CN115960833B - Ptc微肿瘤模型的构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了PTC微肿瘤模型的构建方法，属于生物技术领域。微肿瘤PTC模型的构建方法，包括如下步骤：取癌组织使用保鲜液进行保鲜处理，其中，保鲜处理包括将癌组织使用双抗溶液清洗后浸泡入保鲜液；保鲜液的成分包括D‑鸟氨酸盐酸盐、2,6‑二羟基嘌呤；将癌组织切碎并使用消化液消化；加入培养基和基质胶进行微肿瘤PTC模型的构建。本发明构建方法中，将手术等方式取得的癌症组织使用保鲜液进行保鲜处理，能够长时间保持细胞活性。

Description

PTC微肿瘤模型的构建方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及PTC微肿瘤模型的构建方法。

背景技术

临床上乳腺癌患者常采取手术治疗及放疗、化疗，各种化疗药物存在严重不良反应，并且不同患者对不同药物的敏感性不同，影响治疗的疗效。

肿瘤的异质性也是影响肿瘤药物治疗疗效的重要因素。乳腺癌是具有高度异质性的肿瘤，除了克隆和突变的异质性之外，乳腺癌微环境的异质性也是导致乳腺肿瘤耐药的机制之一。肿瘤微环境中存在着血管内皮细胞、肿瘤相关成纤维细胞、巨噬细胞、T细胞、B细胞等多种细胞成分，这些微环境内的细胞成分比例的变化及表型的转变都对肿瘤耐药性的形成起重要作用。

为了能够制定更加具有针对性的治疗方案，达到精准医疗，有研究使用微肿瘤模型进行药敏检测，预估治疗方案的临床疗效。其中，PTC微肿瘤（Patient-Derived tumor-like Cell Clusters，PTC）模型是患者来源的样本经过剪切、消化、增殖，将肿瘤细胞和肿瘤机制细胞自组装后形成的3D微球，PTC模型中包含多种癌组织来源细胞，包括，肿瘤上皮细胞、肿瘤干性细胞、成纤维细胞、免疫细胞等，可在一定程度上模拟肿瘤微环境。经研究发现，PTC可高度还原癌组织病理、遗传和功能特征。

例如中国专利CN110583619A公开了一种结直肠癌实体瘤组织样本保存液，由胎牛血清、抗菌抗真菌剂三抗、HEPES和HBSS组成，可在样本离体后短时间内维持样本中细胞的活性。对于长时间维持样本活性的方法，有待进一步研究。

发明内容

本发明提供一种PTC微肿瘤模型的构建方法，该方法构建PTC微肿瘤模型的成功率高。

为达到上述发明目的，采用如下技术方案：

一种PTC微肿瘤模型的构建方法，构建方法包括如下步骤：

取癌组织使用保鲜液进行保鲜处理，其中，保鲜处理包括将癌组织使用双抗溶液清洗后浸泡入保鲜液；保鲜液的成分包括D-鸟氨酸盐酸盐、2,6-二羟基嘌呤；

将癌组织切碎并使用消化液消化；

加入培养基和基质胶进行PTC微肿瘤模型的构建。

手术等方式取得的癌组织往往需要在几小时内进行PTC微肿瘤模型的构建，才能保持较高的细胞活性，提高构建的成功率；而经过上述保鲜处理的癌组织能够较长时间的保持细胞活性，避免因未及时处理癌组织造成的损失；提高癌组织的利用率并且增加构建的成功率。

优选地，D-鸟氨酸盐酸盐、2,6-二羟基嘌呤在保鲜液中的终浓度分别为2-6μg/mL，15-32μg/mL。

优选地，保鲜液还包括氢离子缓冲液、双抗溶液、HBSS、Advanced DMEM/F-12培养基。

优选地，氢离子缓冲液终浓度为6-10nM；双抗溶液中的青霉素的终浓度为85-120U/mL；双抗溶液中的链霉素的终浓度为100-120μg/mL。

更优选地，保鲜液的制备方法包括如下步骤：

将D-鸟氨酸盐酸盐、2,6-二羟基嘌呤、氢离子缓冲液、双抗溶液、HBSS加入Advanced DMEM/F-12培养基中，其中HBSS与AdvancedDMEM/F-12培养基的体积比为1:2-5；氢离子缓冲液终浓度为6-10nM；双抗溶液中的青霉素的终浓度为85-120U/mL；双抗溶液中的链霉素的终浓度为100-120μg/mL。

