CN104777299A - 基于图像分析的贝类腹泻性毒素的高通量检测装置及方法 - Google Patents

基于图像分析的贝类腹泻性毒素的高通量检测装置及方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于图像分析的贝类腹泻性毒素的高通量检测装置及方法，该装置包括：电源适配器、广角镜头、智能移动设备、第一暗室、第二暗室、商用试剂检测板、检测板装载台和冷光片。该方法首先制备贝类腹泻性毒素待测样品溶液；然后配置标准品溶液，使用商用试剂盒准备待测检测板；之后通过检测图像采集分析，计算检测板孔子图像RGB空间中R分量的颜色比率值CR，再通过最小二乘法拟合出商用试剂盒检测贝类腹泻性毒素的标定曲线；通过分析待测样品溶液孔子图像CR值，带入标定曲线，进而计算出待测样品溶液贝类腹泻性毒素浓度。本发明实现了贝类腹泻性毒素的高通量定量检测，具有操作步骤简单，成本低廉，能够适应现场检测等优点。

Description

基于图像分析的贝类腹泻性毒素的高通量检测装置及方法
技术领域
本发明涉及一种高通量同时检测贝类腹泻性毒素的检测装置及技术，尤其涉及基于图像分析的贝类腹泻性毒素的高通量检测装置及方法。
背景技术
贝类腹泻性毒素是贝类从浮游藻类中聚集的有害有机物质存于体内蓄积而成，是一类毒性很强的非蛋白毒素，食用后能使人中毒，甚至死亡。目前国内贝类腹泻性毒素检测方法通常使用方法是小鼠生物检测法，液相色谱质谱联用方法和传统的Elisa试剂盒检测方法。小鼠生物检测法个体差异性大导致毒性难以估计，液相色谱质谱联用方法操作繁琐并且设备庞大，无法适应现场检测要求。传统的Elisa试剂盒检测方法所采用的检测仪器为酶标仪，依旧存在着设备庞大而无法适应现场检测，并且酶联反应随着孵化时间的不同存在差异，酶标仪采用的分时检测的方式便造成了孔间检测结果的差异。因此，海洋水产品毒素检测领域迫切需要一种能够适应现场快速检测、操作简便并且检测成本低廉的贝类腹泻性毒素检测装置及方法。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种基于图像分析的贝类腹泻性毒素的高通量检测装置及方法。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种基于图像分析的贝类腹泻性毒素的高通量检测装置，该装置包括：电源适配器、广角镜头、智能移动设备、第一暗室、第二暗室、商用试剂盒96孔检测板、96孔检测板装载台和冷光片；其中，第二暗室通过隔板分为放置电源适配器的空间和检测空间；所述检测空间中具有可抽拉的96孔检测板装载台，商用试剂盒96孔检测板通过卡槽固定在96孔检测板装载台顶部，冷光片通过卡槽固定在96孔检测板装载台底部；电源适配器和冷光片连接；第一暗室通过透光隔板连接第二暗室的检测空间；在第一暗室的顶部开有圆孔，广角镜头固定第一暗室顶部的圆孔正下方；智能移动设备通过卡槽固定在第一暗室顶部外侧，且其摄像头可通过第一暗室的圆孔透过广角镜头，对第二暗室内的商用试剂盒96孔检测板进行图像采集。
一种基于图像分析的贝类腹泻性毒素的高通量检测方法，该方法包括以下步骤：
（1）样品前处理，制备贝类腹泻性毒素待测样品溶液，包括以下子步骤：
（1.1）取贝类生物，除去贝壳，用双蒸水洗净贝肉后均质器均质；
（1.2）称取1 g 均质后的样品加入6 ml体积浓度为 80%的甲醇水溶液，得到混合溶液；
