CN112781960B - 一种制作眼冰冻切片的方法 - Google Patents
一种制作眼冰冻切片的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN112781960B CN112781960B CN202110163040.8A CN202110163040A CN112781960B CN 112781960 B CN112781960 B CN 112781960B CN 202110163040 A CN202110163040 A CN 202110163040A CN 112781960 B CN112781960 B CN 112781960B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- eyeball
- glue
- cornea
- stick
- eyeballs
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title abstract description 41
- 210000005252 bulbus oculi Anatomy 0.000 claims abstract description 55
- 239000003292 glue Substances 0.000 claims abstract description 32
- 210000004087 cornea Anatomy 0.000 claims abstract description 25
- 210000001508 eye Anatomy 0.000 claims abstract description 23
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 15
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 14
- 210000003786 sclera Anatomy 0.000 claims abstract description 14
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 14
- 238000007598 dipping method Methods 0.000 claims abstract description 7
- 239000013078 crystal Substances 0.000 claims abstract description 6
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 claims abstract 5
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 claims abstract 5
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 claims abstract 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims abstract 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 7
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 7
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 7
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 claims description 6
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 claims description 6
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 claims description 5
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 claims description 5
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 claims description 5
- 235000010585 Ammi visnaga Nutrition 0.000 claims description 2
- 244000153158 Ammi visnaga Species 0.000 claims description 2
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 claims description 2
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 claims description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 14
- 238000011160 research Methods 0.000 abstract description 5
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 24
- 210000001525 retina Anatomy 0.000 description 14
- 239000000463 material Substances 0.000 description 11
- 230000008569 process Effects 0.000 description 11
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 description 8
