CN101975768A - 腹泻性贝类毒素检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种腹泻性贝类毒素检测方法，包括步骤：A)建立大田软海绵酸(okadaic acid，OA)诱导HL-7702肝细胞F-肌动蛋白(F-actin)解聚的标准曲线；B)根据HL-7702肝细胞的F-actin解聚的标准曲线进行OA浓度的计算，建立腹泻性贝类毒素的细胞F-actin检测方法，确定可能的检出限范围；C)选择与腹泻性贝类毒素可能共存的成分STX、DA、YTX中的一种或几种作用HL-7702肝细胞，通过检测其破坏HL-7702肝细胞F-actin聚合能力的大小确定该方法测定OA含量的特异性。本发明所述的检测方法，具有优点：(1)以细胞为实验对象，避免了实验动物的使用，符合3R原则；(2)灵敏度高；(3)特异性较好；(4)重复性好；(5)样品提取简便，基质效应低。
Description
技术领域
本发明属于生物检测方法领域，尤其是涉及一种有着较高灵敏度的腹泻性贝类毒素检测方法。
背景技术
当前，我国用于腹泻性贝类毒素(diarrhetic shellfish poisoning，DSP)的检测方法主要有小鼠生物法及酶联免疫吸附检测法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)。
小鼠生物法的检测原理：贝类样品用丙酮、乙醚提取后，经减压蒸干，以1％吐温-60生理盐水溶解后注射入小鼠腹腔，观察小鼠存活情况，计算其毒力。
ELISA的检测原理：测定的基础是抗原抗体反应，微孔板包被有针对大田软海绵酸(okadaic acid，OA)(DSP的主要成分)抗体的捕捉抗体，加入标准或样品溶液及OA酶标记物，游离OA与OA酶标记物竞争OA抗体，同时OA抗体与捕捉抗体连接。洗涤后，将底物和发色剂加入到孔中并且孵育。加入终止液后，在450nm波长下测定吸光度值。
小鼠生物法是当前我国腹泻性贝类毒素的标准检测方法，但其不足之处显而易见，如：(1)动物使用带来的伦理问题，受到动物保护组织的强烈反对；(2)灵敏度低，可比性和重复性差，检测结果与小鼠的品系、体重及状态等有关，难以形成统一的检测标准；(3)准确性差，该方法只能检测出毒力的大小，无法确定毒素的成分和含量，容易因高浓度的锌或不饱和脂肪酸的存在导致假阳性；(4)样品提取过程复杂。
ELISA法主要存在以下不足：(1)抗体往往只针对主要成分，其类似物可能会产生交叉反应，从而出现假阳性或对毒性的估计不准确；(2)单克隆抗体的制备困难，试剂盒价格昂贵；(3)我国目前尚无商品化ELISA试剂盒可售。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于细胞F-actin检测的腹泻性贝类毒素检测方法，解决现有技术存在的缺陷。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种腹泻性贝类毒素检测方法，包括步骤：
A)研究腹泻性贝类毒素的主要成分大田软海绵酸(OA)的细胞毒性效应，通过Cell Counting Kit-8试剂盒法、细胞形态学观察法及流式细胞术等方法，从细胞增殖、细胞凋亡等方面探讨腹泻性贝类毒素的主要成分大田软海绵酸(OA)对HL-7702肝细胞毒性效应；
B)利用荧光染料鬼笔环肽能结合F-actin聚合体的原理，根据OA作用HL-7702肝细胞的剂量-反应关系，选用不同浓度的OA染毒细胞，通过多功能酶标仪定量检测发现OA能明显破坏HL-7702肝细胞的F-actin的聚合，从而建立OA诱导HL-7702肝细胞F-actin解聚的标准曲线；
C)根据HL-7702肝细胞的F-actin解聚的标准曲线进行OA浓度的计算，初步建立腹泻性贝类毒素的细胞F-actin检测法，确定可能的检出限范围；
D)选择与腹泻性贝类毒素可能共存的三种成分：麻痹性贝类毒素的主要成分石房蛤毒素(saxitoxin，STX)、遗忘性贝类毒素的主要成分软骨藻酸(domoic acid，DA)、虾夷扇贝毒素(yessotoxin，YTX)中的一种或者几种，分别以不同浓度(5、10、20、40、80、160nmol/L)作用HL-7702肝细胞，通过检测其破坏HL-7702肝细胞F-actin聚合能力的大小确定该方法测定OA含量的特异性；
