-548细胞中CAB与PRX-08066的联合治疗，发现对HTR2B的干扰部分逆转了联合治疗对细胞活性的抑制作用。(H-I)过表达HTR2B的GH3细胞系中，CAB和PRX-08066的治疗效果明显下降。(J-N)在裸鼠两侧皮下注射GH3细胞，两侧均为1×106个细胞(n＝5)，待成瘤后将裸鼠分为四组，联合治疗组每48h灌胃给药CAB和PRX-08066，CAB治疗组每48h灌胃给药等量CAB，PRX-08066治疗组每48h灌胃给药等量PRX-08066，对照组每48h灌胃给药等量的PBS溶液，每48h测量一次肿瘤体积和裸鼠体重。处死裸鼠后取瘤，拍照，称量肿瘤。证实CAB和PRX-08066联合治疗与单药相比有更良好的对肿瘤生长的抑制作用(p＜0.01)，且对裸鼠体重无明显影响。
图5：GLO-ATP细胞活力试验体外证明联合PRX-08066和CAB可抑制人垂体瘤原代细胞生长。
图6：TCGA数据库显示HTR2B高表达在胃癌、皮肤和葡萄膜黑色素瘤及膀胱尿路上皮癌中提示不良预后(A)。GLO-ATP活力试验体外证明PRX-08066抑制胃癌(AGS、HGC27和MGC-803)，葡萄膜黑色素瘤(MuM-2B)及肾透明细胞癌(786-O)的细胞生长(B)；体外蛋白实验证明PRX-08066抑制胃癌(AGS、HGC27和MGC-803)，葡萄膜黑色素瘤(MuM-2B)及肾透明细胞癌(786-O)的细胞生长；(C、E和F)，而无法抑制皮肤黑色素瘤细胞生长(B16和A375，D)。
具体实施方式
实施例1.RNA-seq检测人pitNETs中HTR2B表达水平
实验材料：pitNETs标本，Trizol(Thermo Fisher USA)
实验方法：
(一)原代细胞制备
1.手术中取出人的pitNETs标本放置于无血清培养液中送至实验室。
2.用Hank’s液洗涤三次，并剔除脂肪，结缔组织，血液等杂物。
3.用手术剪将组织剪成小块(1mm3)，再用Hank’s液洗三次，转移至小青霉素瓶中。
4.视组织块量加入5-6倍体积的0.25％胰酶液，37℃中消化20-40分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。
5.加入3-5ml培养液以终止胰酶消化作用(或加入胰酶抑制剂)。
6.静置5-10分钟，使未分散的组织块下沉，取悬液加入到离心管中。
7.1000rpm，离心10分钟，弃上清液。
8.加入Hank’s液5ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。
9.加入DMEM培养液1-2ml，重悬得到单细胞悬液。
(二)RNA-seq及数据分析
1.提取总RNA(见实施例5)
2.RNA-seq文库制备及测序
(1)去除rRNA：每个样本需要取2μg的总RNA，采用Ribo-ZeroTM Magnetic
Kit试剂盒并根据其说明书步骤去除rRNA。
(2)RNA片段化：采用NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer对不含有rRNA的总RNA进行片段化
(3)1st Strand cDNA合成：采用NEBNext Multiplex Oligos for Illumina试剂盒对上一步所得片段化RNA进行逆转录合成1st cDNA
(4)2st Strand cDNA合成：采用NEBNext Multiplex Oligos for Illumina试剂盒对上述所得片段化RNA进行逆转录来合成2st cDNA
(5)尾端修复：采用NEBNext Multiplex Oligos for Illumina试剂盒对上一步所得ds cDNA进行尾端修复并添加A尾
(6)测序适配体连接：将上步所得产物连接测序适配体
