CN111066778A - 离体组织保存液及其保存方法和应用 - Google Patents

离体组织保存液及其保存方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN111066778A
CN111066778A CN201911405034.8A CN201911405034A CN111066778A CN 111066778 A CN111066778 A CN 111066778A CN 201911405034 A CN201911405034 A CN 201911405034A CN 111066778 A CN111066778 A CN 111066778A
Authority
CN
China
Prior art keywords
tissue
preservation solution
tumor
tissue preservation
vitro
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201911405034.8A
Other languages
English (en)
Inventor
朱燕萍
王志强
郝艳鹏
李晓宇
叶琳璐
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nanjing Puenrui Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Nanjing Puenrui Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nanjing Puenrui Biotechnology Co ltd filed Critical Nanjing Puenrui Biotechnology Co ltd
Priority to CN201911405034.8A priority Critical patent/CN111066778A/zh
Publication of CN111066778A publication Critical patent/CN111066778A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0205—Chemical aspects
    • A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
    • A01N1/0226—Physiologically active agents, i.e. substances affecting physiological processes of cells and tissue to be preserved, e.g. anti-oxidants or nutrients
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0205—Chemical aspects
    • A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
    • A01N1/0215—Disinfecting agents, e.g. antimicrobials for preserving living parts

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种离体组织保存液及其保存方法和应用。该离体组织保存液包括：青链霉素双抗、胎牛血清和改进型L‑15培养基。所得离体组织保存液能为肿瘤组织提供营养并具有抗菌的作用，能够提高了肿瘤组织的活性，进而提高了临床患者来源肿瘤异种移植的建模成功率，此外，还能够保存肿瘤组织样本，建立样本数据库，便于再次实验需要，减少反复取材。