更优选地，浸泡入保鲜液中的时间不超过6h，6h后需更换保鲜液。

优选地，消化液包括：消化液A和消化液B；

其中，消化液A包括II型胶原酶和透明质酸酶；消化液B包括分散酶和DNase Ⅰ。

更优选地，消化液A的配制方法为：向100mL Advanced DMEM/F-12培养基中添加100-120mg II型胶原酶、10-25g透明质酸酶，混合均匀即得消化液A；

消化液B的配制方法为向100mL Advanced DMEM/F-12培养基中添加470-550mg分散酶和10-12mg DNase Ⅰ，混合均匀即得消化液B。

优选地，将癌组织切碎并使用消化液消化的具体步骤包括：

剪切并加入消化液A，37℃进行消化1-2h；消化后离心弃上清，使用消化液B继续在37℃消化10-15min；消化结束后加入HBSS终止消化；之后离心弃上清，使用HBSS重悬沉淀后过滤；过滤后除去滤液，加入红细胞裂解液，混匀后静置3-5min，再次离心，弃上清；之后加入培养基重悬细胞，并加入基质胶混匀，得细胞悬液。

优选地，加入培养基和基质胶进行PTC微肿瘤模型的构建的具体步骤包括：

将细胞悬液接种于6孔板，接种后恒温培养40min；培养后，加入类器官培养基继续培养；培养期间更换培养基。

更优选地，加入培养基和基质胶进行PTC微肿瘤模型的构建的具体步骤包括：

将细胞悬液接种于6孔板，每孔30-70μL，接种后倒置于37℃培养30-40min；培养后取出6孔板，每孔加入类器官培养基2-5mL，37℃培养；每3d更换一次培养基，并观察PTC微肿瘤模型的形成和生长状态。

更优选地，加入培养基和基质胶进行PTC微肿瘤模型的构建的具体步骤包括：

将细胞悬液接种于6孔板，每孔30-70μL，接种后倒置于37℃培养30-40min；培养后取出6孔板，每孔加入类器官培养基2-5mL，37℃培养；每2d更换一次培养基，更换培养基之前，弃去原有培养基后，使用含有肌酸乙酯盐酸盐的保鲜液浸泡2-10min；弃去保鲜液，重新加入类器官培养基。

在更换培养基时先使用含有肌酸乙酯盐酸盐的保鲜液浸泡，再加入新的培养基，能够有效加速PTC微肿瘤模型的构建速度，即使使用较少的癌组织进行培养，同样能够培养成功。

更进一步优选地，保鲜液中肌酸乙酯盐酸盐的终浓度为110-200μg/mL。

本发明还公开了上述PTC微肿瘤模型构建方法在增加PTC微肿瘤模型构建成功率中的用途。

优选地，PTC微肿瘤模型构建成功率大于90%。

本发明还公开了上述方法制得的PTC微肿瘤模型在药敏检测中的用途。通过使用PTC微肿瘤模型进行药敏检测，能够预测治疗方案的临床疗效，从而有利于为患者制定个性化的治疗方案，提高治疗效果。