(7)PCR扩增：对已经有适配体连接的cDNA进行PCR扩增文库用于上机测序
(8)上机测序：将扩增文库用2100Bioanalyzer chip进行质检，质检合格之后，采用Illumina HiSeq测序仪按操作步骤开始测序。
3.RNA-seq信息分析
格式为Fastq的原始数据经FastQC处理，并用NGSQC移除低表达值，所得高
质量Reads经Tophat2整合到小鼠基因组(基因组版本为GRCm38/mm10)，差异表达
基因在R语言中，经limma和edgeR分析所得。
4.实验结果：分析发现垂体瘤各谱系(PIT1,TPIT,SF1及Null cell谱系)的HTR2B基因表达高于GTEX数据库中正常垂体的表达(图1A上)及其统计分析(图1A下)。
实施例2.肿瘤免疫组织化学检测HTR2B在人PitNETs中表达
实验材料：石蜡组织芯片
实验方法：
(一)、制备石蜡切片
1.取材
手术病人肿瘤标本收集
2.固定
将获得的组织用生理盐水洗一下，立即投入中性福尔马林固定液中固定30－50min。
3.洗涤
材料经固定后，流水冲洗，数小时或过夜。
4.脱水
材料依次经70％、80％、90％各级乙醇溶液脱水，各30min，再放入95％、100％各2次，每次20min。
5.透明
纯酒精、二甲苯等量混合液15min，二甲苯Ⅰ，15min、Ⅱ，15min(至透明为止)。
6.透蜡
放入二甲苯和石蜡各半的混合液15min，再放入石蜡Ⅰ、石蜡Ⅱ透蜡各50-60分钟。
7.包埋
包埋时，用镊子夹取石蜡模子(金属质地)在酒精灯上稍加热，放在平的桌面上，从温箱中取出盛放纯石蜡的蜡杯，倒入少许石蜡。再将镊子在酒精灯上稍加热，夹取材料将切面朝下放入蜡模中，排列整齐。再放上包埋盒，轻轻倒入熔蜡。
8.切片
①将已固定和修好的石蜡块装在切片机的夹物台上。
②将切片刀固定在刀夹上，刀口向上。
③摇动推动螺旋，使石蜡块与刀口贴近，但不可超过刀口。
④调整石蜡块与刀口之间的角度与位置，刀片与石蜡切片约成15度左右。
⑤调整厚度调节器到所需的切片厚度，一般为4-10微米。
⑥一切调整好后主可以开始切片。此时右手摇动转轮，让蜡块切成蜡带，左手持毛笔将蜡带提起，摇转速度不可太急，通常以40-50r/min为宜。
⑦切成的蜡带到20-30cm长时，右手用另一支毛笔轻轻将蜡带挑起，以免卷曲，并牵引成带，平放在蜡带盒上，靠刀面的一面较光滑，朝下，较皱的一面朝上。
⑧用单面刀片切取蜡片一小段，放在载玻上加水一滴，置于放大镜或显微镜下观察切片是否良好。
⑨切片工作结束后，应将切片刀取下用氯仿擦去刀上沾着的石蜡，把切片机擦拭干净妥为保存。
9.展片、贴片
打开水浴锅，使水温维持在40-45℃，另准备30％乙醇溶液。
①切片时，将一碗30％乙醇溶液放于切片机旁的桌面上。
②用小镊子夹取预先用刀片割开的蜡带，放在乙醇溶液的水面上，使切片展开。
③小镊子轻轻地将连在一起的切片分开，用一个载玻片将切片完整，已展开的切片捞至温水中，使之充分展开。
④另取洁净的载玻片，捞起展开的切片，使其位于切片1/3处，另一端磨面上标记或贴上标签，放于切片架上。
10.脱蜡复水
将水浴锅温度调至60℃，待水温控制在60℃时，将切片连同切片架放入一干燥的染色缸内，放入水浴锅中，盖上盖子(可密封)，30min至蜡熔化。
之后，石蜡切片经二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡各5min，然后放入100％、95％、90％、80％、70％各级酒精溶液中各3-5min，再放入蒸馏水中3min。
11.染色
切片放入苏木精中染色约10-30min。
12.水洗
用自来水流水冲洗约15min。使切片颜色变蓝，以防切片脱落。
13.分化
将切片放入1％盐酸乙醇液中褪色，约2秒至数十秒钟。见切片变红，颜色较浅即可。
14.漂洗
