CN106769328A - 一种快速观察冻结水产品微观组织切片的制作方法 - Google Patents

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向迎春
黄佳奇
李苑
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Abstract

本发明公开了一种快速观察冻结水产品微观组织切片的制作方法，该方法包括如下步骤：制备锡箔纸模具，倒入OCT包埋剂；将样品切成长方体，并放入锡箔纸模具中进行包埋；将装有样品的锡箔纸放入液氮中，使OCT包埋剂凝固；样品包埋凝固后贴于冷冻切片机载物台上，进行修片；将预冷到‑20℃以下的低温粘着膜贴在修好片后的样品上，进行切片；切好的片用‑20℃以下的体积百分比为70％～80％的乙醇溶液固定2～5min，然后用苏木精伊红染色；经过苏木精伊红染色后，将带样品的低温粘着膜粘附性的一面盖在载玻片上直接封片。本发明通过低温粘着膜粘附冷冻切片样品，达到快速制片且保留了切片时组织内部的冷冻形态以及冰晶状态，使组织内冰晶的轮廓清晰变化极小。

Description

一种快速观察冻结水产品微观组织切片的制作方法
技术领域
本发明涉及显微组织切片领域，具体涉及一种观察冻藏水产品微观组织结构冰晶的切片制作方法。
背景技术
生物组织微观结构观察常常采用显微镜实现。光学显微镜作为最普遍使用的微观组织观察设备，在优质的前期切片制作条件下可以较好呈现组织原有的形态，因此组织切片的质量是最终观察效果的决定因素。常用的前期切片制作包括石蜡切片或者冰冻切片方法。
石蜡切片技术作为最传统的制片方法，前期需要经过长时间的固定，透亮，梯度浸蜡才能进行切片，切片后的样品还需进行一系列的石蜡洗脱才可染色。冷冻切片只需将样品包埋就可以进行切片，大大减少了前期处理时间，更加贴近原本冷冻状态下的组织样。但是冷冻切片由于冰晶的存在，切片常常会引起冰晶粉碎以及组织碎裂；组织在未固定状态下直接包埋切片吸附于载玻片时，由于温差效应使组织迅速融化，固态到液态的转变过程中组织发生相应改变，观察到的组织样由于冰晶融化导致组织变化较大；如果提前固定样品再冰切组织受固定液的影响组织出现严重脱水现象，影响了组织原本状态的观察。
因此，想要观察冷冻样品组织中形态，特别是冰晶形态的观察，需要一种尽可能维持组织原有水分状态的冷冻切片方法以解决冷冻切片组织易碎易变形的劣势。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明提供一种快速观察冷冻组织冰晶状态的冷冻切片制作方法，该方法在较好维持组织原有形态的情况下快速观测组织内部的形态结构，更有利于观测组织冰晶形成的相关信息。
为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：一种快速观察冷冻组织冰晶状态的冷冻切片制作方法，具体包括以下步骤：
(1)制备圆柱形锡箔纸模具，要求底部平整，在模具中倒入OCT包埋剂(SAKURAFinetek)等待样品放入包埋；
(2)将样品在周围覆盖干冰的砧板上切成长方体，并放入锡箔纸模具中进行包埋；
(3)将装有样品的锡箔纸放入液氮中，使OCT包埋剂凝固，待OCT包埋剂凝固后可移入-80℃冰箱贮藏待用；
(4)样品包埋凝固后贴于冷冻切片机载物台上，将冷冻切片机上的切片厚度调至40μm，用样品快进按钮将样品移近刀口，调整要切的平面，利用慢进按钮开始修片；
(5)将预冷到-20℃以下的低温粘着膜贴在修好片后的样品上，进行切片，切片时需注意用力均匀；
(6)切好的片用-20℃以下的体积百分比为70％-80％乙醇溶液固定2-5min，然后用苏木精伊红染色；
(7)经过苏木精伊红染色后，将带样品的低温粘着膜粘附性的一面盖在载玻片上直接封片；所制备的组织切片在显微镜下观察，然后记录、拍照；对组织和冰晶的形态结构进行观察，以形成清晰、明了的组织切片图。
进一步的，所述低温粘着膜为日本徕卡公司型号为Cryofilm typeⅡC(10)的产品。
由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：此方法所致切片形态保存较好，能更加鲜明的观测到组织样在冻结状态下的组织形态，更确切地研究冰晶的形成状态。利用一种在低温条件仍具有粘附性的光学透明膜粘附组织再切片，比载玻片利用温差吸附组织引起的组织变化要小。样品粘附在低温黏着膜上可以批量进行固定染色。然后直接进行盖片，无需等待封片干燥再进行镜检，大大缩短的制片时间，并维持着组织的原有形态。
附图说明
图1是实施例一的载玻片吸附组织制片的观察图；
图2是实施例二的低温粘着膜粘附组织制片的观察图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
以冷冻虾肉组织为原材料进行实施。
实施例一：
制备圆柱形锡箔纸模具，底部平整，倒入OCT包埋剂；预处理好的虾肉从头部的第一虾节切出5mm*3mm*3mm的长方体虾肉组织，其中3mm*3mm为靠虾背的平面放入锡箔纸模具底部；将装有虾肉样品的锡箔纸放入装有液氮的保温杯中，待OCT包埋剂凝固后移入-80℃冰箱贮藏待用；包埋好的样品撕掉外层锡箔纸后用OCT包埋剂固定在载物台上，将冷冻切片机上的切片厚度调至40μm，用样品快进按钮将样品移近刀口，调整要切的平面，利用慢进按钮开始修片，修好后放下防卷板开始切片，切片时需注意用力均匀；切好的片直接用粘附性载玻片吸附，放入用-20℃的体积百分比为70％-80％的乙醇溶液固定2-5min，然后用苏木精伊红染色；染色完毕的样品用二甲苯透亮除去乙醇，滴上中性树胶盖片，待其干燥后镜检，图1为载玻片吸附组织制片的观察图。
实施例二：
制备圆柱形锡箔纸模具，底部平整，倒入OCT包埋剂；预处理好的虾肉从头部的第一虾节切出5mm*3mm*3mm的长方体，其中3mm*3mm为靠虾背的平面放入锡箔纸模具底部；将装有虾肉样品的锡箔纸放入装有液氮的保温杯中，待OCT包埋剂凝固后移入-80℃冰箱贮藏待用；包埋好的样品撕掉外层锡箔纸后用OCT包埋剂固定在载物台上，将冷冻切片机上的切片厚度调至40μm，用样品快进按钮将样品移近刀口，调整要切的平面，利用慢进按钮开始修片，修好后贴上提前预冷的低温粘着膜切片，切片时需注意用力均匀；切好的片用-20℃的体积百分比为70％-80％的乙醇溶液固定2-5min，然后用苏木精伊红染色；染色完毕粘有低温粘着膜的样品直接贴于载玻片上封片镜检，图2是低温粘着膜粘附组织制片的观察图。
从实施例一和实施例二的过程来看，使用低温粘着膜的实施例二省去了最后透亮封片烤片的时间；而且观察到的组织图中，实施例二的组织冰晶更圆润，更好地维持了组织内冰晶的原有形态。

Claims (2)

1.一种快速观察冻结水产品微观组织切片的制作方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
(1)制备圆柱形锡箔纸模具，在模具中倒入OCT包埋剂。
(2)将样品在周围覆盖干冰的砧板上切成长方体，并放入锡箔纸模具中进行包埋。
(3)将装有样品的锡箔纸放入液氮中，使OCT包埋剂凝固。
(4)样品包埋凝固后贴于冷冻切片机载物台上，进行修片。
(5)将预冷到-20℃以下的低温粘着膜贴在修好片后的样品上，进行切片。
(6)切好的片用-20℃以下的体积百分比为70％～80％的乙醇溶液固定2～5min，然后用苏木精伊红染色。
(7)经过苏木精伊红染色后，将带样品的低温粘着膜粘附性的一面盖在载玻片上直接封片。
2.根据权利要求1所述的快速观察冻结水产品微观组织切片的制作方法，其特征在于，所述低温粘着膜为日本徕卡公司型号为Cryofilm type ⅡC(10)的产品。
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