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 6
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 6
- CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N O-Xylene Chemical compound CC1=CC=CC=C1C CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 5
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 5
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 5
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 description 4
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 description 4
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 description 4
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 3
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 3
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 3
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 3
- 239000008096 xylene Substances 0.000 description 3
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 2
- 238000004624 confocal microscopy Methods 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 238000007490 hematoxylin and eosin (H&E) staining Methods 0.000 description 2
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 2
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 2
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 2
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 2
- 230000002207 retinal effect Effects 0.000 description 2
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 2
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 239000001993 wax Substances 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000357 carcinogen Toxicity 0.000 description 1
- 239000003183 carcinogenic agent Substances 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000000795 conjunctiva Anatomy 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 230000010856 establishment of protein localization Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 1
- 210000003128 head Anatomy 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N methanone Chemical compound O=[14CH2] WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000010008 shearing Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 229950003937 tolonium Drugs 0.000 description 1
- HNONEKILPDHFOL-UHFFFAOYSA-M tolonium chloride Chemical compound [Cl-].C1=C(C)C(N)=CC2=[S+]C3=CC(N(C)C)=CC=C3N=C21 HNONEKILPDHFOL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
- 238000004018 waxing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/286—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q involving mechanical work, e.g. chopping, disintegrating, compacting, homogenising