切片再放入自来水流水中使其恢复蓝色。
15.脱水Ⅰ
切片入50％乙醇→70％乙醇→80％乙醇中各3-5min。
16.复染
用0.5％伊红乙醇液对比染色1-3min。
17.脱水Ⅱ
将切片放入95％乙醇中洗去多余的红色，然后放入无水乙醇中3-5min。最后用吸水纸吸干多余的乙醇。
18.透明
切片放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各3-5min。
19.封藏：中性树胶封存
(二)免疫组织化学
1.石蜡切片放置在60℃恒温箱中烘烤120分钟；
2.脱蜡和水化：二甲苯(10min)→二甲苯(10min)→无水乙醇(5min×2次)→95％乙醇(5min
×2)→90％(5min)→85％乙醇(5min)→80％乙醇(5min)→75％乙醇(5min)；
3.蒸馏水冲洗2次5min；
4.加3％H2O2孵育30min(室温)；
5.蒸馏水洗2次；
6.抗原修复：高压修复或微波修复|柠檬酸修复液：柠檬酸0.4g柠檬酸钠3g配成1000ml
高压修复：高压2min；微波修复：预热5min，高火4min，中火5min；
7.PBS洗3次各5min，封闭30min；
8.滴加一抗，4℃过夜或37℃孵育2～3h；
9.PBS冲洗3次各5min；
10.滴加二抗，37℃孵育30～60min；
11.PBS洗3次各5min；
12.DAB显色，自来水充分冲洗；
13.苏木素复染，自来水充分冲洗；14、脱水、透明各5～10min；
14.封片：中性树脂，加盖玻片(组织部位切勿残留小气泡)，自然晾干。
(三)数据统计
所有的手术病理样本都由两位病理学家独立审查。组织化学评分(histochemistry score)即H-SCORE，是处理免疫组化结果的一种组织学评分方法，将每张切片内阳性的细胞数量及其染色强度转化为相应的数值，达到对组织染色半定量的目的。
如使用H-score＝Σpi(i+1)，式中pi表示阳性细胞数量占切片中所有细胞数量的百分数；i代表着色强度。
实验结果：HTR2B在SF1谱系(NFPA)中高表达(图1B和C)
实施例3.在小鼠动物体内证实过表达HTR2B对肿瘤生长的促进作用和PRX-08066对肿瘤生长的抑制作用
实验材料：
人来源的肾上皮细胞系株HEK293T细胞，大鼠来源的垂体瘤细胞株GH3，MMQ细胞系，小鼠来源的垂体瘤细胞株AtT20细胞系购于美国ATCC公司。pLVshRNA-EGFP-Puro(shRNA-HTR2B),pLV-EGFP-Puro(pLV-HTR2B)买自通用生物(安徽)股份有限公司。实验方法：
(一)、转染pLV-HTR2B质粒：
细胞悬浮于常规培养基中，并调节细胞密度为5×105细胞/孔接种于12孔培养板中。
1、转染前一天细胞换新的培养基
2、制备DNA-Lipofectamine 2000复合物，如下:
a、用50ul无血清培养基稀释DNA(0.8g)，轻轻混匀；
b、Lipofectamine 2000使用前，轻轻混匀，用48ul无血清培养基稀释2ulLipofectamine 2000，轻轻混匀，室温孵育5分钟；
c、将a+b的液体加在一起，轻轻混匀，室温孵育20分钟，使DNA-Lipofectamine2000复合物形成；
3、将100ul DNA-Lipofectamine 2000复合物加入培养板中，轻轻前后摇匀；
4、放入37度孵箱中培养24～48h后，1：10传代，加入嘌呤霉素筛选(GH3,2ug/ml；MMQ 1ug/ml；AtT20,1ug/ml)。
5、等细胞在G418作用下，长满后冻存保种。再克隆化培养：将细胞消化后计数50个细胞，加入22ml完全培养基中，混匀，分装在96孔板中(200ul/孔)。第二天在显微镜下，寻找孔中有单个细胞的孔并做标记，等做标记的孔长满后，消化、转移到4孔或6孔培养板中。
(二)、裸鼠荷瘤动物模型的建立
1、一般选取4-6周的裸鼠
2、将对数生长的pLV-HTR2B过表达或对照组GH3细胞收集，用无血清基质10ml，于1500
转/分，离心3min，连续洗3次，最后用无血清基质混匀，用血球计数器计算肿瘤细胞数量(平均5个中方格的细胞计数×104即是肿瘤数/毫升)。计算完肿瘤细胞总数，再将肿瘤细胞密度调至107个/ml，每只小鼠大腿肌肉内测皮下注射接种100ul(即1×
106个肿瘤细胞)，2周左右可扪及肿瘤小节结。
3、对于证明PRX-08066抑制肿瘤的试验，待肿瘤体积长到约100mm3时分组DMSO及PRX-08066组，给予DMSO和PRX-08066腹腔注射，每两天给药一次，且用游标卡尺量肿瘤纵横大小(单位：mm)。
4、给药21天后，处死裸鼠，取出瘤体称重，拍照，并将肿瘤切块保存冻存管及4％的福尔马林中。
5、按照实施例2中的步骤进行肿瘤免疫组织化学染色(Ki67染色)。
实验结果：体内动物实验中，过表达HTR2B促进PitNETs细胞系GH3和Att20肿瘤生长(图1D，E，F)，而PRX-08066能抑制肿瘤细胞生长(图1I，J，K)。
实施例4.克隆形成试验证实PRX-08066抑制GH3细胞生长，干预HTR2B表达后PRX-08066的抑制作用减弱。
实验器材：大鼠来源的垂体瘤细胞株GH3细胞购于美国ATCC公司。PRX-08066(购于MedChemExpress,USA)
实验方法：
1.将处于对数生长期的对照组或者shHTR2B的GH3细胞胰酶消化后，完全培养基(基础培养基+10％胎牛血清)重悬成细胞悬液，并计数；
2.细胞接种：于6孔板培养板中各实验组接种400-1000个细胞/孔(根据细胞生长情况确定，一般为700个细胞/孔；若为12孔板，则体系减半)；按照图中所示浓度加入PRX-08066
3.继续培养到14天或绝大多数单个克隆中细胞数大于50为止，中途每隔3天进行换液并观察细胞状态；
4.克隆完成后，在显微镜下对细胞进行拍照，然后PBS洗涤1次，每孔加入1mL 4％多聚甲醛固定30-60min，PBS洗涤1次；
5.每孔加入结晶紫染液1ml，染细胞20min；
6.PBS 1ml洗涤细胞2次，晾干，数码相机拍照(分别对整个六孔板及每个孔进行单独拍照)。
实验结果：PRX-08066抑制GH3细胞克隆形成，干预HTR2B的表达后PRX-08066的抑制作用减弱(图1G,H)。
实施例5.RNA-seq筛选PRX-08066影响基因STAT3和ARRDC4
实验材料：大鼠来源的垂体瘤细胞株GH3细胞购于美国ATCC公司。PRX-08066(购于MedChemExpress,USA)。
实验方法：
(一)样本制备
1.6孔板培养板中接种106个细胞/孔，培养基体积为2ml/孔，加入PRX-08066使浓度为20μM
2.37℃，5％ CO2条件的培养箱常规培养24h。
(二)RNA-seq(见实施例1)
(三)qRT-PCR
(1)提取RNA和RT-PCR
【冰上进行】
1.收集细胞，每管保留1×107个细胞
2.3600rpm离心3min，弃去上清。
3.每个样品中加入1ml Tripure试剂(每106-107 1ml)，剧烈涡旋，震落细胞使共完全裂解。
4.室温静置5min，或者4度保存。
5.每管加入1/5trisol体积氯仿(三氯甲烷)，剧烈涡旋震荡成乳浊态后，(室温静置5min)
6.12000rpm，4℃离心15min(样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用Tripure试剂的60％)。
7.将异丙醇(熔点－88.5℃，预冷不会凝固)，每管400ul加入新的EP管中(等体积异丙醇)。
8.小心吸取上清液。
9.400ul至预冷异丙醇中，轻轻颠倒(室温静置20min)，或者-20℃过夜。
用DEPC水和无水乙醇配置70％乙醇。
10.12000rpm，4℃离心15min，弃上清。
11.加入70％乙醇0.8ml，轻轻震荡至沉淀飘起来，10000rpm，4℃离心10min.弃上清，再1000rpm 1min，吸掉剩余上清，倒扣于滤纸上，在空气中干燥RNA沉淀。
12.溶解RNA，加入10-50μl DEPC水。
13.Nanodrop测RNA浓度和纯度。
(2)逆转录
逆转录(RT)-takara试剂盒【冰上进行】
①八联管中上样
举例：20μl体系
试剂使用量
5×ELV逆转录premix 4μl
Total RNA 1000ng
RNase Free dH2O补足20μl
轻柔混匀后进行反转录
②thermocycler逆转录
37℃15min(反转录)
85℃5sec(反转录酶的失活反应)
4℃保温
结束后得到cDNA保存于4度
(3)PCR
①上样96孔专用上样板
Real Time PCR体系——10μl体系或20μl【冰上操作】
举例：10μl体系
试剂使用量
SYBR@Green Premix(含rox)(2×)5μl
PCR Forward Primer(10μM)0.4μl
PCR Reverse Primer(10μM)0.4μl
cDNA溶液(该溶液为1000ng mRNA逆转录后的cDNA溶液，再稀释30倍)3μl
DEPC或ddH20(灭菌蒸馏水)1.2μl
②全部加好后先贴qPCR专用透光膜，
③离心1000rpm 1min
④上机
实验结果：RNA-seq和qPCR成功筛选并验证PRX-08066在GH3和Att20细胞系中下调基因STAT3表达(图2A，B)。
实施例6.Western Blot证明HTR2B过表达可上调GH3和AtT20的STAT3磷酸化水平，干扰5HTR-2b或者使用PRX-08066可下调STAT3的磷酸化水平。
实验材料：
人来源的肾上皮细胞系株HEK293T细胞，大鼠来源的垂体瘤细胞株GH3细胞，小鼠来源的垂体瘤细胞株AtT20细胞购于美国ATCC公司
质粒：pLVshRNA-EGFP-Puro(shRNA-HTR2B),pLV-EGFP-Puro(pLV-HTR2B)买自通用生物(安徽)股份有限公司。
抗体：STAT3一抗(Cell Signaling Technology,USA)，p-STAT3一抗(CellSignaling Technology,USA)，HTR2B一抗(ABclonal，中国武汉)，β-actin一抗(赛维尔,中国武汉)，羊抗兔(鼠)二抗(Cell Signaling Technology,USA)，蛋白Marker(ThermoFisherUSA)
实验方法：
(一)pLV-HTR2B过表达和shHTR2B敲降质粒转染：同实施例3
(二)样本制备
1.6孔板培养板中接种106个细胞/孔(接种细胞为GH3或AtT20)，培养基体积为2ml/孔，按照图中所示加入PRX-08066(浓度梯度实验如图所示，时间梯度实验浓度为20μM)，对照组加入等体积PBS。
2.37℃，5％ CO2条件的培养箱常规培养，培养时间：时间梯度实验时间长度如图所示，浓度梯度时间为24h。
(三)提取细胞总蛋白和Western Blot。
(1)细胞培养裂解液的制备
1.将细胞放置冰上并用冰冷的PBS洗涤细胞。
2.吸出PBS，然后加入冰冷的裂解缓冲液(每107个细胞/100mm培养皿/150cm2烧瓶加1mL；每5x106个细胞/60mm培养皿/75cm2烧瓶加0.5mL)。
3.用预冷的塑料细胞刮刀将贴壁细胞从培养皿上刮下，然后轻轻将细胞悬液转移到预冷的离心管中。或者用胰蛋白酶消化细胞并用PBS洗涤细胞，然后将细胞重悬浮于小离心管内的裂解缓冲液中。
4.4℃下持续振摇30分钟。
5.放入微型离心机，在4℃下离心,12000rpm转速下离心20分钟。
6.轻轻地从离心机中取出离心管放置在冰上。将上清液吸出转移到放置在冰上预冷的新管中，弃去沉淀。
(2)样本制备
1.取少量裂解液，用于蛋白质定量分析。测定每种细胞裂解液的蛋白质浓度。
2.确定蛋白质的上样量，并添加等体积的2X稀释Laemmli样本缓冲液。我们建议使用
以下方法对样本进行还原和变性，除非在线抗体数据表显示应使用非还原和非变性条件。
3.对样本进行还原和变性时，将样本缓冲液中的细胞裂解液在100℃下煮沸5分钟。裂解液可等量分装并在-20℃下储存备用。
(3)配胶
1.玻璃板、样品梳、Spacer用洗涤剂洗净，用ddH2O冲洗数次，再用乙醇擦拭，晾干；
2.将两块洗净的玻璃板之间加入Spacer，按照Bio-Rad MiniⅡ/Ⅲ说明书提示装好玻璃板；
3.按如下体积配制10％分离胶8.0ml，混匀：ddH2O 3.0ml；1.0mol/LTris-HCl pH＝8.8 2.1
ml；30％Acr-Bis 2.8ml；10％SDS 80ul；10％AP 56ul；TEMED 6ul。
4.向玻璃板间灌制分离胶，立即覆一层重蒸水，大约20min后胶即可聚合；
5.按如下体积配制6％浓缩胶3.0ml，混匀：ddH2O 1.0mol/LTris-HClpH＝6.830％Acr-Bis；2.0ml 400ul 600ul；10％SDS 10％AP TEMED；36ul 24ul 4ul。
6.将上层重蒸水倾去，滤纸吸干，灌制浓缩胶，插入样品梳。
(4)上样和跑胶
1.将等量的蛋白和分子量标志物上样至SDS-PAGE凝胶孔中。细胞裂解液或组织匀浆的总蛋白上样量为20-30μg，纯化蛋白的上样量为10-100ng。
2.在100V下跑胶约1-2小时。
凝胶百分比取决于目标蛋白的大小
蛋白大小 凝胶百分比
4–40kDa 20％
12–45kDa 15％
10-70kDa 12.5％
15-100kDa 10％
25-100kDa 8％
(5)蛋白从凝胶转移到膜
膜选择PVDF膜。用甲醇活化PVDF 1分钟，并在制备转膜层之前用转膜缓冲液冲洗PVDF。转膜时间和电压可能需要优化。我们推荐按照制造商的说明进行操作。可在封闭步骤之前用丽春红染色法检查蛋白质转膜。
(6)抗体染色
1.用封闭缓冲液在室温下封闭膜1小时或在4℃下封闭过夜。
2.用适当稀释的一抗(p-STAT3，STAT3，HTR2B，β-actin)在封闭缓冲液中孵育膜。我们建议在4℃下过夜孵育；其他条件可以优化。
3.用TBST洗涤膜3次，每次5分钟。
4.用推荐稀释度的偶联二抗在封闭缓冲液中室温孵育膜1小时。
5.用TBST洗涤膜3次，每次5分钟。
6.产生信号时，请遵循试剂盒生产商的建议。除去多余的试剂，并用透明塑料膜覆盖膜。
7.利用暗室显影技术采集化学发光图像，或利用常规图像扫描法采集比色检测图像。
实验结果：
HTR2B过表达可上调GH3和AtT20的STAT3磷酸化水平(图2E)，干扰HTR2B或者使用PRX-08066可下调GH3，AtT20，人原代PitNETs细胞的STAT3的磷酸化水平(图2C，D，F，G，H)。
实施例7.PRX-08066通过HTR2B抑制Gαq/PLC/PKC信号轴从而抑制STAT3磷酸化。
实验材料和实验方法：
大鼠来源的垂体瘤细胞株GH3细胞，小鼠来源的垂体瘤细胞株AtT20细胞(ATCC)。α-Methyl-5-hydroxytryptamine maleate(Alpha-ME,Tocris Bioscience,UK)，Ro-31-8220(碧云天,中国上海)，U73122(MedChemExpress,USA)，YM-254890(MedChemExpress,USA)，PRX-08066(MedChemExpress,USA)，Gallein(MedChemExpress,USA)实验结果：PRX-08066通过HTR2B抑制Gaq/PLC/PKC信号轴从而抑制STAT3磷酸化。
(图3A-D)
实施例8.Western Blot证明卡麦角林(CAB)上调GH3和AtT20的STAT3磷酸化水平并依赖于HTR2B
实验材料：大鼠来源的垂体瘤细胞株GH3细胞，小鼠来源的垂体瘤细胞株AtT20细胞(ATCC)。卡麦角林(Sigma,USA)，PRX-08066(MedChemExpress,USA)；质粒：pLVshRNA-EGFP-Puro(shRNA-HTR2B),pLV-EGFP-Puro(pLV-HTR2B)买自通用生物(安徽)股份有限公司。
实验方法：
(一)shHTR2B敲降质粒转染：同实施例3
(一)样本制备
1.6孔板培养板中接种106个细胞/孔，培养基体积为2ml/孔，按照图示浓度加入CAB和PRX-08066
2.37℃，5％ CO2条件的培养箱常规培养24h
(二)Western Blot：同实施例5
实验结果：卡麦角林(CAB)上调GH3和AtT20的STAT3磷酸化水平，干扰shHTR2B后该效应消失(图4A，D)。
实施例9.GLO-ATP细胞活力试验体外证明PRX-08066和CAB可联合抑制GH3，AtT20细胞系和人PitNETs原代细胞生长；过表达HTR2B可导致GH3对CAB耐药。
实验材料：
同实施例8，原代细胞从NFPA手术标本提取
实验方法：
(一)转染GFP-5HTR-2b过表达和shHTR2B敲降质粒：见实施例3
(二)原代细胞制备及培养
1.手术中取出人的垂体神经内分泌腺瘤标本放置于无血清培养液中送至实验室。
2.用Hank’s液洗涤三次，并剔除脂肪，结缔组织，血液等杂物。
3.用手术剪将组织剪成小块(1mm3)，再用Hank’s液洗三次，转移至小青霉素瓶中。
4.视组织块量加入5-6倍体积的0.25％胰酶液，37℃中消化20-40分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。
5.加入3-5ml培养液以终止胰酶消化作用(或加入胰酶抑制剂)。
6.静置5-10分钟，使未分散的组织块下沉，取悬液加入到离心管中。
7.1000rpm，离心10分钟，弃上清液。
8.加入Hank’s液5ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。
9.加入DMEM培养液1-2ml，血球计数板计数。
10.将细胞调整到5×105/ml左右，转移至25ml细胞培养瓶中，37℃下培养。
(三)GLO-ATP细胞活力试验
1.细胞悬浮于常规培养基中，并调节细胞密度为1×104细胞/孔接种于96孔培养板中。加入含药培养基PRX-08066和CAB作用浓度见图中所示。空白对照组含DMSO 0.3％。
2.将给药后的细胞于37℃，5％ CO2条件下培养24小时。
3.每孔加入CellTiter-GLO溶液，摇床上孵育2分钟，室温避光孵育15分钟。
4.酶标仪检测化学发光。
实验结果：PRX-08066和CAB可联合抑制GH3，AtT20细胞系和人PitNETs原代细胞生长(图4B，E；图5)，当过表达或敲减HTR2B后，CAB对GH3的抑制作用减弱或增强(图4H，I，G)。
实施例10.克隆形成实验体外证明PRX-08066和CAB可联合抑制GH3和AtT20细胞系生长实验材料：卡麦角林(Sigma,USA)，PRX-08066(MedChemExpress,USA)，其余同实施例3
实验方法：加药方法如图所示，其余同实施例4
实验结果：PRX-08066和CAB可体外联合抑制GH3和Att20细胞系生长(图4C，F)
实施例11.裸鼠移植瘤模型体内证明PRX-08066和CAB可联合抑制GH3和AtT20肿瘤生长。
实验材料：卡麦角林(Sigma,USA)，PRX-08066(MedChemExpress,USA)；其余同实施例3
实验方法：注射卡麦角林方法为：腹腔注射，对照组注射等体积PBS，其余同实施例3实验结果：PRX-08066和CAB可体内联合抑制GH3和AtT20肿瘤生长(图4J，K，L，M,N)。
实施例12.TCGA泛癌图谱和生存分析
实验材料：TCGA Pan-Cancer Atlas
实验方法：使用R包UCSCXenaTools从UCSC Xena(https://xenabrowser.net/)下载TCGA Pan-Cancer Atlas的RNA-seq基因表达和临床特征。评估了包括33种肿瘤类型的9,875个原发肿瘤样本的TCGA PanCanAtlas数据。使用FPKM来评估基因的表达水平。我们对每个TCGA队列进行生存分析，使用Kaplan-Meier方法生成生存曲线，并使用对数秩检验来确定统计学意义。我们使用R软件包survminer(https://CRAN.R-project.org/package＝survminer)，根据每个独立的TCGA队列中基因表达和患者总生存期之间的关联，评估中位数值。对于单变量分析，我们通过R包survival(https://CRAN.R-project.org/package＝survival)使用Cox比例危害回归模型计算危险比。实验结果：TCGA提示胃癌(STAD)、皮肤(SKCM)和葡萄膜黑色素瘤(UVM)、及膀胱尿路上皮细胞癌(BLCA)存在高表达HTR2B提示预后不良(图6A)。
实施例13.GLO-ATP活力试验体外证明PRX-08066抑制胃癌(AGS、HCG27和MGC-803)，葡萄膜黑色素瘤(MuM-2B)及肾透明细胞癌(786-O)的细胞生长。
实验材料：PRX-08066(MedChemExpress,USA)，胃癌细胞系(AGS、HCG27和MGC-803)，葡萄膜黑色素瘤(MuM-2B)、肾透明细胞癌(786-O)和皮肤黑色素瘤细胞系(B16和A375)。实验方法：其余同实施例4。
实验结果：PRX-08066体外抑制胃癌细胞系(AGS、HCG27和MGC-803)，
葡萄膜黑色素瘤(MuM-2B)、肾透明细胞癌(786-O)的细胞生长(图6B)。
实施例14.PRX-08066抑制胃癌、葡萄膜黑色素瘤和肾透明细胞癌细胞系STAT3磷酸化。实验材料：PRX-08066(MedChemExpress,USA)，胃癌细胞系(AGS、HCG27和MGC-803)，葡萄膜黑色素瘤(MuM-2B)、肾透明细胞癌(786-O)和皮肤黑色素瘤细胞系(B16和A375)。
实验方法：其余同实施例6.
实验结果：体外蛋白实验证明PRX-08066抑制胃癌(AGS、HGC27和MGC-803)，葡萄膜黑色素瘤(MuM-2B)及肾透明细胞癌(786-O)的细胞生长；(图6-C、E和F)，而无法抑制皮肤黑色素瘤细胞生长(B16和A375，图6-D)。

Claims (5)

1.靶向HTR2B基因的化合物在制备治疗无功能垂体腺瘤、胃癌、葡萄膜黑色素瘤、或者肾透明细胞癌的药物中的用途。
2.HTR2B基因的抑制剂在制备治疗无功能垂体腺瘤生长、胃癌、葡萄膜黑色素瘤、或者肾透明细胞癌的药物中的用途。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的HTR2B基因抑制剂为PRX-08066，结构式为：
4.HTR2B基因抑制剂PRX-08066与卡麦角林联合应用在制备治疗无功能垂体腺瘤的药物中的用途。
5.检测HTR2B的试剂在制备诊断无功能垂体腺瘤、胃癌、葡萄膜黑色素瘤、或者肾透明细胞癌的试剂盒中的应用。
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