Description

离体组织保存液及其保存方法和应用
技术领域
本发明涉及生物学试剂技术领域，特别是关于一种离体组织保存液及其保存方法和应用。
背景技术
组织接种、组织冻存与复苏在医疗、生物、优生学等多个领域已广泛应用，但对于一些难以获得的组织，因实验工作的原因还需要重复实验，反复培养，或直接用组织块接种到动物体内。
目前，普通的保存液对于离体组织的活性保存还有待提高，会导致组织活性不高、建模成功率低以及样本冻存失败。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
本发明的目的在于提供一种离体组织保存液，其能够提高组织的活性，进而提高了临床患者来源肿瘤异种移植的建模成功率。
为实现上述目的，本发明提供了一种离体组织保存液，包括：青链霉素双抗、胎牛血清和改进型L-15培养基；
所述改进型L-15培养基以L-15培养基为基础，加入低聚半乳糖、SOD、维生素E、谷胱甘肽、氢化可的松、IL-2和PBS缓冲液，各个组分的含量为：8％胎牛血清、310～330mg/LL-谷氨酰胺、750～850mg/L半乳糖、30～50mg/L低聚半乳糖、300-500U/ml SOD、35～50μg/L维生素E、330～450mg/L丙酮酸钠、50～120mg/L谷胱甘肽、0.8～1.2μg/L氢化可的松、500-800U/ml IL-2和10mM PBS缓冲液。
本发明的一个优选的实施方式中，上述青链霉素双抗、胎牛血清和改进型L-15培养基的体积比是1∶15-50∶30-100。
更优地一个实施方式中，上述青链霉素双抗、胎牛血清和改进型L-15培养基的体积比是1∶30∶69。
本发明的一个优选的实施方式中，上述青链霉素双抗在离体组织保存液中最终的浓度为0.5-3％，优选的，最终的浓度为1％或2％。
本发明的一个优选的实施方式中，上述胎牛血清在离体组织保存液中最终的浓度为15-50％，优选的，最终的浓度为30％。
本发明的另一目的在于提供一种上述离体组织保存液用在保存肿瘤组织的应用。
本发明的一个优选的实施方式中，上述肿瘤组织是胃肠道肿瘤组织。
本发明的另一目的在于提供一种肿瘤组织的保存方法，步骤包括：将离体的肿瘤组织置于上述离体组织保存液中降温保存。
本发明的一个优选的实施方式中，上述离体组织保存液和肿瘤组织的体积比是5∶4。
与现有技术相比，根据本发明具有如下有益效果：
现有单纯的L-15培养基，培养过程中没有缓冲剂，而且需要避免和二氧化碳，在培养过程中产生的过氧化物、超氧化物及毒素都无法有效的清除，不利于离体组织的培养和保存。而且，L-15培养基中蛋白含量极低，对于肿瘤组织的营养需求不够。本发明所述离体组织保存液中加入了较高比例的胎牛血清，其能为肿瘤组织提供营养，加入青链霉素双抗，起到抗菌的作用。
本发明所述的离体组织保存液能够提高肿瘤组织的活性，成瘤率达到42.86％，进而提高了临床患者来源肿瘤异种移植的建模成功率；另外，该离体组织保存液能够保存肿瘤组织样本，建立样本数据库，便于再次实验需要，减少反复取材。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可以从商业途径得到。
实施例1：离体组织保存液的配制
制备改进型L-15培养基：以L-15培养基为基础，配置10mM PBS缓冲液，配置方法为现有技术；添加低聚半乳糖、SOD、维生素E、谷胱甘肽、氢化可的松和IL-2，配置成各个组分的配比关系如下：8％胎牛血清、320mg/L L-谷氨酰胺、780mg/L半乳糖、35mg/L低聚半乳糖、400U/ml SOD、42μg/L维生素E、400mg/L丙酮酸钠、80mg/L谷胱甘肽、1.1μg/L氢化可的松和700U/ml IL-2，配置方法为现有技术。
配置保存液：将100μL的青链霉素双抗溶于1管保存液，每管离体组织保存液的配制：100μL的双抗(青链霉素)+3mL的胎牛血清+6.9mL的改进L-15培养基，具体参见如下表1。
表1保存液的配方
Figure BDA0002348399770000031
Figure BDA0002348399770000041
实施例2：离体组织保存液的配制
制备改进型L-15培养基：以L-15培养基为基础，配置10mM PBS缓冲液，配置方法为现有技术；添加低聚半乳糖、SOD、维生素E、谷胱甘肽、氢化可的松和IL-2，配置成各个组分的配比关系如下：8％胎牛血清、330mg/L L-谷氨酰胺、800mg/L半乳糖、40mg/L低聚半乳糖、500U/ml SOD、40μg/L维生素E、420mg/L丙酮酸钠、90mg/L谷胱甘肽、1.2μg/L氢化可的松和800U/ml IL-2，配置方法为现有技术。
配置保存液：将200μL的青链霉素双抗溶于1管保存液，每管离体组织保存液的配制：100μL的双抗(青链霉素)+3mL的胎牛血清+6.8mL的改进型L-15培养基，具体参见如下表2。
表2保存液的配方
试剂 用量 最终浓度
L-15培养基 6.8mL 68％
胎牛血清 3mL 30％
青链霉素双抗 200μL 2％
实施例3：离体人胃肠道肿瘤组织的制备
离体人胃肠道肿瘤组织的制备方法，步骤包括：
(1)取材：通过手术、穿刺、内镜取病人胃肠道肿瘤组织，置于实施例2所配制的保存液中，需要将该组织样本完全浸润在保存液中，避免组织体积过大导致部分组织未浸入保存液或运输过程中因颠簸等因素引起组织脱离保存液等情况；
(2)组织运输：在低温环境(保温桶内放置冰袋)且不超过24小时的情况下将该组织运回实验室；
(3)组织处理：将肿瘤组织置于培养皿内，加入L-15，置于冰上备用；在解剖镜下观察肿瘤组织，用剪刀和镊子剔除表面血管、筋膜、脂肪等非肿瘤组织；
(4)组织接种：将处理后的组织剪成约2mm*2mm*2mm，接种到小鼠。
实施例4：活性实验
(1)接种于小鼠的人胃肠道肿瘤组织的活性验证
小鼠接种以后每周观察小鼠出瘤情况，待小鼠成瘤以后，每周测量小鼠体重和肿瘤体积，肿瘤体积采用V＝(长径×短径×短径)/2。
(2)冻存人胃肠道肿瘤组织的活性验证
在37℃的条件下快速复苏冻存的人胃肠道肿瘤组织，然后将复苏的人胃肠道肿瘤组织剪成2mm*2mm*2mm，接种到小鼠，小鼠接种3天后每周观察小鼠出瘤情况，待小鼠成瘤以后，每周测量小鼠体重和肿瘤体积。
(3)统计小鼠建模成功率。
对比例
将实施例3所制得的离体人胃肠道肿瘤组织剪切成2mm*2mm*2mm的块状，其中一块即刻固定并送常规病理检查，其余的随机置于已准备好的保存液A、B、C和实施例1、实施例2所配制的保存液中，其中保存液A、B、C的配方如下：
保存液A：70％的DMEM培养基+30％胎牛血清；
保存液B：98％的L-15培养基+2％青链霉素双抗；
保存液C：70％的L-15培养基+30％胎牛血清。
每管保存液放置1块离体人胃肠道肿瘤组织，将每组保存液中的离体人胃肠道肿瘤组织移植到免疫缺陷小鼠皮下，移植后7天后，A组和C组移植部位均出现黄色粘稠分泌物，取分泌物涂片镜检发现是金黄色葡萄球菌，而B组、实施例1和实施例2组小鼠的移植部位未见异常。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