优选地，药敏检测方法包括以下至少一种检测方案：

（1）表阿霉素、环磷酰胺；

（2）多西他赛、曲妥珠单抗、帕妥珠单抗；

（3）多西他赛、卡铂、曲妥珠单抗、帕妥珠单抗；

（4）多西他赛、表阿霉素、曲妥珠单抗、帕妥珠单抗；

（5）T-DM1、帕妥珠单抗；

（6）多西他赛、曲妥珠单抗、吡咯替尼。

本发明还公开了D-鸟氨酸盐酸盐、2,6-二羟基嘌呤在制备保鲜液中的用途。

本发明还公开了保鲜液在维持肿瘤细胞活性中的用途。

本发明还公开了一种肿瘤细胞用保鲜液，保鲜液的成分包括D-鸟氨酸盐酸盐、2,6-二羟基嘌呤。

优选地，D-鸟氨酸盐酸盐、2,6-二羟基嘌呤在保鲜液中的终浓度分别为2-6μg/mL，15-32μg/mL。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明构建方法中，将手术等方式取得的癌症组织使用保鲜液进行保鲜处理，能够长时间保持细胞活性。保鲜液的成分包括：D-鸟氨酸盐酸盐、2,6-二羟基嘌呤、氢离子缓冲液、双抗溶液、HBSS、Advanced DMEM/F-12培养基。在保鲜液的浸泡下，室温静置6h后仍能保持较高的细胞活性，细胞活性在80%以上；能够有效避免因手术时间长无法及时处理癌组织对后续构建PTC微肿瘤模型造成的影响。此外，在本发明构建PTC微肿瘤模型的过程中，更换培养基时，先使用含有肌酸乙酯盐酸盐的保鲜液进行浸泡，再加入新的培养基；该操作能够有效加速PTC微肿瘤模型的构建进程，所培养的PTC微肿瘤模型最快4d即可达到80μm。

附图说明

图1为PTC微肿瘤模型显微观察结果。

具体实施方式

这里将详细地对示例性实施例进行说明，以下示例性实施例中所描述的实施方式并不代表与本公开相一致的所有实施方式。相反，它们仅是与本公开的一些方面相一致的方法的例子。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，或按照制造厂商所建议的条件。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

类器官培养基购自合肥中科普瑞昇生物医药科技有限公司，货号PRS-BCM-3D；Advanced DMEM/F-12培养基购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司，货号12634028。

实施例1

样本收集

1、志愿者招募

入选标准：

1. 经病理诊断的浸润性乳腺癌；

2. 临床分期T1-4N0-3M0；

3. 经病理免疫组化诊断HER2表达3+或FISH检测阳性表达；

4. 拟接受新辅助治疗（术前治疗），或已接受新辅助治疗后进行手术拟行术后辅助阶段治疗者；

排除标准：

1.经过任何未被包含在方案内的抗肿瘤治疗者；

2.存在明确远处转移者；

3.不计划行手术者；

4.存在严重心脑血管等合并症无法接受化疗或靶向治疗者。

将志愿者分为PTC组和常规治疗组。

2、样本收集

新辅助治疗前:

手术癌组织每次100mg，共需100mg或者穿刺癌组织每次4条，共需4条；视情况抽取外周血每次10mL，共需10mL；

新辅助治疗后：

手术癌组织每次100mg，共需100mg或者穿刺癌组织每次4条，共需4条；视情况抽取外周血每次10mL，共需10mL。

实施例2

PTC微肿瘤模型建立

取PTC组患者癌组织使用双抗溶液洗涤后剪切并加入消化液A，37℃进行消化2h；消化后离心弃上清，使用消化液B继续在37℃消化15min；消化结束后加入HBSS终止消化；之后离心弃上清，使用HBSS重悬沉淀后过滤，滤网孔径为100μm；过滤后除去滤液，加入红细胞裂解液，混匀后静置3min，再次离心，弃上清；之后加入Advanced DMEM/F-12培养基重悬细胞，并加入培养基体积2倍的基质胶混匀，得细胞悬液；将细胞悬液接种于6孔板，每孔50μL，接种后倒置于37℃培养基培养40min；培养后取出6孔板，每孔加入类器官培养基2mL，37℃培养；每3d更换一次培养基，并观察PTC微肿瘤模型的形成和生长状态。

其中，消化液A的配制方法为：向100mL Advanced DMEM/F-12培养基中添加120mgII型胶原酶、20g透明质酸酶，混合均匀即得消化液A；消化液B的配制方法为向100mLAdvanced DMEM/F-12培养基中添加500mg分散酶和10 mg DNase Ⅰ，混合均匀即得消化液B。

共对15例患者进行PTC微肿瘤模型的培养，共有12例成功构建。在此仅展示4号患者癌组织培养成的PTC微肿瘤模型，该患者的PTC微肿瘤模型生长到第7天的如图1所示；由图1可见，细胞成团明显，并且形状规则PTC微肿瘤模型构建成功。

