CN112857953A - 一种利用简易包埋模具制备大型海藻冰冻切片样品的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于海洋生物领域，具体地说涉及一种包埋模具及利用其批量制备大型海藻(草)冰冻切片样品的简易方法。以大型海藻腊叶标本或新鲜藻体为样本材料，通过制备切片样品、制作包埋模具、包埋样品、批量制备、上机切片、染色、显微观察、封片保存步骤达到批量制备冰冻切片样品的目的。本发明取材容易，操作简单，方法有效，极大地提高了大型海藻(草)冰冻切片制备效率。
Description
技术领域
本发明属于海洋生物领域，具体地说涉及一种包埋模具及利用其批量制备大型海藻(草)冰冻切片样品的简易方法。
背景技术
描述大型海藻(草)内部结构特征是经典形态分类学研究的基础。以往的藻类分类学研究通常是通过徒手切片，进而在显微镜下手绘藻体结构黑白色线图。描述我国藻类多样性的学术专著《中国海藻志》其插图也多为手绘线图。然而，我国海藻分类学研究人员严重不足，更是缺乏能够徒手切片且手绘藻体结构线图的科研人员，十分不利于藻类分类学科的发展。
冰冻切片技术操作简单、快速，已广泛应用于医学病理诊断、动物和高等植物组织研究。冰冻切片结合现代多功能显微镜系统拍摄的样品照片也更加清晰美观。然而该技术在海藻学研究中的便捷使用方法仍未见报道。因研究需要，越来越多的藻类研究者期望获得高质量藻类结构图片，但苦于找不到一套快速且实用的切片方法。例如，藻类生理学研究者希望通过切片获得胁迫条件下细胞结构的变化；藻类生态学者希望获得绿潮原因物种内部细胞形态结构；水产养殖学者则希望通过切片获得有害藻类如何侵染养殖藻类内部结构等等。由此可见，切片技术已不仅仅适用于藻类分类学研究，在藻类生理学、生态学和水产养殖等学科中同样也有需求，具有较为广阔的发展空间。因此，将冰冻切片技术应用于藻类学研究具有重要的实践意义。
并且现阶段有些学生做海藻冰冻切片时，选用传统的锡箔纸套在圆柱形物体上定型，进而包埋，这种自治模具质量差，包埋样品易歪斜，且比较费时；更有甚者直接在切片机冷冻托上滴加OCT包埋剂，等其冰冻成固体后再加藻类样品，接着再滴加包埋剂，再等其冻为固体，这种处理往往造成样品歪斜，极其费时费力，很容易导致切片失败。
因此，寻找一套便捷的藻类冰冻切片技术尤为重要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种包埋模具及利用其批量制备大型海藻(草)冰冻切片样品的简易方法。
为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
本发明批量制备大型海藻(草)冰冻切片样品的简易方法，以大型海藻(草)腊叶标本或新鲜藻体为样本材料，通过制备切片样品、制作包埋模具、包埋样品、批量制备、上机切片、染色、显微观察、封片保存步骤达到快速制备大量冰冻切片样品的目的。
一种包埋模具，包括成模管和出模管，成模管上端开口，下端设有可打开的端盖，出模管上端呈锥状。
所述包埋模具使用时成模管下端端盖扣合形成底部，从成模管上端开口滴入包埋剂，并将样品垂直放入其中央，待凝固成模后，打开端盖，出模管锥端从成模管下端口插入将胶模顶出。
一种批量制备大型海藻(草)冰冻切片样品的简易方法：
以大型海藻腊叶标本或新鲜藻体为样本材料，制备切片样品，而后速冻定型；
将包埋计由模具的成模管上端开口处滴入，滴满后将定型后样品垂直放入其中央，而后将其放在液氮盒中速冻直至包埋剂冷冻为白色固体，取出置于室温条件下回温软化，打开端盖，出模管锥端从成模管下端口插入将胶模顶出，再放在液氮盒中二次速冻，即获得切片样品。
所述大型海藻(草)腊叶标本或新鲜藻体；其中，大型海藻(草)为大型红藻、绿藻、褐藻、大型蓝藻或海草。
具体步骤如下：
1)制备切片样品：准备好用来切片的海藻(草)腊叶标本或新鲜藻体，直接或在体视镜下使用单面刀片分别切取特定样本，如藻体主枝、繁殖结构、匍匐茎等，装入7cm×5cm样品袋中备用，并标明样品编号。同时准备一把“十字形”螺丝刀、小号尖头镊子、大号扁头镊子和一把解剖针，樱花牌包埋剂、液氮盒等。