E)同步使用小鼠生物法、ELISA法及细胞F-actin检测法对采集的贝类样品分别进行腹泻性贝类毒素的检测，并进行结果比对，确定细胞F-actin检测法开展贝类样品检测的实用性；
F)对检测样品加标回收。
更优的是：
所述步骤A)包括：
A1)待细胞生长至70-80％汇合度，用0.125-0.25％胰蛋白酶-EDTA消化收集细胞，离心后重悬使其密度达3-5×105个/mL，接种1-2mL细胞悬液于事先铺盖玻片的6孔板中，置于培养箱中培养；培养24h后，弃去培养基，分别使用5、10、20nmol/L OA染毒HL-7702肝细胞，并设甲醇对照；OA染毒24h后，PBS洗涤2-3次，使用Oregon
514phalloidin荧光标记后，通过激光共聚焦显微镜进行观察荧光标记的F-actin；
A2)利用TECAN Infiite M1000多功能酶标仪定量检测OA作用细胞后F-actin解聚效应大小，建立OA诱导HL-7702肝细胞F-actin解聚的标准曲线。
所述的步骤A1)染色包括：
A11)加入400-500μL3.7％甲醛溶液固定10min；
A12)PBS洗涤2-3次，加入600-800μL 0.1％Triton X-100透化4-5min；
A13)PBS洗涤2-3次，加入PBS稀释的Oregon514phalloidin储液，避光染色15-20min；
A14)PBS洗涤2-3次，将6孔板中的盖玻片取出倒扣于滴甘油封存液的载玻片上。
更优的是：所述的步骤A1)染色包括：
A11)加入400-500μL3.7％甲醛溶液固定10min；
A12)PBS洗涤2-3次，加入600-800μL0.1％Triton X-100透化4-5min；
A13)PBS洗涤2-3次，加入PBS稀释的Oregon
514phalloidin储液，避光染色15-20min；
A14)PBS洗涤2-3次，将6孔板中的盖玻片取出倒扣于滴甘油封存液的载玻片上。
更优的是：所述步骤A2)OA诱导HL-7702肝细胞F-actin解聚的标准曲线：
A21)待细胞生长至70-80％汇合度，用0.125-0.25％胰蛋白酶-EDTA消化收集细胞，离心后重悬使其密度达3-5×104个/mL，接种80-100μL细胞悬液于96孔黑板中，置于培养箱中培养；
A22)培养24h后，弃去培养基，分别使用1.25、2.5、5、10、20、40、80nmol/L OA染毒HL-7702肝细胞，同时设甲醇对照和空白对照，各试验组设6个复孔；
A23)OA染毒24h后，PBS洗涤2-3次，对其进行染色，使用TECAN InfiniteM1000多功能酶标仪进行激发波长和发射波长的3D扫描；
A24)可信区内选择最大相对荧光单位值对应的波长即为最佳激发波长和最佳发射波长，分别为Ex＝511nm，Em＝529nm；最佳激发波长和最佳发射波长条件下，进行荧光强度的扫描；
A25)以OA浓度为横坐标，解聚率为纵坐标，建立半对数坐标，建立OA诱导HL-7702肝细胞F-actin解聚的标准曲线。
更优的是：所述的步骤B)中，使用甲醇溶剂进行贝类样品的提取时甲醇的浓度为1-4％。
本发明与现有技术相比，存在如下优点和有益效果：
本发明建立的细胞F-actin检测法与小鼠生物法相比：
(1)以细胞为实验对象，避免了实验动物的使用，符合3R原则；(2)灵敏度高；(3)特异性较好；(4)重复性好；(5)样品提取简便，基质效应低。
本发明建立的细胞F-actin检测法与ELISA法相比：
(1)不存在抗体的交叉反应性，特异性较好；(2)检测限达到2.01μg/100g，低于ELISA法的检测限(10μg/100g)，灵敏度更高。
附图说明
图1为本发明实施例中不同浓度OA处理HL-7702肝细胞的激光共聚焦显微镜扫描结果；图1-a为对照；图1-b为5nmol/L；图1-c为10nmol/L；图1-d为20nmol/L；
图2为本发明实施例中OA诱导HL-7702肝细胞F-actin解聚的标准曲线；
图3为本发明实施例中其他三种贝类毒素对HL-7702肝细胞F-actin检测法的影响示意图；
图4为本发明实施例中甲醇对HL-7702肝细胞F-actin检测法的影响。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明
实施例1建立OA诱导HL-7702肝细胞F-actin解聚的标准曲线
本实施例以HL-7702肝细胞为研究对象，使用OA标准品进行DSP细胞检测方法的研究。
使用Oregon
514phalloidin荧光标记F-actin后，使用激光共聚焦显微镜进行观察。
实验方法：
待细胞生长至80％汇合度，0.25％胰蛋白酶-EDTA消化收集细胞，离心后重悬(密度为5×105个/mL)，接种2mL细胞悬液于事先铺盖玻片的6孔板中，置于培养箱中培养。培养24h后，弃去培养基，分别使用5、10、20nmol/L OA染毒HL-7702肝细胞，设甲醇对照。OA染毒24h后，PBS洗涤2次，参照Phallotoxins(Cat.No.O7465)的方法进行染色。
主要步骤为：
(1)加入400μL3.7％甲醛溶液固定10min；
(2)PBS洗涤2次，加入800μL0.1％Triton X-100透化4min；
(3)PBS洗涤2次，加入490μLPBS及10μLOregon
514phalloidin储液，避光染色20min；
(4)PBS洗涤2次，将6孔板中的盖玻片取出倒扣于滴90％甘油封存液的载玻片上，使用激光共聚焦显微镜进行观察并成像。
结果如图1所示，Oregon
514phalloidin荧光标记的F-actin呈纤维状，各试验组细胞均有纤维状物质能显示绿色荧光，但试验组细胞随着OA浓度的增加，绿色荧光强度明显减弱。由于Oregon
514phalloidin仅与聚合态的F-actin特异性结合，因此在OA的作用下，细胞F-actin存在解聚现象。
利用TECAN Infiite M1000多功能酶标仪定量检测OA作用细胞后F-actin解聚效应大小，建立用于检测DSP的细胞F-actin检测法。
实验方法：
待细胞生长至80％汇合度，0.25％胰蛋白酶-EDTA消化收集细胞，离心后重悬(密度为5×104个/mL)，接种100μL细胞悬液于96孔黑板中，置于培养箱中培养。培养24h后，弃去培养基，分别使用1.25、2.5、5、10、20、40、80nmol/L OA染毒HL-7702肝细胞，同时设甲醇对照和空白对照，各试验组为6个复孔。OA染毒24h后，PBS洗涤2次，参照Phallotoxins(Cat.No.O7456)的方法进行染色。主要步骤为：
(1)加入100μL3.7％甲醛溶液固定10min；
(2)PBS洗涤2次，加入200μL0.1％Triton X-100透化4min；
(3)PBS洗涤2次，加入95μLPBS及5μL Oregon
514phalloidin储液，避光染色20min；
(4)PBS洗涤2次，TECAN Infinite M1000多功能酶标仪进行激发波长和发射波长的3D扫描；
(5)最佳激发波长和最佳发射波长条件下，进行荧光强度的扫描。
实验结果：
TECAN Infinite M1000多功能酶标仪进行激发波长和发射波长的3D扫描，可信区内选择最大相对荧光单位值对应的波长即为最佳激发波长和最佳发射波长(Ex＝511nm，Em＝529nm)。以OA浓度为横坐标，解聚率为纵坐标，建立半对数坐标，如图2所示。从图中可看出，OA可明显导致HL-7702细胞F-actin的解聚，且解聚率与OA浓度在2.5～40nM范围内具有线性关系(R2＝0.993)。SPSS 13.0统计学软件进行单因素方差分析，OA浓度低至1.25nM时，与对照组相比，差异不具有统计学意义(P＞0.05)。
表1不同浓度OA对荧光强度值的影响
| 1.25nM | 2.5nM | 5nM | 10nM | 20nM | 40nM | 对照 | 空白 |
| 37902 | 34798 | 30774 | 18204 | 11208 | 4396.3 | 38772 | 1130.2 |
| 36535 | 37109 | 27804 | 20262 | 8953.3 | 3847.4 | 37749 | 1178.9 |
| 40183 | 36100 | 28348 | 19738 | 9739.5 | 3958.9 | 38721 | 1158.7 |
| 36480 | 30634 | 27662 | 21521 | 10363.9 | 4032.1 | 39226 | 1244.3 |
| 38021 | 35815 | 26994 | 16246 | 7511.4 | 3355.8 | 39566 | 1165.9 |
| 39083 | 35096 | 27663 | 14972 | 9330 | 3421.8 | 36879 | 1122.5 |
R2＝0.993说明线性关系良好，可以通过测定荧光强度值并计算解聚率，对2.5～40nM范围内的OA进行定量检测(浓度超过40nM时，需先进行稀释)。
实施例2腹泻性贝类毒素检测
选择麻痹性贝类毒素的主要成分STX、遗忘性贝类毒素的主要成分DA及YTX，分别以不同浓度(5、10、20、40、80、160nmol/L)作用HL-7702肝细胞(实验方法同实施例1)，进行荧光检测法的特异性检测。以STX、DA及YTX的不同浓度为横坐标，各处理组荧光强度为纵坐标，如图3所示，图3说明可能与腹泻性贝类毒素混存的其他贝类毒素不会造成细胞F-actin的解聚，不会对腹泻性贝类毒素造成干扰。SPSS 13.0统计学软件进行单因素方差分析，在5～160nM范围内，STX、DA及YTX的荧光强度值与对照组相比，差异均不具有统计学意义(P＞0.05)。
表2其他三种贝类毒素对荧光强度值的影响
| 5nM | 10nM | 20nM | 40nM | 80nM | 160nM | control | |
| STX | 39853 | 38283 | 38497 | 40180 | 35735 | 37420 | 36918 |
| 37459 | 39387 | 38463 | 37762 | 39399 | 39459 | 39356 | |
| 40498 | 36401 | 40610 | 38493 | 34303 | 39889 | 40621 | |
| DA | 41106 | 38990 | 42204 | 37949 | 38516 | 39349 | blank |
| 35867 | 37255 | 38182 | 36171 | 39673 | 39895 | 1162.3 | |
| 36488 | 41632 | 37616 | 37166 | 35186 | 37433 | 1476.4 | |
| YTX | 36352 | 38322 | 40403 | 38192 | 37446 | 40176 | 1472.9 |
| 38284 | 38657 | 39494 | 40063 | 37889 | 39173 | ||
| 38838 | 41138 | 37974 | 36126 | 36386 | 36671 |
实施例3细胞F-actin检测法的重复性实验
对6份贝类样品重复进行3次检测，计算解聚率，对应细胞F-actin检测法标准曲线进行OA浓度的计算，结果如表3所示，变异系数为3.18％～14.12％，平均变异系数为7.97％。
表3细胞F-actin检测法的重复性
表3说明细胞F-actin检测法进行贝类样品的检测具有良好的稳定性，重复性好。
实施例4细胞F-actin检测法的样品加标回收率实验
设置3个加标浓度(2.5、5、10nM)，经甲醇提取、氮气吹干后检测荧光强度，计算OA浓度和样品加标回收率。如表4所示，样品原始浓度为3.39nM，样品加标(2.5、5、10nM)回收率分别为95.66％、92.76％、96.49％，平均加标回收率为94.97％。
表4样品加标回收率
表4说明细胞F-actin检测法的毒素提取效率较高，基质效应小。
实施例5甲醇对细胞F-actin检测法的影响
细胞F-actin检测法使用甲醇溶剂进行贝类样品的提取，所以需要考虑甲醇对荧光检测法的影响。SPSS 13.0统计学软件进行单因素方差分析，甲醇浓度达到6％(v/v)时，荧光强度值才与对照组相比差异显著(P＜0.01)。甲醇浓度为4％时，荧光强度值与对照组的差异不显著(P＞0.05)，见图4，结果说明4％以下的甲醇不会对细胞F-actin检测法造成干扰。
表5不同浓度甲醇对荧光强度值的影响
| 对照 | 1％ | 2％ | 4％ | 6％ | 8％ | 10％ | 空白 |
| 39893 | 38026 | 40076 | 36289 | 35982 | 29312 | 27260 | 1311 |
| 37798 | 40108 | 39926 | 38756 | 35120 | 24720 | 26886 | 1259 |
| 40582 | 40357 | 38174 | 38959 | 30518 | 27819 | 23167 | 1343 |
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种腹泻性贝类毒素检测方法，包括步骤：
A)培养人HL-7702肝细胞，选用不同浓度的大田软海绵酸(okadaic acid，OA)染毒细胞，检测OA作用细胞后F-肌动蛋白(F-actin)解聚效应大小，从而建立OA诱导HL-7702肝细胞F-actin解聚的标准曲线；
B)根据HL-7702肝细胞的F-actin解聚的标准曲线进行OA浓度的计算，建立腹泻性贝类毒素的细胞F-actin检测方法，确定可能的检出限范围；
C)选择与腹泻性贝类毒素可能共存的成分：石房蛤毒素(saxitoxin，STX)、软骨藻酸(domoic acid，DA)、虾夷扇贝毒素(yessotoxin，YTX)中的一种或几种，分别以不同浓度作用HL-7702肝细胞，通过检测其破坏HL-7702肝细胞F-actin聚合能力的大小确定该方法测定OA含量的特异性。
2.如权利要求1所述的腹泻性贝类毒素检测检测方法，还包括步骤：
D)同步使用小鼠生物法、ELISA法及细胞F-actin检测法对采集的贝类样品分别进行腹泻性贝类毒素检测，并进行结果比对；
F)对检测样品加标回收。
3.如权利要求1或者2所述的腹泻性贝类毒素检测方法，其特征是：所述步骤C)选用不同浓度石房蛤毒素(saxitoxin，STX)、(domoic acid，DA)、虾夷扇贝毒素(yessotoxin，YTX)中的一种或几种浓度分别为：5、10、20、40、80、160nmol/L。
4.如权利要求1～3任一项所述的腹泻性贝类毒素检测方法，其特征是：
所述步骤A)包括：
A1)待细胞生长至70-80％汇合度，用0.125-0.25％胰蛋白酶-EDTA消化收集细胞，离心后重悬使其密度达3-5×105个/mL，接种1-2mL细胞悬液于事先铺盖玻片的6孔板中，置于培养箱中培养；培养18-24h后，弃去培养基，分别使用5、10、20nmol/L OA染毒HL-7702肝细胞，并设甲醇对照；OA染毒18-24h后，PBS洗涤2-3次，使用Oregon
514phalloidin荧光标记后，通过激光共聚焦显微镜观察荧光标记的F-actin；
A2)利用TECAN Infiite M1000多功能酶标仪定量检测OA作用细胞后F-actin解聚效应大小，建立OA诱导HL-7702肝细胞F-actin解聚的标准曲线。
5.如权利要求4所述的腹泻性贝类毒素检测方法，其特征是：所述的步骤A1)染色包括：
A11)加入400-500μL3.7％甲醛溶液固定10min；
A12)PBS洗涤2-3次，加入600-800μL0.1％Triton X-100透化4-5min；
A13)PBS洗涤2-3次，加入PBS稀释的Oregon
514phalloidin储液，避光染色15-20min；
A14)PBS洗涤2-3次，将6孔板中的盖玻片取出倒扣于滴甘油封存液的载玻片上。
6.如权利要求4所述的腹泻性贝类毒素检测方法，其特征是：所述步骤A2)OA诱导HL-7702肝细胞F-actin解聚的标准曲线：
A21)待细胞生长至70-80％汇合度，用0.125-0.25％胰蛋白酶-EDTA消化收集细胞，离心后重悬使其密度达3-5×104个/mL，接种80-100μL细胞悬液于96孔黑板中，置于培养箱中培养；
A22)培养24h后，弃去培养基，分别使用1.25、2.5、5、10、20、40、80nmol/L OA染毒HL-7702肝细胞，同时设甲醇对照和空白对照，各试验组设6个复孔；
A23)OA染毒24h后，PBS洗涤2-3次，对其进行染色，使用TECAN InfiniteM1000多功能酶标仪进行激发波长和发射波长的3D扫描；
A24)可信区内选择最大相对荧光单位值对应的波长即为最佳激发波长和最佳发射波长，分别为Ex＝511nm，Em＝529nm；最佳激发波长和最佳发射波长条件下，进行荧光强度的扫描；
A25)以OA浓度为横坐标，解聚率为纵坐标，建立半对数坐标，建立OA诱导HL-7702肝细胞F-actin解聚的标准曲线。
7.如权利要求1或者2所述的腹泻性贝类毒素检测方法，其特征是：使用甲醇溶剂进行贝类样品的提取，所述甲醇的浓度为1-4％。
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