实施例3

PTC药敏检测

1、PTC药敏检测方案如下：

（1）表阿霉素、环磷酰胺；

（2）多西他赛、曲妥珠单抗、帕妥珠单抗；

（3）多西他赛、卡铂、曲妥珠单抗、帕妥珠单抗；

（4）多西他赛、表阿霉素、曲妥珠单抗、帕妥珠单抗；

（5）T-DM1、帕妥珠单抗；

（6）多西他赛、曲妥珠单抗、吡咯替尼。

检测方法包括如下步骤：

取上述制得的PTC微肿瘤模型，分别经不同药敏检测方案的药物作用24h，使用MTT试剂盒测试抑制率；对细胞的抑制率大于30%则认为药物组合方案有效，并根据细胞生长抑制率判断药物组合方案的等级：

上述方案对细胞的抑制率的分级有以下5个等级：

强杀伤，抑制率＞70%，剩余细胞活力0-30%；

有效杀伤，抑制率30-70%，剩余细胞活力30-70%；

稳定，抑制率10-30%，剩余细胞活力70-90%；

耐药，抑制率0-10%，剩余细胞活力15-32%；

强烈耐药，抑制率为0，剩余细胞活力为100%。

2、治疗方案设计

PTC组根据药敏结果给患者个性化选择新辅助治疗方案，选择标准如下：

若几个PTC药敏检测的药物组合方案的抑制率均属于有效杀伤等级，即当A方案和B方案的抑制率均落在有效杀伤等级时，根据抑制率，A-B≥10%时，选择A方案；A-B＜10%时，选择毒副作用小的方案。

常规治疗组根据临床常规选择TCH(P)*6、EC*4-TH(P)*4方案进行新辅助治疗，依据计划在术前完成全部周期治疗，达到完全缓解（CR）或部分缓解（PR）或疾病稳定（SD）的目标。其中，CR、PR和SD的判断标准为：

CR：临床检查肿瘤消失并且维持4周以上；

PR：肿瘤最大直径与其最大垂直径的乘积减少50%以上；并且维持4周以上；

SD：肿瘤最大直径与其最大垂直径的乘积减少＜50%或增加＜25%，并且维持4周以上。

设计方案后，预估PTC组患者的治疗效果；治疗过程中的主要参考指标包括：总体病理完全缓解率（tpCR）、客观缓解率（ORR），次要参考指标包括乳腺癌治疗后2年内无浸润性癌复发率（2y-IDFS），乳腺癌治疗后5年内无浸润性癌复发率（5y-IDFS），总生存期（OS）。

检测方案对患者病例缓解程度的预测指标如下：

至少达到CR，抑制率＞70%；

至少达到PR，抑制率30-70%；

至少达到SD，抑制率10-30%。

治疗过程中及时记录临床疗效，并进行后续跟踪和走访记录。

5、治疗结果统计

在HER2阳性乳腺癌患者中，PTC药物测试中最敏感的方案与临床治疗方案一致的有5例，其中术后病理M&P4～5级（视为治疗有效）的有3例（80%），病理完全缓解3例（80%）。PTC药物测试中最敏感的方案（PTC引导方案）与临床治疗方案不一致的有1例，其中术后病理M&P4～5级的有1例（14.3%），病理完全缓解1例（14.3%）。

试验例1

肿瘤PTC模型的构建

以下实验均使用未接受PTC药敏检测患者的癌组织进行测试

1、保鲜液保鲜能力测试

每位患者取50mg癌组织，使用双抗溶液清洗后浸泡入保鲜液A（D-鸟氨酸盐酸盐终浓度4μg/mL、2,6-二羟基嘌呤终浓度17μg/mL、氢离子缓冲液终浓度10nM、青霉素终浓度1000U/mL、链霉素终浓度100μg/mL；HBSS、Advanced DMEM/F-12培养基体积比1:2；共配制100mL），室温静置；另取50mg癌组织，浸泡入保鲜液B（氢离子缓冲液终浓度10nM、青霉素终浓度1000U/mL、链霉素终浓度100μg/mL；HBSS、AdvancedDMEM/F-12培养基体积比1:2；共配制100mL），室温静置；每隔1h使用MTT试剂盒对细胞活性进行测试，测试结果如表1所示。

表1 细胞活力测定结果

培养时间	保鲜液A细胞活性（%）	保鲜液B细胞活性（%）
			1h	98.6	95.7
2h	98.2	83.5
			3h	95.7	62.4
4h	92.5	33.3
			5h	88.3	12.5
6h	82.1	-
			7h	62.4	-

由表可知，保鲜液A的保鲜效果良好，说明D-鸟氨酸盐酸盐和2,6-二羟基嘌呤能够明显提高保鲜液的保鲜效果，室温下浸泡6h仍能够保持80%以上的细胞活性。

2、PTC微肿瘤模型构建成功率统计

构建方案A：

取20mg患者癌组织，从患者体内取出后立刻使用双抗溶液洗涤，剪切并加入消化液A，37℃进行消化2h；消化后离心弃上清，使用消化液B继续在37℃消化15min；消化结束后加入HBSS终止消化；之后离心弃上清，使用HBSS重悬沉淀后过滤，滤网孔径为100μm；过滤后除去滤液，加入红细胞裂解液，混匀后静置3min，再次离心，弃上清；之后加入AdvancedDMEM/F-12培养基重悬细胞，并加入培养基体积2倍的基质胶混匀，得细胞悬液；将细胞悬液接种于6孔板，每孔50μL，接种后倒置于37℃培养基培养40min；培养后取出6孔板，每孔加入类器官培养基2mL，37℃培养；每3d更换一次培养基，并观察PTC微肿瘤模型的形成和生长状态。

其中，消化液A的配制方法为：向100mL Advanced DMEM/F-12培养基中添加120mgII型胶原酶、20g透明质酸酶，混合均匀即得消化液A；消化液B的配制方法为向100mLAdvanced DMEM/F-12培养基中添加500mg分散酶和10 mg DNase Ⅰ，混合均匀即得消化液B。

构建方案B

取20mg患者癌组织，从患者体内取出后立刻使用双抗溶液洗涤，剪切并加入消化液A，37℃进行消化2h；消化后离心弃上清，使用消化液B继续在37℃消化15min；消化结束后加入HBSS终止消化；之后离心弃上清，使用HBSS重悬沉淀后过滤，滤网孔径为100μm；过滤后除去滤液，加入红细胞裂解液，混匀后静置3min，再次离心，弃上清；之后加入AdvancedDMEM/F-12培养基重悬细胞，并加入培养基体积2倍的基质胶混匀，得细胞悬液；将细胞悬液接种于6孔板，每孔50μL，接种后倒置于37℃培养30min；培养后取出6孔板，每孔加入类器官培养基5mL，37℃培养；每3d更换一次培养基，更换培养基之前，弃去原有培养基后，使用含有127μg/mL肌酸乙酯盐酸盐的保鲜液A浸泡5min；弃去保鲜液，重新加入类器官培养基。培养期间观察PTC微肿瘤模型的形成和生长状态。

构建方案C

取20mg患者癌组织，从患者体内取出后立刻使用双抗溶液洗涤，之后浸入保鲜液A浸泡3h。浸泡后剪切并加入消化液A，37℃进行消化2h；消化后离心弃上清，使用消化液B继续在37℃消化15min；消化结束后加入HBSS终止消化；之后离心弃上清，使用HBSS重悬沉淀后过滤，滤网孔径为100μm；过滤后除去滤液，加入红细胞裂解液，混匀后静置3min，再次离心，弃上清；之后加入Advanced DMEM/F-12培养基重悬细胞，并加入培养基体积2倍的基质胶混匀，得细胞悬液；将细胞悬液接种于6孔板，每孔50μL，接种后倒置于37℃培养30min；培养后取出6孔板，每孔加入类器官培养基5mL，37℃培养；每3d更换一次培养基，更换培养基之前，弃去原有培养基后，使用含有127μg/mL肌酸乙酯盐酸盐的保鲜液A浸泡5min；弃去保鲜液，重新加入类器官培养基。培养期间观察PTC微肿瘤模型的形成和生长状态。

构建方案D

取20mg患者癌组织，从患者体内取出后立刻使用双抗溶液洗涤，之后浸入保鲜液B浸泡3h。浸泡后剪切并加入消化液A，37℃进行消化2h；消化后离心弃上清，使用消化液B继续在37℃消化15min；消化结束后加入HBSS终止消化；之后离心弃上清，使用HBSS重悬沉淀后过滤，滤网孔径为100μm；过滤后除去滤液，加入红细胞裂解液，混匀后静置3min，再次离心，弃上清；之后加入Advanced DMEM/F-12培养基重悬细胞，并加入培养基体积2倍的基质胶混匀，得细胞悬液；将细胞悬液接种于6孔板，每孔50μL，接种后倒置于37℃培养30min；培养后取出6孔板，每孔加入类器官培养基5mL，37℃培养；每3d更换一次培养基，更换培养基之前，弃去原有培养基后，使用含有127μg/mL肌酸乙酯盐酸盐的保鲜液A浸泡5min；弃去保鲜液，重新加入类器官培养基。培养期间观察PTC微肿瘤模型的形成和生长状态。

按照以上方案进行培养，观察到PTC微肿瘤模型中最大的细胞团生长到80μm时停止培养，记录培养时间。培养成功率统计如表2所示。

表2 不同构建方案构建结果

	培养成功率（%）	培养时间
			构建方案A	60.87%（14/23）	6d
构建方案B	73.91%（17/23）	5d
			构建方案C	91.30%（21/23）	5d
构建方案D	17.39%（4/23）	8d

对比构建方案A和B可知，构建方案B较A的培养成功率提升不高，但构建方案B培养时间明显缩短明显，说明在培养过程中，更换培养基之前使用含肌酸乙酯盐酸盐的保鲜液A进行浸泡处理，有利于加速PTC微肿瘤模型的构建进程；此外，对比构建方案B和C可知，在进行消化前使用保鲜液A浸泡能够提高构建成功率，而对比构建方案B和D可知使用保鲜液B浸泡构建成功率反而大幅下降，这可能与保鲜液A具有更好的维持细胞活性的作用有关。此外，上述培养方法中均使用20mg癌组织进行培养，说明在癌组织使用量少的情况下，仍能够进行PTC微肿瘤模型的构建。

本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。

以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.PTC微肿瘤模型的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括如下步骤：

取癌组织使用保鲜液进行保鲜处理，其中，保鲜处理包括将癌组织使用双抗溶液清洗后浸泡入保鲜液；保鲜液的成分包括D-鸟氨酸盐酸盐、2,6-二羟基嘌呤；

将癌组织切碎并使用消化液消化；

加入培养基和基质胶进行PTC微肿瘤模型的构建。

2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述D-鸟氨酸盐酸盐、2,6-二羟基嘌呤在保鲜液中的终浓度分别为2-6μg/mL，15-32μg/mL。

3.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述保鲜液还包括氢离子缓冲液、双抗溶液、HBSS、Advanced DMEM/F-12培养基。

4.如权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述氢离子缓冲液终浓度为6-10nM；所述双抗溶液中的青霉素的终浓度为85-120U/mL；所述双抗溶液中的链霉素的终浓度为100-120μg/mL。

5.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述消化液包括：消化液A和消化液B；

其中，消化液A包括II型胶原酶和透明质酸酶；消化液B包括分散酶和DNase Ⅰ。

6.权利要求1-5任一项所述的构建方法在增加PTC微肿瘤模型构建成功率中的用途。

7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述PTC微肿瘤模型构建成功率大于90%。

8.D-鸟氨酸盐酸盐和2,6-二羟基嘌呤在制备肿瘤细胞用保鲜液中的用途。

9.一种肿瘤细胞用保鲜液，其特征在于，所述保鲜液的成分包括D-鸟氨酸盐酸盐、2,6-二羟基嘌呤。

10.如权利要求9所述的一种肿瘤细胞用保鲜液，其特征在于，所述D-鸟氨酸盐酸盐、2,6-二羟基嘌呤在保鲜液中的终浓度分别为2-6μg/mL，15-32μg/mL。

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