（1.3）在4 ℃下，将步骤1.2得到的混合溶液以3500 r/min离心10分钟，收集上清液；
（1.4）在步骤（1.3）残留的贝肉组织中加2 ml 体积浓度为80%的甲醇水溶液，在4 ℃下，以3500 r/min离心10分钟，收集上清液，加入到步骤（1.3）收集的上清液中；
（1.5）重复步骤（1.4），待收集的上清液达到10 ml时，用0.45 um的滤膜过滤，得到滤液；
（1.6）取20ul滤液，用样品稀释缓冲液PBS稀释到1 ml，然后取100 ul作为待测样品溶液；
（2）使用商用试剂盒96孔检测板进行检测，具体包括以下子步骤：
（2.1）将HRP酶标记物，OA抗体溶液及0 ppb、0.2 ppb、0.5 ppb、1 ppb、2 ppb、5 ppb的贝类腹泻性毒素标准品置于室温20-28 ℃下，从铝箔袋中取出微孔条；
（2.2）分别取100 ul的浓度为0 ppb，0.2 ppb，0.5 ppb，1 ppb，2 ppb，5 ppb的标准品依次加到微孔条的微孔中；
（2.3）将步骤（1）得到的待测样品溶液加到微孔条的其余微孔中；
（2.4）吸取50 ulHRP酶标记物到微孔条的每个微孔中，然后加入50 ulOA抗体溶液到每个微孔中，混匀，在20-28 ℃下孵育60分钟；
（2.5）孵育完后，将微孔中的溶液倒入水槽中，用配好的洗板缓冲液清洗，每个微孔至少加入250 ul洗板缓冲液，震荡后倒掉并倒置在吸水纸上拍打，重复三至四次；所述洗板缓冲液为含有质量浓度为0.05% 的Tween-20的PBS溶液；
（2.6）在每个微孔中加入100 ul底物溶液，在20-28 ℃下避光孵育30分钟，此时准备好商用试剂盒96孔检测板；所述底物溶液为TMB溶液；
（3）确定商用试剂盒检测贝类腹泻性毒素的标定曲线：将步骤（2）中准备好的商用试剂盒96孔检测板放置在96孔检测板装载台上，96孔检测板装载台推入第二暗室，然后智能移动设备采集商用试剂盒96孔检测板的图像进行检测，对采集的图像进行处理，处理过程包括以下子步骤：
（3.1）切割出96孔检测板上的微孔所对应的子图像，子图像的孔内像素范围为10×10；
（3.2）将子图像转换至颜色孔间RGB，提取子图像中每个像素的R分量，并计算子图像像素R分量平均值；
（3.3）计算标准品溶液颜色比率CR，根据公式                                                ，其中，Ck为0.2 ppb，0.5 ppb，1 ppb，2 ppb，5 ppb的标准品孔的子图像R分量平均值，C0为0 ppb的标准品孔的子图像R分量平均值；
（3.4）根据最小二乘法拟合曲线算法，拟合出颜色比率CR关于标准品浓度以10为底的对数的标定曲线，即商用试剂盒检测贝类腹泻性毒素的标定曲线；
（4）检测未知浓度的样品溶液贝类腹泻性毒素浓度：将步骤（1）得到的待测样品溶液加入到商用试剂盒96孔检测板的微孔中，重复步骤（2.4）-步骤（3.2），得到在该待测样品溶液浓度下的子图像的Ｒ分量平均值，然后根据步骤（3.3）的公式计算待测样品溶液的CR值，带入步骤（3.4）得到的商用试剂盒检测贝类腹泻性毒素的标定曲线，计算出待测样品溶液贝类腹泻性毒素的浓度，根据步骤（1）的稀释倍数，即可得到1 ml待测样品溶液的贝类腹泻性毒素。