由于大型海藻(草)形态多样，大小各异。有圆柱形、叶状、丝状等，取样规格也不尽相同。柱形或扁压(平)藻体一般切取3―5mm切段，叶状藻体及海草2×5mm切片，丝状藻可混合数个切取，单层细胞叶状藻体柔弱，放入OCT包埋剂中容易卷缩，不易按照特定方向包埋，因此该类物种需叠加多片切取，最好使用腊叶标本为样本，连同一薄层植物标本台纸一同切取，薄层台纸能够支撑单层藻体因而利于样本包埋。
2)制作包埋模具：包括成模管高度约为18mm，内径约为10mm和出模管高度约为20mm，成模管上端开口，下端设有可打开的端盖，出模管上端呈锥状。
所述包埋模具使用时成模管下端端盖扣合形成底部，从成模管上端开口滴入包埋剂，并将样品垂直放入其中央，待凝固成模后，打开端盖，出模管锥端从成模管下端口插入将胶模顶出。
3)包埋样品：将成模管垂直放在桌面上，截面口朝上，缓缓倒满OCT包埋剂，注意不要倒入大气泡，若有大气泡可用解剖针刺破。使用小号尖头镊子夹住步骤1)所述备好的样品，放入液氮盒速冻2―4s定型，目的是加强样品硬度。如需藻体横切面则将目标样品迅速并垂直放入模具中央(如需纵切面则将样品水平放在模具中央)，若样品歪斜可用解剖针快速拨正。然后使用大号扁头镊子夹住模具迅速放入液氮中速冻10s左右，直至乳状包埋剂由无色变为白色固体即可，该过程要控制好速冻时间，防止包埋剂冻裂。若万一发生冻裂，则需要在样品冻裂处涂上包埋剂速冻修复。将速冻好的样品放在桌面上，稍等片刻回温，待包埋剂开始软化时，打开离心管模具盖子，使用螺丝刀头顶住模具出模管部分从成模管盖子处缓缓将包埋样品顶推出来，用镊子迅速把包埋样品重新放入液氮盒中速冻2s左右，放入原来的样品袋，并立即放入-20℃冰箱冻存。
4)批量制备：通过所述步骤1)、2)、3)可快速制备海藻冰冻切片样品。重复上述步骤即可批量制备冰冻切片样品。制备完成的包埋样品圆柱形，表面光滑平整，其中一端有环状标记，作为样品底端的标识，上机切片时需将环状标记端连接在冷冻托上，另一端无环状标记的则为样品端。
5)上机切片：将制备好的样品环形端朝下，用OCT包埋剂将环形端与冷冻托连接，待包埋剂冷冻坚固后可上机切片。经过修片后可切5-20μm厚度不一的超薄切片，取载玻片并注明编号，并使用载玻片直接黏附切片，黏附切片的载玻片可放在-20℃冰箱冻存以备后续观察研究。
6)染色：在黏附冰冻切片的载玻片滴加1―3滴无离子水，在桌面上小心晃动载玻片加快OCT包埋剂溶解。然后滴加一滴质量分数为1％苯胺蓝染色液，静置3―5min，用吸水纸吸取多余染色液，再滴加一滴无离子水，盖上盖玻片。
7)显微镜观察拍照：将做好的载玻片放在显微镜下观察并拍照。
8)封片保存：完成观察拍照后，在盖玻片一端滴入一滴体积分数为30％的Caro溶液封片，室温放置12h待封片液凝固，将封片后的载玻片放入玻片盒室温下可长期保存。
本发明具有如下优点：
本发明取材方便，操作简单，设计新颖，方法有效，极大地提高了大型海藻(草)冰冻切片制备效率。具体为：
1.取材方便，操作简单。本发明创造性的通过简单改造实验室常见的1.5mL离心管作为包埋模具，取材方便，克服了锡纸等传统包埋模具费时费力的缺点。
2.包埋样品质量好，节约成本。本发明仅需要少量的OCT包埋剂，制备的包埋样品柱光滑平整，且有环状标记，便于识别样品端。
3.设计新颖。本发明根据形态各异的海藻样品特点，创造性地提出不同样品制备方案。无论是纤细的丝状藻体还是单层细胞叶状藻体均能够有效制作冰冻切片，并获得良好的切片效果。
附图说明
图1为本发明制作包埋模具和包埋样品主要过程图。
图2为本发明制备的包埋样品柱具有环形标记，便于识别样品端。
图3为本发明单层细胞叶状藻体取样方案。
图4为本发明实施例1石花菜主枝横切面观
图5为本发明实施例1石花菜囊果横切面观
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本发明所限定的范围。
一种包埋模具，包括成模管和出模管，成模管上端开口，下端设有可打开的端盖，出模管上端呈锥状。
所述包埋模具使用时成模管下端端盖扣合形成底部，从成模管上端开口滴入包埋剂，并将样品垂直放入其中央，放入液氮凝固成模后，打开端盖，出模管锥端从成模管下端口插入将胶模顶出。