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/02—Devices for withdrawing samples
- G01N1/04—Devices for withdrawing samples in the solid state, e.g. by cutting
- G01N1/06—Devices for withdrawing samples in the solid state, e.g. by cutting providing a thin slice, e.g. microtome
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/30—Staining; Impregnating ; Fixation; Dehydration; Multistep processes for preparing samples of tissue, cell or nucleic acid material and the like for analysis
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/36—Embedding or analogous mounting of samples
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/42—Low-temperature sample treatment, e.g. cryofixation
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Sampling And Sample Adjustment (AREA)
Abstract
本发明提供一种制作眼冰冻切片的方法，包括步骤1.取新鲜小鼠的眼球浸入1XPBS缓冲液润洗，取出眼球，用吸水纸吸去多余的PBS，但维持眼球表面湿润的状态；步骤2.用细小的棒状物蘸取少量502胶水，迅速将棒状物对准眼球角膜正中间位置，502胶水遇到湿润的角膜，迅速凝固，使棒状物和角膜牢固粘贴在一起；步骤3.手持棒状物将眼球放于装有502胶水的200微升的离心管中，使整个巩膜浸入胶水中，但保持大部分角膜在液面之上。步骤4.迅速让整个眼球浸入1XPBS中，使胶水凝固。随后去除角膜和晶体，进行固定、脱水、包埋、切片、染色。本发明让广大研究者在1小时左右得到一张质量形态好的冰冻切片，其具备了简单、便捷、经济效果好的优点，将会在眼科研究领域推广应用。
Description
技术领域
本发明应用于眼科研究冰冻切片领域，尤其涉及一种制作用于免疫染色的眼冰冻切片的方法。
背景技术
(1)石蜡切片：是将组织通过一系列的处理后包埋于石蜡中，以达到保留组织较好的形态结构的切片方法，在组织化学中应用广泛，用于治病诊断及蛋白定位、表达水平等机制研究。其主要实验步骤有：制片、取材、固定(1小时到数天)、洗涤和脱水。通常从30％或50％酒精(1小时)、70％(1小时)、85％(1小时)、95％(1小时)直至无水乙醇(1小时)，透明(1-2小时)、浸蜡(通常先把组织材料块放在熔化的石蜡和二甲苯的等量混合液中浸渍1-2小时，再先后移入2个熔化的石蜡液中浸渍3小时左右，浸蜡应在高于石蜡熔点30℃左右的温箱中进行，以利石蜡浸入组织内)、包埋。
整个石蜡切片的过程从切片至贴片、脱蜡(用二甲苯脱蜡，再逐级经酒精及梯度酒精直至蒸馏水)、染色、脱水、透明、封片。一般的组织从取材固定到封片制成玻片标本需要数日，且免疫染色背景高。
石蜡切片存在的缺陷是：
操作步骤多，费时费力，免疫组化染色非特异性背景强。其主要实验步骤有：取材、固定、洗涤和脱水、透明、浸蜡、包埋、切片和贴片、脱蜡、染色、脱水、透明、封片等步骤。一般的组织从取材固定到封片制成玻片标本需要数日。在繁杂的操作过程中，抗原的免疫原性会丢失或者改变，导致免疫组化失败，或者免疫组化染色的非特异性背景增强。
(2)冰冻切片：是一种在低温条件下使组织快速冷却到一定硬度，然后进行切片的方法。因其制作过程较石蜡切片快捷、简便。
冰冻切片存在的缺陷是：
①组织结构形态不如石蜡切片清晰。
②不容易制作较薄的切片。
③组织块在冻结过程中容易产生水的结晶而影响细胞的形态结构及抗原物质的定位。
④不容易做连续切片。
(3)眼组织切片，在眼科领域应用广泛，是研究疾病发生机制必不可少的实验方法。眼部组织，其结构精细，复杂，各组织结构所占体积不一，软硬程度不同所以要得到一张保持视网膜清晰完整结构的切片很难。无论冰冻切片还是石蜡切片都很难。
综上所述，在组织形态结构免疫组化大量在临床诊断和科研分析中大量应用的今天，迫切需要一种既可以兼具石蜡切片对组织形态的完整性的展示，又具有冰冻切片快速方便简单流程少，低染色背景的方法。这种方法不仅节约大量的试剂耗材，也节约了实验人员宝贵的时间，缩短了实验周期，并且达到了更好的实验成像效果。
发明内容
本发明的目的在于解决上述现有技术存在的缺陷，提供一种制作眼冰冻切片的方法。
本发明采用如下技术方案：
一种制作眼冰冻切片的方法，包括如下步骤：
1)取新鲜小鼠的眼球浸入1XPBS缓冲液中稍作润洗。取出眼球，置于倒扣的培养皿上。用吸水纸吸去多余的PBS，但维持眼球表面湿润的状态。
2)用细小的棒状物(例如10ul移液器用小枪头或者钝头的牙签或者一小段网球拍用的尼龙弦)蘸取少量502胶水，迅速将棒状物对准眼球角膜正中间位置，502胶水遇到湿润的角膜，迅速凝固。使棒状物和角膜牢固粘贴在一起。
3)手持棒状物将眼球放于装有502胶水的200微升的离心管中，使整个巩膜部分浸入胶水中，但保持大部分角膜在液面之上。保证整个巩膜均匀和502胶水接触，巩膜与502胶水的接触时间约1秒。
4)拿出眼球，并迅速让整个眼球浸入PBS中(502胶水在遇水后迅速凝固，相当于给柔软变形的眼球组织穿上坚固的保护外壳，达到石蜡切片的形态效果)。
5)手拿棒状物，剪掉角膜，去除晶体。(棒状物解决了眼球操作过程中没有很好的夹取固定位置的问题。穿上502外衣的眼球在此时可以剪去角膜，取出晶体，而不会引起眼球结构的破坏，同时固定液可以更好的和视网膜接触，大大缩短了眼球固定和脱水的时间)。原来最少在冰上固定2小时，现在冰上固定30分钟即可。4％多聚甲醛溶液固定时间越短可以减少免疫组化染色时的非特异背景，同时更好地保持抗原的免疫原性，最后得到更好的染色效果。
