CN113418924A - 一种分析红藻细胞内的da分布与含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种分析红藻细胞内的DA分布与含量的方法，在分析DA分布中，将新鲜天然红藻组织进行固定，利用新急速冻结置换法制成切片，再加入DA抗体进行免疫组织化学染色，在显微镜下观察样品中的DA位置情况；在分析DA含量中，将处理后的混合物放入离心机，转速设定为3500rpm，离心16m i n，结束后取上清液。再进行一次重复试验，再次提取红藻中的软骨藻酸。把在之前的操作中提取出的上清液合并，用纯水定容到20mL后，然后用0.45um滤膜进行超过滤，所制成的试验液进行LC/MS检测，对所得数据进行分析统计处理。此方法最大限度的保留红藻内的DA及细胞内部结构，降低在处理过程中DA的流出量，可以更清晰的对其进行观察，所取得的效果更优于目前的其他方法。
Description
技术领域
本发明涉及生物化学领域，具体涉及一种分析红藻细胞内的DA分布与含量的方法。
背景技术
软骨藻酸作为海洋毒素的一类也是天然产物,人们在预防它的毒性同时,应充分利用其生物活性。软骨藻酸作为一种神经毒素，递质和阻断剂，在水产领域中对贝类直接产生危害，间接的影响着人类的生命健康，但同时研究实验也表明软骨藻酸对昆虫也有杀灭能力，其对蟑螂苍蝇的杀死效果不亚于r-BHC等，这些说明了DA在某些方面有一定的应用价值如作为驱虫剂的应用，或作为神经生理学研究的有用对象。当前，国内外很多研究者正继续深入地探讨DA相关特性和机制，以达到控制危害作用和利用相关生化特性的目的。
DA常用的检测方法主要有生物分析法、高效液相色谱法、酶联免疫分析法、毛细管电泳法等等。生物分析法灵敏度较低，选择性弱，因此应用有限。高效液相色谱法是目前官方指定的标准方法，该方法检测限低，灵敏度高，特异性强，应用广泛。高效液相色谱的检测器有紫外检测器、荧光检测器和质谱检测器，由于贝类提取液中干扰组分复杂，光度检测往往不能提供化合物的充分结构信息，因此会引起假阳性的结果，而质谱能提供化学物质的结构信息(LC/MS)，是一种高效的方法，能作为DA确证的分析方法。另外，在传统检测方法的基础上，近年来发展了许多新的检测方法，如神经受体结合检测技术、生物传感器法等，但目前应用范围不广，还存在一些缺陷，没有被广泛采用。
发明内容
鉴于现有技术中的上述缺陷或不足，期望提供一种分析红藻细胞内的DA分布与含量的方法。
根据本申请实施例提供的技术方案，一种分析红藻细胞内的DA分布方法，
包括以下步骤：
T1.将新鲜天然红藻组织进行固定，再用0.1％高酸缓冲液将固定好的红藻组织洗净，将洗净的红藻组织装入器皿中并加入冻结防止剂乙二醇，同时,添加液态氮冷却的异戊烷迅速将红藻组织冻结,然后将冻结后的红藻组织在丙酮内浸泡，并每间隔一段时间就将红藻组织取出在温度为-80℃、-20℃、4℃及室温的丙酮环境中进行轮流置换，形成红藻样品，
T2.在不同温度环境中处理后的所述红藻样品用丙酮、苯甲酸甲酯、硬化剂和树脂进行涂抹处理，使其聚合了一晚上，制成包埋试料，
T3.将包埋试料用膜片安装在刀刃上，将切片机的距离设置为5um的条件切薄，将其放置在滚动玻璃上，重复多次薄切树脂切片，得到优质切片，
T4.切片首先放在蒸馏水中浸泡15分钟，然后依次用流水和蒸馏水清洗，清洗后的切片要在0.5％的黄臭剂中浸泡5秒钟，再次用流水和蒸馏水清洗后，分别经过乙醇、丁醇和氧苯进行脱水和透视，得到样品；
T5.用显微镜对所述样品进行观察并记录好放大倍率拍摄图片。
一种分析红藻细胞内DA含量的方法，
包括以下步骤：
S1.称取2g步骤T1中制好的红藻样品，充分细剪后加入8mL纯水，混匀涡旋后放进沸腾的热水浴中加热5min，期间混匀2次，加热后放入冰水中冷却至室温，全程保证水溶液量不变。再将混合物放入远心分离仪，在3500r/min下离心16min，结束后用微细管收集上层清液，得到上清液a和原液a，
S2.将原a重复步骤S1的操作，得到上清液b，将上清液a和上清液b进行合并，合并后的上清液以纯水定容至20mL，再使用0.45μm滤膜进行超过滤，得到试验液；