Claims (9)

1.一种离体组织保存液，其特征在于，包括：青链霉素双抗、胎牛血清和改进型L-15培养基；
其中，所述改进型L-15培养基由胎牛血清、L-谷氨酰胺、半乳糖、低聚半乳糖、SOD、维生素E、丙酮酸钠、谷胱甘肽、氢化可的松、IL-2和PBS缓冲液组成，各个组分的含量为：8％胎牛血清、310～330mg/L L-谷氨酰胺、750～850mg/L半乳糖、30～50mg/L低聚半乳糖、300-500U/ml SOD、35～50μg/L维生素E、330～450mg/L丙酮酸钠、50～120mg/L谷胱甘肽、0.8～1.2μg/L氢化可的松、500-800U/ml IL-2和10mM PBS缓冲液。
2.根据权利要求1所述的离体组织保存液，其特征在于，所述青链霉素双抗、胎牛血清和改进型L-15培养基的体积比是1∶15-50∶30-100。
3.根据权利要求2所述的离体组织保存液，其特征在于，所述青链霉素双抗、胎牛血清和改进型L-15培养基的体积比是1∶30∶69。
4.根据权利要求1所述的离体组织保存液，其特征在于，所述青链霉素双抗在离体组织保存液中最终的浓度为0.5-3％，优选的，最终的浓度为1％或2％。
5.根据权利要求4所述的离体组织保存液，其特征在于，所述胎牛血清在离体组织保存液中最终的浓度为15-50％，优选的，最终的浓度为30％。
6.权利要求1-5任一项所述的离体组织保存液用在保存肿瘤组织的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述肿瘤组织是胃肠道肿瘤组织。
8.一种肿瘤组织的保存方法，其特征在于，步骤包括：将离体的肿瘤组织置于权利要求1-7任一项所述的离体组织保存液中降温保存。
9.根据权利要求8所述的保存方法，所述离体组织保存液和肿瘤组织的体积比是5∶4。
CN201911405034.8A 2019-12-31 2019-12-31 离体组织保存液及其保存方法和应用 Pending CN111066778A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911405034.8A CN111066778A (zh) 2019-12-31 2019-12-31 离体组织保存液及其保存方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911405034.8A CN111066778A (zh) 2019-12-31 2019-12-31 离体组织保存液及其保存方法和应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111066778A true CN111066778A (zh) 2020-04-28

Family

ID=70320275

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201911405034.8A Pending CN111066778A (zh) 2019-12-31 2019-12-31 离体组织保存液及其保存方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111066778A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112155008A (zh) * 2020-09-30 2021-01-01 北京银丰鼎诚生物工程技术有限公司 脂肪组织的冻存与复苏方法及脂肪组织冻存复苏试剂盒
CN115885981A (zh) * 2023-03-08 2023-04-04 北京百奥益康医药科技有限公司 一种保持离体组织细胞活性的保存液及其制备方法和应用

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6521402B1 (en) * 2000-06-14 2003-02-18 The Texas A&M University System Cryopreservation of tissues for use in nuclear transfer
CN105850981A (zh) * 2016-04-29 2016-08-17 绍兴市人民医院 冻存肿瘤组织的方法
CN108719274A (zh) * 2018-06-01 2018-11-02 湖南赛奥维生物技术有限公司 一种组织保存液
CN109362712A (zh) * 2018-11-29 2019-02-22 广州润虹医药科技股份有限公司 一种脂肪组织冻存液、冻存方法及其应用
CN110447633A (zh) * 2018-05-07 2019-11-15 北京吉尚立德生物科技有限公司 一种肺癌实体瘤组织样本保存液
CN110583619A (zh) * 2018-06-13 2019-12-20 北京吉尚立德生物科技有限公司 一种结直肠癌实体瘤组织样本保存液

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6521402B1 (en) * 2000-06-14 2003-02-18 The Texas A&M University System Cryopreservation of tissues for use in nuclear transfer
CN105850981A (zh) * 2016-04-29 2016-08-17 绍兴市人民医院 冻存肿瘤组织的方法
CN110447633A (zh) * 2018-05-07 2019-11-15 北京吉尚立德生物科技有限公司 一种肺癌实体瘤组织样本保存液
CN108719274A (zh) * 2018-06-01 2018-11-02 湖南赛奥维生物技术有限公司 一种组织保存液
CN110583619A (zh) * 2018-06-13 2019-12-20 北京吉尚立德生物科技有限公司 一种结直肠癌实体瘤组织样本保存液
CN109362712A (zh) * 2018-11-29 2019-02-22 广州润虹医药科技股份有限公司 一种脂肪组织冻存液、冻存方法及其应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
吴燕峰 等: "《实用医学细胞培养技术》", 31 January 2010, 中山大学出版社 *
管忠海: "基于肠癌PDX模型血管靶向药物抗肿瘤个体化治疗研究", 《中国博士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》 *
马学严 等: "《医用试剂与常数手册》", 31 March 1985, 吉林科学技术出版社 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112155008A (zh) * 2020-09-30 2021-01-01 北京银丰鼎诚生物工程技术有限公司 脂肪组织的冻存与复苏方法及脂肪组织冻存复苏试剂盒
CN115885981A (zh) * 2023-03-08 2023-04-04 北京百奥益康医药科技有限公司 一种保持离体组织细胞活性的保存液及其制备方法和应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101490851B1 (ko) 수성 보습제와 윤활제 및 이들의 용도
Nagler et al. The use of the electron microscope in diagnosis of variola, vaccinia, and varicella
JP2009511598A (ja) 胎盤幹細胞を使用する免疫調節
EP3517118A1 (en) Sperm activator and uses thereof
MX2011001991A (es) Tratamiento de la apoplejia utilizando celulas placentarias aisladas.
CN114828872B (zh) 育毛剂
CN111066778A (zh) 离体组织保存液及其保存方法和应用
CN107349220A (zh) 一种包含成纤维细胞外泌体的制剂及其用途
CN103352025B (zh) 改善精子运动能力的人精子体外培养液及其应用
RU2588666C1 (ru) Компонент питательной среды для культивирования клеток млекопитающих
CA2072749A1 (en) Antimicrobial preservation of plasma
JP2021183635A (ja) 胎盤細胞を使用した糖尿病性末梢神経障害の処置
US20170290861A1 (en) Treatment of diabetic foot ulcer using placental stem cells
EP1881838B1 (en) Antitumor agent on the base of bcg vaccine, method for its preparation and its use
RU2190220C1 (ru) Способ выявления микобактерий туберкулеза
RU2652882C1 (ru) Способ определения способности микобактерий туберкулеза к размножению в альвеолярных макрофагах пациентов, прошедших курс противотуберкулезной терапии
JP7313059B2 (ja) 精子細胞を強化するためのヒドロキシ尿素
CN115011480B (zh) 一种从动物组织中分离微生物的方法及其用途
RU2536992C1 (ru) Способ повышения пролиферативных свойств диплоидных клеток фибробластов человека
Abtahi et al. Cryobiology and fertility preservation: A perspective on past, current and future studies
Li et al. Activation of Invariant Natural Killer T Cells Further Ameliorates Post-Infarct Cardiac Remodeling in Mice With MSC Transplantation
US6624191B2 (en) 1-O-alkylglycerols for pharmaceutical or veterinary use for preserving and/or improving sperm
Cardoso Zoccal Janini et al. Intrauterine infusion reduces inflammatory status and could be increased the embryo recovery in mares with chronic endometritis.
Molina et al. Identificación de Especies Bacterianas y Fúngicas en Cadáveres Humanos Utilizados en la Enseñanza de la Anatomía
JP2005261252A (ja) 無血清初期胚培養液

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20200428

RJ01 Rejection of invention patent application after publication