6)放入4％多聚甲醛溶液中，冰上固定30分钟。
7)放入30％蔗糖溶液中脱水30分钟。
8)用吸水纸吸掉眼内的蔗糖溶液，把眼球置入灌满包埋液OCT的包埋盒内包埋。
9)将包埋样本放入-80℃的冰箱，约5分钟后包埋液凝固。去除包埋好的组织块，用冰冻切片机切成10-14um厚度的切片。
本发明的有益效果：
1)用502胶水将棒状物和眼球角膜正中间粘合，解决眼球切片过程中，眼球光滑没有很好的固定抓取位点来进行操作的问题。
2)将502胶水与眼球整个巩膜均匀结合，并迅速放于PBS中，利用502胶水在遇水后迅速凝固并在眼球巩膜外形成相对坚固但不影响切片的保护膜的特性。解决了冰冻切片容易造成视网膜牵拉脱离，结构不齐，层次不清，严重影响视网膜层次结构及视网膜各组织抗原性的问题。
附图说明
图1为本发明的眼冰冻切片步骤流程示意图；
图2为1月小鼠视网膜石蜡切片HE染色效果图；
图3为采用本发明方法的1月小鼠视网膜眼冰冻切片染色效果图；
图4(a)、图4(b)、图4(c)为传统眼冰冻切片免疫组化染色效果图；
图5(a)、图5(b)、图5(c)为用本发明方法的眼冰冻切片免疫组化染色效果图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
1)用502胶水将棒状物和眼球结膜正中间粘合，解决眼球切片过程中，眼球光滑没有很好的固定抓取位点来进行操作的问题。
2)将502胶水与眼球整个巩膜均匀结合，并迅速放于PBS中，利用502胶水在遇水后迅速凝固并在眼球巩膜外形成相对坚固但不影响切片的保护膜，避免了后续的剪去角膜，取晶体和包埋过程中眼球形变引起的网脱。解决另外冰冻切片容易造成视网膜牵拉脱离，结构不齐，层次不清，严重影响视网膜层次结构及视网膜各组织的抗原性的问题。
3)给穿上保护膜的眼球去除角膜晶体后，再固定。既可以不损伤视网膜结构又可以让固定液和视网膜充分结合，缩短固定所需时间。节约时间。减少非特异性背景，提高染色质量。解决了石蜡切片组织从取材固定到封片制成玻片标本需要数日，且需要大量的试剂盒繁琐的操作步骤的实验技术弊端。
4)简便，可以不需要对组织固定、脱水、透明、包埋等手续即可进行切片，减少了一些中间环节。快速、用时短。组织变化不大。能很好保存脂肪，类脂等成分。能够比较完好地保存各种抗原活性及酶类，特别是对有机溶剂或热的温度耐受能力较差的细胞膜表面抗原和水解酶保存较好。
如图1、图3所示，本发明的一种制作眼冰冻切片的方法，包括如下步骤：
1)取新鲜动物眼球浸入1XPBS缓冲液中稍作润洗。取出眼球，置于倒扣的培养皿上。用吸水纸吸去多余的PBS，但维持眼球表面湿润的状态。
2)用细小的棒状物(例如10ul小枪头或者钝头的牙签)蘸取少量502胶水，1-5秒内将棒状物对准眼球角膜正中间位置，502胶水遇到湿润的角膜，迅速凝固，使棒状物和角膜牢固粘贴在一起。
3)手持棒状物将眼球放于装有502胶水的200微升的离心管中，使整个巩膜部分浸入胶水中，但保持整个角膜在液面之上。保证整个巩膜均匀和502胶水接触，巩膜与502胶水的接触时间约1-5秒。
4)拿出眼球，并迅速让整个眼球浸入PBS中(502胶水在遇水后迅速凝固，相当于给柔软变形的眼球组织穿上坚固的保护外壳，达到石蜡切片的形态效果)。
5)手拿棒状物，剪掉角膜，用眼科显微镊小心去除晶体。(棒状物解决了眼球操作过程中没有很好的夹取固定位置的问题。穿上502胶水外衣的眼球在此时可以剪去角膜，取出晶体，而不会引起眼球结构的破坏，同时固定液可以更好的和视网膜接触，大大缩短了眼球固定和脱水的时间)。原来在冰上的固定时间是2小时，现在减少到30分钟。4％多聚甲醛溶液固定时间越短可以减少免疫组化染色时的非特异背景，同时更好地保持抗原的免疫原性，最后得到更好的染色效果。
6)放入4％多聚甲醛溶液中，冰上固定30分钟。
7)放入30％蔗糖溶液中脱水30分钟。
8)用吸水纸吸掉眼内的蔗糖溶液，把眼球置入灌满包埋液OCT的包埋盒内包埋。
9)将包埋样本放入-80℃的冰箱，约5-10分钟后包埋液凝固。去除包埋好的组织块，用冰冻切片机切成以10-14um厚度的切片。
图2为石蜡切片的HE染色效果图，整个制作过程见背景技术石蜡切片部分。图3为采用本发明方法的眼冰冻切片方法制作。步骤流程见前述实施过程。
图3描述的是本发明方法获得的小鼠切片经甲苯胺兰染色后的图。由图可见，整个视网膜的形态完整，也没有网脱。所以，该方法既可以不损伤视网膜结构又可以让固定液和视网膜充分结合，缩短固定所需的时间，见下表1。解决了石蜡切片组织从取材固定到封片制成切片标本需要数日，且需要大量的试剂盒繁琐的操作步骤的实验技术弊端。本发明方法的眼冰冻切片中所需材料价格低廉且为日常生活中用得到的普通材料，非常容易获得。
表1石蜡切片和HB502眼冰冻切片时间对比
石蜡切片在制片的过程中需要用到很多的试剂材料(甲醛、冰醋酸、酒精、二甲苯、石蜡)，其中二甲苯是一种有机溶剂，其被世界卫生组织认定为三类致癌物质之一，影响操作人员的身体健康。而改良的HB502眼冰冻切片只需用到4％的多聚甲醛和30％的蔗糖。HB502眼冰冻切片既节约成本又有利健康。
图4(a)-图4(c)和免疫组化染色效果图，制作步骤如下：
用上面提到的传统的冰冻切片的方法得到冰冻切片，5％NDS(正常驴血清(normaldonkey serum，NDS)加0.1％Triton X-100封闭30分钟，加抗视紫红质抗体2小时或过夜，然后加Alex488偶联的抗兔二抗以及染细胞核的DAPI,室温孵育1小时，用抗荧光焠灭的封片液封片，图像由激光共聚焦显微镜拍摄。
图5(a)-图5(c)中免疫组化染色效果图，是由用图3提到一种制作眼冰冻切片的方法得到冰冻组织切片，然后用5％NDS(正常驴血清(normal donkey serum，NDS)加0.1％Triton X-100封闭30分钟，加抗视紫红质抗体2小时或过夜，然后加Alex488偶联的抗兔二抗以及染细胞核的DAPI,室温孵育1小时，用抗荧光焠灭的封片液封片，图像由激光共聚焦显微镜拍摄。