本发明的有益效果是：本发明实现了贝类腹泻性毒素现场快速检测，具有快速、同步、操作简便、成本低廉和能够适应现场检测等优点。本发明较现有的贝类腹泻性毒素检测方法上，具有操作步骤简单，成本低廉，高通量同时快速检测等优点，克服现有方法无法现场检测的不足。根据以上优点，本发明的装置及方法可广泛用于海洋水产品毒素检测的相关领域。
附图说明
图1是本发明贝类腹泻性毒素的高通量检测装置整体结构图；
图2是本发明所使用的商用试剂盒96孔检测板结构图；
图3是本发明检测贝类腹泻性毒素算法流程图；
图4是本发明与酶标仪检测贝类腹泻性毒素标定结果对比图；
图中，电源适配器1、广角镜头2、智能移动设备3、暗室顶部4、暗室底座5、商用试剂盒96孔检测板6、96孔检测板装载台7、冷光片8。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细描述，但并不是限制本发明。
如图1、2所示，本发明基于图像分析的贝类腹泻性毒素的高通量检测装置，包括：电源适配器1、广角镜头2、智能移动设备3、第一暗室4、第二暗室5、商用试剂盒96孔检测板6、96孔检测板装载台7和冷光片8；其中，第二暗室5通过隔板分为放置电源适配器1的空间和检测空间；所述检测空间中具有可抽拉的96孔检测板装载台7，商用试剂盒96孔检测板6通过卡槽固定在96孔检测板装载台7顶部，冷光片8通过卡槽固定在96孔检测板装载台7底部；电源适配器1和冷光片8连接；第一暗室4通过透光隔板连接第二暗室的检测空间；在第一暗室4的顶部开有圆孔，广角镜头2固定第一暗室4顶部的圆孔正下方；智能移动设备3通过卡槽固定在第一暗室4顶部外侧，且其摄像头可通过第一暗室4的圆孔透过广角镜头2，对第二暗室5内的试剂盒96孔检测板6进行图像采集。
一种应用上述装置检测贝类腹泻性毒素的方法，包括以下步骤：
（1）样品前处理，制备贝类腹泻性毒素待测样品溶液，包括以下子步骤：
（1.1）取贝类生物，除去贝壳，用双蒸水洗净贝肉后均质器均质；
（1.2）称取1 g 均质后的样品加入6 ml体积浓度为 80%的甲醇水溶液，得到混合溶液；
（1.3）在4 ℃下，将步骤（1.2）得到的混合溶液以3500 r/min离心10分钟，收集上清液；
（1.4）在步骤（1.3）残留的贝肉组织中加2 ml 体积浓度为80%的甲醇水溶液，在4 ℃下，以3500 r/min离心10分钟，收集上清液，加入到步骤（1.3）收集的上清液中；
（1.5）重复步骤（1.4），待收集的上清液达到10 ml时，用0.45 um的滤膜过滤，得到滤液；
（1.6）取20ul滤液，用样品稀释缓冲液PBS稀释到1 ml，然后取100 ul作为待测样品溶液；
（2）使用商用试剂盒96孔检测板6进行检测，具体包括以下子步骤：
（2.1）将HRP酶标记物，OA抗体溶液及0 ppb、0.2 ppb、0.5 ppb、1 ppb、2 ppb、5 ppb的贝类腹泻性毒素标准品置于室温20-28 ℃下，从铝箔袋中取出微孔条；
（2.2）分别取100 ul的浓度为0 ppb，0.2 ppb，0.5 ppb，1 ppb，2 ppb，5 ppb的标准品依次加到微孔条的微孔中；
（2.3）将步骤（1）得到的待测样品溶液加到微孔条的其余微孔中；
（2.4）吸取50 ulHRP酶标记物到微孔条的每个微孔中，然后加入50 ulOA抗体溶液到每个微孔中，混匀，在20-28 ℃下孵育60分钟；
（2.5）孵育完后，将微孔中的溶液倒入水槽中，用配好的洗板缓冲液清洗，每个微孔至少加入250 ul洗板缓冲液，震荡后倒掉并倒置在吸水纸上拍打，重复三至四次；所述洗板缓冲液为含有质量浓度为0.05% 的Tween-20的PBS溶液；
（2.6）在每个微孔中加入100 ul底物溶液，在20-28 ℃下避光孵育30分钟，此时准备好商用试剂盒96孔检测板6；所述底物溶液为TMB溶液；
（3）确定商用试剂盒检测贝类腹泻性毒素的标定曲线：将步骤（2）中准备好的商用试剂盒96孔检测板6放置在96孔检测板装载台7上，96孔检测板装载台7推入第二暗室5，然后智能移动设备3采集商用试剂盒96孔检测板6的图像进行检测，对采集的图像进行处理，处理算法如图3所示，处理过程包括以下子步骤：
（3.1）切割出96孔检测板6上的微孔所对应的子图像，子图像的孔内像素范围为10×10；
（3.2）将子图像转换至颜色孔间RGB，提取子图像中每个像素的R分量，并计算子图像像素R分量平均值；
（3.3）计算标准品溶液颜色比率CR，根据公式，其中，Ck为0.2 ppb，0.5 ppb，1 ppb，2 ppb，5 ppb的标准品孔的子图像R分量平均值，C0为0 ppb的标准品孔的子图像R分量平均值；
（3.4）根据最小二乘法拟合曲线算法，拟合出颜色比率CR关于标准品浓度以10为底的对数的标定曲线，即商用试剂盒检测贝类腹泻性毒素的标定曲线；
（4）检测未知浓度的样品溶液贝类腹泻性毒素浓度：将步骤（1）得到的待测样品溶液加入到商用试剂盒96孔检测板6的微孔中，重复步骤（2.4）-步骤（3.2），得到在该待测样品溶液浓度下的子图像的Ｒ分量平均值，然后根据步骤（3.3）的公式计算待测样品溶液的CR值，带入步骤（3.4）得到的商用试剂盒检测贝类腹泻性毒素的标定曲线，计算出待测样品溶液贝类腹泻性毒素的浓度，根据步骤（1）的稀释倍数，即可得到1 ml待测样品溶液的贝类腹泻性毒素。
图4为本发明方法与酶标仪检测贝类腹泻性毒素标定结果对比图，从图中可以看出，本发明方法的标定曲线公式为，CR为颜色比率，C为待测样品腹泻性毒素浓度。实验结果证明本发明方法能够准确检测贝类腹泻性毒素。

Claims (2)

1.一种基于图像分析的贝类腹泻性毒素的高通量检测装置，其特征在于，该装置包括：电源适配器（1）、广角镜头（2）、智能移动设备（3）、第一暗室（4）、第二暗室（5）、商用试剂盒96孔检测板（6）、96孔检测板装载台（7）和冷光片（8）；其中，第二暗室（5）通过隔板分为放置电源适配器（1）的空间和检测空间；所述检测空间中具有可抽拉的96孔检测板装载台（7），商用试剂盒96孔检测板（6）通过卡槽固定在96孔检测板装载台（7）顶部，冷光片（8）通过卡槽固定在96孔检测板装载台（7）底部；电源适配器（1）和冷光片（8）连接；第一暗室（4）通过透光隔板连接第二暗室的检测空间；在第一暗室（4）的顶部开有圆孔，广角镜头（2）固定第一暗室（4）顶部的圆孔正下方；智能移动设备（3）通过卡槽固定在第一暗室（4）顶部外侧，且其摄像头可通过第一暗室（4）的圆孔透过广角镜头（2），对第二暗室（5）内的商用试剂盒96孔检测板（6）进行图像采集。
2.一种应用权利要求1所述装置检测贝类腹泻性毒素的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
（1）样品前处理，制备贝类腹泻性毒素待测样品溶液，包括以下子步骤：
（1.1）取贝类生物，除去贝壳，用双蒸水洗净贝肉后均质器均质；
（1.2）称取1 g 均质后的样品加入6 ml体积浓度为 80%的甲醇水溶液，得到混合溶液；
（1.3）在4 ℃下，将步骤（1.2）得到的混合溶液以3500 r/min离心10分钟，收集上清液；
（1.4）在步骤（1.3）残留的贝肉组织中加2 ml 体积浓度为80%的甲醇水溶液，在4 ℃下，以3500 r/min离心10分钟，收集上清液，加入到步骤（1.3）收集的上清液中；
（1.5）重复步骤（1.4），待收集的上清液达到10 ml时，用0.45 um的滤膜过滤，得到滤液；
（1.6）取20ul滤液，用样品稀释缓冲液PBS稀释到1 ml，然后取100 ul作为待测样品溶液；
（2）使用商用试剂盒96孔检测板（6）进行检测，具体包括以下子步骤：
（2.1）将HRP酶标记物，OA抗体溶液及0 ppb、0.2 ppb、0.5 ppb、1 ppb、2 ppb、5 ppb的贝类腹泻性毒素标准品置于室温20-28 ℃下，从铝箔袋中取出微孔条；
（2.2）分别取100 ul的浓度为0 ppb，0.2 ppb，0.5 ppb，1 ppb，2 ppb，5 ppb的标准品依次加到微孔条的微孔中；
（2.3）将步骤（1）得到的待测样品溶液加到微孔条的其余微孔中；
（2.4）吸取50 ulHRP酶标记物到微孔条的每个微孔中，然后加入50 ulOA抗体溶液到每个微孔中，混匀，在20-28 ℃下孵育60分钟；
（2.5）孵育完后，将微孔中的溶液倒入水槽中，用配好的洗板缓冲液清洗，每个微孔至少加入250 ul洗板缓冲液，震荡后倒掉并倒置在吸水纸上拍打，重复三至四次；所述洗板缓冲液为含有质量浓度为0.05% 的Tween-20的PBS溶液；
（2.6）在每个微孔中加入100 ul底物溶液，在20-28 ℃下避光孵育30分钟，此时准备好商用试剂盒96孔检测板（6）；所述底物溶液为TMB溶液；
（3）确定商用试剂盒检测贝类腹泻性毒素的标定曲线：将步骤（2）中准备好的商用试剂盒96孔检测板（6）放置在96孔检测板装载台（7）上，96孔检测板装载台（7）推入第二暗室（5），然后智能移动设备（3）采集商用试剂盒96孔检测板（6）的图像进行检测，对采集的图像进行处理，处理过程包括以下子步骤：
（3.1）切割出96孔检测板（6）上的微孔所对应的子图像，子图像的孔内像素范围为10×10；
（3.2）将子图像转换至颜色孔间RGB，提取子图像中每个像素的R分量，并计算子图像像素R分量平均值；
（3.3）计算标准品溶液颜色比率CR，根据公式                                                ，其中，Ck为0.2 ppb，0.5 ppb，1 ppb，2 ppb，5 ppb的标准品孔的子图像R分量平均值，C0为0 ppb的标准品孔的子图像R分量平均值；
（3.4）根据最小二乘法拟合曲线算法，拟合出颜色比率CR关于标准品浓度以10为底的对数的标定曲线，即商用试剂盒检测贝类腹泻性毒素的标定曲线；
（4）检测未知浓度的样品溶液贝类腹泻性毒素浓度：将步骤（1）得到的待测样品溶液加入到商用试剂盒96孔检测板（6）的微孔中，重复步骤（2.4）-步骤（3.2），得到在该待测样品溶液浓度下的子图像的Ｒ分量平均值，然后根据步骤（3.3）的公式计算待测样品溶液的CR值，带入步骤（3.4）得到的商用试剂盒检测贝类腹泻性毒素的标定曲线，计算出待测样品溶液贝类腹泻性毒素的浓度，根据步骤（1）的稀释倍数，即可得到1 ml待测样品溶液的贝类腹泻性毒素。
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