S3.用液相质谱联用仪LC/MS法对步骤2中得到的试验液进行分析，得到红藻细胞内的DA含量。
综上所述，本申请的有益效果：
一、最大限度的保留红藻内的DA，降低在处理过程中DA的流出量；
二、在免疫组织化学染色中分析红藻细胞内DA的分布时，可以更清晰的对其进行观察，所取得的效果更优于目前的其他方法。
附图说明
通过阅读参照以下附图所作的对非限制性实施例所作的详细描述，本申请的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为一般方法即HE染色法的组织切片图；
图2为本发明处理后观察到的组织切片图；
图3为藻体内DA的细微分布图；
图4为藻体内DA量的测定结果图；
图5为藻体内DA量的测定结果图。
图中标号：
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本申请作进一步的详细说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释相关发明，而非对该发明的限定。另外还需要说明的是，为了便于描述，附图中仅示出了与发明相关的部分。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本申请。
一种分析红藻细胞内的DA分布方法，
一、选样
分别选择新鲜天然株的枝部分和根部分。
二、固定
要想让分离出组织和细胞保持正常的生理状态，就要让它在取出之后立刻死亡，防止出现病理变化影响最后的观察结果。固定不仅可以达到这种目的，还可以让细胞中的可溶性物质转变为不溶性物质，防止它们溶化和消失。固定的另一作用是固定剂会让组织发生一定的硬化，而有利于之后的处理，让这些细胞和组织易于染色。
固定剂的选择会影响到之后的各项操作，对最终的观察结果会造成直接影响，因此固定剂的选择很重要。良好的固定剂都会具有一些共同的特点，例如，可以很快地渗透到植物组织中去，将细胞中那些易溶解的物质转变成不溶物，从而让组织在之后的操作中维持原有的形状，可以提高细胞内含物的折光度、媒染、染色等能力，在一定程度上具有保存剂的作用。
三、快速冷冻
用0.1M酪酸缓冲液洗净固定好的红藻组织。在容器内缓慢加入冻结防止剂乙二醇时,添加了用液态氮冷却的异戊烷迅速冻结后,然后取出红藻组织，使其在-80℃,-20℃,4℃及室温的丙酮内置换，每次置换期间的时间间隔为5-10分钟左右。用丙酮、苯甲酸甲酯和树脂进行了中间剂处理，并在加入硬化剂的树脂上涂满在样本上，使其聚合了一晚上。
四、薄切
将包埋试料用膜片安装在刀刃上，将切片机的距离设置为5um的条件切薄，将其放置在滚动玻璃上。重复多次薄切树脂切片，最后选择效果最佳的切片进行下一步染色实验。
五、染色观察
切片首先放在苏木素溶液中浸泡15分钟，然后依次用流水和蒸馏水冲洗，洗净后的切片要在0.5％曙红液染色中浸泡5秒钟，再次用流水和蒸馏水冲洗后，分别经过不同浓度的乙醇、丁醇和二甲苯进行脱水晾干，滴上中性树胶，封片得到样品，用显微镜进行观察并记录好放大倍率拍摄图片。
六、免疫组织化学染色
组织切片首先放入10％的双氧水溶液中浸泡10分钟，滴下25％羊血清进行50分钟的封闭处理，用实验吸水纸吸干封闭液后加入第一次抗体DA(10mg/ml),充分混合反应60分钟，同时设置25％羊血清作为对照组。第一次抗体反应结束后进行清洗步骤，之后再加入第二次抗体(1μg/ml)，滴加时要让组织全部浸泡在第二次抗体溶液里50分钟，在此使用的发色试剂为Vina GreenTMChromogen(VGC)，发色后用蒸馏水洗净，封片得到样品，用显微镜进行观察并记录好放大倍率拍摄图片。
七、结果和考察
组织观察结果显示，如图2所示，与其他方法相比虽然树脂很难渗透到中心部位，但是浸透的部位都完好的保留着细胞结构，表明新快速冻结置换法优于目前其他的方法，更适合进行下一步的免疫组织化学染色，来更好的确定红藻细胞内DA分布情况。
而图1为一般方法即HE染色法的组织切片图。
免疫组织化学染色结果显示，由于藻体本身偏红褐色，而使用了发色剂为绿色的VGC后，如图3所示，细胞内的颗粒呈现了绿色状态，初步展现了藻体内DA的细微分布情况。
一种分析红藻细胞内DA含量的方法，
一、制样
称取2g从快速冻结中取得的红藻样品，充分细剪后加入8mL纯水，混匀涡旋后放进沸腾的热水浴中加热5min，期间混匀2次，加热后放入冰水中冷却至室温，全程保证水溶液量不变。再将混合物放入远心分离仪，转速设定为3500rpm，离心16min，结束后取上清液。再进行一次重复试验，再次提取红藻中的软骨藻酸。把在之前的操作中提取出的上清液合并，用纯水定容到20mL后，然后用0.45um滤膜进行超过滤，所制成的试验液进行LC/MS检测。对所得数据进行分析统计处理。
二、LC-MS分析
在用液质谱对取得的软骨藻酸混合液进行分析之前，要保证所取的样品满足仪器的测定条件。并将流动相的组成和流速设置到最佳状态，才能保证之后所测量出来的结果是准确的。
整个分析是通过使用ESI+进行荷质比分离离子的方法，在ZSprayTMMS检测器(ZMD)搭载的Alliance LC/MS系统(Waters)进行的。其中色谱柱子使用了Mightysil RP-18 GP(250×2.0毫米，关东化学有限公司)。移动相使用了1％醋酸和10％的乙腈，其流速为0.2ml/min。MS的检测是对[M+H]+准分子的m/z 312进行跟踪记录。DA标准品分别用1、5、10ppm，以此为基础绘制DA标准曲线，从而根据抽出比及稀释率计算得出了DA量，结果再进行统计处理。
三、结果
如图4和图5所示，固定前的藻类所含的DA量为3016mg/g，但在固定及洗涤后，它减少至285mg/g。在置换后455mg/g，最终在包装埋前为163mg/g。从这一点来看，在新快速冻结置换法中，虽然DA由于固定和冲洗大量流出，但是在包埋之前，在藻体内还残留有少量DA。
以上描述仅为本申请的较佳实施例以及对所运用技术原理等方案的说明。同时，本申请中所涉及的发明范围，并不限于上述技术特征的特定组合而成的技术方案，同时也应涵盖在不脱离所述发明构思的情况下，由上述技术特征或其等同特征进行任意组合而形成的其它技术方案。例如上述特征与本申请中公开的(但不限于)具有类似功能的技术特征进行互相替换而形成的技术方案。
Claims (2)
1.一种分析红藻细胞内的DA分布方法，其特征是，
包括以下步骤：
T1.将新鲜天然红藻组织投入预先配好的固定液中，再用0.1M酪酸缓冲液将固定好的红藻组织洗净，洗净后装入器皿中并缓慢加入冻结防止剂乙二醇，同时,添加用液态氮冷却的异戊烷迅速将红藻组织冻结,然后将冻结后的红藻组织在丙酮内浸泡，并分别在温度为-80℃、-20℃、4℃及室温的丙酮环境中将红藻组织轮流置换，形成红藻样品，
T2.在不同温度环境中处理后的所述红藻样品用丙酮、苯甲酸甲酯、硬化剂和树脂进行涂抹处理，使其聚合了一晚上，制成包埋试料，
T3.将包埋试料用膜片安装在刀刃上(C35)，将切片机的距离设置为5um的条件切薄，将其放置在滚动玻璃上，重复多次薄切树脂切片，得到优质切片，
T4.HE染色：切片首先放在苏木素溶液中浸泡15分钟，然后依次用流水和蒸馏水冲洗，洗净后的切片要在0.5％曙红液染色中浸泡5秒钟，再次用流水和蒸馏水冲洗后，分别经过不同浓度的乙醇、丁醇和二甲苯进行脱水晾干，滴上中性树胶，封片得到样品；
T5.用显微镜对所述样品进行观察并记录好放大倍率拍摄图片。
2.一种分析红藻细胞内DA含量的方法，其特征是，
包括以下步骤：
S1.称取2g步骤T1中制好的红藻样品，充分细剪后加入8mL纯水，混匀涡旋后放进沸腾的热水浴中加热5min，期间混匀2次，加热后放入冰水中冷却至室温，全程保证水溶液量不变。再将混合物放入远心分离仪，在3500r/min下离心16min，结束后用微细管收集上层清液，得到上清液a和原液a，
S2.将原a重复步骤S1的操作，得到上清液b，将上清液a和上清液b进行合并，合并后的上清液以纯水定容至20mL，再使用0.45μmADVANTEC滤膜进行超过滤，得到试验液；
S3.用LC/MS法对步骤2中得到的试验液进行分析，得到红藻细胞内的DA含量。
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