如图5(a)-图5(c)，一种制作眼冰冻切片的方法(HB502眼冰冻切片)比传统的眼冰冻切片更节省时间。传统方法固定需要2小时，脱水(2小时到过夜)。而改良本发明的制作眼冰冻切片的方法只需固定30分钟，脱水30分钟，总共1个小时左右即可进行包埋切片，并得到质量可靠的冰冻切片。
表2.传统冰冻切片与本发明制作眼冰冻切片的方法比较
| 传统冰冻切片步骤 | 所需时间 | HB502冰冻切片步骤 | 所需时间 |
| 固定 | 2小时 | 固定 | 30分钟 |
| 脱水 | 2小时-12小时 | 脱水 | 30分钟 |
| 总耗时 | 4小时-16小时 | 总耗时 | 1小时 |
如今，组织形态结构免疫组化大量在临床诊断和科研分析中大量应用，本方法既可以兼具石蜡切片对组织形态的完整性的优势，又具有冰冻切片快速方便简单流程少的便捷，还有低染色背景的特点。本发明不仅节约大量的试剂耗材，也节约了实验人员宝贵的时间，缩短了实验周期，并且达到了更好的实验成像效果。本发明的制作眼冰冻切片的方法让广大研究者在1小时左右得到质量形态好的冰冻切片，其具备了简单便捷经济效果好的优点，将会在眼科研究领域推广应用。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (3)
1.一种制作眼冰冻切片的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1.将已取出的小鼠眼球浸入1XPBS缓冲液中润洗，取出眼球，置于倒扣的培养皿上，用吸水纸吸去多余的PBS，但维持眼球表面湿润的状态；
步骤2.用细小的棒状物蘸取少量502胶水，1-5秒内将棒状物对准眼球角膜正中间位置，502胶水遇到湿润的角膜，迅速凝固，使棒状物和角膜牢固粘贴在一起；
步骤3.手持棒状物将眼球放于装有502胶水的200微升的离心管中，使整个巩膜部分浸入胶水中，但保持整个角膜在液面之上，保证整个巩膜均匀地和502胶水接触，巩膜与502胶水的接触时间1-5秒；
步骤4.拿出眼球，并迅速让整个眼球浸入PBS中；
步骤5.手拿棒状物，剪掉眼睛的角膜部分，用眼科显微镊去除晶体；
步骤6.放入4%多聚甲醛溶液中，冰上固定30分钟;
步骤7.放入30%蔗糖溶液中脱水30分钟;
步骤8.用吸水纸吸掉眼内的蔗糖溶液，把眼球置入灌满包埋液OCT的包埋盒内包埋；
步骤9.将包埋样本放入-80℃的冰箱，5-10分钟后包埋液凝固。
2.根据权利要求1所述的制作眼冰冻切片的方法，其特征在于，棒状物为10ul移液器用小枪头或者钝头的牙签或者网球拍用的尼龙弦。
3.根据权利要求1所述的制作眼冰冻切片的方法，其特征在于，步骤9还包括取出包埋好的组织块，用冰冻切片机切成10-14um厚度的切片。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110163040.8A CN112781960B (zh) | 2021-02-05 | 2021-02-05 | 一种制作眼冰冻切片的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110163040.8A CN112781960B (zh) | 2021-02-05 | 2021-02-05 | 一种制作眼冰冻切片的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN112781960A CN112781960A (zh) | 2021-05-11 |
| CN112781960B true CN112781960B (zh) | 2024-02-23 |
Family
ID=75761059
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202110163040.8A Active CN112781960B (zh) | 2021-02-05 | 2021-02-05 | 一种制作眼冰冻切片的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN112781960B (zh) |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1961846A (zh) * | 2006-12-08 | 2007-05-16 | 中国人民解放军第三军医大学第一附属医院 | 全层视网膜组织片的体外分离制备方法 |
| CN104634626A (zh) * | 2013-11-15 | 2015-05-20 | 上海交通大学 | 一种改进的冰冻切片方法及其应用 |
| CN110361242A (zh) * | 2019-08-14 | 2019-10-22 | 武汉赛维尔生物科技有限公司 | 一种用于眼球组织的固定液以及眼球组织制片的预处理方法 |
| CN110823663A (zh) * | 2019-10-09 | 2020-02-21 | 中国人民解放军总医院第五医学中心 | 一种动物眼球病理切片的制作方法 |
| CN111238901A (zh) * | 2020-03-04 | 2020-06-05 | 四川省人民医院 | 一种改进小鼠眼球冰冻切片的制作方法 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3723204B1 (ja) * | 2005-03-07 | 2005-12-07 | 有限会社 コーケン | 難浸透性組織迅速固定液 |
| EP3013946B8 (en) * | 2013-06-28 | 2019-04-10 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Methods for expressing a polynucleotide of interest in the retina of a subject |
-
2021