实施例1，制备一种大型海洋红藻石花菜的主枝和囊果横切面冰冻切片样品
1.制备样品：准备好一份石花菜腊叶标本，直接使用单面刀片分别切取藻体主枝和囊果枝4mm切段，装入7cm×5cm样品袋中备用，并标明样品编号。同时准备一把“十字形”螺丝刀、小号尖头镊子、大号扁头镊子和一把解剖针，樱花牌包埋剂、液氮盒等。
2.制作包埋模具：包括成模管高度约为18mm，内径约为10mm和出模管高度约为20mm，成模管上端开口，下端设有可打开的端盖，出模管上端呈锥状。
同时该模具可用1.5mL离心管，将其于其的0.5mL或1.0mL中间位置横向垂直切开，一分为二，分别为成膜管和出模管。圆柱形带盖管体作为包埋模具主体部分，高度约为18mm，内径约为10mm，圆锥形尖底管体作为包埋模具辅助部分，高度约为20mm。
3.包埋样品：将成模管垂直放在桌面上，开口面口朝上，缓缓倒满OCT包埋剂，注意不要倒入气泡，若有气泡可用解剖针刺破。使用小号尖头镊子夹住石花菜样品，放入液氮盒速冻2―4s定型，迅速将目标样品并垂直放入模具中央。使用大号扁头镊子夹住模具迅速放入液氮中速冻10s左右，直至乳状包埋剂由无色变为白色固体即可。将速冻好的样品放在桌面上，稍等片刻回温，待包埋剂开始软化时，打开离心管模具盖子，使用螺丝刀头顶住模具出模管从成模管盖子处缓缓将包埋样品顶推出来，用镊子迅速把包埋样品重新放入液氮盒中速冻2s左右，放入原来的样品袋，并立即放入-20℃冰箱冻存。使用同样方法制备繁殖结构囊果样品，并放入-20℃冰箱冻存。
4.上机切片：将制备好的样品环形端朝下，用OCT包埋剂将环形端与冷冻托连接，待包埋剂冷冻坚固后可上机切片。经过修片后可切5-20μm厚度不一的超薄切片，取一载玻片并注明编号，使用载玻片直接黏附切片。
5.染色：在黏附冰冻切片的载玻片滴加1-3滴无离子水，在桌面上小心晃动载玻片加快OCT包埋剂溶解。然后滴加一滴苯胺蓝染色液，静置3-5min，用吸水纸吸取多余染色液，再滴加一滴无离子水，盖上盖玻片。
6.显微镜观察拍照：将做好的载玻片放在显微镜下观察拍照。
7.封片保存：完成观察拍照后，在盖玻片一端滴入一滴30％的Caro溶液封片，室温放置12h待封片液凝固，将封片后的载玻片放入玻片盒室温保存。
本发明以大型海藻腊叶标本或新鲜藻体为样本材料，通过制备切片样品、制作包埋模具、包埋样品、批量制备、上机切片、染色、显微观察、封片保存步骤达到批量制备冰冻切片样品的目的。本发明取材容易，操作简单，方法有效，极大地提高了大型海藻(草)冰冻切片制备效率。
以上为对本发明实施例的描述，通过对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (4)
1.一种包埋模具，其特征在于：包括成模管和出模管，成模管上端开口，下端设有可打开的端盖，出模管上端呈锥状。
2.按权利要求1所述的包埋模具，其特征在于：所述包埋模具使用时成模管下端端盖扣合形成底部，从成模管上端开口滴入包埋剂，并将样品垂直放入其中央，放入液氮凝固成模后，打开端盖，出模管锥端从成模管下端口插入将胶模推出。
3.一种利用权利要求1所述模具批量制备大型海藻(草)冰冻切片样品的简易方法，其特征在于：
以大型海藻腊叶标本或新鲜藻体为样本材料，制备切片样品，而后速冻定型；
将包埋计由模具的成模管上端开口处滴入，滴满后将定型后样品垂直放入其中央，而后将其放在液氮盒中速冻直至包埋剂冷冻为白色固体，取出置于室温条件下回温软化，打开端盖，出模管锥端从成模管下端口插入将胶模推出，再放在液氮盒中二次速冻，即获得切片样品。
4.按权利要求3所述的批量制备大型海藻(草)冰冻切片样品的简易方法，其特征在于：所述大型海藻(草)腊叶标本或新鲜藻体；其中，大型海藻(草)为大型红藻、绿藻、褐藻、大型蓝藻或海草。
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-
2019
- 2019-11-28 CN CN201911192318.3A patent/CN112857953A/zh active Pending
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