CN110583619A - 一种结直肠癌实体瘤组织样本保存液 - Google Patents

一种结直肠癌实体瘤组织样本保存液 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种结直肠癌实体瘤组织样本保存液。本发明样本保存液由胎牛血清、抗菌抗真菌剂三抗、HEPES和HBSS组成；其中，所述胎牛血清的终浓度为1‑5％(体积分数)；所述抗菌抗真菌剂三抗中的青霉素的终浓度为100‑200U/mL、链霉素的终浓度为100‑200μg/mL、两性霉素B的终浓度为250‑500ng/mL；所述HEPES的终浓度为8‑12mM；余量均为HBSS。利用本发明方法得到的结直肠癌原代细胞培养物可用于多种细胞水平的体外实验、二代测序、构建动物模型、构建细胞系等等。可以预见，这种培养方法和本发明所提供的样本保存液在结直肠癌的研究和临床诊断治疗领域具有广泛的应用前景。

Description

一种结直肠癌实体瘤组织样本保存液
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种结直肠癌实体瘤组织样本保存液。
背景技术
结直肠癌是最常见的严重威胁人类的健康恶性肿瘤之一。在我国结直肠癌的发病率为9.24％，在所有恶性肿瘤中占第四位。而结直肠癌的死亡率为11.77％，在全部恶性肿瘤中占第五位。随着经济的发展、生活水平的提高和生活方式的改变，结直肠癌的发病率还将呈不断上升的趋势。另外，结直肠癌复发转移风险高，超过50％的结直肠癌患者会在根治性治疗后数月到数年内出现不同程度的复发转移。
尽管世界各国的科研和医疗机构对结直肠癌的病因以及发生发展过程的研究都有很大力度的投入，但是人类对这种疾病仍然知之甚少。结直肠癌是一种复杂疾病，其发生、发展是一个动态的过程，涉及到诸多信号分子相互作用，形成了一个复杂的分子调控网络，同时还受到外界环境因素的影响。结直肠癌的病因和发生发展过程有很强的个体差异性，不能一概而论。因此将结直肠癌实体瘤原代细胞培养物作为模型进行个体化精准研究是结直肠癌研究领域乃至结直肠癌诊断治疗领域的趋势。
术中所取的新鲜肿瘤组织样本由于不能即刻进行原代细胞的分离，因此好的样本保存液对于有样本离体后短时间内维持样本中细胞的活性至关重要，可以说这是影响原代肿瘤细胞分离与培养效果中的一个重要环节。
发明内容
为了有效解决上述技术问题，本发明提供了一种新的结直肠癌实体瘤原代细胞培养技术及配套试剂，本发明采用了一种新的样本保存液，其可在样本离体后短时间内维持样本中细胞的活性。
第一方面，本发明要求保护一种结直肠癌实体瘤组织样本保存液。
本发明所提供的结直肠癌实体瘤组织样本保存液由胎牛血清、抗菌抗真菌剂三抗(青霉素-链霉素-两性霉素B)、HEPES和HBSS(Hank's平衡盐溶液)组成。
其中，所述胎牛血清在所述样本保存液中的终浓度为1-5％(如2％，％表示体积百分含量)；所述抗菌抗真菌剂三抗(青霉素-链霉素-两性霉素B)中的青霉素在所述样本保存液中的终浓度为100-200U/mL(如100U/mL)；所述抗菌抗真菌剂三抗(青霉素-链霉素-两性霉素B)中的链霉素在所述样本保存液中的终浓度为100-200μg/mL(如100μg/mL)；所述抗菌抗真菌剂三抗(青霉素-链霉素-两性霉素B)中的两性霉素B在所述样本保存液中的终浓度为250-500ng/mL(如250ng/mL)；所述HEPES在所述样本保存液中的终浓度为8-12mM(如10mM)；余量均为HBSS。
进一步地，所述抗菌抗真菌剂三抗(青霉素-链霉素-两性霉素B)组成如下：每毫升包含10000单位青霉素(碱)、10000μg链霉素(碱)和25μg两性霉素B。所述抗菌抗真菌剂三抗(青霉素-链霉素-两性霉素B)为“Antibiotic-Antimycotic,100X”(如Gibco#15240062，或与其组成相同的其他产品)。所述“Antibiotic-Antimycotic,100X”每毫升包含10000单位青霉素(碱)、10000μg链霉素(碱)和25μg两性霉素B，利用0.85％盐液形式的青霉素G(钠盐)、硫酸链霉素和两性霉素B作为抗真菌剂。
在本发明的具体实施例中，所述胎牛血清的品牌货号为Gibco#16000-044；所述抗菌抗真菌剂三抗(青霉素-链霉素-两性霉素B)的品牌货号为Gibco#15240062；所述HEPES的品牌货号为Gibco#15630080；所述HBSS的品牌货号为Gibco#14170161。
所述样本保存液存在形式可为两种：
其一，所述样本保存液为由所述胎牛血清、所述抗菌抗真菌剂三抗(青霉素-链霉素-两性霉素B)、所述HEPES和所述HBSS(Hank's平衡盐溶液)混合而成的溶液。
所述样本保存液配制好后4℃可保存1个月。
其二，所述样本保存液中的各组分单独存在，使用时按照配方进行配制。
第二方面，本发明要求保护所述样本保存液在保存结直肠癌实体瘤组织中的应用。
第三方面，本发明要求保护一种保存结直肠癌实体瘤组织的方法。
本发明所体用的保存结直肠癌实体瘤组织的方法，具体可包括如下步骤：将刚刚离体的结直肠癌实体瘤组织(如手术过程中从患者体内刚取出的新鲜结直肠癌实体瘤组织)置于前文所述的样本保存液中保存，保存时间为2小时以内。
第四方面，本发明要求保护一种从结直肠癌实体瘤组织中解离出结直肠癌实体瘤原代细胞的方法。
本发明所提供的从结直肠癌实体瘤组织中解离出结直肠癌实体瘤原代细胞的方法，具体可包括如下步骤：
(1)将刚刚离体的结直肠癌实体瘤组织置于前文所述的样本保存液中保存，2小时以内按照如下步骤对所述结直肠癌实体瘤组织进行解离前处理：用体积百分含量为70-75％(如75％)的乙醇清洗结直肠癌实体瘤组织样本表面10到30秒；用样本清洗液清洗所述结直肠癌实体瘤组织样本10-20次(如10次)，用无菌的PBS溶液清洗所述结直肠癌实体瘤组织样本5-10次(如5次)；然后除去所述结直肠癌实体瘤组织样本中的杂质、结缔组织、脂肪组织、坏死组织等影响原代细胞培养的成分。
(2)用样本解离液对步骤(1)处理后的所述结直肠癌实体瘤组织进行解离处理，获得结直肠癌实体瘤原代细胞。
其中，所述样本解离液由胶原酶I、胶原酶II、胶原酶IV和PBS组成；其中，所述胶原酶I在所述样本解离液中的终浓度为150-250U/mL(如200U/mL)；所述胶原酶II在所述样本解离液中的终浓度为150-250U/mL(如200U/mL)；所述胶原酶IV在所述样本解离液中的终浓度为50-150U/mL(如100U/mL)；余量均为PBS。
其中，用蛋白酶的酶活来定义胶原酶(所述胶原酶I、所述胶原酶II或所述胶原酶IV)的单位U：在37℃，pH 7.5的条件下，用1U蛋白酶处理胶原酶(所述胶原酶I、所述胶原酶II或所述胶原酶IV)5小时，可以释放L-亮氨酸1μmol。
在本发明的具体实施例中，所述胶原酶I的品牌货号为Gibco#17100-017；所述胶原酶II的品牌货号为Gibco#17101-015；所述胶原酶IV的品牌货号为Gibco#17104-019；所述PBS的品牌货号为Gibco#21-040-CVR。
其中的胶原酶I、胶原酶II和胶原酶IV可以储液(母液)形式-20℃长期保存，具体可为10倍储液(母液)。10×胶原酶I储液由所述胶原酶I和PBS组成；其中所述胶原酶I的终浓度为2000U/mL；10×胶原酶II储液由所述胶原酶II和PBS组成；其中所述胶原酶II的终浓度为2000U/mL；余量均为PBS；10×胶原酶IV储液由所述胶原酶IV和PBS组成；其中所述胶原酶IV的终浓度为2000U/mL；余量均为PBS。所述胶原酶I、胶原酶II和所述胶原酶IV的酶活定义见前文。
进一步地，所述样本清洗液由抗菌抗真菌剂三抗(青霉素-链霉素-两性霉素B)和PBS组成；其中，所述抗菌抗真菌剂三抗(青霉素-链霉素-两性霉素B)中的青霉素在所述样本清洗液中的终浓度为100-200U/mL(如100U/mL)；所述抗菌抗真菌剂三抗(青霉素-链霉素-两性霉素B)中的链霉素在所述样本清洗液中的终浓度为100-200μg/mL(如100μg/mL)；所述抗菌抗真菌剂三抗(青霉素-链霉素-两性霉素B)中的两性霉素B在所述样本清洗液中的终浓度为250-500ng/mL(如250ng/mL)；余量均为PBS。
进一步地，所述抗菌抗真菌剂三抗(青霉素-链霉素-两性霉素B)组成如下：每毫升包含10000单位青霉素(碱)、10000μg链霉素(碱)和25μg两性霉素B。所述抗菌抗真菌剂三抗(青霉素-链霉素-两性霉素B)为“Antibiotic-Antimycotic,100X”(如Gibco#15240062，或与其组成相同的其他产品)。所述“Antibiotic-Antimycotic,100X”每毫升包含10000单位青霉素(碱)、10000μg链霉素(碱)和25μg两性霉素B，利用0.85％盐液形式的青霉素G(钠盐)、硫酸链霉素和两性霉素B作为抗真菌剂。
在本发明的具体实施例中，所述抗菌抗真菌剂三抗(青霉素-链霉素-两性霉素B)的品牌货号为Gibco#15240062；所述PBS的品牌货号为Gibco#21-040-CVR。
其中，对所述结直肠癌实体瘤组织进行解离前处理的步骤需要在冰上操作，整个操作步骤需要在10分钟内完成。
进一步地，利用所述样本解离液对所述结直肠癌实体瘤组织进行解离可按照包括如下步骤的方法进行：按0.1-0.3mL(如0.1mL)所述样本解离液每mg组织的用量，将剪碎后的所述结直肠癌实体瘤组织(如剪成0.8-1.2mm3的小块)用事先37℃预热的所述样本解离液进行处理，在37℃条件下进行样本解离，解离时间15分钟至3小时。每15分钟在显微镜下观察样本的解离情况，直到观察到大量的单个细胞。
进一步地，在用所述样本解离液对所述结直肠癌实体瘤组织进行解离处理后还可包括如下步骤：用8-15倍(如10倍)体积的消化终止液终止解离反应，收集细胞悬液；用100μm或40μm无菌细胞滤网过滤所述细胞悬液，去除组织残片和粘连细胞；800-1000g(如800g)室温离心10-15分钟(如10分钟)，弃去上清；后用3-5mL(如5mL)无菌PBS重悬细胞；再800-1000g(如800g)室温离心10-15分钟(如10分钟)，弃去上清。
其中，所述消化终止液(配制好后可在4℃保存一个月)由胎牛血清、抗菌抗真菌剂三抗(青霉素-链霉素-两性霉素B)和DMEM培养基组成；其中，所述胎牛血清在所述消化终止液中的终浓度为8-12％(如10％，％表示体积百分含量)；所述抗菌抗真菌剂三抗(青霉素-链霉素-两性霉素B)中的青霉素在所述消化终止液中的终浓度为100-200U/mL(如100U/mL)；所述抗菌抗真菌剂三抗(青霉素-链霉素-两性霉素B)中的链霉素在所述消化终止液中的终浓度为100-200μg/mL(如100μg/mL)；所述抗菌抗真菌剂三抗(青霉素-链霉素-两性霉素B)中的两性霉素B在所述消化终止液中的终浓度为250-500ng/mL(如250ng/mL)；余量均为DMEM培养基。
进一步地，所述抗菌抗真菌剂三抗(青霉素-链霉素-两性霉素B)组成如下：每毫升包含10000单位青霉素(碱)、10000μg链霉素(碱)和25μg两性霉素B。所述抗菌抗真菌剂三抗(青霉素-链霉素-两性霉素B)为“Antibiotic-Antimycotic,100X”(如Gibco#15240062，或与其组成相同的其他产品)。所述“Antibiotic-Antimycotic,100X”每毫升包含10000单位青霉素(碱)、10000μg链霉素(碱)和25μg两性霉素B，利用0.85％盐液形式的青霉素G(钠盐)、硫酸链霉素和两性霉素B作为抗真菌剂。
在本发明的具体实施例中，所述胎牛血清的品牌货号为Gibco#16000-044；所述抗菌抗真菌剂三抗(青霉素-链霉素-两性霉素B)的品牌货号为Gibco#15240062；所述DMEM培养基的品牌货号为Gibco#11965-092。
第五方面，本发明要求保护一种用于从结直肠癌实体瘤组织中解离出结直肠癌实体瘤原代细胞的成套试剂。
本发明所提供的用于从结直肠癌实体瘤组织中解离出结直肠癌实体瘤原代细胞的成套试剂，含有前文所述的样本保存液、所述样本解离液和如下试剂中的至少一种：前文所述的样本清洗液和所述消化终止液。
第六方面，本发明要求保护前文所述的成套试剂在从结直肠癌实体瘤组织中解离出结直肠癌实体瘤原代细胞中的应用。
在第一方面至第六方面中，所述结直肠癌具体可为原发性结直肠癌，病理分期为II期、III期或IV期，各种病理分型的结直肠癌或结直肠癌转移病灶，手术标本重量超过20mg的样本。
在本发明中，以上所有的所述PBS均可为1×PBS，pH7.3-7.5。其具体组成如下：溶剂为水，溶质及浓度为：KH2PO4 144mg/L，NaCl 9000mg/L，Na2HPO4·7H2O 795mg/L。
本发明提供了一种从新鲜结直肠癌实体瘤组织中提取培养结直肠癌实体瘤原代细胞的方法和配套试剂，本发明采用了一种新的样本保存液，其可在样本离体后短时间内维持样本中细胞的活性，利用本发明所提供的样本保存液并结合本发明方法，可达到以下有益效果：
1、组织样本用量少，仅需20mg左右的结直肠癌手术样本；
2、可以用于结直肠癌原发肿瘤原代肿瘤细胞的培养，也可用于结直肠癌转移病灶原代肿瘤细胞的培养；
3、培养周期短，仅需3-10天即可获得107数量级的结直肠癌原代肿瘤细胞；
4、培养稳定性高，用本方法对合格的结直肠癌手术标本进行体外培养的成功率高达70％；
5、细胞纯度高，利用本方法得到的结直肠癌原代细胞培养物中，癌细胞的比例可以达到70％-95％，杂细胞干扰少。
利用本发明方法得到的结直肠癌原代细胞培养物可以用于多种细胞水平的体外实验、二代测序、构建动物模型、构建细胞系等等。可以预见，这种培养方法在结直肠癌的研究和临床诊断治疗领域具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为结直肠癌组织经过处理后得到的单细胞。标尺为100μm，100倍放大。
图2为结直肠癌组织原代培养后得到的细胞团块。标尺为100μm，100倍放大。
图3为结直肠癌组织原代培养后得到的结直肠癌细胞团块切片HE染色图。标尺为100μm，200倍放大。
图4为结直肠癌组织原代培养后得到的癌细胞团块免疫荧光染色图。标尺为50μm，200倍放大
图5为根据测序结果进行拷贝数变异分析(CNV)显示各代结直肠癌原代细胞培养物(P1、P2、P3、P4、P5)与原发结直肠癌肿瘤组织(Tumor)的拷贝数变异情况高度一致。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、配制用于培养结直肠癌原代细胞的试剂
1、样本保存液(100mL)
样本保存液(100mL)的具体配方如表1所示。
表1样本保存液(100mL)
样本保存液配制完成后，用15mL离心管进行分装，每管5mL。分装后可于4℃保存1个月。
2、样本清洗液(100mL)
样本清洗液(100mL)的具体配方如表2所示。
表2样本清洗液(100mL)
样本清洗液需现配现用。
3、样本解离液(10mL)
样本解离液(10mL)的具体配方如表3所示。
表3样本解离液(10mL)
注：样本解离液现配现用。
表3中，胶原酶储液的配制如表4-6所示。
表4 10×胶原酶I储液(100mL)
10×胶原酶I储液配制后，用1.5mL无菌离心管分装，每管1mL。该储液可在-20℃长期保存。
表5 10×胶原酶II储液(100mL)
10×胶原酶II储液配制后，用1.5mL无菌离心管分装，每管1mL。该储液可在-20℃长期保存。
表6 20×胶原酶IV储液(100mL)
20×胶原酶IV储液配制后，用1.5mL无菌离心管分装，每管1mL。该储液可在-20℃长期保存。
表4、表5和表6中，用蛋白酶的酶活来定义胶原酶(所述胶原酶I或所述胶原酶IV)的单位U：在37℃，pH 7.5的条件下，用1U蛋白酶处理胶原酶(所述胶原酶I或所述胶原酶IV)5小时，可以释放L-亮氨酸1μmol。
4、细胞消化液(10mL)
细胞消化液(10mL)的具体配方如表7所示。
表7细胞消化液(10mL)
细胞消化液现配现用。
5、消化终止液(100mL)
消化终止液(100mL)的具体配方如表8所示。
表8消化终止液(100mL)
消化终止液配制后，可在4℃保存一个月。
6、结直肠癌实体瘤原代细胞培养基(100mL)
结直肠癌实体瘤原代细胞培养基(100mL)的具体配方如表9所示。
表9结直肠癌实体瘤原代细胞培养基(100mL)
结直肠癌实体瘤原代细胞培养基配制完成后，用0.22μM针头式滤器(MilliporeSLGP033RS)过滤除菌，在4℃可以保存两周。
表9中，人重组蛋白储液的配制如表11-表15所示，SB202190储液的配置如表16所示，A83-01储液的配置如表17所示，N-acetyl-L-cysteine储液的配置如表18所示，Nicotinamide储液的配置如表19所示，皮质醇储液的配制如表20所示，Y-27632储液的配制如表21所示。配制这些储液时所需的100×BSA溶液配制如表10所示。
表10 100×BSA溶液(1mL)
100×BSA溶液现配现用。
表11 1000×人重组蛋白EGF储液(5mL)
1000×人重组蛋白EGF储液配制后，用1.5mL无菌离心管分装，该储液可在-80℃长期保存。
表12 1000×人重组蛋白bFGF储液(2.5mL)
1000×人重组蛋白bEGF储液配制后，用1.5mL无菌离心管分装，该储液可在-80℃长期保存。
表13 1000×人重组蛋白HGF储液(5mL)
1000×人重组蛋白HGF储液配制后，用1.5mL无菌离心管分装，该储液可在-80℃长期保存。
表14 1000×人重组蛋白Wnt-3a储液(2.5mL)
1000×人重组蛋白Wnt-3a储液配制后，用1.5mL无菌离心管分装，该储液可在-80℃长期保存。
表15 1000×人重组蛋白Noggin储液(5mL)
1000×人重组蛋白Noggin储液配制后，用1.5mL无菌离心管分装，该储液可在-80℃长期保存。
表16 1000×SB202190储液(1.51mL)
1000×SB202190储液配制后，用0.5mL无菌离心管分装，该储液可在-20℃长期保存。
表17 100000×A83-01储液(1.05mL)
1000×A83-01储液配制后，用0.5mL无菌离心管分装，该储液可在-20℃长期保存。
表18 1000×N-acetyl-L-cysteine储液(5mL)
1000×N-acetyl-L-cysteine储液配制后，用0.5mL无菌离心管分装，该储液可在-20℃长期保存。
表19 1000×Nicotinamide储液(4mL)
1000×Nicotinamide储液配制后，用0.5mL无菌离心管分装，该储液可在-20℃长期保存。
表20 1000×皮质醇储液(100mL)
1000×皮质醇储液配制后，用1.5mL无菌离心管分装，该储液可在-20℃长期保存。
表21 1000×Y-27632储液(3.125mL)
1000×Y-27632储液配制后，用0.5mL无菌离心管分装，该储液可在-20℃长期保存。
7、细胞冻存液
细胞冻存液的具体配方如表22所示。
表22细胞冻存液
细胞冻存液现配现用。
表22中，1％甲基纤维素溶液的配制如表23所示。
表23 1％甲基纤维素溶液(10mL)
1％甲基纤维素溶液配制后可在4℃长期保存。
实施例2、结直肠癌术后标本的获取
1、与三甲医院合作，合作的开展通过了正规的医学伦理审查。
2、主治医生医生按照医学指南规定的临床指征选择入组患者，并根据术中临床指征选择合适的样本用于体外培养，样本的选取标准为：原发性结直肠癌，病理分期为II期、III期或IV期，各种病理分型的结直肠癌或结直肠癌转移病灶，结直肠癌手术标本重量超过20mg的样本。
3、主治医生提供患者的性别、年龄、病史、家族史、吸烟史、病理分期分型、临床诊断等基本临床信息。隐去患者的姓名、身份证号等与病人隐私相关的信息，用统一的实验编号代替，实验编号的命名原则为采集样本的八位数字日期+患者住院号后四位。例如2018年1月1日提供的样本，患者住院号为T001512765，则样本实验编号为201801012765。
4、术中由外科医生，在手术室无菌环境中采集新鲜标本，置于事先准备好的样本保存液(见实施例1)中。样本离体后在冰上暂存，两小时内运输到实验室进行下一步操作。
实施例3、结直肠癌组织样本解离前处理
下述操作需要在冰上操作，整个操作步骤需要在10分钟内完成。
下述操作中用到的手术器材，均需事先高温高压灭菌，烘干后才能使用。
1、样本称重。
2、用75％(体积百分含量)乙醇清洗样本表面10到30秒。
3、用样本清洗液清洗样本10次，用无菌的PBS溶液清洗样本5次。
4、用眼科剪、眼科镊、手术刀等器材，小心将样本中的脂肪组织、结缔组织、坏死组织剥离。
实施例4、结直肠癌组织样本解离
下述实施例中用到的手术器材，均需事先高温高压灭菌，烘干后才能使用。
1、用眼科剪将组织剪碎成1mm3左右的小块。
2、按0.1mL样本解离液(见实施例1)每mg组织的用量，用事先37℃预热的样本解离液处理剪碎的组织样本，在37℃条件下进行样本解离，解离时间15分钟至3小时。每15分钟在显微镜下观察样本的解离情况，直到观察到大量的单个细胞。
3、用10倍体积的消化终止液(见实施例1)终止解离反应，收集细胞悬液。
4、用40μm无菌细胞滤网过滤细胞悬液，去除组织残片和粘连细胞。
5、800g室温离心10分钟，弃去上清。
6、用5mL无菌PBS重悬细胞，800g室温离心10分钟，弃去上清。
7、用结直肠癌实体瘤原代细胞培养基(见实施例1)重悬细胞沉淀，在显微镜下观察细胞状态，进行细胞计数。
如图1所示，解离得到的单细胞悬液中，除了肿瘤细胞以外还混杂着大量各种类型的其他细胞，如红细胞，淋巴细胞，纤维细胞等等。本方法的优势之一就是在后续的培养过程中，只有癌细胞可以进行大量扩增，而其他细胞的比例逐渐减少甚至消失，最终获得纯度较高的结直肠癌原代肿瘤细胞。
实施例5、结直肠癌原代细胞培养
1、使用低吸附表面(low-attachment-surface)进行结直肠癌原代细胞悬浮培养，所用培养基即为实施例1中的结直肠癌实体瘤原代细胞培养基，以六孔板为例，按每孔106个细胞的密度铺板，37℃，5％CO2条件下在细胞培养箱中进行培养。
2、每天观察细胞状态，每3天更换一次培养基，直至细胞形成直径80μm左右的团块。
如图2所示，经过3-10天的培养，癌细胞大量扩增形成直径80μm大小的细胞团块，肿瘤细胞总数量可以超过107，其他类型的细胞数量明显减少甚至消失。本方法经过大量样本测试，结直肠癌原代肿瘤细胞体外培养成功率可以达到80％。
实施例6、结直肠癌原代细胞传代
1、收集培养皿中的细胞团块，800g室温离心10分钟，弃去上清。
2、用无菌的PBS溶液清洗细胞团块，800g室温离心10分钟，弃去上清。
3、用细胞消化液(见实施例1)重悬细胞团块，在37℃条件下进行消化。每5分钟在显微镜下观察细胞团块消化的情况，直到细胞团块都被消化为单个细胞。
4、用10倍体积的消化终止液(见实施例1)终止解离反应，收集细胞悬液。
5、800g室温离心10分钟，弃去上清。
6、用结直肠癌实体瘤原代细胞培养基重悬细胞沉淀，细胞计数。
7、使用低吸附表面(low-attachment-surface)进行结直肠癌原代细胞培养，所用培养基即为实施例1中的结直肠癌实体瘤原代细胞培养基，以六孔板为例，按每孔106个细胞的密度铺板，37℃，5％CO2条件下在细胞培养箱中进行培养。
实施例7、结直肠癌原代细胞的冻存
悬浮培养的结直肠癌原代细胞经过2-3次传代扩增后，可以进行冻存：
1、收集培养皿中的细胞团块，800g室温离心10分钟，弃去上清。
2、用无菌的PBS溶液清洗细胞团块，800g室温离心10分钟，弃去上清。
3、用细胞消化液(见实施例1)重悬细胞团块，在37℃条件下进行消化。每15分钟在显微镜下观察细胞团块消化的情况，直到细胞团块都被消化为单个细胞。
4、用10倍体积的消化终止液(见实施例1)终止解离反应，收集细胞悬液，细胞计数。
5、800g室温离心10分钟，弃去上清。
6、用细胞冻存液(见实施例1)，按106/mL的密度重悬细胞沉淀，2mL冻存管每管1mL细胞悬液，梯度降温盒过夜冻存后转移至液氮中长期保存。
实施例8、结直肠癌原代细胞的复苏
液氮中保存的结直肠癌原代细胞可以进行复苏：
1、提前五分钟准备37℃无菌水。
2、将冻存管从液氮中取出，在37℃无菌水中迅速融化细胞。
3、800g室温离心10分钟，弃去上清。
4、用结直肠癌实体瘤原代细胞培养基(见实施例1)重悬细胞沉淀，使用低吸附表面进行结直肠癌原代细胞培养，每管细胞复苏至3.5cm培养皿中，37℃，5％CO2条件下在细胞培养箱中进行培养。
实施例9、结直肠癌原代细胞的HE染色鉴定
下述实施例中用到的试剂耗材说明：
HE染色试剂盒(北京索莱宝生物科技有限公司，#G1120)；
阳离子防脱玻片(北京中杉金桥生物科技有限公司)；
二甲苯、甲醇、丙酮(北京化学试剂公司，分析纯)；
中性树脂胶(北京益利精细化学品有限公司)。
1、800g离心收集细胞团块，用4％多聚甲醛固定。细胞团块沉淀用石蜡包埋并进行切片，切片厚度为5μm。
2、石蜡切片浸泡在二甲苯溶液中室温孵育5分钟进行脱蜡，重复3次后，用去离子水冲洗切片2次。
3、将切片浸入无水乙醇中室温孵育10分钟，重复两次。
4、姜切片浸入95％乙醇中室温孵育10分钟，重复两次后，用去离子水冲洗切片给两次。
5、待玻片上水分微干时加入100μL苏木精染液染色1mins。
6、吸去苏木精染液，用自来水清洗玻片3次。
7、滴加100μL分化液分化1mins。
8、吸去分化液，依次用自来水清洗玻片2次，蒸馏水清洗玻片1次。
9、吸去玻片表面水分，滴加200μL伊红染液染色40s。
10、吸去伊红染液，依次用75％、80％、90％、100％乙醇漂洗脱水20s、20s、40s、40s。
11、等乙醇晾干后，滴加50μL二甲苯进行细胞通透。
12、等二甲苯晾干完全后，滴加一滴中性树脂胶，用盖玻片封片，在显微镜下观察并拍照。
图3展示了体外培养得到的结直肠癌原代肿瘤细胞HE染色效果图，可以看到这些细胞普遍具有核质比高、核深染、核内染色质凝集、多核、细胞大小不均一等癌细胞特征，几十到数百个肿瘤细胞聚集形成具有一定立体结构的肿瘤细胞团块。
实施例10、结直肠癌原代细胞的免疫荧光染色鉴定
下述实施例中用到的试剂说明：
多聚甲醛(北京化学试剂公司，分析纯)，用超纯水溶解多聚甲醛粉末，制成4％(4g/100mL)多聚甲醛溶液；
甲醇、二甲基亚砜(北京化学试剂公司，分析纯)；
双氧水(北京化学试剂公司，35％)；
甲醇、二甲基亚砜、35％双氧水按照4:4:1(体积比)的比例混合制成丹氏漂洗液；
牛血清白蛋白(Sigma，#A1933)，用PBS溶液溶解牛血清白蛋白，制成3％(3g/100mL)的BSA溶液；
免疫荧光一抗抗体(Abcam，#ab17139)；
免疫荧光二抗抗体(CST，#4408)；
Hoechst染液(北京索莱宝生物科技有限公司，#C0021)；
按以下步骤对结直肠癌细胞团块进行免疫荧光染色，一抗为CK8+CK18，表征上皮来源的细胞。
1、收集培养皿中的细胞团块，用PBS清洗一遍后，用4％多聚甲醛重悬细胞沉淀，4℃过夜固定。
2、800g离心弃去上清，用预冷的甲醇溶液重悬细胞沉淀，在冰上放置1小时。
3、800g离心弃去上清，丹氏漂洗液重悬细胞沉淀，室温放置2小时。
4、800g离心弃去上清，依次用75％、50％、25％(体积百分含量)用PBS稀释的甲醇溶液清洗细胞，每次10分钟。
5、800g离心弃去上清，用3％BSA溶液悬浮细胞沉淀，室温封闭2小时。
6、按1：500的比例，用3％BSA溶液稀释一抗，并用抗体稀释液(3％BSA溶液)重悬细胞沉淀，4℃一抗过夜。
7、800g离心弃去上清，用PBS溶液清洗细胞沉淀5次，每次20分钟。
8、按1：2000的比例，用3％BSA溶液稀释二抗，并用抗体稀释液(3％BSA溶液)重悬细胞沉淀，室温二抗2小时。
9、800g离心弃去上清，用PBS溶液清洗细胞沉淀5次，每次20分钟。
10、按1/100的体积比加入100×Hoechst染液，室温染色20分钟。
11、用PBS溶液清洗细胞沉淀2次，每次10分钟。使用激光共聚焦显微镜观察细胞团块的染色情况。
图4展示了体外培养的结直肠癌原代肿瘤细胞团块免疫荧光染色的效果图，可以看到组成细胞团块的细胞都是CK8/CK18阳性，是上皮来源的，证实了本方法培养得到的是纯度较高的肿瘤细胞。对20个结直肠癌样本原代培养物进行免疫荧光染色鉴定，统计结果显示经本方法得到的结直肠癌原代细胞中，肿瘤细胞的比例达到72％-95％(表24)。
表24结直肠癌样本原代培养物免疫荧光染色鉴定
实施例11、结直肠癌原代细胞培养物与原发肿瘤组织
下述实施例中提及的DNA提取流程采用天根血液/组织/细胞基因组提取试剂盒(DP304)进行。
下述实施例中提及的建库流程采用NEB DNA测序建库试剂盒(E7645)进行。
下述实施例中提及的高通量测序是指Illumina HiSeq X-ten测序平台。
1、取得结直肠癌实体瘤样本，进行体外培养操作之前，先取结直肠癌实体瘤样本10mg进行DNA提取，建库及全基因组高通量测序(WGS)，测序深度300×，剩余实体瘤样本用于结直肠癌原代细胞体外培养。
2、结直肠癌组织处理后经过一段时间的培养，形成直径100μm以上的细胞团块记为P0代细胞，之后按传代的次数依次记为P1，P2，…，Pn。从P1、P2、P3、P4代的结直肠癌原代肿瘤细胞培养物中各取106个细胞，进行DNA提取，建库及全基因组高通量测序(WGS)，测序深度300×。
3、各组测序结果分别进行拷贝数变异分析(CNV)，比较原发结直肠癌肿瘤组织与各代结直肠癌原代细胞培养物之间的拷贝数变异，如图5所示，各代结直肠癌原代细胞培养物(P1、P2、P3、P4、P5)与原发结直肠癌肿瘤组织(Tumor)的拷贝数变异情况高度一致，因此经本方法得到的结直肠癌原代细胞能够代表患者原发肿瘤的真实情况。
实施例12、不同样本保存液培养成功率比较
本实施例中所有样本原代培养的操作方法流程均完全一致(参照前文所述)，仅样本保存液配方有所区别。进行测试的各种样本保存液见表25。其中方案E为本发明中采用的配方，具体见表1。
表25测试用样本保存液配方(100mL)
上表中各种样本保存液配制完成后，用15mL离心管进行分装，每管5mL。分装后可于4℃保存1个月。
五种样本保存液方案各处理20例样本，样本离体后在样本保存液中4℃暂存，离体2小时后，按实施例3、4、5中所述方法进行样本处理和培养操作，培养10天后统计结直肠癌实体瘤原代细胞培养成功率如表26：
表26不同样本保存液培养情况
可以看到，样本保存液配方对结直肠癌实体瘤原代细胞培养的成功率有较大的影响，本发明使用的样本保存液(表1)可以最大程度的保护结直肠癌实体瘤组织样本中癌细胞的活性，提高培养的成功率。

Claims (10)

1.一种结直肠癌实体瘤组织样本保存液，其特征在于：所述样本保存液由胎牛血清、抗菌抗真菌剂三抗、HEPES和HBSS组成；其中，所述胎牛血清在所述样本保存液中的终浓度为1-5％(体积百分含量)；所述抗菌抗真菌剂三抗中的青霉素在所述样本保存液中的终浓度为100-200U/mL；所述抗菌抗真菌剂三抗中的链霉素在所述样本保存液中的终浓度为100-200μg/mL；所述抗菌抗真菌剂三抗中的两性霉素B在所述样本保存液中的终浓度为250-500ng/mL；所述HEPES在所述样本保存液中的终浓度为8-12mM；余量均为HBSS。
2.权利要求1所述的样本保存液在保存结直肠癌实体瘤组织中的应用。
3.一种保存结直肠癌实体瘤组织的方法，包括如下步骤：将刚刚离体的结直肠癌实体瘤组织置于权利要求1所述的样本保存液中保存，保存时间为2小时以内。
4.一种从结直肠癌实体瘤组织中解离出结直肠癌实体瘤原代细胞的方法，包括如下步骤：
(1)将刚刚离体的结直肠癌实体瘤组织置于权利要求1所述的样本保存液中保存，2小时以内按照如下步骤对所述结直肠癌实体瘤组织进行解离前处理：用体积百分含量为70-75％的乙醇清洗结直肠癌实体瘤组织表面；用样本清洗液和无菌的PBS溶液先后清洗所述结直肠癌实体瘤组织；
(2)用样本解离液对步骤(1)处理后的所述结直肠癌实体瘤组织进行解离处理，获得结直肠癌实体瘤原代细胞；
所述样本解离液由胶原酶I、胶原酶II、胶原酶IV和PBS组成；其中，所述胶原酶I在所述样本解离液中的终浓度为150-250U/mL；所述胶原酶II在所述样本解离液中的终浓度为150-250U/mL；所述胶原酶IV在所述样本解离液中的终浓度为50-150U/mL；余量均为PBS。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述样本清洗液由抗菌抗真菌剂三抗和PBS组成；其中，所述抗菌抗真菌剂三抗中的青霉素在所述样本清洗液中的终浓度为100-200U/mL；所述抗菌抗真菌剂三抗中的链霉素在所述样本清洗液中的终浓度为100-200μg/mL；所述抗菌抗真菌剂三抗中的两性霉素B在所述样本清洗液中的终浓度为250-500ng/mL；余量均为PBS。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于：利用所述样本解离液对所述结直肠癌实体瘤组织进行解离是按照包括如下步骤的方法进行的：按0.1-0.3mL所述样本解离液每mg组织的用量，将剪碎后的所述结直肠癌实体瘤组织用事先37℃预热的所述样本解离液进行处理，在37℃条件下进行样本解离，解离时间15分钟至3小时。
7.根据权利要求4-6中任一所述的方法，其特征在于：在用所述样本解离液对所述结直肠癌实体瘤组织进行解离处理后还包括如下步骤：用消化终止液终止解离反应，收集细胞悬液；过滤所述细胞悬液，去除组织残片和粘连细胞；
具体的，所述消化终止液由胎牛血清、抗菌抗真菌剂三抗和DMEM培养基组成；其中，所述胎牛血清在所述消化终止液中的终浓度为8-12％(体积百分含量)；所述抗菌抗真菌剂三抗中的青霉素在所述消化终止液中的终浓度为100-200U/mL；所述抗菌抗真菌剂三抗的链霉素在所述消化终止液中的终浓度为100-200μg/mL；所述抗菌抗真菌剂三抗中的两性霉素B在所述消化终止液中的终浓度为250-500ng/mL；余量均为DMEM培养基。
8.一种用于从结直肠癌实体瘤组织中解离出结直肠癌实体瘤原代细胞的成套试剂，含有权利要求1中所述的样本保存液、权利要求4中所述的样本解离液和如下试剂中的至少一种：权利要求5中所述的样本清洗液和权利要求7中所述的消化终止液。
9.权利要求8所述的成套试剂在从结直肠癌实体瘤组织中解离出结直肠癌实体瘤原代细胞中的应用。
10.根据权利要求1-9中任一所述的样本保存液或方法或成套试剂或应用，其特征在于：所述结直肠癌为原发性结直肠癌，病理分期为II期、III期或IV期，各种病理分型的结直肠癌或结直肠癌转移病灶。
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