- 2021-02-05 CN CN202110163040.8A patent/CN112781960B/zh active Active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1961846A (zh) * | 2006-12-08 | 2007-05-16 | 中国人民解放军第三军医大学第一附属医院 | 全层视网膜组织片的体外分离制备方法 |
| CN104634626A (zh) * | 2013-11-15 | 2015-05-20 | 上海交通大学 | 一种改进的冰冻切片方法及其应用 |
| CN110361242A (zh) * | 2019-08-14 | 2019-10-22 | 武汉赛维尔生物科技有限公司 | 一种用于眼球组织的固定液以及眼球组织制片的预处理方法 |
| CN110823663A (zh) * | 2019-10-09 | 2020-02-21 | 中国人民解放军总医院第五医学中心 | 一种动物眼球病理切片的制作方法 |
| CN111238901A (zh) * | 2020-03-04 | 2020-06-05 | 四川省人民医院 | 一种改进小鼠眼球冰冻切片的制作方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| "雌激素受体GPR30介导的小鼠视网膜神经节细胞保护作用";江梦南 等;武汉大学学报(医学版);第37卷(第02期);第195-199页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN112781960A (zh) | 2021-05-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Pfeffer et al. | The presence of a soluble interphotoreceptor retinol‐binding protein (IRBP) in the retinal interphotoreceptor space | |
| CN108572105A (zh) | 一种脑组织冰冻切片的制备方法 | |
| CN111238901B (zh) | 一种改进小鼠眼球冰冻切片的制作方法 | |
| US11241466B2 (en) | Okra as a substitute for cervical mucus | |
| CN108918215B (zh) | 快速制备硬组织切片的方法及其应用 | |
| WO2015100858A1 (zh) | 制备人工心脏瓣膜瓣叶的方法 | |
| CN105641749A (zh) | 利用新鲜牛角膜以制备牛角膜基质的方法及应用方法 | |
| CN110823663A (zh) | 一种动物眼球病理切片的制作方法 | |
| CN105890919A (zh) | 一种玉米初生根组织冰冻切片方法 | |
| CN111257089B (zh) | 一种优化的蝴蝶兰不同花部组织石蜡切片的制作方法 | |
| CN112781960B (zh) | 一种制作眼冰冻切片的方法 | |
| Pfenninger et al. | Methods for the freeze-fracturing of nerve tissue cultures and cell monolayers. | |
| JP3723204B1 (ja) | 難浸透性組織迅速固定液 | |
| CN104865115B (zh) | 使用新鲜冰冻组织检测单克隆抗体类药物组织交叉反应的方法 | |
| Fong et al. | Cryopreservation of the rabbit cornea: freezing with dimethyl sulphoxide in air or in medium | |
| CN109374378A (zh) | 一种甜菜叶石蜡包埋制片的方法 | |
| CN108542915A (zh) | 一种促进伤口愈合的药物及其制备方法 | |
| Ruzza et al. | Ultra-thin DSAEK using an innovative artificial anterior chamber pressuriser: a proof-of-concept study | |
| Claeys et al. | High-pressure freezing and freeze substitution of gravid Caenorhabditis elegans (Nematoda: Rhabditida) for transmission electron microscopy | |
| Ford et al. | The ophthalmic pathology cut-up–Part 2 | |
| CN109324001A (zh) | 膜状非均一性生物材料透明性筛选方法及脱细胞真皮基质 | |
| Krabcova et al. | Rapid cooling of the amniotic membrane as a model system for the vitrification of posterior corneal lamellae | |
| Haller et al. | Improved handling and embedding schemes for cultured murine neuroretinal explants | |
| Rodríguez-Fernández | Development of alternative strategies for preservation and generation of corneal tissues for transplantation | |
| Mobbs et al. | A glyoxylic acid method for the localization of catecholamines in insect nervous systems |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |